İNDÜKTE BALGAMİNDÜKTE BALGAM

Prof. Dr. Betül Ayşe Sin

Ankara Üniversitesi Tıp FakültesiGöğüs Hastalıkları Anabilim DalıAllerjik Hastalıklar Bilim Dalı

TarihçeTarihçe

Eski Yunan’da Hipokrat: Phlegm

1980 HIV’li hastalarda Pneumocystis carinii pnömonisi

1992 Pin ve ark. (astım)

FE Hargreaves ve ark. (yöntemin geliştirilmesi)

BALGAMBALGAM

Disülfid bağlarıyla birbirine tutunan glikoproteinleri içeren, submukozalbezlerden salgılanan jelatinöz bir madde olan mukus ve asılı bulunan hücrelerden oluşan bir materyaldir

AmaçAmaç

Normal şartlarda balgam spontan olarak çıkmazBalgam elde etmek için indüksiyon yapılmalıdır

Astım ve diğer solunum sistemi hastalıklarında havayolu inflamasyonunun

özelliklerini incelemek için spontanolarak balgam çıkaramayan hastalarda alt havayollarından yeterli miktarda

sekresyon örneği toplamaktır

HAVAYOLU İNFLAMASYONUHAVAYOLU İNFLAMASYONU

İDEAL TEST NEDİR?İDEAL TEST NEDİR?

Non-invaziv direkt tanı yöntemi

Basit, güvenilir, geçerli

İndükte Balgamİndükte Balgam

Havayolu hastalıkları

– Astım

– KOAH

– Kronik öksürük

– Eozinofilik bronşit

İndükte Balgamİndükte BalgamDiğer solunum sistemi patolojileri– Tüberküloz– Akciğer kanseri– Kistik fibrozis– Sarkoidozis– İnterstisyel akciğer hastalıkları– Ekstrensek allerjik alveolit– Mesleki toz hastalıkları

(asbestoz, karbon ve mineral partikülleri)– Mantar sporu, polen maruziyeti– Hücre içi bakterileri saptamak

İndükte Balgamİndükte Balgam

Sol ventrikül yetmezliği

(hemosiderin yüklü makrofajlar)

Soğuk algınlığı

(nötrofilik inflamasyon)

YÖNTEMYÖNTEM

Balgamın indüklenmesiİşlemden geçirilmesi (hücre ve sıvı faz analizi için)İnflamatuvar belirteçlerin okunmasıKlinik çalışmalarda ve klinik pratikteki değeri

İşlem sırasında önemli konularİşlem sırasında önemli konular

Malzeme, personelÖncesinde bronkodilatör tedaviAkciğer fonksiyonunun takibiSalin solüsyonu konsantrasyonuNebülizatörden aerosolün çıkış hızıİnhalasyon süresiEkspektorasyon tekniğiBalgam indüksiyonu sıklığı

%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 1

%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 1

Gerekli malzemeler8 tane steril 50 ml Falcon tüp2 tane steril ölçekli plastik bardak2 tane steril filtre (0.22 μm çap)30 cc’lik steril şırınga1 tane steril cam pipetToz NaCl (Sigma®)Steril distile su (non-pirojen, pH=5.5)

Hassas terazide 2 tane plastik kapta 4 g ve 5 g kuru toz NaCl tart Plastik ölçekli 2 tane 100 ml steril bardak içine non-pirojen distile su koy ve üzerine NaCl tozu ekle. İyice çözülene kadar bekleSteril 30 ml enjektörün iç tıpasını çıkar ve steril filtreyi bu enjektörün ucuna takBu şekilde 50 ml Falcon tüpün üstüne yerleştir

%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 2

%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 2

Bardakta çözülen solüsyonu bu tüpün üstüne yerleştirilen enjektörün 25 ml’likkısmına kadar ilave et

