PRUEBAS BIOQUMICAS I. METABOLISMO HIDROCARBONADOEn la mayora de las clulas es de gran importancia el catabolismo de los carbohidratos, gran parte de los microorganismos oxidan azcares para obtener la energa necesaria para la vida celular. En la gran mayora de las bacterias se nutren de sustancias orgnicas que proceden de otros seres vivos, estas son las bacterias llamadas hetertrofas. Otras bacterias se nutren de sustancias orgnicas que sintetizan a partir de sustancias inorgnicas. Estas son llamadas auttrofas. La ruptura de las molculas de carbohidratos es lo que realizan los microorganismos para obtener energa. Tambin catabolizan algunos lpidos y protenas. Para producir energa a partir de la glucosa, que es el carbohidrato utilizado por los microorganismos, stos siguen dos procesos, la respiracin o la fermentacin. La primera etapa de la degradacin de la glucosa es la oxidacin de sta a cido pirvico; este proceso se llama gluclisis.

CONTENIDO(Ctrl + Clic para seguir el vnculo)

Utilizacin de azcares (disacridos, hexosas y pentosas)............................................2 Prueba de la oxidacin-fermentacin de Hugh y Leiffson..............................................4 Prueba de screening de produccin de cido y gas.......................................................9 Prueba de la -D-galoctosidasa (ONPG)......................................................................11 Prueba del Rojo de Metilo...............................................................................................14 Prueba de Voges-Proskauer...........................................................................................16 Fermentacin de la glucosa............................................................................................18 Hidrlisis de la esculina...................................................................................................20

UTILIZACION DE AZUCARES (disacaridos, hexosas y pentosas).

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La posibilidad de que un microorganismo utilice estos compuestos como fuente de energa depende de la presencia y especificidad de enzimas apropiadas. Muchos microorganismos utilizan disacridos para desarrollarse; en general, estos son convertidos antes en los monosacridos que los forman por accin de enzimas especficas. MATERIAL. Mechero. Asa bacteriolgica. Gradilla 16 tubos, con tubos Durham, conteniendo caldo rojo fenol ms el carbohidrato (4 con lactosa, 4 con maltosa, 4 con glucosa y 4 con sacarosa). Cultivo de microorganismos.

TECNICA. 1. Colocar en la gradilla los tubos con los diferentes azcares, distribuidos en cuatro series de 4 tubos. Cada serie debe incluir los 4 azcares a probar. 2. Inocular las 3 primeras series con el microorganismo problema. 3. La serie 4 se deja sin inocular y se utiliza como control de esterilidad y como testigo para comparar los cambios producidos en los tubos inoculados. 4. Incubar a 37oC durante 24 horas. 5. Despus de la incubacin, observar los cambios que se produjeron en los tubos inoculados, comparar los resultados con los indicadores. INTERPRETACION DE RESULTADOS.

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1. Tratar de identificar en cada uno de los tubos los siguientes cambios y registrarlos con las claves indicadas. A: vire del indicador por produccin de cido (tabla). AG: vire del indicador a cido y produccin de gas. A/c: vire del indicador por produccin de amonaco o amidas, lo que indica la no utilizacin del carbohidrato correspondiente. SC: sin cambio, utilizacin de carbohidratos negativa. Clave +: positiva -: negativa A: produccin de cido AG: produccin de cido y gas A/c: reaccin alcalina SC: sin cambio Indicadores de pH y rangos en los que se observa el cambio de color. INDICADOR LIMITES DE pH COLOR ACIDO Verde de bromocresol 3.8-5.4 Amarillo Rojo de metilo 4.2-6.3 Rojo Prpura de bromocresol 5.4-7.0 Amarillo Tornasol 4.5-8.3 Rojo Azul de bromotimol 6.1-7.7 Amarillo Rojo de fenol 6.9-8.5 Amarillo Fenolftalena 8.3-10.0 Incoloro

COLOR ALCALINO Azul Amarillo Violceo Azul Azul Rojo Rojo

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PRUEBA DE LA OXIDACIN-FERMENTACIN DE HUGH y LEIFFSON .

