REAKTANTI AKUTNE FAZE

je grupa proteina u serumu čija se koncentracija u serumu povećava tokom akutnog odgovora organizma (npr. tokom infekcije ili bilo koje druge upale). U reaktante akutne faze ubrajaju se C-reaktivni protein, serumski amiloid A, fibrinogen, haptoglobin i alfa1-kiseli glikoprotein.

FIBRINOGEN

Fibrinogen se nalazi u krvnoj plazmi koja se dobiva kada se krv, kojoj je dodan antikoagulans odvoji od krvnih elemenata. To je izduženi globulin koji se sintetizira u jetri. Fiziološka mu je uloga u koagulaciji krvi. Proteolitičkim djelovanjem trombina iz fibrinogena odvaja se peptidni ostatak, a iz topivog fibrinogena nastaje fibrilarni ne topivi fibrin koji agregacijom stvara prozirni fibrinski gel.Talog koji nastaje kad krv odstoji sadrži krvne stanice i fibrin.

Određivanje fibrinogena

Za određivanje fibrinogena koriste se njegove osobine:

- fibrinogen se pod dejstvom trombina pretvara u fibrin- relativno je nerastvorljiv- osetljiv je na toplotu- kao protein ima imunohemijsku specifičnost i elekrohemijsku pokretljivost

Određivanje fibrinogena sastoji se iz dvije faze:

1. Izolacija fibrinogena u vidu nativnog fibrinogena ili fibrina2. Određivanje količine izolovanog fibrinogena ili fibrina.

Metode za određivanje fibrinogena se dijele na funkcionalne i ne funkcionalne

Funkcionalne metode za određivanje fibrinogena zasnovane su na prvoj fazi pretvaranja fibrinogena u fibrin pomoću trombina, što odgovara reakciji koja se odvija in vivo.

Ne funkcionalna određivanja obuhvataju imunohemijske metode i metode precipitacije fizičko-hemijskim postupcima.

Imunološkim metodama ne mogu se razdvojiti fibrinogen, fibrini i FDP, pa su vrijednosti nešto više od fibrinogena određenog drugim metodama.

Precipitacija solima ili toplotom koje se koriste u nekim metodama mogu dovesti do nespecifične koprecipitacije drugih proteina.

Turbidimetrijsko određivanje fibrinogena (Parfenti metoda)

Metoda se zasniva na tome da višak rastvorene soli izaziva precipitaciju fibrinogena. Kod Fowell-ove modifikacije Parfentijeve metode koristi se amonijum-sulfat, a kod Rapling i Gaffney modifikacije natrijum-sulfit. Ove nefunkcionalne metode su brze za izvođenje, ali male tačnosti.

Clauss-ova metoda - Funkcionalna metoda

Test princip se zasniva na određivanju vremena koje je potrebno da se formira fibrinski ugrušak poslije dodatka trombina u plazmu.

Ova metoda ima najveći klinički značaj jer je u fiziološkim uslovima brzina formiranja fibrina važnija od koncentracije fibrinogena. Postoje brojne modifikacije ove metode, pa se metoda može izvoditi ručno, poluautomatski i automatski. Zavisno od modifikacije metode koriste se različite talasne dužine(405, 470, 540 nm).

Poluautomatski – koagulometar Fibrintimer mjeri stvaranje fibrinskog konca koristeći turbo-denzitometrijski princip.

Automatska koagulometrijska metoda

Automatski koagulometar je centrifugalni analizator koji koristi princip laser nefelometrije. Analizator mjeri intenzitet raspršene svjetlosti koja nastaje propuštanjem monohromatskog svjetlosnog zraka talasne dužine 632 nm kroz uzorak: prije, za vrijeme i poslije formiranja ugruška nakon dodatka tromboplastin-kalcijuma ili trombina ako se koristi Clauss metoda.

Metoda je našla primjenu u laboratorijama sa velikim brojem uzoraka, ali ima ograničenja kod pacijenata na oralnoj antikoagulantnoj terapiji kada je PT veoma produženo.

Referentne vrijednosti: 1,8-3,5 g/L

Dijagnostičko značenje fibrinogen ima u upalnim stanjima i poremećajima koagulacije. Fibrinogen je faktor rizika za koronarnu bolest, a povećanje od 0,6 g/L iznad srednje referentne vrijednosti rizik povećava 85%. Razlike su u koncentraciji pri tome rezultat genskog nasljeđa, a vanjski faktori nemaju uticaja.

Povećana koncentracija fibrinogena nalazi se u blažim oštećenjima jetre, jer u takvim stanjima jetra kompenzatorno stvara više fibrinogena. Povećana koncentracija nalazi se i u plazmi trudnica ili za vrijeme mjesečnice. Koncentracija fibrinogena pocećava se nakon rentgenskog zračenja, kod fokalnih infekcija kao tonzilitisa, sinusitisa i holecistitisa. Posebno velike koncentracije, i do 10 g/L mogu se naći u akutnim bakterijskim infekcijama, npr. pneumokokima, pri sepsi, a takođe u reumatskoj groznici i nefrotskom sindromu, kod kojeg je povećanje fibrinogena rezultat kompenzatorno pojačane sinteze u jetri zbog gubitka albumina. Povećani fibrinogen uzrokuje i ubrzanje sedimentacije eritrocita.

