N° d’ordre : 3125 -...

Université Bordeaux 1

Les Sciences et les Technologies au service de l’Homme et de l’environnement

N° d’ordre : 4209

THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTÉ

Par Nicolas VIRON

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPÉCIALITÉ : BIOLOGIE VÉGÉTALE

Identification et validation de nouveaux gènes candidats impliqués

dans la régulation du développement du fruit de tomate

Directeur de recherche : Mme M. LEMAIRE-CHAMLEY

Soutenue le 17 Décembre 2010

Devant la commission d’examen formée de :

M. BOUZAYEN, Mondher ENSAT Toulouse Professeur

M. TORREGROSA, Laurent SUPAGRO Montpellier Professeur

M. GRANELL, Antonio CSIC, Valencia Directeur de recherche

M. HERNOULD, Michel Université Bordeaux 2 Professeur

Mme LEMAIRE-CHAMLEY, Martine INRA Bordeaux Chargé de Recherche

REMERCIEMENTS

Je tiens tout d’abord à remercier ma Directrice de thèse, Martine Lemaire-Chamley, pour la

qualité de son encadrement et la disponibilité (et la patience !) dont elle a fait preuve pendant

ces trois années. Ce manuscrit n’aurait pu être réalisé sans ses conseils et ses corrections.

Merci de ne pas t’être trop exaspérée face à mes blagues plus ou moins drôle, ni face à ma

conception particulière des plannings…

Je tiens aussi à remercier Christophe Rothan de m’avoir donné l’opportunité de réaliser ce

travail de thèse dans son équipe, et d’avoir supervisé mon travail ainsi que la rédaction de ce

manuscrit. Merci aussi à Dominique Rolin et Christian Chevalier de m’avoir accueilli au sein

de l’UMR Biologie du Fruit.

Je remercie également Messieurs Mondher Bouzayen, Laurent Torregrosa, Antonio Granell et

Michel Hernould d’avoir accepté d’évaluer mon travail en prenant part au jury de thèse.

Je remercie Adeline Moïse et l’équipe du Pôle d’Imagerie du Végétale du Bordeaux Imaging

Center pour la réalisation des observations microscopiques de mes différents transformants.

Merci aussi à Cécile Bres et aux différentes personnes de la plateforme TILLING du Centre

de Génomique Fonctionnelle de Bordeaux pour l’identification des mutants d’un de mes

gènes candidats.

Je souhaite également remercier Moftah Alhagdow qui a réalisé les différents transformants

de tomate utilisés pour la caractérisation des promoteurs fruits-spécifiques. Je le remercie de

m’avoir formé à la transformation génétique de cette plante.

Je remercie aussi les différentes personnes qui se sont succédé à la gestion de la serre et qui

ont veillé à la bonne santé de mes plantes : Patricia Ballias, Aurélie Honoré-Alexandre, Medhi

Miloudi et Isabelle Atienza. Merci également à Florence, Catherine et Nathalie pour le côté

administratif de cette thèse et à Jean-Pierre, Claudine, Alain et Laurent pour le côté matériel.

Merci également aux stagiaires qui ont activement participé aux travaux : Aurélie, Julie et

Imane.

Mes remerciements vont aussi à mes co-locataires de bureau passés Louise et Fabien, et

présents Lisa, Antoine et Joana pour les discussions pas toujours scientifiques mais ô combien

intéressantes qui ont rythmées les journées de manip. Désolé de vous avoir saoulé avec des

sujets qui visiblement n’intéressaient que moi…^^

Je remercie aussi les différents thésards avec qui j’ai pu échanger, et qui m’ont permis de

relativiser l’état d’avancement de mon travail : Medhi, Elodie, Guillaume, Julie, Matthieu

(avec 2 "t"!) Merci aussi à Mathieu (avec 1 "t" et 1 cocard…meuh non c’est pas violent le

rugby !) qui a eu la chance et l’immense privilège de stériliser des graines avec moi ! hé hé !

Merci à toutes les personnes de l’UMR 619 qui ont eu une oreille attentive pour mes

questions scientifiques, ou qui ont simplement été captivées par mes aventures hors-labo

(vous pourrez d’ailleurs retrouver tous mes conseils concernant le Code de la Consommation,

Free, ou encore l’amputation de la queue d’un chat dans mon autobiographie " Francis

LaPince, ma vie, mon oeuvre" !) Merci donc à Yo, Ninie, Benoit, Cécile, DJ, Ken, Pierrot le

Ninja, les Fred’s (Ben dis-donc, on vous voit plus aux soirées…), Jennifer, Véro, Carine,

Yves, Massimo, JP, Julien (A. et P.), Thomas, Bertrand, Marie-Hélène, Katia, Mickael, Linda,

Emeline, Philippe.

