RAPORT ŞTIIN ŢIFIC DE ETAP · insuficient ă a unor medicamente antibacteriene noi [1,2]. Pe...
Transcript of RAPORT ŞTIIN ŢIFIC DE ETAP · insuficient ă a unor medicamente antibacteriene noi [1,2]. Pe...
HEAL inSiDE – Etapa 1 1 / 36
RAPORT ŞTIINŢIFIC DE ETAPĂ
Contract nr. 99 ⁄ 2018, cu titlul „ Design de peptide antimicrobiene cu potenţial
terapeutic ridicat: predicţie in silico şi validare experimentală” (HEAL inSiDE)
PN-III-P1-1.1-TE-2016-0032
Etapa 1
Această etapă are 3 obiective împărţite în 10 activităţi. Deoarece acest document
constituie un raport al activităţii ştiinţifice, obiectivele 1.1 şi 1.3, marcate în gri, sunt
doar enumerate. Obiectivul ştiinţific al acestei etape este 1.2, având 4 activităţi.
Raportul ştiinţific este împărţit în următoarele secţiuni: (1) Introducere, (2)
Rezumatul etapei, (3) Descrierea ştiinţifică şi tehnică, cu subsecţiunile: (3.1)
Programe şi modele utilizate, (3.2) Simulări atomistice, (3.3) Simulări coarse-
grained, (4) Concluzii etapă şi (5) Bibliografie. Sumar activităţi:
Obiectiv 1.1 Planificarea activităţilor ştiinţifice şi administrative
Activitate 1.1.1 Planificarea activităţilor administrative
Activitate 1.1.2 Organizarea de întâlniri de grup regulate în scopul: (i) identificării
potenţialelor probleme ştiinţifice; (ii) planificării activităţilor
ştiinţifice viitoare
Activitate 1.1.3 Actualizarea paginii web a proiectului
Obiectiv 1.2 Studiul membranelor model prin metode atomistice şi
moleculare (CG). Identificarea unui model simplu şi al unuia
complex pentru membrane bacteriene şi de mamifer
Activitate 1.2.1 Pregătirea sistemelor atomistice simple şi complexe de modele
membranare bacteriene şi de mamifer
Activitate 1.2.2 Simularea sistemelor şi studiul dinamicii, a legăturilor de hidrogen,
precum şi a distribuţiei atomilor/grupurilor de atomi de-a lungul
normalei la membrană.
HEAL inSiDE – Etapa 1 2 / 36
Activitate 1.2.3 Analiza rezultatelor obţinute şi propunerea de modele
membranare atomistice bacteriene şi de mamifer (simple şi
complexe).
Activitate 1.2.4 Validarea modelelor membranare propuse prin simulări
moleculare/coarse-grained (CG).
Obiectiv 1.3 Diseminare rezultate proiect
Activitate 1.3.1 Diseminare rezultate în cadrul întâlnirilor regulate ale grupului
Activitate 1.3.2 Diseminare rezultate prin participare la conferinţe şi publicaţii
Activitate 1.3.3 Întocmire raport ştiinţific de etapă, concluzii şi prespective
HEAL inSiDE – Etapa 1 3 / 36
� 1. Introducere
Conform datelor furnizate de Organizaţia Mondială a Sănătăţii rezistenţa
antimicrobiană este în creştere şi reprezintă o ameninţare tot mai mare la adresa
sănătăţii publice [1]. Una din prinicipalele cauze este determinată de dezvoltarea
insuficientă a unor medicamente antibacteriene noi [1,2].
Pe lângă potenţialului terapeutic ridicat, peptidele antimicrobiene naturale prezintă
acţiune bactericidă, antiinflamatoare şi anticancer, cu selectivitate ridicată pentru
celulele bacteriene în comparaţie cu cele de mamifer [3,4]. Cu toate acestea,
posibilitatea ca bacteriile să dezvolte diferite strategii de rezistenţă bacteriană
(modificări în sarcina de suprafaţă) împotriva activităţii peptidelor naturale sugerează
necesitatea unor noi abordări în design-ul unor noi peptide antimicrobiene. Creşterea
siguranţei şi eficacităţii noilor medicamente este esenţială pentru noile peptide
(extrase din fragmente de proteine şi din biblioteci peptidice sau concepute în mod
secvenţial).
Abordările de cercetare ale peptidelor
antimicrobiene pot fi clasificate în 3
categorii [5]: bazate pe şablon
(peptidele sunt tratate ca secvenţe de
aminoacizi, limitate la proprietăţile lor
individuale, cum ar fi hidrofobicitatea,
încărcarea / sarcina electrică etc.),
modele privind relaţia cantitativă
structură-activitate, QSAR (analize
numerice care descriu relaţiile dintre
proprietăţile peptidelor ca intrări şi activitatea biologică ca ieşire, limitată de funcţia
utilizată) şi studiile biofizice (modelare moleculară bazată pe energie liberă, dinamică
moleculară etc., limitată de scală, modele de membrane).
Fig. 1. Inserarea peptidelor antimicrobiene în membrană [5]
HEAL inSiDE – Etapa 1 4 / 36
� 2. Rezumatul etapei
Prima etapă a acestei etapă totalizează 10 activităţi (enumerate pe primele două
pagini ale acestui raport), pentru atingerea a 3 obiective principale: (O1.1)
Planificarea activităţilor ştiinţifice şi administrative; (O1.2) Studiul membranelor
model prin metode atomistice şi moleculare (CG). Identificarea unui model simplu şi
al unuia complex pentru membrane bacteriene şi de mamifer (parte ştiinţifică);
(O1.3) Diseminarea rezultatelor intermediare obţinute în această etapă.
Sumarul activităţii ştiinţifice de etapă (O1.2) este următorul:
Activităţile pentru studiul membranelor model sunt: (i) simulări la nivel
atomistic (3.2), care au avut ca ţintă (a) modelarea mai multor modele
membranare plasmatice atât bacteriene, cât şi de mamifer, (b) obţinerea de
sisteme stabile simple şi complexe şi (c) caracterizarea acestora.
