Reação em cadeia da polimerase (PCR)
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PCR e Eletroforese de Nucleotídeos
Dalvania Pinho DominguesFralini dos Santos MarcilioGabriel Machado CarvalhoLeonardo Teles FaberPatricia de Sá AlmeidaRita de Cássia Costa de Carvalho
PCR=Polymerase Chain Reaction
Reação em Cadeia da Polimerase –técnica que utiliza a enzima DNA polimerase ,responsável pela síntese de DNA ,para amplificar in vitro,qualquer segmento de DNA utilizado como molde através de ciclos .
Histórico
1983 – Kary Banks Mullis.
Reação em cadeia da polimerase.
Conceito de primer 1987– Primeira publicação:Science. 1989 – Automação do processo pelo uso do
primeiro termociclador automático. 1983 – Prêmio Nobel de Química:Kary Banks Mullis
Princípios Consiste de três etapas:
Denaturação– 95 ºC por 30 segundos
Anelamento-ligação dos primers(64ºC)
Polimerização-síntese de cadeia complementar de DNA
Princípios
Requer:
DNA molde
DNA polimerase termoestável
2 primers
Deoxinucleotídeos trifosfato(dNTPs)
Cátion divalente(MgCl2)
Tampão
Termociclador
Limitações Contaminação por DNA estranho Incorporação errônea de bases Difícil aplicação a sequências maiores que 500
Daltons Inibidores:• Fenol• Proteinase K• Agentes quelantes em excesso(EDTA)• Hemoglobinas e outras proteínas das hemácias• SDS(dodecil sulfato de sódio)• Elevadas concentrações de sal
Aplicações
1.Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros)
2.Seleção de clones recombinantes, com primers complementares a seqüências do vetor.
3.Sequenciamento direto de produtos amplificados
Aplicações
4.Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas, estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas)
5.Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos
6.Diagnóstico pré-natal em caso de risco
Aplicações 7.Elucidar relações evolutivas entre espécies,
utilizando material arqueológico
8.Na Medicina Forense,análises em cenas de crimes (impressão digital de DNA-Fingerprint)
9.Teste de paternidade
Avanços Utilização de DNA polimerase termoestável(Taq
polimerase)
Novas DNA polimerases(Pfu DNA polimerase,Tli DNA polimerase,Vent DNA polimerase)
Novas estratégias de análise(Nested PCR,Touchdown PCR,Inverse PCR,PCR-ELISA,Multiplex PCR,HotStart PCR,RT-PCR,PCR-Competitiva.)
Eletroforese de Nucleotídeos
Método padrão para análise,identificação e purificação de fragmentos de DNA ou RNA que diferenciam-se em tamanho ou conformação.
Histórico1933-Tiselius:eletroforese para separar proteínas em
solução1955-Smithies:géis de amido para separar proteínas
do soro Frederick Sanger:análise completa da insulina
bovina1956-Ingran:primeiro mapa peptídico1959-Raymond:géis de poliacrilamida1966-Maizel:uso de SDS1975-O´Farrel:gel bidimensional1981-Jorgenson e Lukacs :Eletroforese Capilar(EC)
Princípios
Aplicação de uma diferença de potencial
Migração de partículas em um determinado gel
Separação molecular na amostra Visualização das “bandas”
Princípios Requer:• Amostra(livre de contaminação)• Gel (agarose ou poliacrilamida)• Tampão(TBE:Tris-Borato EDTA e TAE:Tris-
Acetato EDTA)• Equipamento para Eletroforese• Corantes:Prata,Ponceau,Azul de
Bromofenol,Xileno-Cianol.• Ladders(marcadores de tamanho)
Limitações
Taxa de migração do DNA nos géis de agarose
1.Tamanho molecular do DNA 2.Concentração da agarose 3.Conformação do DNA 4.Presença de Brometo de Etídio 5.Voltagem aplicada 6.Tipo de agarose 7.Tampão
Limitações
Não é adequada para determinação de compostos voláteis,não-polares e de massa molar baixa(menores que 200 Daltons)
Não é adequada para polímeros não-iônicos com massa molar alta(maiores que 500 Daltons)
Aplicações
Sequenciamento de DNA(eletroforese capilar)
Separação de misturas complexas de macromoléculas
Avanços
Western blotting Eletroforese Capilar em Solução
Livre(ECSL) Eletroforese Capilar em Gel(ECG) Eletrocromatografia Capilar Micelar(ECCM) Eletroforese Capilar com Focalização
Isoelétrica(ECFI) Isotacoforese Capilar(IC)
Referências Alberts B, Jonhson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed; 2004.
http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf(Acesso em 08 de agosto de 2008)
http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm(Acesso em:18 de agosto de 2008
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.htmlhttp://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html(Acesso em 18 de agosto de 2008)
http://www.etall.hpg.com.br(Acesso em 18 de agosto de 2008)