Je tiens également à remercier différentes personnes croisées tout au long de mon cursus

universitaire, et qui ont influencé mon orientation professionnelle : Malika Aïnouche, Fatma

et David Lecourieux, et Valérie Schurdi-Levraud.

Je remercie enfin ma famille, et tout particulièrement mes parents qui m’ont soutenu pendant

toutes ces années de fac, sans (trop) montrer leur inquiétude face à un cursus aussi long.

Merci enfin et surtout à Stef pour ton soutien et ton affection, si je suis allé au bout de ce

projet c’est en grande partie grâce à toi !

Bon bah voilà…ça c’est fait ! ^^

ABREVIATIONS

Acides nucléiques et nucléotides

ADN Acide désoxyribonucléique

ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire

ATP Adénosine 5’ triphosphate

ARN Acide ribonucléique

dNTP Désoxynucléotide 5’ triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

EST Marqueur de séquence exprimé (« Expressed Sequence Tag »)

Unités

°C Degré Celsius

g Accélération

kDa KiloDalton

pb, kb, kpb, Paire de bases, kilobases, kilopaire de bases

U Unité

rpm Rotation par minute

s, min, h Seconde, minute, heure

Divers

ABA Acide abscissique

AIA Acide 3-indole acétique

CTAB Bromure d'hexadécyltriméthylammonium

DAPI 4’,6-diamino-2-phénylindole

DEPC Diéthylpyrocarbonate

DNAse Désoxyribonucléase

DO Densité optique

DTT Dithiothréitol

EDTA Acide éthylène diamine tétraacétique

EMS Méthyl sulfonate d’éthyl (“Ethyl methyl sulfonate”)

GFP « Green fluorescent protein »

JAA Jours après anthèse (DPA, « days post anthesis »)

LB, RB Bordures gauche et droite du T-DNA (« Left border, right border »)

mQ MilliQ

ORF Cadre ouvert de lecture (« Open reading frame »)

p/p, p/v, v/v poids/poids, poids/volume, volume/volume

PCR Réaction de polymérisation en chaine (« Polymerase chain reaction »)

qPCR PCR quantitative en temps réel

QTL Ttrait de caractère quantitatif (« Quantitative Trait Loci »)

RNAse Ribonucléase

RNasin Inhibiteur de ribonucléase (“Ribonuclease inhibitor”)

RT-PCR Transcription inverse suivie d’une PCR

SDS Sodium dodécyl sulphate

Tris Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane

UV Ultraviolet

Sommaire

Chapitre 1 : INTRODUCTION ........................................................................................................ 1

I. La Tomate............................................................................................................................. 1

I.A Histoire de la tomate ...................................................................................................... 1

I.B Intérêt scientifique ......................................................................................................... 2

I.C Importance agronomique et nutritionnelle ..................................................................... 5

I.C.1 La production ........................................................................................................... 5

I.C.2 Importance nutritionnelle ........................................................................................ 7

II. Structure et développement du fruit de tomate .................................................................. 8

II.A De la graine au fruit ....................................................................................................... 8

II.B Structure du fruit de tomate ........................................................................................ 10

II.C Développement du fruit de tomate .............................................................................. 11

II.C.1 La mise à fruit ....................................................................................................... 12

II.C.2 La phase de division cellulaire ............................................................................... 12

II.C.3. La phase d’expansion cellulaire ............................................................................ 13

II.C.4. La mûrissement du fruit ....................................................................................... 14

III. Régulation du développement précoce du fruit ................................................................ 16

III.A La famille des gènes à MADS-Box ................................................................................ 17

III.B Contrôle de la taille et de la forme du fruit de tomate................................................. 18

III.B.1 Fw2.2 (Fruit weight 2.2) ....................................................................................... 18

III.B.2 Fas (fasciated) et ln (locule-number) .................................................................... 19

III.B.3 Ovate, sun et fs8.1 ............................................................................................... 20

III.C Contrôle hormonal du développement du fruit ........................................................... 21

III.C.1 La mise à fruit et la phase de division cellulaire .................................................... 21

III.C.2 Auxines et gibbérellines influencent l’expansion des cellules ................................ 23

III.D Autres types de régulation .......................................................................................... 23

III.D.1 Régulation épigénétique ...................................................................................... 24

III.D.2 Les petits ARNs (sRNAs) ....................................................................................... 24

III.D.3 Régulation métabolique ....................................................................................... 25

IV Présentation du travail de thèse ........................................................................................ 26