Scopul acestor simulări a fost de a pregăti (ii) simulările la nivel semi-atomistic
sau coarse-grained (3.3). Acestea au fost folosite pentru a identifica cele mai
bune modele de membrane plasmatice bacteriene şi de mamifer, fiecare în
două variante de complexitate: (a) model simplu şi (b) model complex.
Descrierea detaliată a activităţilor este realizată la secţiunea 3, începând cu
prezentarea programelor şi metodelor care au fost folosite pentru a obţine modelele
membranare menţionate mai sus (3.1).
Raportul ştiinţific de etapă se încheie cu câteva concluzii majore asupra rezultatelor
obţinute, precum şi o listă de referinţe folosite în acest raport.
HEAL inSiDE – Etapa 1 5 / 36
� 3. Descrierea ştiinţifică şi tehnică
3.1. Programe şi modele utilizate
NAMD [6] – cod de dinamică moleculară care este proiectat pentru paralelizarea
eficientă a simulărilor de sisteme biomoleculare de largi dimensiuni. NAMD este
accesibil pentru utilizare gratuită, pentru o perioadă nelimitată de timp şi este bazat
pe un design modern şi tehnologii de programare avansate. Versiunile recente ale
codului (NAMD 2.12 – NAMD2.13) includ accelerări semnificative pe partea de
paralelizare a codului folosind setul de instrucţiuni CUDA ale motoarelor grafice
(GPU).
GROMACS [7] – cod de dinamică moleculară proiectat în principal pentru
biomolecule (proteine, lipide), dar este utilizat şi în studiul altor sisteme (polimeri).
Permite paralelizarea mult mai eficientă a simulărilor coarse-grained.
VMD [8] – program de vizualizare şi modelare dezvoltat pentru sisteme
biomoleculare, eficient în pregătirea configuraţiilor iniţiale şi postanaliza traiectoriilor
NAMD/GROMACS.
CHARMM [9, 10] – câmp de forţe atomistic al cărui calcul al energiei potenţiale se
realizează după descrierea de mai jos:
( ) ( ) [ ] ( )
( )
2 2 2
0 0 0
12 6
21,3 1,3
0
1 cos( )
2
b
i j ij ij
ij ub
i, j i, jij ij ij
U k b b k k n k
q q r rk b b
r r r
θ ψ ωθ θ ψ δ ω ω
εε −
= − + − + + − + −
+ + − + −
∑ ∑ ∑ ∑
∑ ∑ ∑
bonds angles dihedrals impropers
min min
atoms atoms Urey Bradley
MARTINI [11] – câmp de forţe semi-atomistic / coarse-grained (CG) care modelează
ca o singură particulă 4 sau 3 atomi grei împreună cu atomii de hidrogen aferenţi.
Câmpul de forţe Martini 2 a fost rafinat în mai multe etape prin îmbunătăţirea
câmpului pentru proteine, apă şi ioni (a fost dezvoltat inclusiv câmp de forţe polarizat
[12]) şi extinderea acestuia asupra unui număr impresionant de lipide [13-16].
Tcl/Tk – limbaj de scripting foarte eficient în generarea de structuri în format
PDB/GRO şi pentru analiza datelor obţinute din postanaliza VMD. Limbajul este
HEAL inSiDE – Etapa 1 6 / 36
compatibil cu VMD şi astfel poate fi folosit şi în cadrul postanalizei traiectoriilor în
VMD.
Python [17] – limbaj de programare avansat uşor de utilizat de tip iterativ, imperativ
şi cu un interpretor interactiv.
Microsoft Excel – utilitar de analiză rapidă a fişierelor de tip bază de date în mod
text.
HEAL inSiDE – Etapa 1 7 / 36
3.2. Simulări atomistice
În aceste simulări s-a urmărit obţinerea de modele membranare plasmatice
bacteriene şi de mamifer.
Metode
Construcţia membranei.
Tab. 1. Detalii simulări. Componenţa lipidică a bistraturilor folosite în simulările atomistice.
ATOMISTIC MAMIFER
simplu (bistrat simetric) fosfatidilcolină
strat superior strat inferior
POPC 144 144 ternar (bistrat simetric) strat superior strat inferior
fosfatidilcoline + colesterol DPPC 50 50 DLiPC 30 30 CHOL 20 20
simplu (bistrat asimetric) strat superior strat inferior fosfolipide + colesterol
DPPC 33 22 DLiPC 25 23 POPE 10 26 CHOL 32 29
simplu (bistrat asimetric) strat superior strat inferior fosfolipide + colesterol (4X) (4X) (4X)
DPPC 132 88 DLiPC 100 92 POPE 40 104 CHOL 128 116 complex (bistrat asimetric) strat superior strat inferior
fosfolipide (neutre + încărcate) + sfingomielină + colesterol
DPPC 10 12 DLiPC 26 5 POPE 10 24 PSM 24 10 DOPS 0 18 CHOL 32 29 complex (bistrat asimetric) strat superior strat inferior
fosfolipide (neutre + încărcate) + sfingomielină + colesterol
(4X)
(4X) (4X)
DPPC 40 48 DLiPC 104 20
HEAL inSiDE – Etapa 1 8 / 36
POPE 40 96 PSM 96 40 DOPS 0 72 CHOL 128 116
BACTERIAN simplu (bistrat simetric)
fosfolipide neutre + încărcate strat superior strat inferior
DOPC 122 122 DOPG 22 22
ternar (bistrat simetric) fosfolipide (neutre + încărcate)
+ cardiolipină
strat superior strat inferior
PVPE 90 90 PVPG 5 5 PVCL2 5 5
Au fost studiate prin simulări atomistice modelele membranare plasmatice (vezi
Tabelul 1) de mamifer (simetric simplu/ternar, asimetric simplu/complex) şi
bacteriene (simetric simplu/ternar) (vezi Figura 2). Structura iniţială a fost construită
cu ajutorul Membrane Builder [18].
