Univerza v LjubljaniFakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Seminarska naloga pri predmetu biokemija II

PRIONOPATIJE IN DRUGE NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI

S SORODNIM POTEKOM

Matej Huš

V Ljubljani, maja 2010

Slika 1: Ovca s praskavcem[b]

Slika 2: Krava z BSE[b]

ZGODOVINA

Leta 1884 sta raziskovalca Robert Koch in Friedrich Loeffler postavila skupino trditev, ki so poznane pod imenom Kochovi postulati in povezujejo domnevne povzročitelje bolezni z boleznimi, ki naj bi jih povzročali. Da lahko rečemo, da je nek mikroorganizem povzročitelj bolezni, se mora:

- v obilju nahajati v bolnih osebkih, medtem ko ga v zdravih ne sme biti;- izolirati iz obolelega organizma in gojiti v čisti kulturi;- izkazati, da vbrizganje kulture mikroorganizma v zdrav organizem povzroči

bolezen.Nekatere postulate je spremenil že Koch. Prvega je črtal, ko je opazil asimptomatske prenašalce kolere. Virusi v njegovem času niso bili znani, a se jih ne da gojiti v kulturi s preprostimi postopki.[a] Skoraj celo stoletje je veljala dogma, da so povzročitelji nalezljivih bolezni bakterije, glive, praživali ali virusi. Čeprav so slednji skrajno poenostavljena oblika življenja, ki izven gostitelja sploh ne živi, mora vsak parazit, ki povzroča bolezensko stanje, imeti lasten dedni material v obliki DNA ali RNA.

V osemdesetih letih prejšnjega stoletja se je v Veliki Britaniji pojavila neznana bolezen goveda z dolgo inkubacijsko dobo. Pri obolelih živalih so se v možganih pojavile zaplate gobastega tkiva, zaradi česar so bolezen poimenovali bovina spongiformna encefalopatija (BSE). Sorodna bolezen, ki prizadene koze in ovce, se imenuje praskavec (angl. scrapie) in je poznana že od 18. stoletja. Jelenjad napada bolezen kroničnega hiranja (CWD), prve primere sorodnih obolenj pri ljudeh pa so odkrili sredi prejšnjega stoletja med kanibalskim plemenom Fore na Papui Novi Gvineji. Bolezen so poimenovali kuru.

Vsem boleznim je skupen izmuzljiv povzročitelj, saj dolgo časa raziskovalcem ni uspelo izolirati nobenega patogenega organizma, ki bi bil prisoten pri vseh obolelih organizmih in bi povzročal bolezen. Poleg tega je bila kužnina tudi po prekuhavanju še vedno kužna. Sterilizira jo šele štiriurna obdelava z NaOH pri 134 °C in tlaku 4 atm.[b] Prve hipoteze o povzročitelju bolezni brez lastnega genskega materiala sta v šestdesetih letih prejšnjega stoletja postavila radiobiolog Tikvah Alper in matematik John Stanley Griffith. Predpostavila sta, da bolezni prenaša kužnina, ki sestoji izključno iz proteinov. Šele leta 1982 je Stanley B. Prusiner z Univerze v Kaliforniji izoliral prve skupke proteinov, ki so povzročali praskavec. Dve leti po objavi so v laboratoriju izolirali čisti protein, ki ga je Prusiner poimenoval prion. Leta 1997 je za svoje delo dobil Nobelovo nagrado za medicino.[c] Do danes so na področju prionov in bolezni, ki jih povzročajo, izvedli že mnogo raziskav, tako da je mehanizem njihovega delovanja dobro razjasnjen.

2

Sika 3: Primerjava mišjega in človeškega proteina PrP[f].

Slika 4: Rezultat obdelave PrP 33-35 s proteinazo K je PrP 27-30.

