Predavanje 1- UV-VIS Spektrofotometrija
description
Transcript of Predavanje 1- UV-VIS Spektrofotometrija
UV-VIS spektrofotometrija
Zasniva se na apsorpciji svetlosti
UV znači: ultra (iznad, preko) + violet(ljubičasto) 200-380 nm
• VIS-visible (vidljivo) 380-780 nm
Apsorpcija zračenja dovodi do prelaza valentnih elektrona iz osnovnog u pobuđeno stanje
• hν = Eviše-Eniže
• hromoforna grupa ili hromofora
Molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju
u UV –VIS delu spektra
Pobuđuju se valentni elektroni:
�sigma (σ)elektroni�pi (π) elektroni�slobodni elektronski parovi (n)
Pobuđivanje:Iz vezivne u antivezivne
Dozvoljenielektronski prelazi
σ→σ*n→σ*π→π*n→π*
Jedan elektronski prelaz-jedna apsorpciona traka A=f(λλλλ)
λ max-ona talasna dužina koju jedinjenje najviše apsorbuje
1.Mesto u spektru2. Intenzitet3. Poluširina
Apsorcijom zračenja u UV-VIS oblasti spektra pobuđuju se
• A) joni• B) elektroni bliži jezgru• C) valentni elektroni• D) protoni
Deo molekula odgovoran za apsorpciju u UV-VIS oblasti zove
se• A) Hromobara• B) Hromofora• C) Hromozom• D) Hromatin
Apsorpcioni spektar predstavlja zavisnost
• A=f (λmax )• A=f (λ) • λ =f (A)• λ =f (c)
Da li su sledeći prelazi poređani po rastućim ili opadajućim
energijama?• σ→σ*• n→σ*• π→π*• n→π*
Obeležiti oblasti spektra
Skraćenica UV znači:
• A) ultra vidljiv• B) iznad vidljive• C) ispod vidljive• D) iznad ljubičaste• E) ispod ljubičaste
Koliko je λ max ?
Šta utiče na λmax ?
1.Priroda supstanceRazličita jedinjenja imaju
različite hromofore (molekul ili deo molekula koji je odgovoran za apsorpciju u UV-VIS oblasti)
Apsorpcioni spektar benzena (1) oko 255 nm i fenola (2) oko 270 nm
180 200 220 240 260 280 300
2
1
n-π∗
π−π∗
A
λ, nm
Više dvostrukih vezapomeranje ka većim talasnim
dužinama- batohromno pomeranje
Proteini (belančevine) apsorbuju u UV oblasti spektra
Belance je belo!
Hromofore:�Peptidna veza (-CONH-)�Aromatične aminokiseline u
bočnom lancu�Prostetične grupe
UV spektri :a)proteina b) nukleinskih kiselina
Šta nije hromofora kod proteina?
• Pepridna veza• Bazne aminokiseline• Aromatične aminokiseline• Prostetične grupe
Na većoj talasnoj dužini apsorbuje
• a) benzen• b) fenol
a) Naftalenb) Antracen
Pored strukture, na položaj apsorpcione trake utiču:
• pHSlaba baza ili slaba kiselina-u jonskom
ili molekulskom obliku u zavisnosti od pH
Izobestična tačka
Provera:Kapnite par kapilimuna u čaj…
Rastvarač• Jod u etru je ljubičast
• Jod u vodi je žućkasto-braon
Šta znači reč HROMOFORA?
• Grčki:• NOSILAC BOJE chroma + phoros
Boja jedinjenja
Selektivna apsorpcijau vidljivom delu
spektra(400-800 nm)
Komplementarne bojeKomplementarno-koje se dopunjuje,nadopunjujuće
Predmeti su one boje koju reflektuju
Rastvori su one boje koju propuštaju, a ne apsorbuju
Zašto je NaCl bezbojan, a NiCl2 obojen?