HEAL inSiDE – Etapa 1 9 / 36
Fig. 2. Reprezentări ale sistemele atomistice model alese în urma analizelor de mai jos: (sus) de mamifer (stânga) simetric simplu (fosfatidilcolină) – POPC(mov); (dreapta) simetric ternar (fosfatidilcoline+cholesterol) – DPPC(albastru),DLiPC
(roz),CHOL (alb) şi (jos) bacteriene (stânga) simetric simplu (fosfolipide neutre+încărcate) – DOPC(verde), DOPG(magenta); (dreapta) simetric ternar
(fosfolipide (neutre+încărcate)+cardiolipină) – PVPE (cyan), PVPG (galben), PVCL2 (albastru)
Construcţia sistemului.
Sistemele atomistice au fost solvatate (model TIP3P [19]) şi neutralizate cu ajutorul
ionilor de sodiu si clor pentru a avea concentraţia molară de 0.15 mol/L.
Câmpul de forţe.
În simulările atomistice au fost folosite câmpul de forţe CHARMM C36 [9] şi câmpul
de forţe atomistic CHARMM pentru sfingomielină [10].
Protocoale de simulare.
Simulările au fost realizate cu programul de dinamică moleculară NAMD [6]. Acesta
foloseşte integratorul Verlet pentru propagarea poziţiilor şi vitezelor atomilor. În toate
simulările am utilizat pasul de integrare de 2 fs, distanţa de tăiere folosită a fost de
12 Å, iar funcţia de comutare a fost setată la 9 Å pentru toate interacţiunile de scurtă
distanţă. Cu excepţia interacţiunilor electrostatice, care au fost actualizate la fiecare
al doilea pas, toate celelalte interacţiuni au fost actualizate la fiecare pas. Pentru a
minimiza efectele de margine au fost aplicate condiţii de periodicitate, iar
HEAL inSiDE – Etapa 1 10 / 36
interacţiunile electrostatice de lungă distanţă au fost tratate folosind metoda Particle
Mesh Ewald (PME) [20]. Temperatura a fost fixată la 300 K folosind un termostat
Langevin [21, 22] cu un coeficient de amortizare de 5 ps-1.
Tab. 2. Detalii de simulare. Mărimea sistemelor/timpul de simulare. ATOMISTIC MAMIFER Componenţă bistrat Număr atomi Timp simulare POPC 65496 >70 ns DPPC:DLiPC:CHOL (4X) 178095 100 ns DPPC:DLiPC:POPE: CHOL 42011 100 ns DPPC:DLiPC:POPE: CHOL (4X) 157480 300 ns DPPC:DLiPC:POPE:PSM:DOPS:CHOL 38563 100 ns DPPC:DLiPC:POPE:PSM:DOPS:CHOL (4X)
165317 300 ns
BACTERIAN Componenţă bistrat Număr atomi Timp simulare DOPC:DOPG 66340 >70 ns PVPE:PVPG:PVCL2 45504 100 ns
Protocolul următor a fost folosit în toate simulările: a) sistemele au fost minimizate
10.000 de paşi aplicând restricţii următorilor atomi: fosfor (k = 2.5 kcal mol-1 Å-2),
atomii de oxygen ai apei şi ionii (k = 0.1 kcal mol-1 Å-2), b) 150 ps warmup de la 0 K a
300 K, cu creşterea temperaturii cu 3 K la fiecare ps. Au fost aplicate restricţii:
atomilor de fosfor (k = 1 kcal mol-1 Å-2), atomii de oxygen ai apei şi ionii (k = 0.1 kcal
mol-1 Å-2), c) 350 ps echilibrare la temperature de 300 K, cu restricţii aplicate atomilor
de fosfor (k = 0.1 kcal mol-1 Å-2), d) timpul aferent fiecărei simulări a fost sintetizat în
Tabelul 2.
HEAL inSiDE – Etapa 1 11 / 36
Rezultate şi discuţii
Distribuţiile grupurilor de atomi
Distribuţiile grupurilor de atomi au fost determinate cu ajutorul plugin-ului de analiză
Density Profile Tool [23] din programul VMD [8]. Distribuţia grupurilor de atomi de-a
lungul normalei la membrană au fost obţinute împărţind membrana în felii de 1 Å
grosime. Centrul bistratului lipidic este situat la z=0, fiind reprezentate profilele
separat pentru cele 2 straturi. Toate grupurile de atomi enumerate din legendă
conţin doar atomii grei.
Fig. 3. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană pentru bistrat
de mamifer simetric simplu (fosfatidilcolină)
Primul bistrat lipidic de mamifer considerat este un bistrat simplu care are în
componenţă lipide POPC. Distribuţiile indică că apa pătrunde în bistratul lipidic până
la regiunea unde sunt situate grupările glicerol, cozile lipidice formate din grupările
metil fiind hidrofobe (vezi Fig. 3) în concordanţă cu datele experimentale [24, 25].
HEAL inSiDE – Etapa 1 12 / 36
Fig. 4. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană pentru bistrat
de mamifer simetric ternar (fosfatidilcoline + cholesterol)
Bistratul lipidic terţiar este gradul următor de complexitate considerat. În Fig. 4 este
reprezentată distribuţia grupurilor de atomi aferente bistrat de mamifer simetric
format din lipidele DPPC, DLiPC şi colesterol. Moleculele de cholesterol sunt situate
mai adânc în bistrat, în comparaţie cu fosfatidilcolinele. Lipidele DPPC au 2 lanţuri
saturate fiind prezente doar legături simple, spre deosebire de lipidele DLiPC care
prezintă lanţuri nesaturate.
