Pruebas Bioquímicas.2

MC JEANETT CHÁVEZ ONTIVEROS

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 1

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOAFACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICASLICENCIATURA EN INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Culiacán, Sinaloa.

MC JEANETT CHAVEZ ONTIVEROS

Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Enterobacterias

Indol

Rojo de Metilo

Vogues Proskauer

Citrato como única fuente de carbono

Fermentación de hidratos de carbono

Descarboxilasa

Fenil-Alanina desaminasa

Citocromo-oxidasa

Reducción de nitratos

Ortonitrofenil galactósido

Indol

M di R tiCaldo de triptófano (1% Trp)

Es uno de los productos de la degradación metabólica del triptófano, el cual surge por la hidrólisis del mismo con la ayuda de la enzima

triptofanasa.

Medios y Reactivos.- Reactivo de Kovac (Soln. Acidificada de p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol isoamílico)

Reactivo de Ehrlich

Interpretación.-

Positiva: Color fucsia brillante en la interfase del reactivo.

Negativa: Un anillo amarillo

Control.-Control positivo: E. coli

Control negativo: Klebsiella pneumoniae



Rojo de Metilo

Prueba cuantitativa de la producción de ácidos que requiere que los m.o produzcan ácidos fuertes (láctico, acético y fórmico) a partir de glucosa, por la vía de fermentación de ácidos mixtos

Principio.-

Medios y Reactivos.-

Caldo Rojo de Metilo-Voges-Proskauer (RM/VP)

Indicador Rojo de MetiloInterpretación.-

Positiva: Aparición de color rojo en la superficie del medio

vía de fermentación de ácidos mixtos.

Positiva: Aparición de color rojo en la superficie del medio

Negativa: Puede producir un color anaranjado

Controles.-

Control Positivo: E. coli

Control Negativo: Enterobacter aerogenes

Voges- Proskauer

Medios y Reactivos.-

Medio

Principio.-

El ácido pirúvico es un compuesto formado de la degradación de la glucosa

Medio.-

Caldo RM/VP

Reactivos.-

Alfa-naftol (5%)

Alcohol etílico absoluto

Hidróxido de potasio (40%)

Se degrada a acetoína (acetilmetilcarbinol)vía butanodiólica

Acetoína + O2 + KOH (40%) Diacetilo (rxna. Guanidina y/o arginina) alfa-naftol

(5% EtOH)

Interpretación.-

Positiva: Aparición de un color rojo 15 minutos o más después del agregado de los reactivos

Negativa: No aparece coloración roja, puede aparecer color cobre

Rojo

Prueba Positiva Prueba Negativa

CitratoCitrato• Prueba verifica:

• Uso de citrato como única fuente de C• Uso de citrato como única fuente de C• Uso de compuestos amoniacales como fuente de N

• Se cultivan en agar citrato de Simmons (Citrato de sodio y (NH3)3PO4; azul de bromocresol)bromocresol)

• Si es positiva habrá una alcalinización del medio.



IMViCIMViC• (E.coli ++--) (Enterobacter --++)• (Salmonella -+-+ ) (Citrobacter -+-+)

Fermentación de Carbohidratos (Caldo Rojo de Fenol)

Hidratos de Carbono

Glucosa

Sacarosa

Lactosa

Rojo de Fenol

pH < 6.8 pH > 7.4

Amarillo Roja-Rosado

Interpretación.-

Amarillo

POSITIVO

Amarillo/ gas

NEGATIVO

No hay cambio en la No hay cambio en la coloración Rojo-rosado oscuro



Fermentación de AzúcaresGlucosa

Organismo Resultado del test1) Control Negativo2) S. aureus Ácido3) P. vulgaris Ácido, gas4)P. aeruginosa Negativo5) E. coli Ácido, gas

Sacarosa

Organismo Resultado del test

1) Control Negativo

2) S. aureus Ácido

3) P. vulgaris Ácido, gas

4)P. aeruginosa Negativo

5) E. coli Negativo

Lactosa

Organismo Resultado del test

1) Control Negativo

2) S. aureus Ácido

3) P. vulgaris Negativo

4)P. aeruginosa Negativo

5) E. coli Ácido, gas

Medio universalmente Medio universalmente empleado para la empleado para la diferenciación de diferenciación de enterobacteriasenterobacterias, en base , en base enterobacteriasenterobacterias, en base , en base a la fermentación de a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido y a la producción de ácido sulfhídrico. sulfhídrico.



Agar TSI (Triple Sugar Iron)

Diferentes pruebas sobre agar TSI

•• SiSi lala bacteriabacteria problemaproblema fermentafermenta lala glucosa,glucosa,acidificaráacidificará elel mediomedio haciendohaciendo virarvirar aa amarilloamarillo elelindicadorindicador enen elel fondofondo deldel tubo,tubo, mientrasmientras queque sisi nonoeses fermentadorafermentadora dede glucosa,glucosa, elel mediomedio permanecerápermanecerádede colorcolor rojorojo..

