Oddělení experimentální virologieÚstav hematologie a krevní transfuze, Praha

Terapeutické vakcíny- nové poznatky

Michal Šmahel

Terapeutické vakcíny proti HPV???

+ částečné pokrytí populace vakcinací

+ typy HPV neobsažené ve vakcíně

+ proklouznutí imunizaci

+ nádory u již infikovaných se objeví za několik let

Pokroky ve vývoji terapeutických vakcín???

NIC - MOCPROČ?

účinnost imunizace

účinek v klinických zkouškách

ZLEPŠENÍJAK?

Východiska, předpoklady

častá spontánní regrese

imunitní buňky v regredujících lézích

cirkulujicí specificky stimulované imunitní buňky

zvýšený výskyt nádorů při poruše imunity

Virové proteiny = nádorové antigeny

Infekce HPV

regrese progrese

malignínádor

99% 1%

persistentníinfekce

genet. predispozice kofaktory prostředíúnik imunitě hostitele

HPV – evolučně staré

mechanismy úniku imunitě

replikačnístrategie HPV

aktivní tlumení imunity

Replikační strategie HPV

infekce bazálních keratinocytů, ne APC

nelyzují hostitelské buňky

bez viremie (nedostávají se do krve)

časné antigeny hlavně jádře

produkce pozdních antigenů minimalizována

vyvolání tolerance expozicí antigenů v nezánětlivém prostředí

Utlumení funkce interferonů

E6 - vazba na transkripční faktor IRF-3 zabránění aktivace tvorby IFN-α,β

- vazba na Tyk2 inhibice signálů vyvolaných IFN-α

E7 - vazba na transkripční faktor IRF-1 zabránění aktivace tvorby IFN-β

E6,E7 - po uvolnění z buněk snižují tvorbu IFN-γ v buňkách NK

Rozpoznání nádorové buňky lymfocyty Tc

tumor cell

Zpracování antigenu a prezentace pomocí MHC-I

endoplasmatic reticulum

Golgiapparatus

transportvesicle

proteasome

TAP-1 TAP-2

MHC-I2m

LMP-2LMP-7

peptides

Vliv HPV na prezentaci antigenů

E5 inhibice tvorby MHC I. třídy

inhibice přesunu MHC-I na povrch

E7 inhibice promotoru MHC-I

inhibice promotoru LMP-2/TAP-1

Hlavní únikové mechanismy nádorů

snížení exprese MHC I. třídy

snížení produkce nádorového antigenu

změna sekrece imunomodulačních faktorů

zvýšená odolnost k apoptose

nestabilita genomu premaligních buněk

hromadění mutací

maligní buňky

imunitní dozor

onkoprotein E6 inaktivuje p53

unikající imunitě

Terapeutické HPV vakcíny

Cíl: buněčná imunita proti nestrukturálním antigenům

E1, E2 - v počátcích infekce - po integraci často zrušeny

E6, E7 - onkogeny

- přítomny stále

Strategie terapeutických vakcín

1. Peptidové/proteinové vakcíny

2. DNA/RNA vakcíny

3. Vakcíny využívající živých vektorů

4. Buněčné vakcíny

5. Rostlinné vakcíny

Peptidové vakcíny

délkapeptidů

početpeptidů

antigeny

1. generace 8,10 AA 2 E7 HPV16

2. generace 32 AA 12 E7 a E6HPV16

Proteinové vakcíny

Izolované proteiny (z bakterií)E7GST/algammulinTA-GW (HPV6 L2-E7) - XenovaTA-CIN (HPV16 L2-E6-E7) - XenovaHspE7 – Stressgen

E6E7-IMX – CSL Ltd. PD-E7/AS02 - GSK

DNA vakcíny

„Nahá“ nebo v komplexu - s polymery - s lipidy

Problémy s E6 a E7: - onkogennost

- malá imunogennost

Onkogennost E6 a E7

Možnosti řešení:

kousky genu kodující epitopy

promíchaný gen

mutovaný gen

PROTEIN E7GGG

C-X-X-C C-X-X-Cvazba na pRB

CK II

Konzervovanáoblast 1

Konzervovaná oblast 2

AA 1 15/16 37/38 98

Doména vázající zinek

TG21LYG24YG26Q

TD21LYC24 YE26Q

E7GGG

HPV16 E7

Promíchaný (shuffled) E7

Osen et al., Vaccine. 2001 Jul 20;19(30):4276-86

Imunogennost E6 a E7

Možnosti zvýšení

modifikace genu- změna sekvence epitopů- změna stability proteinu- změna zastoupení kodónů

konstrukce fúzních genů

Fúzní geny

Mechanismy účinku: změna buněčné lokalizace

nasměrování do dráhy MHC-I nasměrování do dráhy MHC-II

přenos mezi buňkami zvýšení degradace proteinu dodání pomocných epitopů

PROTEIN Sig/E7/LAMP-1

Signálnípeptid

AA 1 29/30 127/128 167

HPV16 E71-98 Tyr-Gln-Thr-Ile

endoplazmatickéretikulum

endozomylysozomy

Lysosome-associated membrane protein 1 (LAMP-1)

Wu et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11671-11675, 1995

Zvýšení účinnosti DNA vakcín

Adjuvans

Způsob aplikace

Geny pro imunostimulační molekuly

Prodloužení přežívání DC

Kombinace s jiným typem vakcíny (heterologní „prime-boost“)

Klinické zkoušky DNA vakcín

ZYC101 - Zycos - HPV16 E6 a E7 - enkapsulovaná plasmid. DNA [poly (lactide-co-glycolide)]

Živé vakcínové vektory

Bakterie Listeria monocytogenes Salmonella BCG

Viry Virus vakcinie Adenoviry Adeno-asociované parvoviry (AAV) Alfaviry

Klinické zkoušky rVV

TA-HPV (HPV16/18 E6/E7) – Xenova

HPV16 E2 – Mexico

MVA-HPV-IL2 (HPV16 E6,E7) - Transgene

Heterologní prime-boostTA-HPV (rVV) + TA-CIN (protein)

Varianty HPV v genu E6

Selektované pod tlakem imunitního dozoru snížení prezentace antigenů

KORELACE SE ZVÝŠENOU ONKOGENNOSTÍ

R10G - v epitopu HLA-B7 - zvýšený výskyt u pacientů s HLA-B7L83V - v epitopu HLA-B44 - výskyt spojen s progresí nádorů

Příprava imunorezistentních klonů TC-1

Imunizace myší proti antigenu E7 DNA vakcínou

Podkožní podání nádorových buněk TC-1

Odvození buněčných linií z nádorů

Klonování linií in vitro

Imunosenzitivita klonů z nádoru TC-1

TC-1/E7GGG 5/5 0/5

TC-1/B7 5/5 0/5

TC-1/C6 5/5 5/5

TC-1/F9 5/5 5/5

TC-1/C1 5/5 0/5

TC-1/E4 5/5 5/5

TC-1/B6 5/5 5/5

pBSC E7GGG.GUSBuněčná linie

Sekvenace E7 v klonech TC-1

TC-1

TC-1/C6

N53S

Predikce vazby peptidu na MHC-I

H2-Db score

RAHYNIVTF 82RAHYSIVTF 49

Binding threshold: 53

Infekce HPV

regrese progrese

imunita únik

premaligní léze maligní Tu

regrese progrese regrese progrese

vakcinace

Současnost

Infekce HPV

regrese progrese

imunita únik

premaligní léze maligní Tu

regrese progrese regrese progrese

chemo+imuno

Budoucnost?