HEAL inSiDE – Etapa 1 13 / 36
Fig. 5. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană pentru bistrat
de mamifer asimetric simplu (fosfolipide + colesterol)
Distribuţia grupurilor de atomi reprezentată în Fig. 5 indică că în membrana
asimetrică alcătuită din 4 componente DPPC, DLiPC, POPE şi colesterol, lipidele
POPE sunt inserate mai adânc în bistrat, în comparaţie cu DPPC şi DLiPC. La fel ca
în studiile experimentale RMN [26], grupările PC sunt situate perpendicular pe planul
membranar, iar grupările PE sunt situate paralel cu acesta.
Putem observa ca localizarea colesterolului depinde nu doar de stratul în care se
situează, ci şi de compoziţia celuilalt strat, deoarece bistratul asimetric se comportă
ca o entitate unitară care este consituită din 2 straturi care comunică între ele.
HEAL inSiDE – Etapa 1 14 / 36
Fig. 6. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană pentru bistrat
de mamifer asimetric complex (fosfolipide (neutre+încărcate)+sfingomielină+colesterol)
Pentru a crea un model cât mai realist, am studiat prin simulări atomistice o
membrană asimetrică cu compoziţia celor 2 straturi diferite (DPPC, DLiPC, POPE,
PSM, DOPS şi cholesterol). În cadrul separaţiei de fază, faza ordonată este bogată
în cholesterol şi lipide PSM, din acest motiv studiul bistratului asimetric este esenţial
în caracterizarea membranelor de mamifer. Comportamentul lipidelor POPE (vezi
Fig. 6) inserate mai adânc în membrană este acelaşi ca în cazul bistratului de
mamifer asimetric simplu (vezi Fig. 5).
HEAL inSiDE – Etapa 1 15 / 36
Fig. 7. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană bistrat bacterial
simetric simplu (fosfolipide neutre + încărcate)
Un model consacrat alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) a fost folosit în
simulări atomistice pentru a studia membrana interioară E. coli. Lipidele utilizate sunt
DOPC (dioleoilfosfatidilcolină) şi DOPG (dioleoilfosfatidilglicerol) (vezi Fig. 7). Acest
model este utilizat pe scară largă, iar distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul
normalei la membrană este în concordanţă cu datele experimental obţinute prin
RMN de Heller [27].
HEAL inSiDE – Etapa 1 16 / 36
Un model mai complex alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) şi cardiolipină (CL)
a necesar în simulările atomistice pentru a simula membrana interioară E. coli. Au
fost utilizate lipidele PVPE, PVPG şi PVCL2, lipidele CL fiind inserate mai adânc în
bistratul lipidic, în comparaţie cu fosfolipidele (vezi Fig. 8).
În continuare, urmărim în acest studiu comparativ relaţia dintre modelele
membranare (amestecuri simple, respectiv terţiare de mamifer şi bacteriale) şi
sistemele naturale.
Fig. 8. Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană bistrat bacterial
simetric ternar (fosfolipide (neutre + încărcate) + cardiolipină)
HEAL inSiDE – Etapa 1 17 / 36
Grosimea bistratului lipidic
Proprietăţile structurale generale ale bistratului lipidic, cum e grosimea stratului
lipidic (măsurată ca distanţa medie dintre atomii de fosfor dintre cele două straturi),
sunt importante pentru a determina atât timpul necesar echilibrării acestuia, cât şi
parametri termodinamici (cum ar fi modulul izotermic de compresibilitate a suprafeţei
bistratului). Astfel, se observă uşor că pentru ajunge într-o stare de echilibru stabil
este nevoie de mai mult timp pentru sistemele cele mai complexe, şi mai puţin
pentru cele simple (vezi Fig. 9 şi 10). În cazul bistraturilor model pentru membrane
de mamifer, cel complex simetric şi asimetric (negru şi roşu) se comportă la fel, iar
cel ternar (verde) este foarte similar (44 Ǻ vs. 46 Ǻ şi 45 Ǻ, respectiv). Bistratul
simplu POPC (albastru în Fig. 9) este însă sensibil mai subţire (39 Ǻ). Pentru a
menţine avantajele unui model extrem de simplu (monostrat), dar şi pentru a pentru
a obţine (cel puţin la nivel mecanistic) comportamentul bistratului de mamifer cu
minimul necesar, am hotărât să studiem în profunzime modelele de mamifer (a)
POPC (simplu simetric) şi, respectiv (b) DPPC:DLiPC:CHOL 5:3:2 (ternar simetric).
Fig. 9. Grosimea bistraturilor de mamifer studiate
HEAL inSiDE – Etapa 1 18 / 36
Fig. 10. Grosimea bistraturilor bacteriene studiate
În cazul modelelor bistrat bacteriene am continuat, în mod similar cu cele de
mamifer, studiul aprofundat al modelelor bistrat simplu simetric (DOPC:DOPG 85:15)
şi complex simetric (PVPE:PVPG:PVCL2 90:5:5). Grosimile bistraturilor
corespunzătoare celor două modele (vezi Fig. 10) sunt uşor mai apropiate decât în
cazul modelelor de mamifer (39 Ǻ vs. 43 Ǻ).
HEAL inSiDE – Etapa 1 19 / 36
Legăturile de hidrogen
Una din analizele cele mai importante care indică gradul de reactivitate al unui bistrat
este studiul legăturilor de hidrogen inter- şi intra-lipidice [28]. Această analiză indică
legăturile de hidrogen intra-lipidice (legăturile de hidrogen pe care o moleculă le
formează cu ea însăşi) şi inter-lipidice (legăturile de hidrogen pe care o moleculă de
formează cu alte molecule). Pentru a înţelege în amănunţime comportamentul /
mecanismul dinamicii lipidice a bistraturilor propuse ca model, cea din urmă va fi
împărţită în ceea ce urmează în interacţiunile dintre molecule lipidice de acelaşi tip şi
în molecule lipidice de tipuri diferite. În figurile de mai jos este indicată frecvenţa
apariţiei legăturilor de hidrogen pe moleculă, pentru diferite lipide în diferite bistraturi.
