Perspektiven für die wirkungsbezogene Analytik · J Planar Chromatogr, in print. Multidetektion ....
Transcript of Perspektiven für die wirkungsbezogene Analytik · J Planar Chromatogr, in print. Multidetektion ....
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Gertrud Morlock, Chair of Food Science, Justus Liebig University Giessen and
TransMIT Centre for Effect-Directed Analysis, Giessen
Perspektiven für die wirkungsbezogene Analytik
als behördliches Werkzeug
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1. Flexibilität
2. Robustheit
3. Validierung
4. Schnelligkeit
5. Kosteneffizienz
6. Weiterbildung
Anforderungen
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Wirkungsbezogene Analytik
Warum Summenparameter, wenn es besser geht?
Warum Mainstream-Chromatographie, wenn es besser geht?
Besser = schneller = kostengünstiger = mehr Info = Einzelsubstanz
Mainstream → Normung
Übersehen wir das Wesentliche?
W. Kreiss et al. Anal Bioanal Chem 398 (2010) 2081
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Wirkungsbezogene Analytik
HPTLC-UV/Vis/FLD-bioassay-HRMS/ATR-FTIR/NMR
G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121
• Umfassend (comprehensive) • Verbunden (hyphenated) • In situ
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1. Flexibilität
2. Robustheit
3. Validierung
4. Schnelligkeit
5. Kosteneffizienz
6. Weiterbildung
Anforderungen
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G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121
Flexibilität und Robustheit
• Probenkonzentration und –art, z. B. ohne Extraktion/Anreicherung
• Fragestellung und Tiefe der Bearbeitung, z. B. Multidetektion
• Potentielle Wirkungen
→ Verschiedene Assays
→ Übertragung neuer Assays
→ Zuverlässiges Fingerprinting
→ Auswertung mit MVDA oder ANN
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n Probenkonzentration und -art
I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104
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n Probenkonzentration und -art
I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104
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Video zu Bier → https://youtu.be/Q7AGuljcFvQ
G. Morlock and I. Klingelhöfer, 2016, JLU Giessen
Probenkonzentration und -art
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G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121
Flexibilität und Robustheit
• Probenkonzentration und –art, z. B. ohne Extraktion/Anreicherung
• Fragestellung und Tiefe der Bearbeitung, z. B. Multidetektion
• Potentielle Wirkungen
→ Verschiedene Assays
→ Übertragung neuer Assays
→ Zuverlässiges Fingerprinting
→ Auswertung mit MVDA oder ANN
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Vis UV FLD NP PEG AS DAP DPPH* A.f. AChE B.s.
Pimpinella saxifraga L. root
G. Morlock, T. Lapin, J Planar Chromatogr, in print
Multidetektion
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n Plate section VIII
G. Morlock, T. Lapin, J Planar Chromatogr, in print
Multidetektion
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G. Morlock, www.uni-giessen.de/food → Research
…all info in a single run ….or fingerprinting in parallel
Multidetektion
1 2
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G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121
Flexibilität und Robustheit
• Probenkonzentration und –art, z. B. ohne Extraktion/Anreicherung
• Fragestellung und Tiefe der Bearbeitung, z. B. Multidetektion
• Potentielle Wirkungen
→ Verschiedene Assays
→ Übertragung neuer Assays
→ Zuverlässiges Fingerprinting
→ Auswertung mit MVDA oder ANN
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n Zuverlässiges Fingerprinting 50 Deutsche Biere im Vergleich
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P. Ristivojević, G. Morlock, in submission
Welches Bier ist empfehlenswert?
Auswertung mit MVDA
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1. Flexibilität
2. Robustheit
3. Validierung
4. Schnelligkeit
5. Kosteneffizienz
6. Weiterbildung
Anforderungen
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n Validierung
→ Zuverlässiges wirkungsbezogenes Fingerprinting
• Multidetektion
• Bioquantifizierung
• Negativkontrolle
• Positivkontrolle
• Equivalentberechnung
• Clustern mit ANN, t-SNE
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n Bioquantifizierung
pg/band E1 25 – 1000 EE2 0.5 – 20 E2 0.5 – 20
E3 25 – 1000
I. Klingelhöfer, G. Morlock, J. Chromatogr. A 1360 (2014) 288-295
Dosis/Wirkungskurven Scharfe Peaks noch nach
24 h in wässrigem Medium!