Smanjena koncentracija fibrinogena nalazi se pri funkcionalnoj jetrenoj insuficijenciji, zbog smanjene sinteze u jetri. To se može naći pri teškim oštećenjima jetre, u toksičnom hepatitisu, jetrenoj cirozi ili akutnoj atrofiji jetre. Koncentracija je smanjena i u teškim krvarenjima i kaheksiji pri zloćudnim bolestima. Fibrinogen je malo smanjen i kod tifusa, što je iznimka jer je inače povećan kod infektivnih bolesti. Blago je smanjen pri bolestima koštane srži, mijeloične leukemije, perniciozne anemije, šarlaha i palgre. Postoji i konstitucionalna fibrinogenopatija, a te osobe su sklone krvarenjima.

C - REAKTIVNI PROTEIN (CRP)poznat je u laboratorijskoj dijagnostici kao najviše ispitivan protein plazme, koji služi kao

upalni marker, zbog čega je važan indikator kod upale, nekroze tkiva ili traume. Ima visoku osjetljivost i malu specifičnost. Kod zdravih osoba CRP je prisutan u vrlo niskim koncentracijama.

CRP je glikoprotein kojeg proizvode jetra i masne stanice (adipociti). Njegove vrijednosti strelovito rastu u slučaju akutne upale, pa tako mogu porasti i stotinu puta u roku samo 24 sata, pa se posljednjih godina CRP u dijagnostici često koristi kao zamjenski test za sedimentaciju eritrocita.

U fazi nespecifičnog imunog odgovora organizma na neku infekciju, CRP je važan imunološki protein. Povećanje njegove koncentracije u krvi nastaje već šest do devet sati nakon početka infekcije, a maksimum dostiže za jedan do tri dana, nakon prethodnog porasta koncentracije interleukina 6, kojeg izlučuju različite imunološke stanice. Njegovi imunološki učinci su brojni: aktivacija komplementa, supresija ili aktivacija određenih tipova T-limfocita i proizvodnje nekih citokina, mogućnost vezanja bakterijskih polisaharida i fosfolipida iz tkiva oštećenih upalom, traumom ili infekcijom.

Najčešće se koristi za potvrdu postojanja akutnih upala, zatim organskih bolesti, poput infarkta srčanog mišića, infekcije ili tromboze, te raznih hroničnih bolesnih stanja, kao što su hronične upale, reumatske bolesti i maligni tumori.

Važan je za razlikovanje virusnih od bakterijskih upala. Kod virusnih infekcija koje prate povišena sedimentacija i povišen broj leukocita, CRP ostaje u nižim granicama vrijednosti nego ako je posrijedi bakterijska infekcija, kada je njegov porast puno viši.

Uspješno se primjenjuje i u diferencijalnoj dijagnostici upala zglobova i mišića, kod ranog otkrića upala zglobnih ovojnica, kao pomoć u dijagnostici simptoma i bolesti probavnog sistema,

posebno za razlikovanje iritabilnog kolona od neke organske bolesti crijeva, kao i razlikovanje ulceroznog kolitisa od Crohnove bolesti.

Procjene koncentracije CRP-a korisne su i u procjeni napredovanja bolesti, odnosno efikasnosti terapije. Tako će npr. uspješnom primjenom antibiotske terapije CRP koncentracija u serumu pasti brže od sedimentacije eritrocita, pa se praćenjem njegove koncentracije može spriječiti nepotrebno uzimanje manje djelotvornog ili nedjelotvornog antibiotika, zamijeniti ga djelotvornijim. U tom smislu određivanje vrijednosti CRP-a od iznimne je važnosti i u dijagnostici i praćenju terapije infekcija u nedonoščadi i novorođenčadi.

Nakon hirurških operacija, koncentracija CRP-a raste za dva do šest sati, a pada do trećeg dana nakon operacije. Ako ne dođe do pada vrijednosti CRP-a nakon tog vremena, to upućuje na infekciju kao komplikaciju operativnog zahvata.

Koncentracija CRP-a određuje se iz seruma biohemijskim testiranjem raznim metodama (ELISA test, brza imunodifuzija, aglutinacija...), a posljednjih nekoliko godina najčešće metodom imunoturbidimetrije.

U serumu zdravih odraslih osoba i adolescenata ima manje od 5 mg/L CRP-a Pozitivan CRP test daje informaciju o postojanju upalnih procesa u organizmu, među kojima

su najčešća karcinom, bolesti vezivnog tkiva, infarkt srca, infekcije, upalne bolesti creva, lupus eritematodes, pneumokokna upala pluća, reumatoidni artritis, reumatska groznica, tuberkuloza, itd

Normalna koncentracija ovog proteina u krvi ipak ne isključuje mogućnost blažih lokaliziranih upala ili hroničnih bolesti, kao što su ulcerozni kolitis ili sistemski lupus eritematodes.