•• SiSi lala bacteriabacteria problemaproblema fermentafermenta lactosalactosa y/oy/of áf á ffsacarosa,sacarosa, acidificaráacidificará elel mediomedio enen susu superficiesuperficie

volviéndolovolviéndolo dede colorcolor amarillo,amarillo, mientrasmientras queque sisi nono loloes,es, lala superficiesuperficie deldel mediomedio continuarácontinuará dede colorcolorrojorojo..

• Si produce ácido sulfhídrico (debido a la reducción de las sales de hierro), se presentará un ennegrecimiento del tubo.

La producción de sulfhídrico y el consiguiente ennegrecimiento pueden impedir ver la fermentación de la glucosa (fondo amarillo), perofermentación de la glucosa (fondo amarillo), pero este hecho implica directamente que la bacteria es fermentadora de glucosa.

•• Si aparece rotura o desplazamiento del medio, Si aparece rotura o desplazamiento del medio, significa que la bacteria es productora de gas. significa que la bacteria es productora de gas.

Fermentación de azúcares (TSI)

Resultados (slant/butt)

Símbolo Interpretación

1)No cambio/ no cambio

NC/NC No Fermentación

2)Amarillo/amarillo con burbujas

A/A Fermentación de glucosa y lactosa y/o sacarosa, con producción de gas

3)? Rojo/amarillo con precipitado

negro

? NC/A ? Fermentadora de glucosa

4)Amarillo/amarillo i it d

? ?con precipitado

negro5)Rojo/Rojo ? No fermentación,

peptona catabolizada

1 2 3 4 5



Ejemplo de la Fermentación de Carbohidratos en microorganismos

¿Qué azúcares fermentan Shigella s. y E. coli?

Fermentación de azúcares (Lactosa Agar Mac Conkey)

UREASA

C

O

NH22HN

Urea

22

C

O

NH22HN + 2HOH CO2 + H2O + 2NH3

Ureasa

Principio

(NH4)2CO3

Materiales y Reactivos

Caldo Urea de Stuart Agar Urea de Christensen

Extracto de levadura

0,1g Peptona 1g

Glucosa 1g

Fosfato monopotásico

9,1g

Fosfato disódico 9,5g

Urea 20g

Rojo de Fenol 0,01g

Cloruro de sodio 5g

Fosfato monopotásico

2g

Urea 20g

Rojo de fenol 0,012g

Agar 15g



Procedimiento1) Inoculación

2) Incubación

3) Interpretación de

35ºC / 18-24 hrs.

3) Interpretación de resultados

Interpretación de Resultados

Caldo Stuart

Positivo Coloración roja

NegativoNo existe cambio en

la coloración

Agar Christensen

Positivo

Hidrolizado lento.-

Hidrolizado rápido.- Color rojo en el medio

Color rojo solo en un principio solo en el pico de flauta, pero luego se torna en todo el tubo

Agar Christensen

Negativo

p

Hidrolizado lento.-

Hidrolizado rápido.-

Color rojo en el medio

Color amarillo original

Color amarillo original

Controles

Control Positivo Proteus

Control Negativo

Proteus

E. coli

Fenil- Alanina Desaminasa

Enterobacteriaceae

Proteus

Morganella

Providencia

Morganella



Materiales y Reactivos

Agar Fenil Alanina

DL Fenilalanina 2g

Extracto de Levadura 3g

Cloruro de Sodio 5gAgar Fenil - Alanina

Fosfato de Sodio 1g

HCl concentrado 2,5 ml

Agar 12g

Cloruro Férrico 12g

Agua Destilada 100ml

ProcedimientoInoculación del pico de flauta

Incubación

Se agregan de 4 a 5 gotas de cloruro férrico

35ºC/18-24 hrs

Se gira el tubo

Interpretación

InterpretaciónPositiva

Negativa

Coloración verde

No hay cambio de Negativa ycoloración

Controles

Control positivo.- Especies de Proteus

Control negativo.- E. coli

Decarboxilasas

Lisina

Ornitina

Cadaverina

Putrescina

Arginina Citrulina

Medios y ReactivosPeptona 5g

Extracto de carne 5g

Púrpura de bromocesol 0,01g

Rojo de cresol 0,005g

Glucosa 0,5g

Piridoxal 0,005g

Agua destilada 1 l



ProcedimientoInoculación de 2 tubos1)

Medio Moeller (control) Medio Moeller + Aminoácido

Se cubren con aceite mineral estéril

2)1 cm por encima de la

superficie

3) Incubación (35ºC/18-24hrs)

Interpretación

Positiva.- Indica un vire de color azul-púrpura

Negativa.- No existe cambio de coloracióng

Control

Aminoácido Control Positivo Control Negativo

Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae

Ornitina Enterobacter cloacae Especies de Klebsiella

Arginina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes

Figura 1. CADENA RESPIRATORIA (5 complejos).

Citocromo Oxidasa

CITOCROMO-OXIDASA



SE ENCUENTRA EN:

o Microaerófilos

o Anaerobios Facultativos

La prueba de la oxidasa es importante para identificar microorganismos que carecen de

la enzima o son anaerobios obligados.

