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… de outubro de 2016
C A M E V E TCódigo: 000
TRÂMITE IDATA: … de outubro de 2016
GUIA DE PROVA DE POTÊNCIA PARA VACINAS INATIVADAS BOVINAS QUE CONTENHAM EM SUA FORMULAÇÃO O VÍRUS
DA DIARREIA VIRAL BOVINA
Guia n° 2 - G.V.
AUTORES PROSAIA
Participaram da confecção deste guia os seguintes especialistas (listados por ordem alfabética), que formam o grupo ad hoc do Vírus da Diarreia Viral Bovina da Fundação PROSAIA:
AUTOR PRINCIPAL
Dra. Viviana Parreño (Instituto de Virologia / INCUINTA CICVeA, INTA Castelar. Pesquisadora Independente CONICET)
AUTORES SECUNDÁRIOS
Dr. Gustavo Combessies (Laboratório Azul)
Dr. Fernando Fernández (INTA. Coordenador Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento)
Dra. Valeria Gonzalez Thomas (Analista Profissional do Departamento de Controle de Vacinas da Coordenação de Virologia. Direção de Laboratório Animal. Direção Geral de Laboratório e Controle Técnico. Serviço Nacional de Sanidade e Qualidade Agroalimentar – SENASA)
Dr. Alejandro Ham (Laboratório Biogênese Bagó S.A. - CAPROVE).
Dr. Darío Malacari (Laboratório CRESAL Veterinária S.A.)
Dr. Anselmo Odeón (INTA Balcarce)
Dra. Andrea Pecora (Instituto de Virologia , CICVeA, INTA Castelar. Pesquisadora Assistente - CONICET)
Dra. Maria Sol Perez Aguirreburualde (Instituto Patobiologia, INTA Castelar)
Dra. Sandra Tobolski (Laboratório Biogênese Bagó S.A. - CAPROVE).
Dra. María Marta Vena (Médica veterinária. Consultora independente em pesquisa e desenvolvimento e assuntos regulatórios).
Dr. Andres Wigdorovitz (INCUINTA, CICVeA, INTA Castelar, Pesquisador INDEPENDIENTE CONICET)
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Responsável pela coordenação do grupo: Javier Pardo – Médico veterinário (Fundação PROSAIA).
Tabela de conteúdos
Prólogo ...............................................................................................................................31. Introdução.........................................................................................................................52. Guia: Controle de potência em cobaias.............................................................................62.1. Esquema da prova..........................................................................................................72.1.1. Cobaias........................................................................................................................72.1.2 Procedimento...............................................................................................................72.1.3. Interpretação................................................................................................................82.1.4. Critério de validação do teste......................................................................................82.1.5. Cálculos.......................................................................................................................92.1.6. Critério de aprovação..................................................................................................93. Harmonização de ensaios para a região............................................................................94. Referências......................................................................................................................10
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PROVA DE POTÊNCIA PARA VACINAS INATIVADAS BOVINAS QUE CONTENHAM EM SUA FORMULAÇÃO O VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA
1. INTRODUÇÃO
O Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB) pertence ao gênero pestivírus da família
Flaviviridae (Ridpath, 2005). O VDVB se classifica em genótipos (1 e 2). O genótipo 1, por sua
vez, pode ser subdividido em 17 subgenótipos e o genótipo 2, em 3 subgenótipos (Giammarioli,
Pellegrini, Casciari, Rossi, & De Mario, 2008). Os dois genótipos podem ser diferenciados entre si
mediante análises genéticas e com a utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) dirigidos contra
as glicoproteínas principais do invólucro E2 e ERNS (Nettleton, Paton, & Bela, 1997).
Recentemente, foi proposta a inclusão de uma nova espécie conhecida como “Vírus Hobi” ou
“VDVB-3” (Shi et al., 2016). O VDVB pode apresentar dois biótipos: o não-citopatogênico
(NCP) e o citopatogênico (CP), classificados conforme os efeitos visíveis (lesões) gerados nos
cultivos celulares epiteliais (Ouisa, Assieb, & Rchambaulta, 2005). Em geral, o biótipo NCP é o
que aparece com maior freqüência em bovinos.