Faktori koji mogu promijeniti vrijednosti CRP-a u serumu mogu biti biološki i analitički.

Biološki faktori su: pojačan fizički napor, visoka hronološka dob, trudnoća (posebno posljednjih nekoliko mjeseci), uzimanje oralnih kontraceptiva, pušenje i visoka nadmorska visina.

Najčešća dva analitička faktora koja mogu uticati na vrijednost CRP-a su povišene masnoće u serumu (lipemija) i postojanje tzv. reumatoidnih faktora. Pušači imaju i statistički značajno više serumske vrijednosti CRP-a od nepušača, dok u serumu osoba s normalnim i povišenim vrijednostima holesterola i triglicerida nema statistički značajne razlike u vrijednostima ovog proteina.

Procjena kardiovaskularnog rizika

Prema vrijednostima visoko osjetljivog CRP-a (tzv. high sensitivity-hs-CRP) može se procijeniti rizik od kardiovaskularnih bolesti:- hs-CRP manji od 1 mg/L - nizak rizik - hs-CRP od 1-3 mg/L - umjeren rizik - hs-CRP veći od 3 mg/L - visok rizik.

Nerealno snižene vrijednosti CRP-a mogu se naći u osoba koje su na terapiji lijekovima za smanjenje masnoća u krvi (statinima) ili na terapiji aspirinom.

Mjerenje koncentracija CRP-a u serumu pokazalo se vrlo važnim i dobrim pokazateljem rizika za nastanak infarkta srčanog mišića u osoba kod kojih istodobno postoji nekoliko faktora rizika za tu bolest, ali i kod onih koji imaju niske vrijednosti LDL - holesterola u krvi. Budući da je dokazano da CRP potiče aterosklerozu, njegove povišene vrijednosti mogu pomoći u objašnjenju razloga zbog kojih neke osobe dožive akutni infarkt srčanog mišića ili moždani udar iako su im koncentracije lipida u krvi normalne. Prema brojnim istraživanjima, ovaj protein pokazao se i kao visoko prediktivan u smislu najave mogućeg sljedećeg infarkta, moždanog udara ili bolesti perifernih arterija, a koristan je i za praćenje efikasnosti liječenja kardiovaskularnih bolesti.

Metode koje se koriste za određivanje nivoa CRP u serumu zasnivaju se na sposobnosti vezivanja za

različite biološke ligande stvarajući CRP-ligand komplekse. Kada se reagens koji sadrži anti-humana CRP antitijela doda u uzorak seruma koji sadrži CRP, on se veže za antitijela formirajući nesolubilni CRP-ligand kompleks koji se taloži, što se može vizualizirati i mjeriti.

Kvalitativna lateks aglutinacija je prvi laboratorijski metod koji je razvijen za mjerenje CRP, a mjeri prisustvo ili odsustvo aglutinacije i precipitacije, ukazujući samo na to da li je CRP prisutan ili odsutan u uzorku seruma. Pozitivni test ukazuje na prisustvo CRP-ligand kompleksa koji se formira vezanjem CRP-a uzrokujući aglutinaciju i precipitaciju, dok je test negativan kada nema aglutinacije. Pozitivni test ukazuje da je nivo CRP > 6 mg/L ili čak iznad 10 mg/L u zavisnosti od reagensa koji se koristio. Čisto kvalitativne CRP metode se ne koriste za mjerenje nivoa CRP zato što imaju nisku osjetljivost sa pozitivnim rezultatima kod bilo kojeg stanja sa upalom ili tkivnom destrukcijom. Pozitivni CRP test bi trebao biti praćen sa semikvantitativnim testom.

Semikvantitativna lateks aglutinacija uključuje upotrebu serijskog razblaženja seruma i soli, koji je pomješan sa lateks reagensom i posmatrano prisustvo aglutinacije. Najveće razblaženje u kojem je aglutinacija vidljiva odgovara približnom titru ili koncentraciji CRP-ligand kompleksa.

Kvantitativni imunotest je najbrži, sofisticirani i senzitivni metod za detekciju i mjerenje CRP. Imunoenzimski test i imunoflurescentni kvantitativni test koriste monoklonalna anti-CRP antitijela markirana sa enzimom ili fluorescentnom bojom fiksirani u bunarčićima na mikrotitarskoj ploči ili epruveti. Kada se doda razblaženi humani serum, CRP se veže za imobilizirana markirana anti-CRP antitijela formirajući CRP-ligand komplekse, a nevezana antitijela se isperu iz epruvete.

Fluorescentno-markirani CRP-ligand kompleks može se vizualizirati i mjeriti pod fluorescentnim mikroskopom.

Dodavanje supstrata na enzim-markirane CRP-ligand komplekse koji reaguju sa enzimom uzrokuje obojenu reakciju, a uzorak se očitava sa spektrofotometrom.

Laser i nefelometar koriste diodu koja emituje infracrvene zrake i prolaskom kroz epruvete koje sadrže fiksirana anti-CRP monoklonalna antitijela sa humanim serumom, rezultiraju formiranjem CRP-ligand kompleksa od čije količine ovisi stepen raspršivanja svjetla.