MEDIOS Y REACTIVOS

• CLORHIDRATO DE TETRAMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE KOVAC)1% (REACTIVO DE KOVAC)

• CLORHIDRATO DE DIMETIL-P-FENILENDIAMINA, 1% (REACTIVO DE GORDON Y MCLEOD)

REACCIÓN

Cit crd IncoloroCit crd IncoloroCit cox Azul (azul de indofenol)



REACTIVO DE KOVAC

vs

REACTIVO DE GORDON Y REACTIVO DE GORDON Y McLEOD

Ventajas del reactivo de Kovac

• Estabilidad durante el almacenamiento

• Mas sensible para la detección de citocromo-oxidasa

M ó i• Menos tóxico

PROCEDIMIENTODirecta Indirecta

2 o 3 gotas de reactivo se agregan directamente en colonias bacterianas aisladas en un medio en placa.

Se agregan unas pocas gotas del reactivo a una tira de papel de filtro o se usan tiras o discos comerciales impregnados con reactivo p gdesecado.

INTERPRETACIÓN

10 s Las colonias que tienen actividad de citocromo-oxidasa desarrollan un color azul oscuro en el sitio de inoculación en 10 s.

10 – 60 s Debe evaluarse aún más porque probablemente no pertenezca a la familia Enterobacteriaceae.



No deben usarse asas o alambres de o alambres de

inoculación de acero inoxidable o Nichrome

para esta prueba.

CONTROLESControl Positivo Pseudomonas

aeruginosa

Control Negativo Escherichia coli

Propósito

Reducción de Nitratos

Este examen detecta la habilidad de un organismo para reducir nitratos (NO3) a nitritos (NO2) o algunos otros compuestos

nitrogenados, tales como nitrógeno molecular (N2), usando la enzima nitrato reductasa.



Reactivo A Ácido Sulfanílico 8g

ÁÁcido acético (5N), 30%

1L

Reactivo B α-naftalamina 8g

Ácido acético (5N), 30%

1L

CALDO DE NITRATO O AGAR NITRATO (PICO DE FLAUTA)

Extracto carne 3gExtracto carne 3g

peptona 5g

Nitrato de potasio (KNO3) 1g

Agar (sin nitritos) 12g

Agua destilada 1L

PROCEDIMIENTO

Inoculación

Incubación(a 35°C,

18 a 24 horas)

Agregar 1mL de cada uno

de los reactivos A y B



El polvo de zinc se agrega a los tubos cuyo resultado parezca ser negativo (siga siendo claro).

CONTROLES

CONTROL POSITIVO

E. coli

CONTROL NEGATIVO

Acinetobacter calcoaceticus

Ortonitrofenil Galactósido



β-Galactosidasa

Lactosa permeasa

CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS (criterio ONPG TEST)

Bacterias no fermentadoras de lactosa

Son incapaces de producir ácidos a partir de lactosa.

Bacterias no fermentadoras de Dan una prueba positiva de lactosa (carecen de permeasa,

pero si poseen β-galactosidasa)ONPG.

Fermentadores tardíos de lactosa Poseen una actividad permeasa Fermentadores tardíos de lactosa Poseen una actividad permeasa lenta.

Fermentadores normales Dan una prueba positiva de OMPG rápida.

PROCEDIMIENTOAsa de crecimiento

Bacteriano + 0.5 mL de solución fisiológica

Se agrega una gota de toluenogota de tolueno

Mezclar durante unos s

A l ióAgregar soluciónONPG amortiguadora

Baño de agua a 37°C



Agar-hierro de Kligler MEDIO RICO EN

LACTOSA(KIA)

Agar-hierro-triple-azúcar (TSI)(TSI)

Fosfato de sodio buffer,1M, pH7

O-nitrofenil-β-galactósido (ONPG), 0.75 M

REACTIVOSSolución Fisiológica

Tolueno

INTERPRETACIÓN

5-10 min Algunos.

El color amarillo por lo común es evidente.

1 hora La mayoría.

24 horas Las reacciones no deben interpretarse p

como negativas hasta después de 24 horas

de incubación.

CONTROLES

CONTROL POSITIVO E. coli

CONTROL NEGATIVO Proteus



http://www.uprm.edu/biology/cursos/micro/pruebas.htm

• http://html.rincondelvago.com/pruebas-bioquimicas.html

• http://images.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.troybio.com/images/Product_Images_BBL/MCONKEY-ECOLI.gif&imgrefurl=http://www.troybio.com/images/Product_Images_BBL/BBL.htm&h=1648&w=1629&sz=745&tbnid=fOb6kWI8BPcJ:&tbnh=150&tbnw=148&hl=es&start=14&p=fOb6kWI8BPcJ:&tbnh=150&tbnw=148&hl=es&start=14&prev=/images%3Fq%3Dagar%2Bmac-conkey%26svnum%3D10%26hl%3Des%26lr%3D

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