interação antigeno anticorpo
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INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO
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Antígeno
-Toda molécula reconhecida como estranha pelo organismo – interage com Ac e TCR
-Epitopo – menor fração de um antígeno capaz de ser reconhecida por anticorpos ou se ligar a TCRs.
-Antigenicidade: capacidade de um antígeno de ser reconhecido pelo sistema imunológico
-Imunogenicidade: capacidade do antígeno de ativar uma resposta imunológica
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Determinantes Antigênicos
A estrutura íntegra do antígeno é primordial para seu reconhecimento ideal
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Ligação do Antígeno ao Anticorpo
A ligação entre Ag e Ac é resultado da conformação do Ag e do Fab do Ac e das interações químicas entre eles
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INTERAÇÃO AG-AC
Ag + Ac Ag-Ac
A interação Antígeno-Anticorpo segue a lei das massas
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Complexo Ag-AC
A quantidade de um antígeno e de um anticorpo em umaSolução é fundamental para a formação de complexos Ag-Ac
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INTERAÇÕES Reações reversíveisReações reversíveis.
Ligações não covalentes:Ligações não covalentes:-Pontes de hidrogênio-Interações hidrofóbicas-Interações de Van der Waals-Ligações iônicas
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Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para
pesquisa e diagnóstico
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MÉTODOS
• PRECIPITAÇÃOPRECIPITAÇÃO- Imunodifusão
• AGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO- Aglutinação direta e indireta- Inibição da aglutinação- Teste de Coombs
• IMUNOENSAIOSIMUNOENSAIOS- RIA- ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo- Western Blotting
APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
- - Pesquisa - Diagnóstico- Soroepidemiologia
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MÉTODOS
1) Reagentes não marcados• Reação de precipitação• Reação de aglutinação
2) Reagentes marcados• Radioimunoensaios (RIA)• Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)• Imunofluorescência• Western Blotting
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PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
• Precipitação:Precipitação:Formação de complexos Ag/Ac.
• Aglutinação:Aglutinação:É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.
• As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.
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Classificação das reações de precipitação
1.Precipitação em meio líquido
2.Imunodifusão radial dupla
3.Imunodifusão radial simples
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Precipitação em meio líquido
(Oudin, 1946)
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• Zona de excesso de anticorpo = Formam-se imunocomplexos menores e solúveis e o sinal de leitura é baixo.
• Zona de equivalência = Formam-se grandes complexos gerando um sinal máximo.
• Zona de excesso de antígeno = Formam-se imunocomplexos menores e solúveis e o sinal de leitura decresce novamente.
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O sistema para detecção dos precipitados:
• Fonte de energia radiante (halogênio, tungstênio e laser)
• Condensador (flash de luz paralelo e não divergente)
• Seletor de comprimentos de onda (filtro ou monocromadores)
• Cubeta
• Sistema de detecção (define a técnica empregada)
• 0º = Turbidimetria
• 90º = Nefelometria
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Fontede luz
Cubeta
0º
• Turbidimetria:
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17
Fontede luzTungstênioMercúrioXenônio
Cubeta
30º
0º
90º
• Nefelometria:
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Imunodifusão radial dupla
(Ouchterlony, 1947)
Antígeno e anticorpo colocados em posição horizontal, em pontos diferentes, difundem-se um contra o outro formando um precipitado.
Ac
Ag Ag
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1. Os reagentes são colocados em
concentrações molares idênticas
a velocidade de difusão vai
depender do PM.
2. A curvatura estará dirigida
sempre para o orifício em que se
encontra a substância de maior
PM, nas condições ideais para a
reação.
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Imunodifusão radial simples
(Mancini e Fahey, 1965)
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• Ac + Ag multivalente particulado • Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-
quantitativo)• Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex
REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
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ANTÍGENOS PARTICULADOS
Exemplos: Aglutinação Ativa: Bactérias (Brucelose) Hemácias (Sistema ABO)
Aglutinação Passiva: Hemácias tratadas antígenos Partículas tratadas antígenos anticorpos
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Partículas Naturais PartículasSintéticas
PassivaConjugaçãoPrévia Ag
HEMAGLUTINAÇÃO BACTÉRIAS LÁTEX, ETC
PassivaConjugação
Prévia Ag ou Ac
Antígenossuperfície
membrana
Antígenos ouReceptoressuperfície
membrana
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2) Reagente (anticorpo anti A, B):
AGLUTINAÇÃO DIRETA
1) Amostra de sangue na placa teste:
Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação
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Leitura do resultado:
Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.
negativo positivo
AGLUTINAÇÃO DIRETA
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N acetil glicosamina
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Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)
INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
+Soro anti - hCGUrina
São incubados e colocados numa placa
Adicionam-se Partículas revestidas com hCG
Resultado positivo: (presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.
Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial
Resultado negativo:(ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.
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TESTE DE COOMBS
• Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs);
• DHRN – mãe produz IgG anti-Rh;
• Não aglutinam os eritrócitos;• Direto: Ac ligados aos
eritrócitos fetais;• Indireto: Ac anti-Rh não
aglutinantes no soro materno. • Permite detectar
incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.
