Caractersticas de crecimiento modelado deLactobacillus acidophilususando RSM y ANNGanga Sahay MeenaI,*;Nitin KumarI;Gautam Chandra MajumdarI;Rintu BanerjeeI;Pankaj Kumar MeenaII;Vijesh YadavIIIBiotecnologa Microbiana y Laboratorio de Procesamiento de Downstream;Departamento de Ingeniera Agrcola y Alimentaria;Instituto Tecnolgico de la India;KharagpurIIPor Laboratorio de Productos;Dairy Dairy Research Institute Nacional de la Divisin de Tecnologa;Karnal - HaryanaRESUMENLas condiciones de cultivo a saber.contenido de carbono y de nitrgeno adicional, el tamao del inculo, la edad, la temperatura y el pH deLactobacillus acidophilusse optimizaron usando la metodologa de superficie de respuesta (RSM) y de la red neuronal artificial (ANN).Modelos de crecimiento cinticos se ajustaron a los cultivos de un Box-Behnken Diseo (BBD) experimentos de diseo para diferentes variables.Este concepto de la combinacin de la optimizacin y modelado presenta diferentes condiciones ptimas para el crecimiento de L. acidophilus de su estudio de optimizacin inicial.A travs de estas herramientas estadsticas, el rendimiento del producto (masa celular) deL.acidophilusse increment.Los coeficientes de regresin (R2) de ambos las herramientas estadsticas predijeron que ANN era mejor que la de RSM y la ecuacin de regresin fue resuelto con la ayuda de algoritmos genticos (GA).El porcentaje normalizado error cuadrtico medio obtenido a partir de los modelos de RNA y RSM fueron 0,06 y 0,2%, respectivamente.Los resultados demostraron una mayor precisin de la prediccin de ANN en comparacin con RSM.Palabras clave:metodologa de superficie de respuesta (RSM), redes neuronales artificiales (ANN), algoritmos genticos (GA), Box-Behnken besign (BBD)INTRODUCCINLactobacillusson los miembros ms prominentes de la clase pltora de especies bacterianas con propiedades probiticas.La popularidad de estas bacterias del grupo se basa en los milenios de su uso en los alimentos y piensos que se utilizan en las bebidas lcteas y yogures probiticos, ya cien aos (Sanders 1999).Mayora de las especies bacterianas de esta clase se clasifican formalmente como GRAS (generalmente reconocidos como seguros) organismos.Actualmente, los consumidores estn muy preocupados acerca de los atributos nutricionales y funcionales de los alimentos en todo el mundo.Una serie de beneficios para la salud tales como efectos anti-mutagnicas, propiedades anti-cancergenas, la mejora en el metabolismo de la lactosa, la reduccin del colesterol srico y la estimulacin del sistema inmunolgico han sido reclamados por los alimentos probiticos, que caen en la categora de alimentos funcionales (Shah 2007).En consecuencia, el mercado mundial de alimentos funcionales est prosperando con estimaciones recientes indican hasta una cuota anual de $ 50 mil millones.El mercado probitico mundial se estima en $ 15 mil millones, que inclua el 10% de las bacterias lcticas beben mercado.Hoy en da, este mercado est creciendo a un ritmo del 5 al 30%, dependiendo del pas y del tipo de producto.Aunque el mercado mundial de los probiticos est creciendo rpidamente, y sin embargo, en la India, acaba de comenzar a gestar para hacer su primer movimiento con compaas lderes como Amul, Nestle y Madre de Lechera (Bhadoria y Mahapatra 2011).Los probiticos tienen un fuerte efecto estimulador tanto para el normal desarrollo de la microbiota y maduracin del tejido linfoide asociado a intestino (Schezenmeir y De Vrese 2001).Las bacterias probiticas tales comoLactobacillusyBifidobacteriumsp pueden jugar un papel importante en la promocin de la salud humana en el tracto gastrointestinal (Mitsuoka, 1990).Contribuyen activamente en la digestin, la estimulacin inmune y