Proizvodnja antitoksina (antivenoma) antitoksina (VEF).pdf · zmijski otrov je “mozaik...
-
Upload
truongxuyen -
Category
Documents
-
view
265 -
download
9
Transcript of Proizvodnja antitoksina (antivenoma) antitoksina (VEF).pdf · zmijski otrov je “mozaik...
Proizvodnja antitoksina(antivenoma)
Imunološki zavod d.d.
Mr. sc. Maja Lang Balija, dr. vet. med.
• Otrovne životinje (eng. poisonous
animals) – kriptotoksične životinje
• Životinje otrovnice ( eng. venomous
animals) – fanerotoksične životinje
• Toksini – mala molekulska masa
• Venomi – proteini/peptidi velike
molekulske mase (mješavina toksina)
Životinjski otrovi (venomi)
Fanerotoksične životinje
• posjeduju posebne sustave za proizvodnju i
aplikaciju otrova u žrtvu:
• zmije (poskok, riđovka)
• kukci (pčele, ose, bumbari, stršljeni)
• pauci (Crna udovica)
• ribe (pauk, škarpina, golub)
Kriptotoksične životinje
• dio tijela (meso, jetra, krv, koža) otrovan bez
posebnih aparata za unošenje otrova u žrtvu:
• tropske ribe (puffer fish – otrovna kuglasta riba) i hobotnice –
tetrodotoksin- neurotoksin (protuotrov još uvijek nije
pronađen) -bakterija roda Vibrio na površini tijela (1 200 puta
otrovniji od cijanida LD50 = 5 – 8 μg/kg)
• vodozemci (dart-žaba Phyllobates terriblis - batrahotoksin
(250 puta jači od strihnina) letalna doza 1 – 2 μg/kg tjelesne
mase); bufotoksin – žaba krastača (Buffo sp.)
Životinje otrovnice naših krajeva
• zmije:
• AGLYPHAE (bezubice)• OPISTOGLYPHAE (stražnjožljebozubice) porodice
Colubridae:» Malpolon insignitus (zmajur)» Telescopus fallax (crnokrpica)
• PROTEROGLYPHAE (prednjožljebozubice) porodice Elapidae i Hydrophiidae (nema slobodnoživućih predstavnika u Europi)
• SOLENOGLYPHAE (cjevozubice)porodice Viperidae:» Vipera ammodytes (poskok)» Vipera berus (riđovka)» Vipera ursinii macrops (planinski žutokrug)
Životinje otrovnice naših krajeva
• pauci:• Lactrodectus tredecimguttatus (Crna udovica)
• škorpioni (Euroscropius italicus, Euroscropius germanus)
• relativno bezopasni (neurotoksični peptidi i enzimi –fosfolipaza A2, fosfoesteraza, hijaluronidaza)
• upalna reakcija, bula na mjestu uboda, lokalna ukočenost
• pčele, ose, bumbari i stršljeni• relativno bezopasni (složena smjesa otrova: enzimi; biološki
aktivni peptidi – melitin, apamin, mastoporan, bombolitin)
• lokalna upalna reakcija do anafilaktičnog šoka
Otrovi i klinička slikaotrovanja
Podjela zmijskih otrova prema mehanizmu djelovanja
• Neurotoksični (postsinaptičke i predsinaptičke membrane) - Elapidae gujemišići oka (ptosis); jezik (teškoće u govoru); grlo(dysphagia); grudi (dyspnea)
• Miotoksični (rabdomioliza) - Hydrophiidae - morske zmije
• Vaskulotoksični – Viperidae – prave ljutice i jamičarke
hemoragini (metaloproteinaze)
oštećenja endotela, zgrušavanja krvi, bujanja (bubrenje, edem) na ugriženom mjestu, lokalna nekroza, tromboza - “suha gangrena”, šok - hipovolemija, acidoza, kardijalna i pulmonalna depresija
Otrov pauka Crne udovice:• smjesa citotoksičnih enzima (hijaluronidaza, kolagenaza, esteraza,
fosfolipaza, ribonukleaza) i α-latroksin (polipeptid LD50-0,1 mg/kg u mačke)