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I. Klingelhöfer, G. Morlock, J. Chromatogr. A 1360 (2014) 288-295
Bioquantifizierung
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n Bioquantifizierung
I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104
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I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104
Bioquantifizierung
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y = 56.495x - 1719.7 R² = 0.9956
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
20 70 120 170 220H
PTLC
-pYE
S flu
ores
cenc
e si
gnal
, pea
k ar
ea [A
U]
Amount of CAPE [ng/zone]
G. Morlock, I. Klingelhöfer, Anal. Chem. 86 (2014) 8289–8295
Bioquantifizierung
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n → Beer samples
I. Klingelhöfer, G. Morlock, J Chromatogr A 1360 (2014) 288-295; wine in preparation
→ Spices
→ Wine
Bioquantifizierung
Weißwein
a b c
d e
A B C b c
f g
A B C
Roséwein
b c
g
A B C
Rotwein
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→ Comprehensive information by non-target bioprofiling
→ High-resolution mass spectrometry for unknown active ingredients
→ Completes risk assessmeent
C.. Stiefel, T. Schubert, G. Morlock, ACS Omega 2 (2017) 5242−5250
Bioquantifizierung
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n Quantitative HPTLC-EDA-DART-MS
Reliable quantification → Mean r2 of 0.9992 → Mean deviation 4.6% (A. fischeri vs. pYES)
T. Häbe, M. Jamshidi-Aidji, J. Macho, G. Morlock (2017) in preparation
Parabens?
Bioactives?
Bioquantifizierung - Methodenvergleich
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n Negativkontrolle etc.
Negative control A: UV 366 nm B: HPTLC-placebo pYES:
same procedure like for pYES, but without yeast cells in medium
Typical 4-methylumbelliferone fluorescence is not observed. Standard addition Oversprayed application A: Sample B: Oversprayed application of
sample and CAPE C: HPTLC-pYES of sample
Overlapped application D: HPTLC-pYES using
overlapped application
1
2
3
1
2 3
G. Morlock, I. Klingelhöfer, Anal. Chem. 86 (2014) 8289–8295
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n Equivalentberechnung, Positivkontrolle
M. Jamshidi-Aidji, G. Morlock Anal Chem 88 (2016) 10979−10986
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→ Bioquantification of known bioactive substances IC50 of CT: 65 ng/band → equivalent to 365 μg S1 and 203 μg S2 root powders
→ Biological equivalent contents of unknown bioactive substances
→ Antimicrobial equivalency of natural antibiotic and synthetic antibiotics → 1 ng/band CT ~ 0.6 ng/band ciprofloxacin ~ 2 ng/band marbofloxacin
M. Jamshidi-Aidji, G. Morlock Anal Chem 88 (2016) 10979−10986
S. m. roots S1 S2
Biodensitometry/densitometry
CT content (mg/g) 1.8/1.6 3.2/3.9
Repeatability (%RSD, n=2) 8.7/0.4 7.0/0.9
Intermediate precision (%RSD, n=3)
16.3/1.4 15.2/1.6
Mean CT bioequival. content ± SD (mg/g, n=2)
a 1.1 ± 0.1 2.2 ± 0.0
c 2.7 ± 0.0 < LOD
Equivalentberechnung, Positivkontrolle
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M. Jamshidi-Aidji, E. Hauck, G. Morlock, 2016, JLU Giessen
Video zu Salbei www.youtube.com/watch?v=_htlxuKajH0
Workflow, Equivalentberechnung
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D. Fichou und G. Morlock, in Vorbereitung
Auswertung mit ANN
D. Fichou, G. Morlock, in preparation
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D. Fichou, G. Morlock, in preparation
Auswertung mit ANN
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D. Fichou und G. Morlock, in Vorbereitung
Auswertung mit ANN
D. Fichou, G. Morlock, in preparation
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n AChE, BChE, α/ß-glucosidase, amylase, tyrosinase, xanthinoxidase…
Quantitative Enzymhemmung
M. Jamshidi-Aidji, G. Morlock, in preparation
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1. Flexibilität
2. Robustheit
3. Validierung
4. Schnelligkeit
5. Kosteneffizienz
6. Weiterbildung
Anforderungen
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n Schnelligkeit und Kosteneffizienz
• Reduzierte Probenvorbereitung
• Einfacher Arbeitsablauf
• Parallele Trennung
• Multidetektion
• Simultane Detektion vieler Proben
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8:00 20 Proben anreichern durch Auftragen
8:45 Parallele Trennung
9:30 Simultane Derivatisierung & Assays
13:00 Hotspots: HRMS
14:00 Auswertung, MVDA, ANN, t-SNE…
Schnelligkeit im Alltag
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n … max. 2 Tage 50 Deutsche Biere im Vergleich
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Benchmarking Küvettenassay HPTLC-Bioassay
Laufende Kosten (Euro)
- Mobile Phase - 0,012
- Stationäre Phase - 0,30
- Küvette 0,21 -
- Assay 1,15 0,10
Summe (Euro) 1,36 0,41
Günstiger (Faktor) → 3-fach
Probendurchsatz/Tag 137 368
Schneller (Faktor) → 3-fach
Küvettenassay versus HPTLC-Bioassay
… vor allem aber kommt noch dazu:
Reduzierte Probenvorbereitung und kaum Matrixeinfluss auf Assay!
