Bisnis Maritim Tugas Kelompok Kelas B Dan E Kelompok 7 Revisi
PPT PCR Kelompok 2 Kelas 4 H
-
Upload
suci-uci-syafitri -
Category
Documents
-
view
296 -
download
13
description
Transcript of PPT PCR Kelompok 2 Kelas 4 H
POLYMERASE CHAIN REACTION
POLYMERASE CHAIN REACTION
Disusun oleh :
Afifah Tri Listianingtias1304015018
Frisca Natalia Manungkalit 1304015207
APA ITU PCR ?
Adalah sutau teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme.
Teknik secara in vitro
Teknik ini dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.
OLYMERASE
HAIN
EACTION
KONSEP PCR
Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu, untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.
Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
PRINSIP KERJA PCR
DENATURASI
ANNEALING
EXTENSION
DENATURASI
92C
3
5
3
5
+
5
3
5
3
9296C . Ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer.
BACK
ANNEALING
5
3
5
3
Forward primer
Reverse primer
menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Pada suhu 4560C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat.
BACK
EXTENSION
Taq
5
3
Taq
5
Atau pemajangan . Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76C.
BACK
KESELURUHAN PRINSIP PCR
DNA 1 copy
PCR
PROSES AMFIKASI SECARA EXPONENSIAL
DNA REPLICATION
YANG DIBUTUHKAN DALAM PROSES PCR
BAHAN
ALAT
Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro
BACK
Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasi
TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)
Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)
Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM. DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.
N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB) Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)
Minyak mineral ringan
Akrilamida (grade elektroforesis)
Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)
Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR
Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)
Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)
KOMPONEN PENTING PCR
DNA cetakan
Molekul deoksi-ribonukleotida
DNA Polymerase
DNA primase
DNA helikase dan DNA girase
DNA ligase
Single strand binding protein (SSB
APLIKASI PCR
Isolasi Gen
DNA Sequencing
Identifikasi Forensik
Diagnosa Penyakit
ISOLASI GEN
BACK
Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
DNA SEQUENCING
BACK
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
IDENTIFIKASI FORENSIK
BACK
Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.Banyak orang yang juga yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
DIAGNOSA PENYAKIT
BACK
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.
EVALUASI PCR
KELEBIHAN
Memiliki spesifisitas tinggi
KELEMAHAN
Sangat mudah terkontaminasi
Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
Dapat membedakan varian mikroorganisme
Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
Mudah di set up
Biaya peralatan dan reagen mahal
Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten)
Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya.