Reação de Polimerização em Cadeia - PCR
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Reação de Polimerização em Cadeia - PCR
1-Introdução
2-Automatização da PCR
3-Sistema de reação
4-Iniciadores – primers
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1-Introdução
Kary Mullis1985 – Cetus Corporation
A PCR é um sistema para a replicação do DNA in vitro, que permite que uma seqüência “alvo”de DNA seja amplificada em milhares de cópias em apenas algumas horas
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2-Automatização da PCR
• O isolamento da DNA polymerase termoestável da bactéria Thermus aquaticus, a Taq polymerase.
• Ciclos com oscilações entre altas e baixas temperaturas, controladas por computador
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Termociclador
2-Automatização da PCR
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Etapas básicas da PCR:
• 1- desnaturação térmica do DNA molde• 2- Anelamento de oligonucleotídeos
sintéticos – iniciadores• 3- Polimerização das novas fitas a partir
dos iniciadores
2-Automatização da PCR
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Em um microtubo...
• DNA a ser amplificado (pequenas quantidades)
• Solução tamponada contendo:– DNA polimerase– Iniciadores– dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
– Cofator enzimático MgCl2– Água milliQ
3-Sistema de reação
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4-Iniciadores - primers
• Tamanho – entre 10 a 30 bases• Composição de bases - ~50% de
G/C• Seqüências – não devem ter
complementaridades intra ou inter molecular
• Cálculo da Tm
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Cálculo da Tm - temperatura de anelamento dos iniciadores
• Do inglês: melting temperature• Temperatura na qual se tenta obter o equilíbrio
entre a formação e a dissociação dos híbridos gerados pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio
• Para o cálculo:• Tm= 2(A+T) + 4(G+C)
4-Iniciadores - primers