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FUNDAMENTO. Para esta prueba se utilizan dos tubos que contengan una preparacin de un medio semislido con glucosa y rojo de fenol. El rojo de fenol acta como indicador de las modificaciones de pH. Esta prueba se basa en que el metabolismo oxidativo de los microorganismos solo produce cido en la superficie del medio, mientras que el fermentativo lo produce en todo el medio, incluso en las zonas de anaerobiosis. El catabolismo del carbohidrato puede realizarse en eubacterias mediante dos vas: una es la va oxidativa, degradando el azcar totalmente a CO2 y H2O, practicada por los aerobios estrictos y otra es la va fermentativa, la cual degrada al azcar dando como producto otros compuestos orgnicos de naturaleza cida, de 1, 2, 3 o 4 carbonos, realizada por los microorganismos aerobios facultativos y anaerobios. Puede aparecer gas en el medio solamente en el metabolismo fermentativo y se detecta por la aparicin de burbujas dispersas, grietas, o bien porque el medio se despega del fondo del tubo. La prueba se realiza en dos tubos con medio semislido y recto, que inicialmente son de color verde. Se inoculan por picadura en el centro del tubo y uno de ellos se recubre con parafina lquida estril (que impide el contacto del medio con el oxgeno atmosfrico). Esta prueba detecta la formacin de cido por el viraje de un indicador de pH. Los carbohidratos sobre los que se puede realizar la prueba son: glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa. MATERIAL. Tubos de cultivo. Asa bacteriolgica. Pipeta de 10 ml. Algodn. Mechero. Estufa de cultivo.

REACTIVOS. Vaselina o parafina estril. Solucin al 10% del carbohidrato estril a probar (glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa).

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Cultivo microbiano. Medio bsico de Hugh y Leiffson (g/L). Peptona...................................................2 gr Cloruro de sodio.....................................5 gr Fosfato dipotsico..................................0.3 gr Azul de bromotimol...............................0.03-0.08 gr Agar.......................................................2-3 gr

Se prepara la solucin de estos componentes base y se esterilizan en autoclave. Luego se le agrega una solucin del carbohidrato para que la concentracin final sea del 1%, a partir de una solucin madre al 10%, previamente esterilizada por filtracin.

TCNICA. 1. Agregar al medio bsico de Hugh y Leiffson la solucin al 10% del carbohidrato, en proporcin del 10% de carbohidrato, con lo cual la solucin preparada tendr una concentracin final del 1%. 2. Se toma con el asa una muestra de microorganismo problema que estar en un cultivo puro y joven de 14 a 24 horas. 3. Se siembra por picadura central y profunda para impedir el contacto con el oxgeno. Se siembran 2 tubos de esta manera. Un tercer tubo no se inocular y servir de control negativo. 4. Se calientan suavemente los tubos para que el oxgeno incluido en el medio se desprenda. 5. Uno de los tubos inoculados se sella con 1 o 2 ml de vaselina o parafina estril para mantenerlo en anaerobiosis. 6. Se incuban los tubos a 37C durante 48-72 horas, pueden incluso requerir hasta 14 das de incubacin. RESULTADOS. Los resultados que pueden aparecer son: oxidacin, fermentacin, ni fermentacin ni oxidacin, fermentacin y oxidacin.