Fig. 11. Legăturile de hidrogen în bistratul de mamifer simetric simplu (fosfatidilcolină)
Modelul cel mai simplu al unei membrane de mamifer, analizate şi folosite atât în
simulări, cât şi în experimente precedente [28, 29] este bistratul simetric cu
monocomponenta de fosfatidilcolină cu două cozi lipidice, una saturată (palmitoil –
16:0) şi una mononesaturată (oleoil – 18:1): POPC. Acesta l-am denumit bistratul de
mamifer simetric simplu. Numărul mic de legături de hidrogen pe molecula de POPC
(atât intra-, cât şi inter-molecular) indică un grad scăzut de reactivitate al bistratului
de POPC, în concordanţă cu rezultatele obţinute anterior [28].
HEAL inSiDE – Etapa 1 20 / 36
Fig. 12. Legăturile de hidrogen în bistratul de mamifer simetric ternar
(fosfatidilcoline + cholesterol)
Următorul model de complexitate care l-am folosit în acest studiu pentru modelele
membranare de mamifer, care prezintă acurateţe şi din punct de vedere al grosimii
bistratului, este bistratul lipidic cu compoziţie ternară DPPC:DLiPC:CHOL în
concentraţie 5:3:2. Legăturile de hidrogen studiate între capetele lipidice ale DPPC şi
DLiPC arată legături intra-lipidice pe moleculă rare, similare cu POPC (aprox. 5%),
dar cu stabilitate uşor mai ridicată. Legăturile de hidrogen inter-lipidice DPPC şi
DLiPC sunt mai puţine, dar cu stabilitate similară (şi la fel şi cu POPC), evidenţiând
importanţa capetelor lipidice la fel (PC-uri) în formarea acestor legături. Deşi
mobilitatea DPPC-urilor este mai mică faţă de cea a DLiPC-urilor, acestea au
legături inter-moleculare mai instabile.
HEAL inSiDE – Etapa 1 21 / 36
Fig. 13. Legăturile de hidrogen în bistratul bacterial simetric simplu
(fosfolipide neutre + încărcate)
Cel mai simplu model de bistrat lipic bacterian folosit are două componente (un
fosfolipid neutru – fosfatidilcolină şi unul încărcat negativ – fosfatidilglicerol).
Amândouă cozile lipidice folosite au fost simplu nesaturate în aceeaşi poziţie (oleoil
– 18:1). Analiza rezultatelor legăturilor de hidrogen indică faptul că DOPG-urile nu
formează aproape deloc legături inter-moleculare (datorată şi concentraţiei scăzute –
15%). DOPC-urile formează legături inter-moleculare similare cu DLiPC-urile şi
POPC-urile, indicând importanţa capetelor lipidice. Pe de altă parte însă fiecare al
doilea DOPG formează legături intra-moleculare, indicând un grad extrem de ridicat
de reactivitate, datorat sarcinii capului lipidic PG. Această activitate se reflectă în
conexiunile şi cu vecinii de alt tip (DOPC) cu care formează legături de hidrogen
(aproximativ 10% din moleculele din bistrat).
HEAL inSiDE – Etapa 1 22 / 36
Fig. 14. Legăturile de hidrogen în bistratul bacterial simetric ternar
(fosfolipide (neutre + încărcate) + cardiolipină)
Nivelul următor de complexitate folosit în a modela bistratul bacterian a fost cu trei
tipuri de molecule, toate având aceleaşi cozi lipidice: PV (similar cu PO, dar
nesaturaţia este cu două poziţii mai spre centrul bistratului V vs. O). PVPCL2-ul sunt
două cardiolipine legate şi împreună cu PVPG-ul prezintă un comportament similar
din punct de vedere al legăturilor de hidrogen mai ales datorită faptului că împreună
reprezintă doar 10% din moleculele din bistrat. Datorită sarcinii capetelor lipidice
stabilitatea acestora e crescută şi rămâne prezentă în toată simularea pentru ambele
molecule. PVPE-urile prezintă o legături de hidrogen intra-moleculare pe moleculă
uşor mai puţine, dar cu frecvenţă similară. Ca şi în cazul PG-urilor la membrana
simplă, concentraţia scăzută a moleculelor încărcate elimină practic formarea
legăturilor de hidrogen între acestea, însă se poate observa că aproximativ 10% din
molecule (ca în modelul simplu) formează legături de hidrogen inter-moleculare.
Fiecare al doilea PVPE formează legături inter-moleculare, cu frecvenţă destul de
ridicată. Având în vedere că acestea reprezintă 90% din bistrat, aceasta dă un nivel
ridicat de reactivitate al membranei model.
HEAL inSiDE – Etapa 1 23 / 36
Concluzii
Ca primă activitate în cadrul etapei 1 al acestui proiect am urmărit construirea unei
varietăţi de sisteme biomoleculare care să modeleze în diferite grade de detaliu
membranele plasmatice de mamifer şi bacteriene. Aceasta s-a realizat prin
construirea la început a 4 modele membranare de mamifer de mărimi diferite sub
forma unor bistraturi lipidice, după cum urmează: simplă simetrică, complexă
simetrică, simplă asimetrică şi complexă asimetrică (Act.1.2.1).
Apoi a fost urmărită dinamica acestora chiar şi până la 300 ns pentru a analiza
evoluţia, stabilitatea structurală şi reactivitatea acestora (Act.1.2.2), urmărind
grosimea bistratului lipidic, distribuţia atomilor/grupurilor de atomi din bistrat, precum
şi legăturile de hidrogen intra-/inter-lipidice. În urma acestor analize am propus
folosirea modelului simplu simetric (format din POPC) şi a celui ternar simetric
(format din DPPC:DLiPC:CHOL în concentraţie 5:3:2). În mod similar am propus 2
modele şi pentru membrana plasmatică bacteriană: modelul simplu simetric (format
din DOPC:DOPG în concentraţie 85:15) şi modelul ternar simetric (format din
PVPE:PVPG:PVCL2 în concentraţie 90:5:5) (Act.1.2.3).