İç tıpa alınarak ucundaki siyah lastikli kısmı enjektörün içine oturt

Yukarıdan aşağı doğru pistonu yavaşyavaş iterek bu sırada Falcon tüpe filtreden sıvıyı süz

%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 3

%4 ve %5 hipertonik salinhazırlanması - 3

MEKANİZMAMEKANİZMA

Havayolunu döşeyen sıvının ozmolaritesinde ↑

İndirektDirekt

Bronş mukozasında damar permeabilitesi ↑

Submukozal bezlerde mukus yapımı ↑

Mast hücre aktivasyonuDuyu siniri uçlarının

uyarılması

Havayolu lümenindeki sekresyonlarınklirensinin ↑

Havayolu lümenindeki sekresyonlarınklirensinin ↑

Altın standart teknik yokAncak geçerli olanlar varAltın standart teknik yokAncak geçerli olanlar var

Yüksek out-put ~1 ml/dkUltrasonik nebulizatörle(De Vilbiss Ultra Neb 99) İzotonik (%0.9) veya hipertonik(%3, %4, %5) NaCl (salin) solüsyonu aerosol halindeFarklı zaman periyotlarında (5 dk, 7 dk) toplam 3 kez inhale ettirilir (12-30 dk)Bu sırada hastaya belli komutlar verilerek ayrı bir kaba tükürmesi, steril bir kaba balgam çıkarması söylenir

Tüplerin BağlanmasıTüplerin Bağlanması

2pc

4 parça

1 pc

ağızlık (mouth piece)

T-tube

Distile su

Aquapack(20 ml HS)

Hipertoniksalin

Hasta için öneriler – 1Hasta için öneriler – 1

Öncesinde diş fırçalanırNebülizasyon sırasında postür, oturur ve dik pozisyonda olmalıdırBuruna klip takılabilirBuharı ağızlıktan inhale ederBu süre boyunca tidal solunum yapar ve her 20 sn’de bir kez yavaş derin nefes alır

Hasta için öneriler – 2Hasta için öneriler – 2Yassı epitel hücre kontaminasyonunuazaltmak içinİnhalasyon sırasında aşırı tükrük olursa ayrı bir kaba tükürürHer indüksiyon periyodu sonunda burnunu temizler, ağzını ve boğazını suyla çalkalar ve yutar, ağız mukozasını gazlıbezle tahriş etmeden kurular Hafifçe öne eğilerek derin bir öksürükle steril petri kabına balgam çıkarır

Balgam İndüksiyonu - 1Balgam İndüksiyonu - 1Hastaya işlem hakkında ayrıntılı bilgi verilirBazal SFT ölçülür (pre-bronkodilatörFEV1, en az 3 kez)2 puff (200 μg) salbutamol(MDI + spacer) ile inhale ettirilir10-15 dk sonra FEV1 ölçülür (post-bronkodilatör)Eğer post-bronkodilatör FEV1 >%60 (beklenen) ya da >1 lt ise devam edilir

Balgam İndüksiyonu – 2Balgam İndüksiyonu – 2Pirojensiz steril hipertonik salin ya sabit konsantrasyonda (%3 veya %4.5) ya da artan konsantrasyonlarda (%3,4,5) kullanılır (20 ml)5 veya 7 dk arayla (<21 dk/toplam) indüksiyon yapılır. (Ya da; 1,4 ve 5 dk, sonra 3 kez 5 dkarayla)Her indüksiyon periyodu sonunda FEV1ölçülür

Balgam İndüksiyonu – 3Balgam İndüksiyonu – 3

Yeterli miktar ve kalitede balgam çıkaramaz ise %4 ve %5 salin ile devam edilir. Ancak FEV1’de düşüş %10 veya 200 ml’den fazla olmamalıdırEğer post-bronkodilatör FEV1’e göre %10 veya 200 ml’den fazla, ancak %20 ya da 400 ml’den az FEV1 düşmüş ise diğer 7 dk aynı salin konsantrasyonu kullanılır