11Na→1s2 2s2 2p6 3s1
Na+ →1s2 2s2 2p6 isto kao i Ne Velika E da se prevede u pobuđeno
stanje ⇒u UV oblasti
28Ni → 1s22s22p63s23p64s23d8
Ni2+ → 1s22s22p63s23p64s23d6
Mala E da se prevede u pobuđeno stanje⇒ u VIS oblasti
Koje je boje ovo jedinjenje?
600 620 640 660 680 700
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
A
λλλλ, nm
Ako neki rastvor maksimalno apsorbuje oko 300 nm, znači da je
• Obojen• Bezbojan
Šta nam govore UV-VIS spektri?
•Kvalitativna analiza:Koja supstanca je u uzorku?
Ali ne možemo biti 100% sigurni
Aktivnost enzima preko pojave ilinestanka spektara njihovih supstrata.
NADH ima maxna 340 nm
NAD+ nema max na 340 nm
Ispitivanja aktivnosti brojnih enzima kojikatalizuju
reakcije koje uključuju učešće redoks paraNAD+/NADH.
� Alkohol-dehidrogenaza katalizuje:
C2H5OH + NAD+ → CH3CHO + NADH + H+
Raste apsorbancija na 340 nm
� Sorbitol-dehidrogenaza katalizuje:
D-Fruktoza +NADH → D-Sorbitol +NAD+
• Smanjuje se apsorbancija na 340 nm
Kvantitativna analiza kolika je koncentracija?
LAMBERT-BEEROV ZAKON
Ikdb
dI =−
∫∫ =−bI
J
dbkI
dIp
00
bkI
I p =−0
ln
kbp eII −= 0
Eksponencijalni oblik Lambertovogzakona
kbp eII −= 0
Intenzitet propuštene svetlosti eksponencijalno opada sa debljinom sloja kroz koju svetlost prolazi.
U zakon se “ubacuje” i Beer sa koncentracijom…
cbaA=Apsorbancija nekog rastvora srazmerna je koncentraciji
tog rastvora, debljini sloja kroz koji svetlost prolazii apsorptivnosti rastvorene supstance.
Beerov zakon:
Lambert-Beerov zakon
A- apsorbancijaIo- intenzitet upadne svetlosti
Ip- intenzitet propuštene svetlostia-(molarni) apsorpcioni koeficijent ili (molarna) apsorptivnost
b-dužina optičkog putac-koncentracija
cbaI
IA
p
== 0log
Transparencija
• Izražava se u procentima:
• Veza između apsorbancije i transparencije:
0I
IT p=
100%0
⋅=I
IT p
TT
I
IA p 1
logloglog0
=−=−=
TT
A %log21001001
log −=⋅=
Važna veličina,jedino se može meriti
Ip
Veza između A i T
IZME ĐU 20 - 80%T, ODNOSNO 0,1 - 0,7 A
TA log−=
Kalibraciona krivaBeerov zakon:nagib=ab, odsečak
=0cbaA =
0,00,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
koncentracija
y= kx + njednačina prave
A
Metoda kalibracione krive (standardna, analitička
kriva)
A=f(c)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,00,0
0,2
0,4
Ax
cx
A
c,%
Serija standardnihrastvora (najmanje 6)
poznatih koncentracija.Sa krive se odredi
nepoznatakoncentracija
Ograničenja Lambert-Beerovog zakona
Jedan do dva reda veličine• U intervalu od 1x10-5 do 5x10-4
mol/dm3 ili1x10-4 do 1x10-3 mol/dm3
Dve grupe razloga:• Zbog rastvorka i rastvarača,
t°C slabo• Zbog aparata (pozadinsko
zračenje)
Isključivo za monohromatsku svetlost!
Izbor radne talasne dužine
Zašto je najbolja kalibraciona kriva br. 1?