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1. Flexibilität
2. Robustheit
3. Validierung
4. Schnelligkeit
5. Kosteneffizienz
6. Weiterbildung
Anforderungen
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n Weiterbildung nötig
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[M-H]-
Estron
Identification: Targeted
Bioassay: Non-targeted
Sample fingerprinting and profiling
Wirkungsbezogene Analytik
HPTLC-UV/Vis/FLD-bioassay-HRMS
1. Flexibilität
2. Robustheit
3. Validierung
4. Schnelligkeit
5. Kosteneffizienz
6. Weiterbildung
G. Morlock, www.uni-giessen.de/food → Research
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A. Móricz, P. Ott, G. Morlock: Discovered acetylcholinesterase inhibition and antibacterial activity of polyacetylenes in tansy root extract via effect-directed chromatographic fingerprints, in submission
Tanacetum vulgare L. root
Beispiele
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n
A. Móricz et al.: Effect-directed analysis via hyphenated HPTLC for bioanalytical profiling of sunflower leaves, in submission
Helianthus annuus L. leaf
Beispiele
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n Beispiele
Coumarin-containing food products
S. Krüger, L. Winheim, G. Morlock, Food Chem 239 (2018) 1182-119
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n
S. Krüger et al., Effect-directed fingerprints of 77 botanicals via a generic high-performance thin-layer chromatography method combined with assays and mass spectrometry, J Chromatogr A 1529 (2017) 93-106
Generic method for 77 botanicals
Beispiele
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n Beispiele
Vanilla and its food products
M. Busso et al.: Effect-directed analysis and bioprofiling of 32 vanilla products, characterization of multi-potent compounds and quantification of vanillin and ethyl vanillin via HPTLC-UV/Vis/FLD-EDA-HRMS, in preparation
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n
T. Shen, H. Zorn, G. Morlock, Fungal Biology and Biotechnology (2015) 2:8
Broths of Basidomycetes monitored over fermentation time
Bioluminescence of Aliivibrio fischeri after 3 min
Bioluminescence of Aliivibrio fischeri after 30 min
Beispiele
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n Salicaceae bud extracts
S. Hage, G. Morlock J. Chromatogr. A 1490 (2017) 201-211
Beispiele
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Biological detection of antibiotics
Beispiele
Salvia officinalis
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n Fresh and dried elderberries
S. Krüger, M. Mirgos, G. Morlock, J. Chromatogr. A 1426 (2015) 209-219
Beispiele
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n Ginger (Zingiber officinale) and its food products
S. Krüger, A. Bergin, G. Morlock, Food Chem. 243 (2018) 258-268
Beispiele
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ce
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n
Y. Chen, G. Morlock, Chromatographia 79 (2015) 89-96
Protoberberines and ephedrines in herbal drugs for TCM
(Phelodendron, Coptis, Tinospora and Ephedra)
Beispiele
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n
G. Morlock, The Analytical Scientist, 27-04 (2015) 42-43 Taha, M.T., Krawinkel, M.B., Morlock, G.E., J. Chromatogr. A 1394 (2015) 137-147
Stored milk thistle
Beispiele
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n