Na Argentina, os dados reportados por Odeón e colaboradores, a partir de um levantamento
sorológico realizado em três regiões do país (Buenos Aires, La Rioja e Corrientes), revelaram uma
elevada prevalência (48,6% - 90,7%) de anticorpos contra o VDVB 1ª, em bovinos adultos (acima
de 2 anos), indicando uma ampla distribuição e exposição a este vírus no rebanho bovino dessas
províncias argentinas (Odeón et al., 2001). Em concordância com estes dados, relatórios mais
recentes descrevem prevalências de 79.8% (77.9%-80.8%) em animais adultos, em rebanhos de
criação da Província de Chubut (Pérez Aguirreburualde, 2014)(Pérez A., 2014). Quanto às
variantes virais que circulam na Argentina, o subgenótipo 1b do VDVB é o mais comum
(atingindo 70% dos isolamentos), seguido pelo subgenótipo 1a e pelo genótipo 2 (Pecora et al.,
2014; Pecora, Pérez Aguirreburualde, Zabal, & Dus Santos, 2017). Estas porcentagens variam de
acordo com o país. No Brasil, 80% dos isolamentos analisados, no último estudo epidemiológico
publicado, pertencem ao VDVB-1a, VDVB-2b e Vírus Hobi-like (também conhecido como
VDVB-3) (Silveira et al., 2015, 2017)(Silveira et al., 2015). No México, recentemente, reportou-se
a predominância do subgenótipo 1c do VDVB, entre 60 isolamentos estudados neste país (Gomez-
Romero, Basurto-Alcantara, Verdugo-Rodriguez, Bauermann, & Ridpath, 2017)
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No último estudo filogenético realizado no Uruguai, a maioria dos isolamentos do VDVB
analisados foi agrupada dentro do subgenótipo 1a, embora tenham sido encontrados também
isolamentos VDVB-1i e VDVB-2b (Maya et al., 2016). No Chile, encontrou-se porcentagens
similares de isolamentos VDVB-1 e VDVB-2 (Pizarro-Lucero et al., 2006). Nos Estados Unidos,
alguns trabalhos indicam que o subgenótipo 1b é o mais frequente em rebanhos bovinos (Fulton,
2015; Ridpath et al., 2011).
Embora seja um vírus ubíquo, vários países da União Europeia implantaram planos para o
controle/erradicação da diarreia viral bovina, baseados na detecção e na eliminação de animais
persistentemente infectados (PI) (Ståhl & Alenius, 2012).
Infecção aguda
É a forma clássica desta doença. Provavelmente, a rota de transmissão seja através das vias
orofaríngeas e respiratórias. O animal pode se infectar com um biótipo CP ou NCP e desenvolver
uma afecção respiratória, digestiva ou reprodutiva. O resultado pode ser uma infecção subclínica
ou uma doença severa com uma alta incidência de mortalidade, que pode vir acompanhada de
trombocitopenia e diátese hemorrágica, dependendo do genótipo do vírus atuante (Ridpath, 2005).
A afecção respiratória pode ser uma das manifestações da infecção generalizada pelo VDVB e
alguns investigadores associam esta doença com as cepas do subgenótipo 1b (Fulton et al., 2002).
O tropismo deste vírus pelo sistema imunológico ao infectar as células brancas, causando depleção
de linfócitos B e T circulantes, resulta em uma imunossupressão temporária que favorece a
infecção com outros patógenos (Bolin, 2002).
Existe evidência epidemiológica e experimental de que o VDVB está diretamente
associado ao Complexo Respiratório Bovino (CRB); interagindo com patógenos como o Vírus
Sincicial Respiratório (VRS), Parainfluenza bovina tipo 3 (PI-3), Herpesvírus Bovino Tipo 1
(Rinotraqueíte infecciosa bovina, IBR), Mannheimia haemolytica; Mycoplasma bovis; etc
(Grissett, White, & Larson, 2015).