Balgam İndüksiyonu – 4Balgam İndüksiyonu – 4

FEV1 en iyi post-bronkodilatör değerin %20 (veya 400 ml)’sinden fazla düşerse ya da semptom olursa işleme son verilir

Hasta 2 puf kısa etkili β2 agonist ile tedavi edilir

FEV1 bazal değerin %5’ine kadar yükselmesi için hasta izlemde tutulur

Yüksek riskli hastada alternatif protokol - 1Yüksek riskli hastada alternatif protokol - 1

İşlem öncesi hastaya gerekli bilgi sunulurGüvenlik önlemi alınır. Ekipman hazırlanırBronkodilatör öncesi FEV1 ölçülür200 μg inhale salbutamol verilir10-15 dk sonra post-bronkodilatör FEV1ölçülür (%20 düşüş değeri hesaplanır)%0.9 steril salin solüsyonuyla başlanır; 30 sn, 1 dk ve 5 dk inhale ettirilir, her periyot sonrası FEV1 değeri ölçülür

Yüksek riskli hastada alternatif protokol – 2Yüksek riskli hastada alternatif protokol – 2

Balgam çıkaramazsa HS %3’e arttırılır, 30 sn, 1 dk ve 2 dk inhalasyon yaparYine yeterli balgam yoksa %4.5’a arttır. 30 sn, 1 dk, 2 dk, 4 dk ve 8 dk süreyle inhalasyon yaparHer indüksiyon süresi sonunda FEV1 ölçümPost-bronkodilatör değere göre FEV1’de >%20 düşüş ya da semptom olursa işlem durdurulurHasta spontan olarak öksüremez ise 4-8 dksonra öksürüp balgam çıkarması söylenir

Teknikte Önemli NoktalarTeknikte Önemli Noktalar

Aynı kişide indüksiyonlar arasındaki inhalasyon süresi sabit tutulmalı

15-21 dk standart süre

2 indüksiyon arasında 48 saat ara olmalı

İnhale edilen hipertonik solüsyonun volümü

Solunum hızı (dakikada 1 kez hafif derin nefes alarak tidal solunum yapar)

Balgamın İşlenmesi – 1Balgamın İşlenmesi – 1Tüm balgam örneği ya da gözle görülen visköz kısımlar ayrılarak 2 saat içindeişlemden geçirilmelidir50 ml opak polipropilen santrifüj tüpün ağırlığını tart (polistiren tüp kullanma)Balgam örneğini bu tüpe transfer ederek ağırlığını tartBalgamın ağırlığını hesaplaFosfat tamponlu salin = PBS veya normal salin ile 1:10 dilüsyonda %0.1 DTT solüsyonunu günlük taze hazırla (9 ml PBS + 1 ml Sputolysin®)

Dithiothreitol (DTT)Dithiothreitol (DTT)

Rezidüel mukusa hapsolmuş hücrelerin likefaksiyonla açığa çıkmasını sağlar

Disülfit bağlarını parçalar. Bu bağlar müsinöz glikoproteinlerle çapraz bağyaparak balgamı jel formunda tutar

Çok az hücre hasarına yol açar

Hücre eldesi için yararlı ancak bazıimmünolojik teknikler için uygun değil

Balgamın İşlenmesi – 2Balgamın İşlenmesi – 2Balgam miktarına eşdeğer volümde %10 Sputolysin® ekle (1 ml DTT 1gr balgam)Bu karışım 3-5 kere (15”) vortekslenirTüpü bench rocker’da oda ısısında 15 dkbeklet (tam homojenizasyon için)(48 μm naylon gazlı bezden filtre edilebilir)Bu karışım 2500xg (+4°C) 15 dk(veya 300-1500xg, 10-15 dk) santrifüj etÜstte kalan süpernatanı pipetle 1 ml tüplere al ve -20,-80°C’de sakla (soluble mediatör)