la inhibicin de patgenos tales comoBacteroides, Escherichia, ClostriduimyProteus,que son potencialmente dainos que se encuentran bacterias en el tracto gastrointestinal (Ziemer y Gibson 1998).El principal mecanismo de accin de los probiticos se conoce como la colonizacin competitiva, o la supresin competitiva.Se describe mejor como la proliferacin de bacterias probiticas en el intestino humano, dejando poco espacio para el crecimiento de cualquier patgeno.Adems, segregan subproductos tales como cido lctico y cido actico, que reducen el pH, creando as un ambiente hostil para el crecimiento de microorganismo patgeno.Los cidos secretados tambin aumentan el peristaltismo, que tambin ayudan a acelerar los agentes patgenos aunque los intestinos (Ballongue 1992 y Biavati et al. 2000).Para desarrollar el modelo de crecimiento de bacterias probiticas por el mtodo tradicional, es decir, una variable a-la-vez (OVAT) lleva mucho tiempo y deja de lado las interacciones de las diferentes variables que tambin pueden afectar el rendimiento.Optimizacin de procesos a travs de mtodo estadstico es una tcnica en la que los cambios o ajustes se realizan en un proceso para obtener mejores resultados (Myers y Montgomery, 2002).Existen varias tcnicas para la optimizacin de procesos, tales como la metodologa de superficie de respuesta (RSM), Redes Neuronales Artificiales (RNA), Algoritmos Genticos (GA), etc En estas aplicaciones de ingeniera, una respuesta de inters suele ser influenciada por diversas variables y el objetivo de las aplicaciones de la ingeniera es encontrar las variables que pueden optimizar la respuesta.RSM es una herramienta para el estudio de los parmetros de proceso ptimos que producen un mximo o el valor mnimo de la respuesta y representa los efectos directos e interactivas de los parmetros del proceso a travs de dos y tres dimensiones parcelas (Gangadharan et al. 2008).ANN es modelos computacionales del sistema nervioso.Organismos naturales, sin embargo, no poseen slo el sistema nervioso, sino tambin la informacin gentica almacenada en el ncleo de sus clulas (genotipo).El sistema nervioso es parte del fenotipo, que se deriva de este genotipo a travs de un proceso, llamado desarrollo (Rajasekaran y Vijaylakshmi 2004).Utilizando el mtodo de redes neuronales (NN), la relacin entre un conjunto de variables independientesXy las variables dependientesYse puede conseguir.De los pares dados de entradaXy salidaY.datos, red neuronal aprende directamente y desarrolla una relacin entre ellos, pero no da ninguna ecuacin matemtica que relaciona las variables.Despus de que el aprendizaje, esta red es capaz de predecir la salida correcta a partir de un conjunto de datos de entrada que no se ha utilizado previamente durante el aprendizaje.GA es una herramienta mediante la cual los problemas de optimizacin se pueden resolver con precisin con un uso limitado de tiempo en la computadora (Das 2005).Optimizacin de varias cepas bacterianas en matraces Erlenmeyer usando diferentes herramientas de optimizacin se han reportado por otros autores (Nagarjun et al 2005;.. Kumari et al 2009; Negi y Banergee 2009;. Lima et al 2009; Usmiati y Marwati 2009; Coelho et al. 2011).En este estudio se ha desarrollado el modelo emprico para aumentar el crecimiento de las clulas deL.acidophilusmediante la optimizacin de los parmetros de crecimiento tales como la temperatura, el pH, el volumen de inculo, perodo de incubacin y el efecto adicional de diferentes fuentes de carbono y nitrgeno utilizando el RSM, Ann y GA.MATERIAL Y MTODOSProductos QumicosTodos los disolventes y reactivos utilizados en el presente estudio se adquirieron de Merck, Alemania.Condiciones organismo y el crecimientoCultivo puro deL.acidophilusNCDC 14 se obtuvo en estado seco por congelacin de Coleccin Nacional de Cultivos lcteos (CNDC), Lcteos Instituto Nacional de Investigacin, Karnal, Haryana, India.El cultivo se mantuvo a 4 C y sub-cultivadas en las inclinaciones de MRS (De Man Rogosa y Sharpe) medio de crecimiento dos veces en un mes.El mtodo utilizado para la extraccin de activacin de cultivo y pellets microbiana fue misma que se informa por Sharma et al.