Chapitre 2 : RESULTATS ET DISCUSSION ..................................................................................... 30

I. Nouveaux vecteurs pour l’analyse fonctionnelle du développement du fruit de tomate ..... 30

II. Analyse fonctionnelle de protéines à F-Box ........................................................................ 45

II.A Analyse in silico ........................................................................................................... 46

II.B Sélection des gènes candidats pour la transformation de tomate cv. Micro-Tom ......... 48

II.B.1 Agro-injection dans le fruit de tomate ................................................................... 48

II.B.2 Analyse d’expression par qRT-PCR......................................................................... 50

II.C Génération de lignées transgéniques affectées dans l’expression des gènes FB2, FB11, FB12 et FB24 ..................................................................................................................... 51

II.C.1 Lignées P35S:FB2OE et P35S:FB2RNAi ............................................................................ 52

II.C.2 Lignées P35S:FB11RNAi .............................................................................................. 55



III. Caractérisation fonctionnelle d’un homologue de tomate d’AtGEM (Glabra2-Expression

Modulator) ............................................................................................................................ 62

III.A Les homologues de AtGEM chez la tomate ................................................................. 64

III.B Génération de plantes transgéniques affectées dans l’expression du gène SlGEM1..... 67

III.B.1 Analyse des transformants P35S : SlGEM1OE ........................................................... 67

III.B.2 Analyse des transformants P35S:SlGEM1RNAi........................................................... 69

III.B.3 Analyse de l’expression de SlGEM2 chez les lignées transformées ........................ 72

III.B.4 Analyse cytologique des péricarpes de fruit des transformants ............................ 72

III.C Identification et caractérisation de mutants de SlGEM1 par TILLING ........................... 73

III.C.1 Phénotypes des fruits des plantes mutantes. ....................................................... 74

III.C.2 Altération de la fécondation ................................................................................. 76

III.D Implication de SlGEM1 dans les processus de différentiation chez la tomate .............. 79

Développement racinaire............................................................................................... 79

Observation du développement et de la densité de trichomes foliaires ......................... 80

Chapitre 3 : DISCUSSION ET PERSPECTIVES ................................................................................ 81

I. Analyse fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à F-Box chez la tomate ............. 81

I.A Rôle de la protéine à F-Box FB2 chez la tomate ............................................................. 83

I.B Rôle de la protéine à F-Box FB11 chez la tomate ........................................................... 84

I.C Rôle de la protéine à F-Box FB12 chez la tomate ........................................................... 85

I.D Rôle de la protéine à F-Box FB24 chez la tomate ........................................................... 86

II. Caractérisation fonctionnelle d’un homologue de tomate d’AtGEM (Glabra2-Expression

Modulator) ............................................................................................................................ 87

II.A Implication de SlGEM1 dans la régulation du cycle cellulaire ? ..................................... 89

II.B Implication de SlGEM1 dans la différenciation cellulaire ? ............................................ 90

II.C Implication de SlGEM1 dans le développement du pollen et du fruit ? ......................... 91

II.D Mécanisme moléculaire d’action de SlGEM1 ............................................................... 93

CONCLUSION ......................................................................................................................... 96

Chapitre 4 : MATERIELS ET METHODES ...................................................................................... 97

I. Matériel biologique ............................................................................................................ 97

I.A Matériel végétal et conditions de cultures .................................................................... 97

I.B Souches bactériennes et milieu de culture .................................................................... 98

II. Méthodes d’analyse des acides nucléiques ........................................................................ 99

II.A Extraction d’ADN génomique ....................................................................................... 99

II.B Extraction d’ADN plasmidique ................................................................................... 100

II.C Extraction d’ARN ........................................................................................................ 100

II.D Traitement DNAse ..................................................................................................... 101

II.E Electrophorèse des acides nucléiques ........................................................................ 101

II.F Amplification de séquences nucléiques ...................................................................... 101

II.F.1 Réaction de transcription inverse (RT) ................................................................. 101

II.F.2 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ........................................................ 102

II.F.3 RT-PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) ...................................................... 102

III. Méthode de clonage par recombinaison (système Gateway™) ...................................... 104

III.A Plasmides utilisés pour l’agroinjection et la génération de plantes transgéniques ..... 105

III.B Préparation de l’insert .............................................................................................. 106

III.C Insertion dans le vecteur d’entrée ............................................................................ 107

III.D Transfert dans le vecteur de destination ................................................................... 107

III.E Transformation des bactéries thermocompétentes ................................................... 107

III.E.1 Préparation des bactéries thermocompétentes .................................................. 107

III.E.2 Transformation des bactéries thermocompétentes ............................................ 108

III.E.3 Sélection des bactéries transformées ................................................................. 108