Balgamın İşlenmesi – 3Balgamın İşlenmesi – 3

Altta kalan hücre peleti, Ringerli laktat(veya PBS) ile resüspande edilerek volüm 1 ml’ye tamamlanır, hafifçe karıştırılır10 μl hücre süspansiyonu + 10 μl tripanmavisi ile hücre canlılığına bakılır (>%50)Bu karışımdan 10 μl alıp Neubauer manualhemositometride toplam hücre sayımıyapılır (ml’deki hücre sayısı)

Toplam hücre sayısı= (toplam hücre x karede/x kare)X10.000Xörneğin volümü2.600.000=104/1X10.000X2.5 cc

Balgamın İşlenmesi – 4Balgamın İşlenmesi – 4

Toplam hücre sayısından yassı hücre kontaminasyon yüzdesini hesapla (<%20 olmalı)

Sitospin slaytta, optimal hücre (40-60x103)yoğunluğu elde etmek için uygun miktarda Ringerli laktat solüsyonu ile resüspande edilir (dilüsyon faktörü için TCC/160.000. 2.600.000:160.000=16.25 ml-2.5 ml=14 ml RL ekle. Böylece her slaytta 40.000 hücre)

Balgamın İşlenmesi – 5Balgamın İşlenmesi – 5Hücre konsantrasyonu 1x106 hücre/ml’yeayarlanır. 40-65 μl (450-650 x 103

hücre) hücre süspansiyonu her sitospineilave edilirEn az 6 kodlanmış sitospin hazırlanır. Her cytofunnel’a 200 μl hücre süspansiyonu konur600 rpm (22xg)’de 6 dk santrifüj edilir (Shandon III Cytocentrifuge)

Balgamın İşlenmesi – 6Balgamın İşlenmesi – 6

24-48 saat havada kurumaya bırakılırDiff-Quick (Giemsa ve Wright) ile boyanırEn iyi boyanan slaytlardan 400 intaktnon-skuamöz toplam hücre sayılarak diferansiyel hücre dağılımı elde edilirToplam hücre sayısının yüzdesi olarak ifade edilirKodlanmış slaytlar çift kör okuyucular tarafından değerlendirilmelidir

İnvaziv yassı hücreli akciğer kanserinde indükte balgam örneği

Atipik mikobakteri enfeksiyonu olan hastanın indükte balgamında aside-rezistans basiller

Astımlı hastanın indükte balgam örnekleri

İndükte balgamda eozinofiller

Astımlı hastanın indükte balgamında eozinofil

KOAH’lı hastanın indükte balgamında makrofajlar

J Allergy Clin Immunol 2002; 109; S100-101

Normal yetişkinde indükte balgamda diferansiyel hücre sayıları

Normal yetişkinde indükte balgamda diferansiyel hücre sayıları

Hücre sayısı Median (%)

Makrofaj 60.8

Nötrofil 36.7

Eozinofil 0.0

Lenfosit 0.5

Bronş epitel hücresi 0.3

Metakromatik hücre 0.0

İndükte Balgamın Klinik Anlamıİndükte Balgamın Klinik AnlamıHÜCRE TİPİ ARTIŞIN NEDENLERİEozinofilik Kontrolsüz astım

Astımsız eozinofilik bronşitAllerjen ve kimyasal duyarlandırıcı maruziyetiSteroide cevap veren kronik havayolu darlığı

Nötrofilik Sigara içmekHava kirleticileri (ozon)EndotoksinİnfeksiyonSteroide dirençli astım