Infecção congênita
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As consequências da infecção fetal causada pelo VDVB dependem do momento da
exposição ao vírus durante a gestação e está associada à disseminação transplacentária durante a
viremia. Se a infecção fetal ocorrer entre 0 a 45 dias da gestação, esta pode causar morte
embrionária; uma infecção entre 45 a 175 dias da gestação pode provocar aborto, defeitos
congênitos e/ou imunotolerância. Se a infecção ocorrer entre os dias 125 e 285, poderá provocar
aborto e nascimento de bezerros fracos, embora também seja comum o nascimento de bezerros
normais com anticorpos neutralizantes pré-colostro contra o VDVB (Malacari, Pecora, Capozzo,
& Odeón, 2016). A infecção venérea pode ocorrer quando são utilizados touros infectados de
forma aguda ou PI. A contaminação do sêmen com o VDVB ocorre porque este replica na
vesícula seminal e na glândula prostática. O sêmen infectado apresenta diminuição em sua
motilidade espermática e um aumento porcentual nas anormalidades morfológicas dos
espermatozóides (González Altamiranda et al., 2012; Ridpath, 2005). Um fator de risco ocasional
pode ser a presença de touros não virêmicos, mas com infecção testicular persistente, os quais
eliminam os vírus através do sêmen, de forma contínua.
Infecção persistente
Os animais PI são produtos da infecção transplacentária durante a gestação entre 35 a 125
dias. Acredita-se que o requisito para a geração da persistência recaia sobre a exposição ao vírus
quando o sistema imune do feto está em desenvolvimento (entre 40 a 125 dias). Este quadro está
associado à infecção por biótipos NCP e os animais infectados passam a ser os principais
transmissores da doença. Os animais PI são imunotolerantes aos vírus homólogos do VDVB; no
entanto, resultam imunocompetentes às cepas heterólogas do VDVB e também a outros agentes
infecciosos como HVBo, PI-3, etc. (Lanyon, Hill, Reichel, & Brownlie, 2013). Nos animais
persistentemente infectados (PI), o VDVB persiste em todos os tecidos, especialmente nas células
do sistema imune (Peterson, 2010).
Doença das mucosas
A doença das mucosas (DM) é uma manifestação esporádica da infecção pelo VDVB, que
acomete os animais PI ao serem infectados pelo biótipo CP. A presença do biótipo CP pode ser
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externa por sobre-infecção com biótipos CP homólogos (Ridpath, 2005), ou então, em decorrência
de rearranjos moleculares (mutação) na cepa NCP persistente (i.g. deleções, inserções, duplicações
de sequências virais e inserções de sequências do hospedeiro), originando assim a cepa CP. A
doença apresenta sinais clínicos severos (incluindo leucopenia severa, diarreia profusa, erosões e
ulcerações em todo o aparelho digestivo), baixa morbidade e uma letalidade próxima a 100%. A
DM pode apresentar um curso agudo ou crônico, dependendo da homologia entre o VDVB NCP e
o CP que acomete o animal PI (Bolin, 1995).
Síndrome hemorrágica
Esta síndrome, associada a infecções agudas com cepas do VDVB do genótipo 2, provoca
nos bovinos diarreia com sangue, epistaxe, congestão na conjuntiva e mucosas, hemorragias
petequiais e equimóticas nas mucosas, pirexia, leucopenia, linfopenia e neutropenia, com altas
taxas de mortalidade (Ridpath, Neill, Vilcek, Dubovi, & Carman, 2006).
Exames sorológicos
Os anticorpos induzidos após a infecção ou com a vacina contendo o VDVB presentes no
soro dos bovinos, podem ser detectados mediante técnicas clássicas de neutralização viral (NV) ou
mediante o teste de ELISA. Em cada teste, devem ser incluídos soros controles positivos e
negativos. Os resultados dos mesmos devem estar dentro dos limites predeterminados para que os
testes sejam considerados válidos/satisfatórios.
Observação sobre o teste NV
Para a realização do teste de NV são utilizadas cepas de VDVB CP para simplificar a
leitura dos resultados através do microscópio óptico. Algumas das cepas CP, amplamente
utilizadas, são “Singer”, “Oregon C24V” e “NADL”, pertencentes ao genótipo 1 do VDVB.
No caso específico dos estudos de prevalência, em virtude da variabilidade antigênica
detectada entre as cepas, com base na proteína E2 e considerando que a maior parte dos
anticorpos neutralizantes são gerados contra dita proteína, para realizar os testes de NV é
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conveniente tomar a precaução de selecionar cepas do VDVB apresentando suficiente semelhança
antigênica com as variantes virais circulantes no gado local (Pecora et al., 2014).
Por outro lado, quanto aos estudos experimentais de eficácia/imunogenicidade vacinal, os
ensaios de VN deveriam ser realizados empregando a mesma cepa utilizada na formulação da
vacina, ou uma cepa que apresente uma relação suficiente de homologia com a cepa vacinal.
No que diz respeito aos testes comerciais de ELISA disponíveis no mercado, em sua
maioria, estão baseados na detecção de anticorpos contra as proteínas virais não estruturais do
VDVB, tais como NS3 ou Erns, as quais se mantêm extremamente conservadas entre cepas de
diferentes genótipos. Esta estratégia superaria as limitações previamente descritas para o ensaio de
NV, quanto à variabilidade antigênica entre cepas.
Vacinas
As vacinas contra o VDVB podem ser de dois tipos: as formuladas com o vírus atenuado
ou aquelas produzidas com o vírus inativado. As vacinas produzidas com o vírus atenuado
geralmente dão uma resposta imune mais consistente no que tange à proteção proporcionada, em
comparação com as vacinas inativadas. No entanto, o uso destas vacinas está associado a vários
riscos. Em primeiro lugar, não podem ser aplicadas em fêmeas gestantes, pois podem provocar
infecção fetal e aborto. Por sua vez, a vacinação em animais PI com cepas atenuadas poderia
induzir quadros de DM. Finalmente, deve-se levar em conta que toda vacina viva contendo uma
cepa mal atenuada pode trazer riscos, ou uma reversão à virulência da cepa vacinal, com efeitos
indesejados.
As vacinas de vírus inativados, embora sejam muito mais seguras do que as atenuadas,
precisam ser administradas em várias doses para obter níveis satisfatórios de imunidade e devem
ser formuladas com adjuvantes ou imunomoduladores.
Na Argentina, a autoridade Nacional de Sanidade Animal (SENASA) autoriza, unicamente,
a fabricação de vacinas contendo o vírus inativado. E, somente, em 2012, foram apresentadas para
controle oficial 218 séries, equivalentes a um total de 50.770.794 doses de vacinas virais não
vesiculares bovinas. A partir da implementação da Resolução 598 de 2012, o SENASA dá início
ao controle de potência das vacinas bovinas não vesiculares, mediante o modelo com cobaias.
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Foram descritas vacinas experimentais de subunidades baseadas na glicoproteína E2 do
VDVB, gerada em diversos sistemas de expressão, como os baculovírus em células de insetos, ou
em células de mamíferos. Estas vacinas abrem uma perspectiva futura em termos de “vacinas
marcadoras” ou “DIVA” (discriminate between infected and vaccinated animals), quando forem
utilizadas juntamente com um teste sorológico complementar, que permite distinguir os animais
vacinados dos infectados (van Oirschot, 2001).
Seja qual for o tipo de vacina utilizada para proteger os bovinos contra o VDVB, a
profilaxia deveria vir acompanhada da eliminação dos animais PI, de um programa de controle dos
animais introduzidos no rebanho e do controle do sêmen utilizado.