IV Transformation et sélection des plantes .......................................................................... 109

IV.A Transformation des agrobactéries ............................................................................ 109

IV.B Agroinjection dans le fruit de tomate ....................................................................... 109

IV.C Transformation des cotylédons de tomate................................................................ 110

IV.D Méthodes de sélection et d’analyses des plantes transgéniques ............................... 110

IV.D.1 Sélection des plantes transgéniques .................................................................. 110

IV.D.2 Etude de la ségrégation du transgène ................................................................ 112

V Analyses réalisées sur les transformants et les mutants .................................................... 112

V.A Analyse du développement racinaire ......................................................................... 112

V.B Observations du développement des trichomes ........................................................ 112

V.C Test de germination de pollen ................................................................................... 112

V.D Analyses cytologiques ............................................................................................... 113

V.E TILLING ...................................................................................................................... 113

RÉFÉRENCES ............................................................................................................................ 114

ARTICLES ET COMMUNICATIONS ............................................................................................. 124

Chapitre 1 : INTRODUCTION

Introduction 1

Figure 1 : Première représentation

graphique de la tomate (Rembert

Dodoens, 1557)

Chapitre 1 : INTRODUCTION

I. La Tomate

I.A Histoire de la tomate

La tomate (Solanum lycopersicum) est cultivée dans presque tous les pays du monde.

Elle appartient à la famille des Solanacées, qui comprend un grand nombre de plantes

présentant des vertus nutritives, pharmaceutiques ou ornementales (la pomme de terre, le

poivron, le piment, l‟aubergine, le tabac, le pétunia, le datura et la belladone). La forme

sauvage de la tomate est originaire de l‟ouest de l‟Amérique du sud, et plus précisément des

Andes péruvienne, région qui inclue la Bolivie, le Chili, la Colombie, l‟Equateur, et le Pérou.

Il semble que le centre de domestication de la tomate se trouve au Mexique où il existe une

grande diversité au niveau de la taille, de la couleur et de la forme du fruit (Hobson and

Grierson, 1993). Les premières études qui décrivent la tomate remontent au XVIème

siècle.

Cette date concorde avec l‟apparition de la tomate sur le continent européen grâce à

l‟intensification des échanges maritimes avec le "nouveau monde". Pour la première fois,

Pietro Andrea Mattioli, botaniste et médecin italien, en

donne une description sommaire dans un chapitre

publié en 1544 consacré aux mandragores et

l'appelle pomi d'oro, pomme d'or. Rembert Dodoens en

fait la première représentation graphique en 1557 sous

le nom de pomme d‟amour (figure 1). La plante étant

de la même famille que la belladone, plante indigène en

Europe connue pour sa toxicité, ses fruits ne furent pas

considérés comme comestibles, mais utiles en médecine

ou en tant que plante ornementale. Par la suite, son

usage alimentaire s‟est développé sous forme de

sauces dans la région de Naples, puis sa consommation

à l‟état de produit frais a commencé dans de nombreux pays du bassin méditerranéen et s‟est

répandue vers le Nord de l‟Europe à la fin XVIII siècle.

En 1753, Carl von Linné la baptise Solanum lycopersicum, soit “pêche de loup”

d‟après son étymologie grecque. En 1754, Philip Miller la distingue du genre Solanum et la

nomme Lycopersicon esculentum. Récemment, la prise en compte de preuves génétiques,

http://fr.wikipedia.org/wiki/Pierandrea_Mattioli

http://fr.wikipedia.org/wiki/1544

Introduction 2

phylogénétiques, morphologiques et géographiques a permis de confirmer l‟appartenance de

la tomate au genre Solanum et a conduit à l‟adoption définitive du nom Solanum lycopersicum

par la communauté scientifique (voir SOL newsletter 2006 issue 11 ;

http://www.sgn.cornell.edu).

I.B Intérêt scientifique

La domestication de la tomate, bien qu‟exercée très précocement par les populations

locales d‟Amérique du sud, n‟a réellement pris son essor qu‟une fois la culture bien implantée

sur le continent européen (Pitrat and Cootd, 2003). Au cours du 19ème siècle apparaissent les

premières variétés issues de la sélection de variants résultant de mutations ou de fécondations

croisées. Les publications par Vilmorin-Andrieux, dans « La description des plantes

potagères », permettent de suivre l‟évolution des variétés proposées aux maraîchers. Au

nombre de 7 en 1856, ces premières variétés marquent l‟avènement d‟une période de

recherche intense d‟amélioration des caractères du fruit à buts agroalimentaires. Au début du