HEAL inSiDE – Etapa 1 24 / 36
3.3. Simulări coarse-grained
Scopul simulărilor semi-atomistice (coarse-grained) au fost să extindă cele
atomistice la o scară mai mare (microsecunde) pentru a obţine validarea modelelor
atomistice şi propunerea modelelor moleculare (simple şi complexe), atât bacteriene,
cât şi atomistice ce vor fi folosite în simulările de peptide din cadrul acestui proiect.
Metode
Construcţia membranei.
Tab. 3. Detalii simulări. Componenţa lipidică a bistraturilor folosite în simulările coarse-grained.
COARSE-GRAINED MAMIFER
simplu (bistrat simetric) strat superior strat inferior fosfatidilcolină
POPC 961 961 ternar (bistrat simetric) strat superior strat inferior
fosfatidilcoline + colesterol DPPC 400 400 DIPC 288 288 CHOL 192 192
BACTERIAN simplu (bistrat simetric) strat superior strat inferior
fosfolipide neutre + încărcate DOPC 765 765 DOPG 135 135
ternar (bistrat simetric) strat superior strat inferior fosfolipide (neutre + încărcate)
+ cardiolipină
PVPE 810 810 PVPG 45 45 PVCL2 45 45
Modelele membranare plasmatice folosite în simulările coarse-grained (vezi Fig. 15)
sunt cele asupra cărora s-a decis aprofundarea studiului (simetrice simple/ternare)
de mamifer şi bacteriene (vezi Tab. 3). Coordonatele iniţiale din fişierele de input
au fost generate având ca referinţă structurile atomistice ale lipidelor. Raportul
compoziţiei lipidice din modelele coarse-grained este acelaşi cu cel din modelele
atomistice.
HEAL inSiDE – Etapa 1 25 / 36
Fig. 15. Reprezentări coarse-grained ale sistemelor model alese: (sus) de mamifer
(stânga) simetric simplu (fosfatidilcolină) – POPC(mov); (dreapta) simetric ternar (fosfatidilcoline+cholesterol) – DPPC (albastru), DLiPC (roz), CHOL (alb) şi (jos) bacteriene (stânga) simetric simplu (fosfolipide neutre+încărcate) –
DOPC(verde), DOPG(magenta); (dreapta) simetric ternar (fosfolipide (neutre+încărcate)+cardiolipină) – PVPE (cyan), PVPG (galben), PVCL2 (albastru)
Construcţia sistemului.
Sistemele coarse grained au fost solvatate (MARTINI water [11]) şi neutralizate cu
ajutorul ionilor de sodiu şi clor pentru a avea concentraţia molară de 0.15 mol/L.
Câmpul de forţe.
Câmpul de forţe MARTINI [11] a fost folosit în toate simulările coarse-grained.
HEAL inSiDE – Etapa 1 26 / 36
Protocoale de simulare.
Programul Gromacs versiunea 5.1.4 a fost utilizat în toate simulările efectuate,
folosind un pas de integrare de 20 de fs. Un ansamblu NPT a fost folosit la 1 bar şi
301 K. Presiunea constantă a fost menţinută de o cuplare slabă semi-izotropă,
folosind un timp de relaxare de 12 ps. Temperatura constantă a fost menţinută prin
cuplarea separată a proteinei cu membrana şi a apei cu ionii la o baie termică de
301 K folosind un timp de relaxare de 1 ps. Dupa minimizarea şi echilibrarea
membranelor, fiecare simulare a fost rulată un timp efectiv de 32 µs (4 ori mai mare
decât timpul de simulare). Detalii despre sisteme (mărimea sistemelor/timpul de
simulare) sunt sintetizate în Tabelul 4.
Tab. 4. Detalii de simulare. Mărimea sistemelor/timpul de simulare. COARSE-GRAINED MAMIFER Componenţă bistrat Număr particule Timp simulare POPC 37470 8 µs DPPC:DIPC:CHOL 35326 8 µs
BACTERIAN Componenţă bistrat Număr particule Timp simulare DOPC:DOPG 34854 8 µs PVPE:PVPG:PVCL2 37602 8 µs
HEAL inSiDE – Etapa 1 27 / 36
Rezultate şi discuţii
Distribuţiile grupurilor de bead-uri
Distribuţiile grupurilor de bead-uri coarse-grain (CG) au fost determinate cu ajutorul
plugin-ului de analiză Density Profile Tool [23] din programul VMD [8]. Distribuţia
grupurilor de atomi de-a lungul normalei la membrană au fost obţinute împărţind
membrana în felii de 1 Å grosime. Centrul bistratului lipidic este situat la z=0, fiind
reprezentate profilele separat pentru cele 2 straturi.
Fig. 16. Distribuţia bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul normalei la
membrană pentru bistrat de mamifer simetric simplu (fosfatidilcolină)
Primul bistrat lipidic de mamifer considerat este cel simplu, care are în componenţă
lipide POPC. Distribuţiile indică că apa pătrunde în bistratul lipidic până la regiunea
unde sunt situate grupările glicerol, cozile lipidice formate din grupările metil fiind
hidrofobe (vezi Fig. 16). Acestea sunt în concordanţă foarte bună cu distribuţiile
obţinute din simulările atomistice (vezi Fig. 3).
HEAL inSiDE – Etapa 1 28 / 36
Fig. 17. Distribuţia grupurilor de bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul
normalei la membrană pentru bistrat de mamifer simetric ternar (fosfatidilcoline + cholesterol)
Bistratul lipidic terţiar este varianta complexă considerată. În Fig. 17 este
reprezentată distribuţia grupurilor de bead-uri CG aferente bistratului de mamifer
simetric format din lipidele DPPC, DLiPC şi colesterol. Moleculele de cholesterol
sunt situate mai adânc în bistrat, în comparaţie cu fosfatidilcolinele. În plus faţă de
simulările atomistice, gruparea sterol a colesterolului se regăseşte şi în centrul
bistratului. Aceasta se datorează aranjării acestei molecule între cele două straturi şi
chiar a migrării lor dintr-un strat în celălalt, fenomen care nu se poate observa pe
scale de timp mici (sub microseconde) explorate la nivel atomistic. Lipidele DPPC au
2 lanţuri saturate fiind prezente doar legături simple, spre deosebire de lipidele
DLiPC care prezintă lanţuri nesaturate. Astfel, distribuţiile grupărilor CG regăsesc pe
cele atomistice şi explorează la scale mari de timp şi conformaţii neexplorabile de
către simulările atomistice.