(2013). El crecimiento deL.acidophilusse llev a cabo en 250 ml de matraces Erlenmeyer que contena 50 ml de medio de agar MRS cada uno (pH 7,0) y se mantuvo a 37 C.La biomasa celular se determin midiendo la densidad ptica (DO) del medio a 600 nm.Antes de medir la OD, el lquido que contiene clulas se centrifugaron y se lav con agua destilada estril para dos veces para eliminar los componentes del medio que se adhieren.Diseo ExperimentalSeleccin de los parmetros inicialesPara la seleccin de los parmetros iniciales, se utiliz "una variable a un mtodo de tiempo '.Las diferentes variablesa saber.temperatura, el pH, el volumen de inculo, se seleccionaron edad de inculo y fuentes de carbono y nitrgeno adicionales para el crecimiento deL.acidophilus.El desarrollo de modelos empricosCon el fin de encontrar el efecto de diferentes parmetros de crecimiento en el valor predicho de crecimiento bacterianoYpse obtuvo mediante la realizacin de los experimentos con diferentes combinaciones de variables independientes (parmetros de crecimiento), que se obtuvo a partir de un diseo experimental estndar.Durante los experimentos, se midi la respuesta, o valores de variables dependientes obtenidos a partir de cada una de las combinaciones de variables independientes.Se desarroll una relacin matemtica entre las variables independientes y dependientes.Utilizando este modelo, el valor predicho de respuesta eran averiguar dentro del dominio de valores de las variables independientes limitante.Para los diferentes parmetros de crecimiento que se desea desarrollar un modelo polinomial entre elLactobacilluscrecimiento y los parmetros de crecimiento para desarrollar la siguiente relacin entre los valores codificadosx1,x2,x3,x4,x5yx6de las variables independientes y variable dependienteYp, como se muestra a continuacin.Yp=bo+b1x1+b2x2+b3x3+b4x4+b5x5+b6x6+b7x12+b8x22+b9x32+b10x42+b11x52+b12x62+b13x1x2+b14x1x3+bx1x4+b16x1x5+b17x1x6+b18x2x3+b19x2x4+b20x2x5+b21x2x6+b22x3x4+b23x3x5+b24x3x6+b25x4x5+b26x4x6+b27x5x6(Eq. 1)Dondebo,b1,b2......... etcson las constantes de regresin.Modelado experimentalBox-Behnken DiseoProceso de optimizacin que implica el mtodo OVAT slo se utiliz para la seleccin de los parmetros iniciales, mientras que RSM se adopt para optimizar las condiciones de crecimiento deL.acidophiluspor diseo de Box-Behnken.MINITAB (versin 6.5) de software se utiliza para el diseo experimental.OptimizacinModelado de la red neuronal artificialEn la presente investigacin, se utiliz una red neuronal de propagacin hacia delante de nuevo de alimentacin para evaluar su capacidad en la celda de prediccin de rendimiento msico deL.acidophilus.En este proceso, ANN calcula el error entre la (predicha) deseado y la respuesta real (experimental).El nmero de neuronas en la capa de entrada, capa oculta y la capa de salida de esta red neuronal se mantuvieron como 6, 11 y 1, respectivamente (. Fig. 1).Esta ANN fue entrenado primero con los datos reportados deB.bifidum(Meena et al. 2011).Despus del entrenamiento, que era capaz de predecir el rendimiento de la masa de clulas deL.acidophiluscon precisin a travs de la minimizacin de error que se compara con el valor predicho de rendimiento de la masa de clulas obtenida a partir de RSM.