Lenfositik SarkoidozisChlamydia pneumoniaİnterstisyel akciğer hastalıkları

Balgam İndüksiyonuBalgam İndüksiyonu

Erken alınan örneklerErken alınan örnekler

Santral hava yollarından geliyor, mukus fazla

Geç alınan örneklerGeç alınan örnekler

Surfaktan yüksek, periferik havayolu ve alveollerden geliyor

İndükte BalgamBronş yıkamasıİndükte BalgamBronş yıkaması

Santral (proksimal) havayolu lümeninden gelen sekresyonlar

Santral (proksimal) havayolu lümeninden gelen sekresyonlar

BronkoalveolarlavajBronkoalveolarlavaj Periferik havayolu lümenindenPeriferik havayolu lümeninden

Bronş biyopsisiBronş biyopsisi Santral havayolu duvarından hücre örneğiSantral havayolu duvarından hücre örneği

İndükte BalgamEozinofil ve nötrofilden zengin, lenfosit ve makrofaj daha az

AVANTAJLARIAVANTAJLARI DEZAVANTAJLARIDEZAVANTAJLARIBRONKOSKOPBRONKOSKOPİİ Biopsi ve BAL alınabilir

Yapısal değişiklikle ilgili bilgi verirİmmün histokimya, insituhibridizasyon, elektron mikroskopiSegmental allerjenprovokasyonuBronşial yıkama (invitroçalışma için hücre eldesi)

Eğitimli personel ve pahalıekipmanİnvazivAlveolar ve bronşiyalmateryal karışabilirKanla kontamine olabilirBiopsi örneği sadece büyük havayolundan alınabilirHücre sayısı verimliliği düşük

İİNDNDÜÜKTE KTE BALGAMBALGAM

Nispeten noninvazivProksimal havayolundan direkt örnekler alınabilirTekrarlanabilirGeçerlidir Basit, pratik, ucuz ve güvenilirGeniş sayıda hastada çalışma mümkün

Bronkokonstriksiyon riski varBaşarı oranı ~%80İşlenme yöntemi biraz fazla iş yükü gerektiriyorHemen sonuç alınamıyor (zaman sorunu var) (en az 100 dakika gerekli)

Balgam inceleme yönteminin, özel tekniklerin uygulanmasını

kolaylaştırmak amacıyla daha standart hale gelmesi ve geliştirilmesi

gereklidir

Balgam inceleme yönteminin, özel tekniklerin uygulanmasını

kolaylaştırmak amacıyla daha standart hale gelmesi ve geliştirilmesi

gereklidir

Özel TekniklerÖzel Teknikler

Flow sitometri

İn situ hibridizasyon

PCR

İmmün sitokimyasal boyanma

İn vitro hücre kültürü

Genetik analiz

Cevap Bekleyen SorularCevap Bekleyen SorularGüvenilir hücre sayıları için en düşük kabul edilebilir hücre viabilitesiHücreler ve sıvı fazda yapılacak ölçümler üzerinde balgamın işlenme zamanının uzamasının etkisiSıvı faz ve hücreler üzerinde sallamaya karşısabit durmanın etkisiHücre morfolojisinde santrifüj hızının etkisiHücre sayısı ve sıvı faz için naylon filtreden geçirmenin etkisi

Dr. F. ÖzerAtopik astımlılarda antilökotrien tedavinin, allerjenleuyarılan havayolu enflamasyonu üzerine etkisi (2003)Dr. Ö. AbadoğluThe effect of montelukast on eosinophil apoptosis: inducedsputum findings of patients with mild persistent asthma. (Allergol Immunopathol 2005; 33: 105-11)Dr. E. KurtThe effect of natural pollen exposure on eosinophilapoptosis and its relationship to bronchialhyperresponsiveness in patients with seasonal allergicrhinitis. (Ann Allergy Asthma Immunol 2005; 95: 72-8)Dr. A. Berna DursunMevsimsel allerjik rinitli hastalarda indükte balgam örneklerinde sisteinil lökotrien ve matriks metalloproteaz-9 ile doku matriks metalloproteaz inhibitör-1 düzeylerinin değerlendirilmesi ve bu faktörlerin bronş aşırı duyarlılığı ile ilişkisinin araştırılması (2006)