HEAL inSiDE – Etapa 1 29 / 36
Fig. 18. Distribuţia bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul normalei la membrană
bistrat bacterial simetric simplu (fosfolipide neutre + încărcate)
Un model consacrat alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) folosit în simulări
atomistice pentru a studia membrana plasmatică a E. coli. a fost bistratul (DOPC şi
DOPG). Am reprodus simulările atomistice la nivel CG cu lipidele în aceeaşi
concentraţoe 85:15 (vezi Fig. 18). Distribuţia grupurilor de atomi de-a lungul normalei
la membrană este în concordanţă cu cele obţinute din simulările atomistice (Fig. 7).
HEAL inSiDE – Etapa 1 30 / 36
Fig. 19. Distribuţia bead-urilor/grupurilor de bead-uri de-a lungul normalei la membrană
bistrat bacterial simetric ternar (fosfolipide (neutre + încărcate) + cardiolipină)
Modelul ternar bacterian alcătuit din fosfolipide (neutre + încărcate) şi cardiolipină
(CL), stabilit în simulările atomistice pentru a modela membrana plasmatică E. coli.,
a fost realizat cu un bistrat simetric PVPE:PVPG:PVCL2 90:5:5. Simulările CG arată
că distribuţia bead-urilor reproduce din nou foarte bine (vezi Fig. 19) pe cele din
simulările atomistice (Fig. 8).
HEAL inSiDE – Etapa 1 31 / 36
Concluzii
În cadrul acestei subsecţiuni am folosit câmpul de forţe semi-atomistic / molecular /
coarse-grained (CG) Martini pentru a putea extinde simuările atomistice la sisteme
cu un ordin de mărime mai mari şi scale de timp 2-3 ordine de mărime. Acestea sunt
necesare pentru a putea explora acţiunea peptidelor asupra modelelor membranare
la aceste scale de timp. Astfel, aceste modele trebuie să valideze modelele
atomistice prin verificarea stabilităţii structurale folosind distribuţia de bead-uri şi
compararea acestora cu distribuţia grupurilor de atomi din simulările atomistice.
Rezultatele simulările CG au arătat că: (i) câmpul Martini este adecvat pentru
folosirea simulărilor CG la scale de timp extinse; (ii) modelele CG păstrează
stabilitatea structurală a modelelor atomice propuse la subsecţiunea precedentă,
validând aceste 4 modele (câte una simplă şi una complexă pentru membrane
plasmatice model de mamifer şi bacteriene) (Act.1.2.4).
HEAL inSiDE – Etapa 1 32 / 36
� 4. Concluzii etapă
Secţiunea corespunzătoare raportului ştiinţific (3) a atins toate activităţile ştiinţifice
propuse în cadrul etapei 1, ajungând la următoarele concluzii:
• s-au folosit modele iniţiale atomistice multiple (de la cele mai simple la
cele mai complexe) şi s-au rulat peste 1.2µs de simulări pentru a stabili
modelele ce vor fi folosite în identificarea peptidelor antimicrobiene.
• în urma unei analize complexe a simulărilor atomistice am propus două
modele pentru membrana de mamifer: (i) simplă simetrică (bistrat
POPC) şi (ii) ternară simetrică (bistrat DPPC:DLiPC:CHOL 5:3:2) şi
două modele pentru membrana plasmatică bacteriană: (i) simplă
simetrică (bistrat DOPC:DOPG 85:15) şi (ii) ternară simetrică (bistrat
PVPE:PVPG:PVCL2 90:5:5).
• modelele propuse au fost validate structural prin simulări semi-
atomistice / coarse-grained folosind câmpul de forţe Martini pe sisteme
cu un ordin de mărime mai mari şi pe scale de timp 2-3 ordine de
mărime mai mari.
Rezultatele favorabile obţinute în prima etapă permit proiectul să avanseze la
activităţile din etapele următoare.
HEAL inSiDE – Etapa 1 33 / 36
� 5. Diseminări etapă
Conferinţe internaţionale
1. M. Bacalum, M. Radu, I. Turcu, ”In silico studies on the dynamics and
energetics of histidine-modulated arginine- and tryptophan-based peptides in
membrane models”, International Conference on Analytical and
Nanoanalytical Methods for Biomedical and Environmental Sciences (IC-
ANMBES), 23-25 May 2018, Braşov, Romania.
(prezentare poster)
2. L. Janosi, G. Necula, M. Bacalum, M. Radu, I. Turcu, ”Molecular modeling of
histidine-modulated arginine-/ tryptophan-based peptides: dynamics and
energetics”, 15th National Conference of Biophysics (CNB), 7-10 September 2018, Bucureşti, Romania.
(prezentare poster)
HEAL inSiDE – Etapa 1 34 / 36
� 6. Bibliografie
[1] WHO, Antimicrobial resistance: global report on surveillance, WHO Lib.Cat.-in-Pub.Data (2014).
[2] Silver, L.L., Clin. Microbiol. Rev., Challenges of antibacterial discovery, 24 71 (2011).
[3] Hancock, R.E., H.G. Sahl, Nat. Biotechnol., Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies, 24, 1551 (2006).
[4] Fosgerau, K., T. Hoffmann, Drug Discov. Today, Peptide therapeutics: current status and future directions, 20, 122 (2015).
[5] Fjell, C.D., J. A. Hiss, R. E. Hancock, G. Schneider, Nat. Rev. Drug Discov., Designing antimicrobial peptides: form follows function, 11, 37 (2012).