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Reaccin Oxidacin Fermentacin Ni fermentacin ni oxidacin Fermentacin y oxidacin

Tubo abierto cido (amarillo) cido (amarillo) cido-Gas (amarillo) cido o cido-Gas (amarillo)

Tubo cerrado Verde cido (amarillo) cido-Gas (amarillo) cido o cido-Gas (amarillo)

El indicador en medio cido (el metabolismo de los azcares produce cidos, tanto en presencia como en ausencia de oxgeno) es de color amarillo. Si el microorganismo es nicamente oxidante, despus de la incubacin slo estar amarillo el medio sin cubrir con parafina, si es oxidante y fermentador, en los dos tubos el color virar a amarillo y si slo puede utilizar el azcar cuando no hay oxgeno sera fermentador (tubo con parafina amarillo). Cuando se forma cido, el medio vira de verde a amarillo. Si aparece gas se forman burbujas en el seno del medio, pudiendo agrietar el medio y/o desprenderlo del fondo del tubo. Existen microorganismos con requerimientos nutritivos, en esos casos aadir al medio de Hugh y Leiffson un 0.1% de extracto de levadura o suero. Cuando observemos en la superficie del tubo abierto una alcalinizacin inicial podemos prolongar la incubacin para que la reaccin alcalina vire a cida y evitar as falsas interpretaciones.

Rango de viraje del indicador de pH azul de bromotimol. pH=6 pH=7.6 pH=7.1 cido (amarillo). alcalino (azul de Prusia intenso) neutro (medio sin inocular) (verde).

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PRUEBA DE SCREENING DE PRODUCCIN DE ACIDO y GAS.

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Se aplica para averiguar la capacidad degradativa de un microorganismo de un cierto carbohidrato. Se puede realizar sobre distintos carbohidratos, esta prueba orienta para posteriormente realizar otras ms selectivas, como la de rojo de metilo o Voges Proskauer, Eijkman, etc. Se basa en el viraje de color de un indicador de pH al producirse cidos. La formacin de gas se observa en una campana de Durham. MATERIAL. Tubo de cultivo. Asa bacteriolgica. Campana de Durham. Pipeta de 10 ml. Mechero. Estufa de cultivo.

REACTIVOS. Solucin al 10% estril de carbohidrato a utilizar. Solucin al 1% de rojo de fenol. Rojo de fenol................................................................................1 gr. Alcohol de 95..............................................................................50 ml.

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Agua destilada..............................................................................50 ml. Disolver el rojo de fenol en el alcohol, agregar el agua y filtrar. Cultivo bacteriano. Agua de peptona. Solucin acuosa de peptona al 4%.

TCNICA. 1. Llenar 2 tubos de ensayo provistos de campana de Durham con el siguiente medio: Agua de peptona................................................................900 ml. Solucin al 10% del carbohidrato......................................100 ml. Solucin al 1% de rojo de fenol.........................................1 ml. 2. Tomar una muestra con el asa de cultivo puro del microorganismo problema. 3. Inocular un tubo y dejar el otro como control negativo. 4. Incubar a 37C durante 24-48 horas.

RESULTADOS. La formacin del cido se ver por el viraje de color rojo a amarillo. Si se formara gas, ste se ver en el interior de la campana de Durham. Se puede sustituir el indicador de rojo de fenol por otros, como azul de bromotimol, prpura de bromocresol, etc. Si se estudian enterobacterias se sustituir el medio descrito por agar McConkey. La campana de Durham debe estar perfectamente llena de caldo nutritivo en el momento de incubar pues una sola burbuja inducira a error.

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PRUEBA DE LA -D-GALOCTOSIDASA (ONPG).

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Esta prueba se basa en la capacidad que tienen los microorganismos de fermentar la lactosa. Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen 2 enzimas especficas una es la lactosa permeasa que est en la membrana celular y es capaz de transportar la lactosa a travs de la membrana celular. La otra enzima es la -D-Galoctosidasa, que est localizada en el interior de la clula y desdobla la lactosa en glucosa y galactosa. El compuesto empleado se llama Ortonitrofenil- -D-Galactopiransido (ONPG). Los microorganismos, segn fermenten o no la lactosa, se pueden clasificar en: Fermentadores activos de lactosa en 24 hr, los cuales poseen ambas enzimas. No fermentadores de lactosa, carecen de ambas enzimas, no degradan la lactosa, no penetra en la clula la lactosa. Fermentadores tardos de lactosa, poseen la enzima -D-Galactosidasa son capaces de permeabilizar ligeramente la lactosa con concentraciones altas de lactosa y fermentarla en 215 das. Se aplica fundamentalmente en la diferenciacin de enterobacteriasas.