Pelo que sabemos, não há, na região, um critério unificado para avaliar a eficácia das
vacinas inativadas, contendo em sua formulação o VDVB.
2. GUIA: PROVA DE POTÊNCIA EM COBAIAS
Este guia descreve um teste in vivo em animais de laboratório (cobaias), que permite
avaliar a potência (imunogenicidade) de vacinas de vírus inativado ou de subunidades utilizadas na
prevenção da infecção causada pelo VDVB.
Para a validação do modelo, foram seguidas as recomendações internacionais em matéria
de validação de métodos de controle de vacinas veterinárias, em particular, de vacinas combinadas
(EMEA/P038/97, 1998)(RE, 2001). Paralelamente, foram avaliadas, em bovinos e cobaias, vacinas
experimentais e comerciais, formuladas em adjuvantes oleosos e aquosos, contendo a valência
VDVB, combinadas com concentrações variáveis de outros antígenos virais (HVBo, PI-3, VRSB)
e bacterianos (Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,Histophilus sommi, Leptospira sp
y Campylobacter fetus). A imunogenicidade, aferida em ambas as espécies, com o título de
anticorpos neutralizantes contra o VDVB pós vacinação, demonstrou índices de concordância
quase perfeitos entre o modelo cobaia e a espécie de destino. O detalhamento técnico e estatístico
da validação está incluso no ANEXO I deste guia. Este teste pode ser utilizado para o controle de
qualidade de cada série da vacina do VDVB a ser liberado no mercado, sendo uma ferramenta
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prática tanto para as empresas produtoras de vacinas, quanto para o órgão de controle oficial,
garantindo, assim, a presença no mercado de produtos padronizados e eficazes.
No que tange ao bem-estar animal, esta prova atende às diretrizes dos órgãos
internacionais ao substituir e reduzir significativamente o emprego de animais em testes
experimentais (Akkermans and Hendriksen, 1999; Halder et al., 2002; Hendriksen, 2009).
O modelo cobaia desenvolvido, é um ensaio in vivo, mediante o emprego de um número
mínimo de animais (n=6 por vacina e 2 testemunhas/placebos), assegurando um resultado com
uma confiança de 95% (ANEXO1). Além disso, permite avaliar a imunogenicidade induzida para
todos os antígenos virais que a compõem, em vacinas combinadas polivalentes. Este modelo
também resulta apto para avaliar a imunogenicidade de vacinas de subunidades, com base na
proteína E2 ao induzir Ac neutralizantes (Pecora et al., 2015).
2.1 Esquema da prova
2.1.1 Cobaias
São utilizados, no mínimo, 6 animais para cada vacina, com uma idade acima de 30 dias e
um peso de 400 gramas ± 50 gramas, provenientes de uma colônia controlada, isentos de Ac
contra o VDVB. Podem ser utilizados machos ou fêmeas, mas cada grupo deve conter animais do
mesmo sexo, com um prazo de adaptação, após o ingresso na sala de inoculação, de 7 (SETE)
dias, no mínimo.
2.1.2 Procedimento
As cobaias são imunizadas com duas doses de vacina (em um intervalo de 21 dias), por via
subcutânea, com um volume equivalente a 1/5 da dose bovina. Os animais são mantidos sob
estudo durante, pelo menos, 30 dias e são colhidas amostras de soro após 9 dias da revacinação
(30 DPV). Juntamente com a avaliação da/s vacina/s incógnitas (n=6), deve-se incluir um grupo de
animais testemunhas não vacinados (n=2), bem como um grupo de cobaias vacinadas com uma
vacina de referência de potência conhecida (n=6). Após 30 (trinta) dias do início do controle, os
animais vacinados e os animais testemunhas são sangrados, realizando neles o controle sorológico
mediante a técnica da NV (ANEXO II).