• intenzivna bol po cijelom tijelu (“ukočen bolan osmijeh”), lokalno crvenilo i oteklina; neurovegetativni simptomi; hipertenzija, tahikardija, srčana aritmija; psihičke reakcije (histerija, halucinacija, delirij); prijapizam u muškaraca (24 – 48 sati)
Dobivanje otrova
Zmijski otrovi:
• dobivaju se manualnom “mužnjom” zmija otrovnica
• viskozne bezbojne do žućkaste tekućine (oksidaza L-aminokiselina)
• svježi otrov nije stabilan - sušenje je esencijalno za održavanje biološke aktivnosti
Otrovi kukaca:
• dobivaju se maceracijom otrovnog aparata ili elektrostimulacijom (anestezija CO2+1-2V –
helicere ili cijeli pauk na 60V)
• viskozne bezbojne tekućina
• svježi otrov nije stabilan – 0,06-0,26 mg
poskok
Vipera ammodytes
(20- 45 mg suhe tvari)
riđovka
Vipera berus
(4 -10 mg suhe tvari)
sastav otrova ovisi o:
• vrsta, spol i dob zmije
• kondicija zmije
• geografsko podrijetlo (ambijentalne prilike)
• temperatura okoline (hibernacija, estivacija)
• način prehrane
Sastav zmijskih otrova
•proteinske
proteini, glikoproteini, peptidi
•neproteinske
aminokiseline, lipidi,
anorganski ioni, organske
kiseline, nukleozidi i
nukleotidi, i dr.
Georgieva D et al. Journal of Proteome Research 2008; 7: 866-886.
PAhomologija s
AtxBaa
numberi.v. LD50pIfosfolipaza
Amoditoksini (Atx)
+
+
+
95.9%1220,361mg/kg9.4-9.5AtxC (j)
/1220,58 mg/kg10.0AtxB (k1)
97.54%1220,021mg/kg10.2AtxA (k2)
++ 68%121-6.8AtnI2 (i2)
Ritonja et al. Biochim. Biophys. Acta 1985; 828: 306-312.Ritonja A et al. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1986; 367: 919-923.Križaj I et al. Biochim. Biophys. Acta 1989; 999: 198-202Križaj I et al. Eur. J. Biochem. 1992; 204: 1057-62.
Sastav otrova poskoka
• odgovorni za hemoragičnu aktivnost venoma
• VaH1; VaH2, VaH3
• pI cca 5.5
• Mr 70 000 Da
Hemoragini (H)
Leonardi A et al. Toxicon. 2002;40:55-62.
Imunoreakcija na zmijske
otrove
• kompleksan antigen s jakim toksičnim djelovanjem
• humoralna imunoreakcija - visoki titar antitijela razreda IgG
• međusobno natjecanje više antigena unutar smjese
• križna reaktivnost antiseruma
zmijski otrov je “mozaik antigena” - Boquet (1979)
Imunoreakcija na zmijske
otrove
Imunoglobulini (protutijela/antitijela)
biološke makromolekule – važne sastavnice imunog sustava koje nastaju u reakciji sa antigenom
humoralna imunost
glikoproteini (aminokiseline 82-96% i ugljikohidrati 4-18%)
većina u krvnoj plazmi (međustanična tekućina, sekreti egzokrinih žlijezda, vezani na B-limfocite kao receptori za Ag)
specifično i selektivno vezanje Ag koji su potakli njihovu sintezu
biološka svojstva: vezanje komplementa
prolaženje kroz placentu
sudjelovanje u aktivaciji mastocita
vezanje za makrofage
pospješivanje fagocitoze
PRIKAZ KLASA IMUNOGLOBULINA KOD LJUDI
SVOJSTVA Ig G IgA IgM IgD IgE
mol.masa (kDa)
150 160 900 180 190
broj potklasa 4 2 2? 1 1
udio u ukupnim Ig (%)
75-80 13-15 7-9 1 0.002
vrijeme poluživota u plazmi (dani)
23 6 5 3 2
brzina sinteze (mg/kg/dan)
20-60 8-10 5-8 0,4 0,004
Klase imunoglobulina
Proizvodnja antitoksina
Pod pojmom antitoksina, obuhvaćeni su heterologni preparati
proizvedeni iz životinjske (pretežno konjske) hiperimune
plazme ili seruma, koji sadrže specifične imunoglobuline za
pasivnu zaštitu ljudi protiv toksina.