PRIONI

Prioni so zgrajeni iz enega sialoglikoproteina[d], ki ga pri človeku kodira gen PRNP na 20. kromosomu. Gen PRNP sestoji iz dveh eksonov, ločenih z enim intronom, ki se prepišeta v dve molekuli RNA in nato povežeta v eno molekulo mRNA. Protein PrP 33-35 (PrPC), ki ga sintetizirajo zdrave celice, je prekurzor prionskega proteina. V živčnih celicah ga najdemo z glikoinozitol fosfolipidnim sidrom pritrjenega na površino nevronov. Vključen je v delovanje sinaps, kjer veže bakrove(II) ione. Njegove funkcije in vitro še niso uspeli ponoviti. Kakor vsi običajni proteini, je PrP 33-35 občutljiv na proteaze.[e]

Včasih pa se na proteinu PrP 33-35 izvede še šest posttranslacijskih modifikacij, ki bi lahko bile ključne za izbruh bolezni[f]:

- oba konca se glikozilirata;- dva cisteinska ostanka se povežeta z disulfidnimi vezmi;- signalni peptid na N-koncu se odstrani;- hidrofobni segment na C-koncu se odstrani;- doda se fosfatidilinozitolni glikolipid na C-koncu;- odstrani se prvih 57 aminokislin na N-koncu.

3

Slika 5: Levo model PrPC, desno model PrPSc.

Nastali protein se imenuje PrP 27-30. Poleg posttranslacijskih modifikacij se od PrP 33-35 razlikuje še po aminokislinskem ostanku 178, ki je asparagin namesto aspartata. To spremeni njegovo zgradbo in jo zaklene, da vsebuje 21 odstotkov alfa vijačnice in 54 odstotkov beta ploskve, medtem ko ima PrP 33-35 le 3 odstotke beta ploskve in 42 odstotkov alfa vijačnice. Mutirana oblika PrP 27-30 ima avtokatalitične sposobnosti, saj ob stiku s PrP 33-35 povzroči, da se ta zvije v mutirano obliko. PrP 27-30 nastane iz oblike PrPSc (mutirana oblika PrPC), ki jo najdemo pri praskavcu, z delno proteolizo N-konca, tako da ostane le na proteolizo odporno jedro.[g] Zaradi avtokatalitičnih lastnosti in proteolizne odpornosti PrP 27-30 so bolezni, ki jih povzroča, neozdravljive. Zaradi velikega deleža strukture beta ploskve polimerizirajo proteini PrP 27-30 v amiloidne fibrile. Ker PrP 27-30 ni topen, točnih rentgenskih in NMR-analiz ni moč izvesti; znane podatke so dobili iz kristalografskih analiz kristalitov.[c] PrPSc za razliko od PrPC tudi ni topen v vodnih raztopinah surfaktantov.[g]

V zadnjih dveh letih so odkrili novo konformacijo proteina PrP, občutljivo na proteinazo K, ki prav tako povzroča spongiformno encefalopatijo. Bolezen z imenom PSPr (na proteinazo občutljiva prionopatija) je po poteku in simptomih sorodna Alzheimerjevi bolezni.[h]

Protein Delež α-vijačnice Delež β-ploskvePrP 33-35 (PrPC, divji tip) 42 3PrPSc 30 43PrP 27-30 21 54Tabela 1: Zgradba proteina PrP[g]

Agregati PrP 27-30 v možganih povzročajo počasno propadanje nevronov v talamusu z apoptozo in moteno delovanje drugih nevronov. V človeku prioni povzročajo Creutzfeldt-Jakobovo bolezen (njena varianta nCJD ima izvor v uživanju mesa živali z BSE), smrtno družinsko nespečnost (FFI), kuru in Gerstmann–Sträußler–Scheinkerjev sindrom. Vse bolezni so neozdravljive in jih zaznamuje počasno propadanje nevronov. Njihove skupne značilnosti so povečanje števila astrocitov, izčrpanje dendritskih trnov, amiloidoza in tvorba številnih vakuol v cerebralnem korteksu, zaradi česar jim s skupnim imenom pravimo spongiformne encefalopatije. Pri vseh boleznih opazimo zelo dolgo inkubacijsko dobo, postopno izgubo mišične koordinacije po izbruhu, demenco, ki se sprva kaže kot slabljenje spomina, kasneje pa pešanje vseh kognitivnih funkcij, in napredujočo nespečnost. Imunskega odgovora ni, ker je prion telesu lasten protein.