Figura 1 - Estructura bsica de un feed-forward back propagacin de redes neuronales (Meena et al. 2011).Algoritmos GenticosCon el fin de maximizar el rendimiento de la masa de clulas deL.acidophilus, GA se aplic al modelo basado ANN desarrollado (. Fig. 2) mediante el control anteriormente mencionado seis parmetros de crecimiento.Se hizo pasar por la minimizacin de problema asociado con los estudios de optimizacin.Optimizacin gentica se continu hasta que el mximo rendimiento de masa celular obtenida.Software usadoPara la correcta ejecucin de ANN y GA, MATLAB 7.0 y 6.5 MINITAB se utiliz para desarrollar el modelo emprico.RESULTADOS Y DISCUSINSeleccin de los parmetros inicialesDiferentes variables de crecimiento deL.acidophilusfueron seleccionados por el mtodo de OVAT y los resultados mostraron enla Figura 3 (a - f).Todos estos parmetros, su variacin y los valores ptimos se dan en laTabla 1.

Figura 2 - Diagrama de flujo de los algoritmos genticos simples (Meena et al 2011.).

Figura 3 - Seleccin de los diferentes parmetros de crecimiento Lactobacillus acidophilus (A. Seleccin de la temperatura inicial para el crecimiento de L. acidophilus, B. Seleccin de pH inicial de L. acidophilus. crecimiento, C. Seleccin de volumen inoculo inicial de L. acidophilus 255 crecimiento, D. Seleccin de perodo de incubacin inicial para el crecimiento de L. acidophilus, E. Seleccin de adecuada fuente de carbono para el crecimiento de L. acidophilus y F. Seleccin de la fuente de nitrgeno adecuada para crecimiento).Tabla 1 - Valores de los diferentes parmetros para la optimizacin de un solo parmetro.

El desarrollo de modelos empricosA partir de la seleccin de parmetros inicial, los valores mximo y mnimo de seis parmetros independientes paraL.acidophilusse fijaron como se muestra enla Tabla 2. Era uno de los objetivos para desarrollar el modelo entre los valores codificadosx1,x2,x3,x4,x5yx6de las variables independientes y la variable dependienteYp.Por esta , los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo al diseo de Box-Behnken.Todas estas combinaciones se dan en laTabla 3con su correspondiente valor experimentalYde correopara el crecimiento deL.acidophilus.Tabla 2 - Limitar el valor de las variables independientes.

Tabla 3 - Diseo experimental de Lactobacillus acidophilus con valor experimental Ye.

RSM se usa principalmente para la optimizacin de las condiciones de crecimiento, el parmetro de reaccin, o la ampliacin de laL.acidophiluscondiciones de crecimiento (Sen y Babu 2005).Los datos experimentales se ajustaron a la ecuacin cuadrtica completa y la matriz de diseo y la aptitud de cada trmino se analiz por medio de ANOVA (Kumari et al. 2008).Figura 4muestra los coeficientes del modelo correspondientes (R20,796) junto con la regresin coeficiente de determinacin, que era una medida de lo bien que se podra hacer el modelo de regresin para ajustar los datos en bruto.

Figura 4 - Determinacin del coeficiente de la ecuacin de regresin R2 para el mtodo de Lactobacillus acidophilus EMD.Un mapa de caractersticas de la red de auto-organizacin se utiliz para predecir los parmetros de condiciones de crecimiento.Diferentes factores,a saber.temperatura, el pH, el volumen de inculo, inculos edad y fuentes de carbono y nitrgeno adicionales se utilizaron como cada unidad de capa de entrada.La capa de salida se compone de una variable de respuesta, el crecimiento deL.acidophilus.Se utiliz un conjunto de factores para la formacin y se introduce en el ordenador.Varias iteraciones se llevaron a cabo con diferentes nmeros de neuronas de capa oculta con el fin de determinar la estructura ptima ANN.El nmero ptimo de neuronas en la capa oculta se determina iterativamente cambiando el nmero de neuronas.Comenz con dos neuronas y se aument hasta seis.El valor mnimo MSE y una buena prediccin de los resultados del entrenamiento y conjuntos de validacin se obtuvieron con cuatro neuronas en la capa oculta (Dutta et al. 2004).El R2valor entre las respuestas reales y estimados se determin como 0.927 (. Fig. 5).En el modelado ANN, las repeticiones en el punto de centro no mejor la capacidad de prediccin de la red debido a las entradas similares.