Esta enzima hidroliza la lactosa originando glucosa y galactosa. Para conocer si un microorganismo posee -galactosidasa se utiliza como sustrato un compuesto orgnico, ONPG (o-nitrofenil--D-galactsido), que presenta el mismo tipo de enlace de la galactosa que en la lactosa, ste, al ser hidrolizado, libera o-nitrofenol que es de color amarillo, mientras que el ONPG es incoloro. Por tanto una reaccin positiva originar color amarillo cuando se incube el microorganismo en presencia de ONPG. La prueba se realiza en medio lquido que contiene ONPG y es cuantitativa. MATERIAL. Dos tubos de ensayo estriles. Bao o estufa a 37C. Asa.

REACTIVOS. Solucin tamponada a pH 7 de ONPG.

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o Orto-nitrofenil- -D-Galactopiransido (ONPG)...............0.1 % o Buffer fosfato......................................................................1/15 M o pH........................................................................................8.0 Solucin fisiolgica estril. Tolueno. Cultivo bacteriano.

TCNICA. 1. Preparar una suspensin densa del microorganismo a partir de un cultivo puro en 0.5 ml de suero fisiolgico estril. 2. Liberar la -D-Galactosidasa de las bacterias. Para ello se aade una gota de tolueno a la suspensin y mezclar vigorosamente durante unos segundos. 3. Aadir 0.5 ml de la solucin tamponada de ONPG, mezclar. 4. Incubar a 37C y leer antes de 24 horas. 5. Debe utilizarse un inculo concentrado para que exista una concentracin alta de enzima y aumentar la velocidad de reaccin. 6. Es importante que la solucin de ONPG sea incolora y por ello debe prepararse en el momento. 7. La solucin debe guardarse en frascos de color mbar a una temperatura de 4C pues se desestabiliza fcilmente. 8. Antes de usarse se debe atemperar en un bao a 37C para que se disuelvan los fosfatos que cristalizan durante la conservacin. 9. La solucin de ONPG se puede sustituir por tabletas o discos comerciales. 10. Los microorganismos que se ensayan deben estar incubados en un medio con lactosa, por ejemplo, agar hierro Kliger.

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RESULTADOS. ONPG positivo: amarillo. En la mayora de los microorganismos a los 60 minutos. ONPG negativo: incoloro. No se puede interpretar antes de 24 horas.

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PRUEBA DEL ROJO DE METILO

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Esta se utilizan para identificar microorganismos que producen grandes cantidades de cidos (lcticos, actico, frmico) a partir de la glucosa, por va de la fermentacin cida mixta. MATERIAL Lpiz graso. Mechero. 4 Tubos de ensaye con caldo RM/VP. Pipetas estriles de 1.0 mL. Solucin rojo de metilo. o Rojo de metilo.......................................................0.1 gr. o Etanol al 95%........................................................250 ml. o Agua destilada......................................................250 ml.Disolver el indicador en el alcohol y despus agregar el agua.

Cultivo de bacterias de 24 horas.

MEDIO DE CULTIVO. CALDO RM/VP

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Glucosa...............................................................5.0 gr. Peptona de carne.................................................5.0 gr. Fosfato dipotsico..............................................5.0 gr. Agua destilada....................................................1000 ml. pH.......................................................................7.0

Disolver los ingredientes, ajustar el pH, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

TCNICA. 1. Inocular 3 tubos con el microorganismo problema. El tubo 4 se deja como control. 2. Incubar a 35C durante 48-72 horas. 3. Al trmino de la incubacin, en condiciones aspticas con pipeta estril, tomar una alcuota del primer tubo y transferirla a un tubo vaco. 4. Repetir el procedimiento con los otros 3 tubos. 5. Agregar a cada tubo que contienen las alcuotas 5 gotas del indicador rojo de metilo. 6. Observar la reaccin. RESULTADOS. 1. El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la produccin de cido fue suficiente como para alcanzar un pH de 4.4 por lo que se considera que la prueba es positiva. 2. El desarrollo de un color naranja, indica la produccin de cido pero no en cantidad suficiente como para considerar la reaccin positiva.