Gostitelj Bolezen Mehanizem patogenezeOvce Praskavec (angl. scrapie) Infekcija v genetsko podvrženih ovcahGovedo Bovina spongiformna

encefalopatija (BSE)Infekcija prek kostne moke, okužene s prioni

Kune Prenosna kunja encefalopatija (TME)

Infekcija s prioni iz ovac ali goveda

Jelenjad Bolezen kroničnega hiranja (CWD)

Neznan

Mačke Felina spongiformna encefalopatija (FSE)

Infekcija prek govedine, okužene s prioni

Kopitarji Eksotična encefalopatija kopitarjev (EUE)

Infekcija prek kostne moke, okužene s prioni

4

Gostitelj Bolezen Mehanizem patogenezeČlovek Creutzfeldt-Jakobova bolezen

- iatrogena (iCJD)- sporadična (sCJD)- variantna (vCJD)- družinska (fCJD)

Z okuženimi hipofiznimi hormoni, instrumenti, transplantiSomatska mutacija ali spontana konverzija PrPC v PrPSc?Infekcija prek govejega mesa, okuženega s prioniPodedovana mutacija gena PRNP

Pleme Fore

Kuru Infekcija prek ritualističnega kanibalizma

Ljudje Smrtna družinska nespečnost (FFI)

Podedovana mutacija gena PRNP

Ljudje Smrtna sporadična nespečnost (FSI)

Somatska mutacija ali spontana konverzija PrPC v PrPSc?

Ljudje Gerstmann–Sträußler–Scheinkerjev sindrom (GSS)

Podedovana mutacija gena PRNP

Tabela 2: Prionske bolezni[i]

Daleč najpogostejša spongiformna encefalopatija pri človeku je Creutzfeldt-Jakobova bolezen, ki se pojavlja v več oblikah. Kopičenje PrPSc v možganih je pri iatrogeni obliki (iCJD) posledica vnosa PrPSc v telo z zdravljenjem s hipofiznimi hormoni pridobljenimi iz hipofize umrlih s CJB ali po presadku roženice ali dure, pridobljenih od umrlih s CJB, ali z uporabo nevrokirurških inštrumentov, okuženih s PrPSc. Pri variantni obliki (vCJD) je kužni material bolnik zaužil v obliki mehansko predelanega govejega mesa. Družinsko Creutzfeldt-Jakobovo bolezen (fCJD) povzroča mutacija gena PRNP, ki se deduje avtosomno dominantno. Pri sporadični obliki (sCJD) je razlog kopičenja polimernih agregatov PrPSc v možganih neznan.[j]

Spongiformne encefalopatije se lahko prenašajo horizontalno, bodisi prek človeškega stika bodisi prek uporabe okuženega pribora (iCJD) ali uživanja mesa bolnih živali (vCJD), ali pa vertikalno z dedovanjem mutiranega gena PRNP (fCJD, FFI, GSS).[j] Dvojni način prenos je unikaten.

DRUGE NEVRODEGENERATIVNE BOLEZNI

Poleg prionskih bolezni obstoji vrsta drugih nevrodegenerativnih bolezni, ki prizadenejo ljudi. Mednje sodijo Alzheimerjeva bolezen (AD), frontotemporalna demenca (FTD), Parkinsonova bolezen (PD), razne poliglutaminske bolezni (Huntingtonova bolezen (HD), spinocerebralna ataksija (SA)) ipd. Medtem ko se poliglutaminske bolezni prenašajo izključno z dedovanjem genetskih napak, ki povzročijo nenormalno dolge poliglutaminske verige na koncu proteinov, se druge bolezni pojavljajo v sporadični obliki ali v avtosomsko dominantni kot posledica drugačnosmiselnih mutacij. S prionopatijami si delijo vrsto značilnosti – fenotipsko raznolikost in širjenje patologije v organizmu – zaradi česar bi lahko bilo tudi zdravljenje usmerjeno na podobne tarče.

Tako kot je za prionske bolezni značilno nalaganje agregatov PrPSc v možganih, je tudi za neprionske nevrodegenerativne bolezni značilno kopičenje netopnih fibrilnih agregatov proteinov (β-amiloid, protein tau, α-sinuklein, poliglutaminski niz) v živčnih celicah, kar povzroča simptome bolezni.