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2.1.3 Interpretação
A análise da regressão linear do título de anticorpo determinado pela técnica da NV,
realizada durante a validação do modelo cobaia para a valência VDVB, indicou que a resposta de
anticorpos induzida pelas vacinas com o VDVB, em bovinos e cobaias, foi diretamente
proporcional à concentração de antígeno (Ag) contido na vacina (ensaio dose-resposta) (ANEXO
1).
O modelo cobaia foi capaz de discriminar significativamente entre vacinas aquosas e
oleosas, formuladas com concentrações de Ag de 1 log de diferença (ANEXO 1)m
A partir dos resultados obtidos na curva dose-resposta, foram calculados pontos de corte ou
níveis de títulos de Ac neutralizantes que permitem diferenciar as vacinas, de acordo com a
imunogenicidade induzida em cobaias e bovinos.
Foi estabelecido um ponto de corte que permite discriminar entre vacinas de baixa
imunogenicidade e de imunogenicidade satisfatória (Tabela 1) (consultar detalhes técnicos da
validação no ANEXO I).
Tabela 1 Pontos de corte de classificação de vacinas para VDVB 2016
ESPÉCIEPOTÊNCIA DA VACINA Ac anti-VDVB
Não Satisfatória Satisfatória Muito Satisfatória
COBAIA ȳ < 1,37 1,37 ≤ ȳ ≤ 2,0 2,0 < ȳ
BOVINO Ȳ < 1,54 1,54 ≤ Ȳ ≤ 2,13 2,13 < Ȳ
Tabela 1. Pontos de corte determinados como o log10 do titulo de anticorpos neutralizantes
presentes no soro de cobaias e bovinos vacinados com a vacina incógnita. (y) Título médio de Ac
de grupos de 5 cobaias, avaliado a 30 dias pós-vacinação (dpv); (Y) grupos de 5 bovinos
avaliados a 60 dpv. Os bovinos recebem duas doses de vacina com um intervalo de 30 dias e são
colhidas amostras a 0 e 60 dpv. As cobaias recebem duas doses de vacina (1/5 do volume da
dose bovina), com um intervalo de 21 dias e são colhidas amostras a 30 dpv.
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Vacinas com títulos de Ac neutralizantes acima de 1,37 em cobaias e acima de 1,54 em
bovinos foram associados a vacinas de imunogenicidade satisfatória. No entanto, vacinas que
induzem títulos de Ac inferiores aos mencionados pontos de corte são consideradas não
satisfatórias. (ANEXO I).
2.1.4 Critério de validação da prova das cobaias
Será considerada válida a prova de potência em cobaias, quando a média obtida do título
de Ac dos animais vacinados, com uma vacina de referência, de qualidade satisfatória, estiver
dentro do valor esperado (acima de 1,37 em cobaias e 1,54 em bovinos), e as cobaias controles
não vacinadas (testemunhas) permanecerem soronegativas para Ac neutralizantes contra VDVB
durante toda a experiência.
2.1.5 Cálculos
Serão avaliados todos os soros dos seis animais imunizados com a vacina controlada. Serão
selecionados 5 (CINCO) soros com o maior título obtido (expressado em log10 do inverso da
máxima diluição com atividade neutralizante) e sobre eles será calculada a média aritmética.
2.1.6 Critério de aprovação
Se a média do log10 dos títulos de Ac neutralizantes a 30 dpv nas cobaias vacinadas for
superior ou igual a 1,37, a vacina será considerada satisfatória.
3. HARMONIZAÇÃO DE ENSAIOS PARA A REGIÃO
É recomendável contar com um painel de soros controles positivos e negativos para
anticorpos contra o VDVB, bem como vacinas de referência. Estes reagentes de referência locais
serão utilizados para harmonizar os resultados obtidos em cada laboratório de ensaios que adotar
este método de controle. A vacina de referência permitirá estabelecer a conformidade do ensaio da
imunização das cobaias e o painel de soros, por sua vez, poderá ser utilizado como controle da
técnica sorológica recomendada (NV) e para a padronização de outros ensaios alternativos
(ELISA).
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4. REFERÊNCIAS
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