Figura 5 - Determinacin del coeficiente de la ecuacin de regresin R2 para Lactobacillus mtodo acidophilus ANN.Usando MATLAB 7.0, las constantes de la ecuacin de regresin y el valor predicho de la variable dependiente (OD) fueron averiguarlo.El modelo obtenido paraL.acidophilusfue como se indica a continuacin.Yp= 0,2838 a 0,2319 x1+ 0,2335 x2+ 0.0468x3+ 0.738x4+ 0.0215x5+ 0.133x6- 0.082x12- 0.0627x22+ 0.0575x32+ 0.3429x42+ 0.0327 x52+ 0.0375x62- 0.1088x1x2- 0.1655x1x3+ 0.0244x1x4+ 0.0359x1x5- 0.1597x1x6- 0.0689x2x3- 0.0154x2x4- 0.1625 x2x5- 0.0487 x2x6+ 0,603 x3x4- 0,1381 x3x5-0.0592x3x6- 0.0873x4x5- 0.1972x4x6- 0.083x5x6 (Ec. . 2)El valor predicho de valor experimental variable y correspondiente independiente paraL.acidophilusse muestra en laTabla 4. Los algoritmos genticos se han aplicado sobre los datos obtenidos de red neuronal utilizando MATLAB7.0.Tabla 4 - Valores experimentales y predichos para Lactobacillus acidophilus usando RSM y ANN.

Tabla 5mostr el valor ptimo, o una combinacin de diferentes parmetros de proceso en el que el crecimiento bacteriano se mide por la densidad ptica (DO) fue mxima paraL.acidophilus.Tabla 5 - valor ptimo de los parmetros del proceso de Lactobacillus acidophilus.

CONCLUSINEn el presente estudio, se utilizaron metodologas de RSM y RNA para predecir el modelo de crecimiento deL.acidophilusy optimizado los parmetros de crecimiento.Ambos modelos proporcionan predicciones similares de calidad para las variables independientes por encima de las condiciones de crecimiento deL.acidophiluscon ANN mostrando una mayor precisin en la estimacin.Coeficiente de regresin (R2) de la ANN y RSM reflexion que ANN era mejor que RSM.RSM fue til para obtener informacin visin (por ejemplo, las interacciones entre los diferentes componentes) del sistema directamente, pero ANN tambin fue igualmente til en el anlisis de sensibilidad.ANN mostr mejor tcnica de modelado para el grupo que muestra la relacin no lineal sobre RSM datos.Por lo tanto, ANN podra ser una herramienta muy potente y flexible muy adecuado para el desarrollo del modelo de crecimiento emprico debido a una accin correctiva implcita que surge de la metodologa de la formacin y el procedimiento de estimacin asociado.Presentar los resultados mostraron que el mayor rendimiento de la masa de clulas deL.acidophilusse observ a 37,7 C, pH de 6,08, el volumen de inculo y la edad de 0,79 ml y 13,04 h, respectivamente, el contenido de carbono 42,62% (w / v) y el contenido de nitrgeno (39,92% (w / v). Esta combinacin de variables independientes podra ser de buena importancia al motor de arranque industrias productoras de cultura con el fin de aumentar la escala de la produccin deL. acidophilusen escala comercial ms econmica debido a la alta produccin de masa celular.