5

Protein Vloga Lokacija Bolezenprionski protein delovanje sinaps,

veže bakrove ionepovršina nevronov prionopatije

protein tau[k], [l] stabilizacija mikrotubul predvsem v aksonih nevronov, drugje v sledovih

tauopatije, demence (AD, FTD)

β-amiloid[m] neznana, najnovejše študije kažejo protimikrobno delovanje proti vsaj osmim pogostim patogenim mikroorganizmom

možgani AD, cerebralna amiloidna angiopatija

α-sinuklein[n] neznana živčno tkivo, jedra možganskih celic

PD, demenca z Lewyjevimi telesci, multipla sistemska atrofija

poliglutaminski niz[o]

- večkratna ponovitev glutaminskega kodona CAG na različnih genih

HD, SA1-3, SA6-7, SA17, DRPLA, Kennedyjeva bolezen, spinalna in bulbarna mišična atrofija

Tabela 3: Proteini, udeleženi pri nevrodegenerativnih boleznih

Fenotipska raznolikost

Večina običajnih nevrodegenerativnih obolenj ima kopico fenotipov. Spreminjajo se starost ob izbruhu, hitrost napredovanja, lokacija prizadetih delov živčnega sistema in obseg kopičenja proteinskih agregatov. Zanimivo je, da je nalaganje proteina tau značilnost več kot 20 različnih nevrodegenerativnih bolezni, med njimi tudi AD in FTD. Sporadične tauopatije imajo zelo različno prizadete dele možganov, trajanje bolezni, starost bolnikov in morfologijo fibrilov. Podobno tudi prionske bolezni napredujejo različno hitro in izvirajo iz različnih mutacij gena PRNP.

Pri prionskih boleznih poznamo različne oblike proteina PrPSc (zaporednje aminokislin, posttranslacijske modifikacije, pogoji agregacije), ki se zvijejo v različne oblike in se kažejo v različnih fenotipih bolezni. Kateri fenotip bo določena oblika PrPSc povzročila pri sesalcih, še ni mogoče napovedati.

Podobno imajo amiloidni proteini vrsto konformacij (za protein tau poznamo šest izoform divjega tipa[l] in vrsto mutant, med njimi ∆K280 in P301L in dvojno mutanto V337M. Navedene mutante imajo različne konformacijske oblike. Fibrilne strukture β-amiloida in α-sinukleina so poznane v dveh konformerah različne toksičnosti). Mutirana oblika v vseh primerih sproži (zaseje) fibrilizacijo monomere divjega tipa, pri čemer so nastale fibrile enake konformacije kot sevni protein. Ker informacijo o svojem zvitju prenašajo na zdrave proteine, ki se polimerizirajo v napačno zviti obliki, jih to uvršča v isti razred kot prione.

Tvorbo agregatov lahko povzročajo tudi kovalentne modifikacije. Polimerizacijo proteinov tau v fibrilarne agregate povzroča hiperfosforilacija, zaradi katere se stabilnost mikrotubul poruši. To vodi v odmrtje celic in tvorbo nevrofibrilarnih vozličev, ki so prisotni pri AD.[p] V teh primerih proteina tau ne najdemo le v aksonih, marveč tudi v celičnih telescih in dendritih prizadetih celic.[q]

6

Ali različne konformere fibrilnih proteinov povzročajo različne fenotipe nevrodegenerativnih bolezni, še ni dognano. Za dokaz bo treba nedvoumno povezati posamezno konformero z določenim fenotipom bolezni.

Širjenje patologije

Nevrodegenerativne bolezni se začnejo z motnjami v delovanju neke regije v možganih, medtem ko so v kasnejših stadijih bolezni običajno prizadeta mnogo večja območja možganov. Prva prizadeta regija je pri isti bolezni pogosto ista in lahko služi za diagnozo (npr. pri AD je to običajno entorinalni korteks, kjer se kaže kopičenje proteina tau). Lezije se širijo po normalnih poteh notranje možganske povezanosti (pri AD sledijo hipokampus, amigdala in neokorteks). PD se začne z motoričnimi simptomi, ki jih povzroča propadanje dopaminskih recepetorjev v črni substanci, in pri znatnem deležu bolnikov napreduje do demence, kar nakazuje prizadetost dodatnih delov možganov. Vse to kaže na patogeno povezavo med prizadetimi celicami in okolico.

Prionopatije se začnejo z majhnim inokulumom, ki je lahko kontaminiran kirurški instrument ali pa spontana akumulacija PrPSc v eni celici. Sčasoma se prionopatija razširi po živčnem sistemu, verjetno prek vagusnega živca v medulo, pons, medmožgane, male možgane in talamus po nevroanatomskih povezavah.