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• Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos)
• Tipos:- Radioimunoensaios
- Ensaios imunoenzimáticos (ELISA)
- Imunofluorecência / Citometria de Fluxo
- Western blotting
IMUNOENSAIOS
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Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
Marcação de Anticorpos
1966 Nakane Avrameas
Conjugação de anticorpos com a
Peroxidase
Inicialmente aplicada a antígenos particulados
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
![Page 33: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/33.jpg)
EIE
Todo em fase líquidaHOMOGÊNEOS
HETEROGÊNEOSSeparação em
fase sólida
(ELISA)
CROMÓGENOS SOLÚVEIS CROMÓGENOS INSOLÚVEIS
( W. BLOTTING)
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
![Page 34: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/34.jpg)
1971 Engval & Perlmann
IMOBILIZAÇÃO DE ANTÍGENOS SOLÚVEISEM FASES SÓLIDAS (PLÁSTICOS)
ELISA
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
![Page 35: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/35.jpg)
ELISAFASE SÓLIDA POLIESTIRENO
POLIVINILCLORETO
NYLON
IMUNOPEROXIDASE
SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES
WESTERN BLOTTING
SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE ELETROFORESE
UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)
![Page 36: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/36.jpg)
O QUE LEVAR EM CONSIDERAÇÃO ???
•Pureza•Atividade específica•Limiar de detecção•Facilidade de conjugação•Eficácia após conjugação•Estabilidade do conjugado
ENZIMAS
![Page 37: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/37.jpg)
PEROXIDASE
FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO
FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS
ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO
VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS
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PEROXIDASE
Como se processa a reação ????
H2O2
H2O
½ O2
PEROXIDASE
Cromógeno
COR
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CROMÓGENOS PARA PEROXIDASE
Orthophenylene diamine (OPD)
5-aminosalicylic acid (5AS)
Tetramethylbenzidine (TMB)
2,2 azino-di(3- ethylbenzothiazoline) (ABTS)
4-Cloronaphthol
Diaminobenzidine (DAB)
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ELISA INDIRETO
![Page 41: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/41.jpg)
ELISA / CAPTURA
![Page 42: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/42.jpg)
TMB
OPD
![Page 43: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/43.jpg)
APLICAÇÕES DOS ENSAIOS IMUNO-ENZIMÁTICOSAPLICAÇÕES DOS ENSAIOS IMUNO-ENZIMÁTICOS
- - Borrelia burgdorferiBorrelia burgdorferi (IgG e IgM) (IgG e IgM)
- Citomegalovírus (IgG e IgM)- Citomegalovírus (IgG e IgM)
- Citomegalovírus (Ag)- Citomegalovírus (Ag)
- Hepatite A (Ac totais)- Hepatite A (Ac totais)
- Hepatite B:- Hepatite B:anti-HBsanti-HBsanti-HBc (IgG e IgM)anti-HBc (IgG e IgM)anti-HBeanti-HBeHBsAgHBsAgHBeAgHBeAg
- Hepatite D (Ac totais)- Hepatite D (Ac totais)
- Hepatite C- Hepatite C
- HIV - Ac- HIV - Ac
- HIV - Ag- HIV - Ag
- HTLV-1 e HTLV-2 - Ac- HTLV-1 e HTLV-2 - Ac
- Rubéola (IgG e IgM)- Rubéola (IgG e IgM) Curso CBAB/CNPq/MCT - 2006Curso CBAB/CNPq/MCT - 2006
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ELISPOTELISPOT
![Page 45: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/45.jpg)
Imuno-histoquímicaImuno-histoquímica
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Western-blotWestern-blot
![Page 47: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/47.jpg)
![Page 48: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/48.jpg)
Negative Negative -No bands presentNo bands present
PositivePositive-Bands at either p31 OR p24 Bands at either p31 OR p24 AND bands present at either AND bands present at either
gp160 OR gp120 gp160 OR gp120
IndeterminateIndeterminate
- Bands present, but pattern - Bands present, but pattern does not meet criteria for does not meet criteria for
positivity positivity
gp160
gp120
gp55
gp41
gp31
gp24
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RadioimunoensaiosRadioimunoensaios
![Page 50: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/50.jpg)
![Page 51: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/51.jpg)
lucigeninalucigenina
luminolluminol luciferinaluciferina
QuimioluminescênciaQuimioluminescência
![Page 52: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/52.jpg)
![Page 53: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/53.jpg)
Reações de ImunofluorescênciaReações de Imunofluorescência
Luz ultra-Luz ultra-violeta violeta
(145-290 nm)(145-290 nm) Luz visível Luz visível (>450nm)(>450nm)
(Coons (Coons et al.,et al., 1941,1942) 1941,1942)
![Page 54: interação antigeno anticorpo](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013108/5571fb294979599169941b2f/html5/thumbnails/54.jpg)
Isotiocianato de Isotiocianato de Fluoresceína Fluoresceína
(ITCF)(ITCF)
Isotiocianato de Isotiocianato de Rodamina BRodamina B
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Treponema pallidumTreponema pallidum
Pneumocystis cariniiPneumocystis carinii
Tripanosoma cruziTripanosoma cruzi
Giardia lambliaGiardia lamblia
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