homologni (humani) imunoglobulinski preparati, normalni i specifični
heterologni (životinjski) hiperimuni antitoksični i antibakterijski
imunoglobulini (proizvodne životinja – kunić, ovce, koze, magarci, konji,…)
Tehnologija proizvodnje antiseruma (antivenoma)
1. postupak hiperimunizacije nemodificiranim otrovom
2. obrada hiperimune plazme do konačnog proizvoda
idealan antiserum (antitoksin) trebao bi biti sposoban neutralizirati sve toksične komponente
životinjskih otrova
• stoljetna tradicija proizvodnje antiseruma:
- 1890. godine - prvi proizvedeni antitoksin protiv tetanusa proizveden na kunićima
- 1892. godine – imunizacija ovaca i konja tetanusnim toksinom
- od 1959. godine - konjski antitoksin protiv otrova europskih zmija i pauka crne udovice (Latrodectus tredecimguttatus)
Povijest proizvodnje antitoksina u Imunološkom zavodu
Proizvodnja antiseruma u Imunološkom zavodu
način aplikacije antigena prilikom imunizacije (potkožno)
pripremna imunizacija• otrov europskih zmija • otrov pauka crne udovice • otrovi se apliciraju u rastućim dozama kroz više mjeseci
hiperimunizacija (proizvodna imunizacija)• otrov europskih zmija• otrov pauka crne udovice • otrovi se apliciraju jednokratno svakih cca mjesec dana
Uzimanje krvi
konj – zdrav, dobro gojno stanje i kondicija, pregledan na bolesti koje mogu biti potencijalne zoonoze (EMEA CPMP/BWP/3354/99 -
Note for guidance on production and
quality control of animal immunoglobulins
and immunosera for human use)
mjesto punkcije - Vena jugularis
mjesto punkcije oprano, obrijano, dezinficirano
Prikupljanje i obrada krvi
vađenje u PVC vrećice(ACD)
praćenje trijasa
sedimentacija na +40 C/24 h
Plazmafereza
miješanje staničnih elemenata krvi s fiziološkom otopinom
zagrijavanje mješavine na cca 37 0C
vraćanje staničnih elemenata krvi s fiziološkom otopinom
monitoring zdravstvenog stanja• homologna krv• zrak u sistemu• ugrušak – zastoj• paravenozno vraćanje• opće stanje
Prikupljanje plazme
odlijevanje plazme u prijenosne PVC spremnike; pohranjevanje plazme na < -20 0C do prerade
Prerada plazme (proizvodnja antitoksina)
Stites D.P. et al. Basic and clinical Immunology 1994.; Appelton&Lange, Prentice-Hall International Inc.
Tehnološke operacije koje se
koriste u preradi konjske plazme
enzimska razgradnja
precipitacija
adsorpcija
dijaliza
Enzimska razgradnja hiperimune konjske plazme praćena
SDS-elektroforezom
kDa
--- 53
--- 76
--- 116
--- 170--- 212
1. Početna plazma
2. Plazma (pH = 3,6)
3. Konc. pepsina 1
4. Konc. pepsina 2
5. Konc. pepsina 3
6. Konc. pepsina 4
7. Standardi poznatih mol.
masa
8. Plazma (pH = 3,6)
1 2 3 4 5 6 7 8
Konačni proizvodi –sastav antitoksina
aktivne tvari u ovako proizvedenom antitoksinu su
termostabilni F(ab)2 fragmenti specifičnih
imunoglobulina sposobnih da u ljudskom organizmu
neutraliziraju odgovarajuće toksine
pomoćne tvari antitoksina su natrijev klorid, pomoću
kojeg se postiže izotoničnost i m-krezol, koji se dodaje
kao konzervans
Proizvodnja antitoksina protiv otrova europskih zmija
Zmijski antitoksin Imunološkog zavoda
vodeće ljekovito sredstvo u terapiji zmijskih ugriza na području Europe i Male Azije
1 ml preparata štiti od najmanje:100 LD50 V. ammodytes venoma 100 LD50 V. aspis venoma 50 LD50 V.berus venoma 50 LD50 V. ursinii venoma50 LD50 V. lebetina venoma50 LD50 V. xanthina venoma
zmajur crnokrpica, pržac
planinski riđovka poskok u uzgoju(photo by Rainer Fesser)
Zmije Hrvatske