PrPSc potuje iz prizadete celice v naivno celico, kjer pretvarja PrPC v PrPSc, na dva načina. Lahko potuje po sinaptičnih povezavah ali pa se izloči v okolico, kjer ga sosednje celice privzamejo. Prehajanje se vrši prek eksosomov ali tunelskih nanocevk (zanje se predpostavlja, da so citoplazmatske povezave med celicami sesalcev). Ali neprionski proteinski agregati prehajajo med človeškimi celicami in vivo, ni znano. Raziskave celic v kulturi in na transgenih miših s človeškim sinukleinom kažejo, da je to možno. Celice v kulturi so privzele agregate proteinov tau, β-amiloida, α-sinukleina in poliglutamina. Protein tau in poliglutamin sta v celicah tudi sprožila napačno zvijanje pravilno zvitih proteinov in njihovo nadaljnjo agregacijo. Induciranje napačnega zvijanja in agregiranja proteinov in vivo v ljudeh še ni bilo dokazano.

Protein Konformacijska raznolikost?

Prehajanje agregatov med celicami v kulturi?

Širjenje agregacije in vivo?

Prionski protein (PrP)

Da Da. Da.

Amiloid-β Da Celice vključijo ekstracelularne agregate.

Da: inokulacija v možgane sproži nadaljnjo agregacijo

Tau Da Celice vključijo ekstracelularne agregate, prenos intracelularnih agregatov.

Da: ekstracelularna inokulacija sproži vnos v celice in inducira napačno zvijanje proteinov.

α-sinuklein Da Celice sproščajo protein, druge celice v kulturi ga privzamejo.

Možno: v ljudeh presajene celice razvijejo Lewyjeva telesca; presajene celice v miših asorbirajo proteine iz gostitelja in tvorijo inkluzije.

Poliglutaminski niz

Da Celice v kulturi privzamejo agregate, ki inducirajo napačno zvitje proteinov v celici; agregati prehajajo med celicami.

Ne.

Tabela 4: Skupne značilnosti sesalskih proteinov, povezanih z nevrodegenerativnimi boleznimi

7

Slika 6: Transcelularno širjenje napačno zvite oblike proteinov[r]

Razlike

Razlike med prionskimi in običajnimi nevrodegenerativnimi obolenji obstajajo. Za zdaj ni dokazov o spontani infektivnosti sporadičnih oblik AD, FTD ali PD. Prioni po zaužitju nespremenjeni potujejo skozi prebavni trakt, se absorbirajo v gostitelja, pomnožujejo in potujejo do možganov. Proteini, ki se agregirajo pri ostalih nevrodegenerativnih boleznih, tega niso zmožni. Raziskave sicer kažejo, da bi se lahko serumska amiloidoza A, ki jo povzroča agregacija serumskih amiloidov A, prenašala na tak način, a ne sodi med nevrodegenerativne bolezni. Poleg tega prionopatije po dolgi inkubacijski dobi po izbruhu simptomov napredujejo hitro, tipično vodijo v smrt v manj kot letu dni, medtem ko so nevrodegenerativne bolezni počasnejše.

Podoben način širjenja?

Ker je protein PrP transmembranski, se bolezen laže širi med celicami, medtem ko sta protein tau in sinuklein intracelularna proteina. Kljub temu protein tau in sinuklein nekako prehajata med celicami. Lokalno prehajanje je posledica izliva agregatov v okolico po smrti celice in eksocitoze, medtem ko nove raziskave odkrivajo tudi širjenje fibrilarnih agregatov po sinaptičnih poteh bodisi zaradi degeneracije sinapse bodisi v okviru normalnega sinaptičnega delovanja.