Apsorbancija nije direktno srazmerna:
• a) koncentraciji• b) gustini• c) debljini sloja• d) apsorptivnosti
Direktno se može meriti
• A)apsorbancija• B) transparencija• C) koncentracija• d) rasuta svetlost
Ako je apsorbancija 0, transparencija je
• a) 0• b) 100• c) 100%• d) 50%
Ako je transparencija 0%, apsorbancija je
• A) 0• B) 100%• c) 100• d) beskonačna
Apsorbancija je srazmerna koncentraciji
• Da • Ne • Zavisi
Lambert-Beerov zakon predstavljalinearnu zavisnost
• apsorbancije od talasne dužine• apsorbancije od koncentracije• talasne dužine od koncentracije• koncentracije od apsorbancije
Instrumentimere APSORBANCIJU i
TRANSPARENCIJU• Fotometri (fotokolorimetri, kolorimetri)
• Spektrofotometri
IZVOR ZRA ČENJAMONOHROMATOR
DETEKTOR
Izvori zračenja-lampe
• VIS deo spektra: volframova lampa(360- 950 nm)
• UV deo spektra: deuterijumova i vodonična (190-420 nm)
cevi za pražnjenježivina lampa- linijske spektre
Monohromator
• Od polihromatske treba da izdvoji monohromatsku svetlost.
• Sastoji se od:1. Ulaznog i izlaznog razreza2. Sistema za kolimaciju (sočiva i ogledala)3. Disperzionog elementa: prizma ili
difrakciona rešetka
Disperzioni element
PRIZMA DIFRAKCIONA REŠETKA
U VIS oblasti spektra-stakleneU UV oblasti spektra- kvarcne
Kivete
• Staklene- za VIS oblast
• Kvarcne-za UV oblast
• Najčešće prečnika 1 cm (dužina
optičkog puta)
Kivete
Detektor: fotoćelija, fotomultiplikator i fotodiode
Intenzitet fotostruje srazmeran
intenzitetu svetlostii= k ×××× Ip
PHOTODIODE ARRAY
više desetina hiljada
dioda;
moguće merenje
istovremeno
svih talasnih dužina
iz jedne spektralne oblasti
Sheme spektrofotometra
Shema spektrofotometara
Dvozračni spektrofotometar
Fotometar
• Jednostavniji uređaji od spektrofotometara• Samo u VIS oblasti spektra• Meri se apsorbancija i transparencija obojenih rastvora-
određuje se koncentracija
Kao monohromatori FILTERI
“Vaš” fotometar
Kako izabrati filter prema boji ispitivanog rastvora?
• Boja filtera je komplementarna bojiispitivanog rastvora.
• To znači da filter treba maksimalno da propusti svetlost one boje koju rastvor maksimalno apsorbuje.
Ako merimo apsorbanciju žutom rastvoru, izabraćemo filter:
• Crveni• Zuti• Zeleni• Narandžasti• Plavi• Ljubičasti
Šta je slepa proba?
• Rastvor = rastvorak + rastvarač
• Apsorbuje i rastvorak i rastvarač• Eliminisati apsorbanciju (transparenciju)
rastvarača tako što se kazaljka instrumenta dovede na 0 apsorbancije, odnosno 100% transparencije
• Na taj način merenjem se dobija samo apsorbancija (transparencija) rastvorka.
Vežba - Fotometija
• Izmeriti apsorbanciju i transparenciju standardnog i nepoznatog rastvora
• Izračunati koncentraciju koristeći metodu standarda
Vežba - Spektrofotometrija“Vaš” spektrofotometar
Vežba - Spektrofotometrija“Vaš” spektrofotometar
Vežba - Spektrofotometrija“Vaš” spektrofotometar
Vežba: Spektrofotometrija
-snimiti apsorpcioni spektar A=f(λ)-naći λmax
-na toj talasnoj dužini izmeriti apsorbanciju standardnih rastvora (koji ste prethodno napravili)
-nacrtati kalibracionu krivu -i sa nje odrediti nepoznatu koncentraciju i
molarni apsorpcioni koeficijent
Objasniti slike
C1
C2
350 400 450 λλmax
A1
A2
A3
A
AX
340350
370
390
410
C C C C1 X 3 C
a) b)
A