[6] J. C. Phillips, R. Braun, W. Wang, J. Gumbart, E. Tajkhorshid, E. Villa, C. Chipot, R. D. Skeel, L. Kale, K. Schulten, J. Comput. Chem., Scalable molecular dynamics with NAMD.26, 1781 (2005).
[7] H.J.C. Berendsen, D. van der Spoel and R. van Drunen, Comput. Phys. Commun., GROMACS: A Message-Passing Parallel Molecular Dynamics Implementation, 91 (1995) 43.
[8] W. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten, J. Molec. Graphics, VMD: Visual molecular dynamics,14 (1996) 33.
[9] J. B. Klauda, R.M. Venable, J.A. Freites, J.W. O’Connor, D.J. Tobias, C. Mondragon-Ramirez, I. Vorobyov, A.D. MacKerell, Jr., R.W. Pastor, Update of the CHARMM all-atom additive force field for lipids: validation on six lipid types, J. Phys. Chem. B, 114 (2010) 7830.
[10] R.M. Venable, A.J. Sodt, B. Rogaski, H. Rui, E. Hatcher, A.D. MacKerell, Jr., R. W. Pastor, J.B. Klauda., Biophys J., CHARMM All-Atom Additive Force Field for Sphingomyelin: Elucidation of Hydrogen Bonding and of Positive Curvature, 107(1) (2014), 134.
[11] S. J. Marrink, H.J. Risselada, S. Yefimov, D.P. Tieleman and A. H. de Vries, J. Phys. Chem. B, The MARTINI Force Field: Coarse Grained Model for Biomolecular Simulations, 111 (2007) 7812.
[12] Semen O. Yesylevskyy, Lars V. Schäfer, Durba Sengupta, and Siewert J. Marrink, PLoS Comp. Biol., Polarizable Water Model for the Coarse-Grained MARTINI Force Field, 6(6) (2010), e1000810
[13] S.J. Marrink, A.H. de Vries, T.A. Harroun, J. Katsaras, S.R. Wassall, J. Am. Chem. Soc., Cholesterol shows preference for the interior of polyunsaturated lipid membranes, 130(1) (2008),10.
HEAL inSiDE – Etapa 1 35 / 36
[14] H.J. Risselada, S.J. Marrink, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., The molecular face of lipid rafts in model membranes, 105(45) (2008), 17367.
[15] C.A. Lopez, Z. Sovova, F.J. van Eerden, A.H. de Vries, S.J. Marrink, J. Chem. Theory Comput., Martini force field parameters for glycolipids, 9(3) (2013), 1694.
[16] H.I. Ingólfsson, M.N. Melo, F.J. van Eerden, C. Arnarez, C.A. López, T.A. Wassenaar, X. Periole, A.H. De Vries, D.P. Tieleman, S.J. Marrink, J. Am. Chem. Soc., Lipid organization of the plasma membrane, 136(41) (2014), 14554.
[17] G. van Rossum and J. de Boer, CWI Quarterly, Interactively Testing Remote Servers Using the Python Programming Language, 4 (1991), 283.
[18] E.L. Wu, X. Cheng, S. Jo, H. Rui, K.C. Song, E.M. Dávila-Contreras, Y. Qi, J. Lee, V.Monje-Galvan, R.M. Venable, J.B. Klauda, W. Im, J. Comput. Chem., CHARMM-GUI Membrane Builder Toward Realistic Biological Membrane Simulations, 35 (2014), 1997.
[19] Jorgensen, W. L.; Chandrasekhar, J.; Madura, J. D.; Impey, R. W.; Klein, M. L. J. Chem. Phys., Comparison of simple potential functions for simulating liquid water, 79 (1983) , 926.
[20] U. Essmann, L. Perera, M. L. Berkowitz, T. Darden, H. Lee, L. G. Pedersen, J. Chem. Phys., A smooth particle mesh Ewald method, 103 (1995), 8577.
[21] S. E. Feller, Y. Zhang, R. W. Pastor, J. Chem. Phys., Constant pressure molecular dynamics simulation: The Langevin piston method, 103 (1995), 4613.
[22] G. J. Martyna, D. J. Tobias, M. L. Klein, J. Chem. Phys., Constant pressure molecular dynamics algorithms, 101 (1994), 4177.
[23] Giorgino T., Comput. Phys. Comm., Computing 1-D atomic densities in macromolecular simulations: The density profile tool for VMD, 185(1) (2014) 317.
[24] N. Kucerka, Y. F. Liu, N. J. Chu, H. I. Petrache, S. T. Tristram, J. F. Nagle, Biophys. J., Structure of fully hydrated fluid phase DMPC and DLPC lipid bilayers using X-ray scattering from oriented multilamellar arrays and from unilamellar vesicles, 88 (2005) 2626.
[25] K. Gawrisch, H. C. Gaede, M. Mihailescu, S. H. White, Eur. Biophys. J., Hydration of POPC bilayers studied by 1H-PFG-MAS-NOESY and neutron diffraction, 36 (2007) 281.
[26] M. C. Phillips, E. G. Finer, H. Hauser, Biochim. Biophys., Differences between conformations of lecithin and phosphatidylethanolamine polar groups and their effects on interactions of phospholipid bilayer membranes, 290 (1972), 397.
[27] H. Heller, M. Schaefer, J. Phys. Chem., Molecular dynamics simulation of a bilayer of 200 lipids in the gel and in the liquid crystal phase, 97, (1993) 8343.
HEAL inSiDE – Etapa 1 36 / 36
[28] L. Janosi, A. A. Gorfe, J. Chem. Theory Comput., Simulating POPC and POPC/POPG Bilayers: Conserved Packing and Altered Surface Reactivity, 6(10) (2010), 3267.
[29] Kucerka, N.; Tristram-Nagle, S.; Nagle, J. F., J. Membr. Biol., Structure of fully hydrated fluid phase lipid bilayers with monounsaturated chains, 208 (2005), 193.
Director de proiect Data: 30.11.2018
Dr. Lorant JANOSI