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PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

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Principio En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. Medios y reactivos 1. Caldo RM/VP Glucosa...............................................................5.0 gr. Peptona de carne.................................................5.0 gr. Fosfato dipotsico..............................................5.0 gr. Agua destilada....................................................1000 mL pH.......................................................................7.0

Disolver los ingredientes, ajustar el pH, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

2. Reactivo de Barritts A (5%) Alfa naftol..........................................................5.0 gr. Etanol 95%.........................................................100 mL 3. Reactivo de Barritts B

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Hidrxido de potasio..........................................40.0 gr. Creatinina...........................................................0.3 gr. Agua destilada....................................................100 mL Estos reactivos deben prepararse inmediatamente antes de su uso. Tcnica 1. Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. 2. Incubar a 35C durante 24 horas. 3. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. 4. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.

Interpretacin 1. Una prueba positiva est indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de aadir los reactivos, revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.

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FERMENTACIN DE GLUCOSA.

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Introduccin La determinacin de la capacidad de fermentacin de la glucosa es importante en las primeras etapas de identificacin de bacterias quimitrofas. Principio Se utiliza un caldo que contiene glucosa (azcar del cual la mayora de las bacterias quimiotrofas pueden obtener energa, ya sea por fermentacin o respiracin), peptona y un indicador de pH que permite detectar la produccin de cidos (caracterstica de la fermentacin de la glucosa). Adems en la fermentacin se produce gas, ya sea CO2 solo o una mezcla de H2 y CO2. El H2 es insoluble y se detecta por la formacin de una burbuja en una campana de Durham presente en el medio. Medios y reactivos Caldo de fermentacin Proteasa peptona.......................................10.0 g Glucosa.....................................................10.0 g Prpura de bromocresol...........................0.015 g NaCl.........................................................5.0 g Agua destilada..........................................1000 mL pH.............................................................6.8

Se dispensa en tubos por 9 mL y se agrega una campanita de Durham invertida. Tcnica Se inocula con asa y se incuba a 35C durante 48 horas. Interpretacin Bacteria no fermentadora de glucosa (color prpura) 1. Fermentacin de glucosa sin produccin de gas (color amarillo). 2A es una reaccin positiva dbil 2. Fermentacin de glucosa con produccin de gas. En 3B se produjo alcalinizacin en la superficie pero se lee como positivo. En cualquiera de los tubos, la utilizacin de aminocidos (provenientes de las peptonas) puede ocurrir aerbicamente, dando como resultado la produccin de amonio. En el tubo 3B la cantidad de amonio producida es suficiente para neutralizar el cido producido.

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HIDRLISIS DE LA ESCULINA. La esculina contiene un carbohidrato unido a un compuesto aromtico. Este test se usa a menudo para distinguir especies de Streptococcus. Hay microorganismos que hidrolizan la esculina en esculetina y glucosa, la primera reacciona con sales de hierro originando un compuesto de color negro. Se realiza en tubos inclinados incubados durante 48 h. Se crecen las bacterias en un medio complejo que contiene 0,01 % de esculina y un 0,05 de citrato frrico. Medios y reactivos Caldo de fermentacin Tcnica Se siembra en tubo y por picadura. Se incuba en estufa a 37C y se establece la lectura despus de 24-48 horas de su inoculacin. Peptona...............................................10.0 g Citrato frrico amnico......................0.05 g Esculina..............................................0.01 g Agar....................................................20.0 g Agua destilada....................................1000 mL

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