Na podoben način se širi prionska oblika PrPSc, tako da bi imela potrditev tega mehanizma pomembne ramifikacije za zdravljenje nevrodegenerativnih bolezni. Današnje metode zdravljenja skušajo zavreti celično smrt in podaljšati življenjsko dobo nevronov, a je zdravljenje v veliki meri samo paliativno in simptomatsko (AD se zdravi z levodopo, ki se v živčnem sistemu pretvarja v dopamin, in dopaminskimi agonisti, kot so bromokriptin, pergolid, pramipeksol, kabergolin. Uporabljajo se še amantadin, biperiden in triheksifenidil, katerih funkcija ni dokončno pojasnjena[s]). Terapija z zarodnimi celicami je verjetno neučinkovita zato, ker zarodne celice niso odporne proti napačnemu zvijanju, ki ga inducirajo že napačno zviti proteini. Največ obetajo raziskave s področja razvoja protiteles, ki dajejo v miših pri tauopatijah in sinukleinopatijah spodbudne rezultate pri farmakološkem blokiranju privzema agregatov v celice. Tehnike s protitelesi bi se prav tako lahko osredotočile na proteinske agregate v celicah, ki se izločajo v ekstracelularni prostor.

8

REFERENCE

a. Dimmock N. J., et al. Introduction to Modern Virology. 6. natis. Oxford, Blackwell Publishing. 2007. ISBN 978-140-5136-45-7.

b. Riesner, D. Prionen-Krankheiten: Vom ausgefallenen Forschungsthema zur epidemiologischen Anwendung. Chemie in unserer Zeit. 1996, let. 30, št. 2, str. 66–74.

c. Hörnlimann, B., et al. Prions in humans and animals. 1. natis. Berlin, Walter de Gruyter GmbH & Co. 2007. ISBN 978-311-0182-75-0.

d. Bolton D. C., et al. Scrapie PrP 27-30 is a sialoglycoprotein. The Journal of Virology. 1985, let. 53, str. 596-606.

e. Otvos, L. jr., Cudic, M. Post-translatonal modifications in prion proteins. Current Protein & Peptide Science. 2002, let. 6, str. 643–642.

f. Manson J. C., Tuzi N. L. The murine PrP gene (Prnp), and murine and human PrP proteins. Expert Reviews in Molecular Medicine. 2001. Dostopno: http://journals.cambridge.org/fulltext_content/ERM/ERM3_12/S1462399401002952sup002.htm.

g. Prusiner, S. B., et al. Conversion of α-helices into β-sheets features in the formation of the scrapie prion proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1993, let. 90, str. 10962-10966.

h. Gambetti P., et al. A Novel Human Disease with Abnormal Prion Protein Sensitive to Protease. Annals of Neurology. 2008, let. 63, str. 697-708.

i. Prusiner, S. B., et al. Prion Protein Biology: Review. Cell. 1998, let. 93, str. 337–348.

j. Popović, M., et al. Navodila za obravnavo bolnika s Creutzfeldt-Jakobovo boleznijo. 1. natis. Ljubljana, Inštitut za varovanje zdravja Republike Slovenije. 2009. ISBN 978-961-6659-48-2.

k. Drubin, D. G., Kirschner, M. W. Tau Protein Function in Living Cells. The Journal of Cell Biology. 1986, let. 103, št. 6, str. 2739-2746.

l. Buée, L. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Research Reviews. 2000, let. 33, str. 95-130.

m. Soscia, S. J., et al. The Alzheimer’s Disease-Associated Amyloid b-Protein Is an Antimicrobial Peptide. PLoS ONE. 2010, let. 5, št. 3, str. 1-10.

n. Yu, S., et al. Extensive nuclear localization of α-synuclein in normal rat brain neurons revealed by a novel monoclonal antibody. Neuroscience. 2007, let. 146, št. 2, str. 539-555.

o. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Trinucleotide repeats: Mechanisms and patophysiology. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 2000, let. 1, str. 281-328.

9

p. Forlenza, O. V., Gattaz W. F. Influência de mecanismos colinérgicos nos processos neurodegenerativos relacionados à formação de amilóide e à fosforilação da proteína tau. Revista de Psiquiatria Clínica. 1998, let. 25, št. 3, str. 114-117.

q. Götz, J., et al. Somatodendritic localization and hyperphosphorylation of tau protein in transgenic mice expressing the longest human brain tau isoform. The EMBO Journal. 1995, let. 14, št. 7, str. 1304-1313.

r. Frost B., Diamond, M. I. Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases. Nature Reviews. 2010, let. 11, str. 155-159.

s. Picon, P. D., Beltrame A. Doença de Parkinson: Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas. Brasília: Organização Pan-Americana de Saúde Brasil. 2002. Dostopno: http://www.opas.org.br/medicamentos/docs/pcdt/do_d12_01.pdf.

10