XXème siècle, des instituts publics américains s‟impliquent dans cette étape de sélection

variétale, rapidement rejoints par des compagnies privées : la mise sur le marché de nouvelles

variétés atteint alors plusieurs milliers au début des années 50. Dès lors, apparaissent des

variétés dites hybrides qui supplantent peu à peu les anciennes lignées fixées, elles sont

obtenues à partir de lignées homozygotes éloignées génétiquement et dont le croisement

procure à la descendance une vigueur accrue face à un caractère donné, appelée vigueur

hybride ou hétérosis. Les recherches menées afin de créer ces variétés de tomate plus

performantes d‟un point de vue agronomique ont évolué selon quatre axes (Bai and Lindhout,

2007) : (i) le rendement de production fut tout d‟abord la cible des sélectionneurs dès les

années 1970, (ii) puis l‟amélioration de la conservation des fruits à partir des années 1980,

(iii) l‟amélioration du goût à partir des années 1990, et enfin (iiii) l‟amélioration de la qualité

nutritionnelle des fruits fait aujourd‟hui l‟objet d‟une attention toute particulière de la part des

sélectionneurs. Cependant, les pertes de variabilité génétique associées à la domestication de

la tomate Solanum lycopersicum var. cerasiformae au Mexique puis à la domestication de la

tomate Solanum lycopersicum sur le continent européen, associées à une reproduction

autogame, ont rendu indispensable le recours aux hybridations interspécifiques avec les

espèces sauvages afin de créer une variabilité sur laquelle la sélection puisse avoir prise. C‟est

dans le but de pallier cette lacune que le Professeur Charlie Rick a organisé plusieurs

expéditions dans les Andes afin de collecter des espèces naturelles de tomates présentant des

Introduction 3

caractères génétiques alors introuvables dans les tomates domestiques. Ces efforts ont abouti à

la création du « C. M. Rick Tomato Genetics Resource Center » (Davis, Etats-Unis,

http://tgrc.ucdavis.edu) qui répertorie, stocke et distribue des graines provenant de plus de

1500 variétés uniques aux chercheurs du monde entier. De nombreux centres dans le monde

entretiennent des banques d‟accessions : plus de 75 000 accessions sont disponibles à l‟heure

actuelle dans plus de 120 pays différents. La plupart de ces ressources ont été utilisées au

cours de ces 20 dernières années par les professionnels afin d‟améliorer les résistances aux

maladies et aux pathogènes, ainsi que la qualité des tomates (Robertson and Labate, 2007), en

sélectionnant, au sein du génome de ces lignées, les régions apportant les caractères

quantitatifs d‟intérêt (QTL). En effet, les variétés sauvages de tomate représentent une source

extrêmement riche d‟allèles hautement variables utilisés notamment pour la construction de

lignées d‟introgressions (ILs pour « introgression lines »). Ces dernières sont constituées à

partir de segments chromosomiques, issues des espèces sauvages, et insérés dans un fond

génétique constant : par exemple, des variétés de tomate commerciale ou des lignées quasi-

isogéniques. A l‟heure actuelle, il existe plusieurs collections d‟ILs de Solanum lycopersicum

qui intègrent le génome de Solanum pennellii (Eshed and Zamir, 1995), Solanum

pimpinellifolium (Doganlar et al., 2002), Solanum hirsutum (Monforte and Tanksley, 2000) et

Solanum lycopersicoides (Canady et al., 2005). Ces ILs présentent de nombreux avantages

pour la cartographie fine de QTL et l‟identification de gènes dans le cadre de procédés

d‟amélioration variétale (Zamir, 2001). Au début des années 90, les premiers marqueurs

moléculaires ont permis de construire une carte de référence du génome de la tomate, et de

mettre en évidence un grand nombre de gènes d‟intérêt (Tanksley et al., 1992). Depuis, de

nombreux marqueurs ont enrichis cette carte et l‟essentiel des données de cartographies du

génome de la tomate sont consultable sur le site du SGN (http://solgenomics.net/index.pl).

Une approche complémentaire est apportée par l‟étude de mutants de tomate dont le

nombre s‟est considérablement accru depuis la mise en place d‟études à grande échelle. Entre

1956 et 2005, les données disponibles (TGRC, http://tgrc.ucdavis.edu/) ont évolué de 118

mutants connus dont 56 cartographiés à plus de 1000 mutations répertoriées dont 400

cartographiées (Ji and Chetelat, 2007). La plupart des stratégies de mutagenèse utilisées

incluent le traitement des graines ou du pollen avec des agents chimiques (en particulier

l‟EMS) ou des radiations (rayons X et gamma). Le développement récent d‟une nouvelle

technique de criblage à haut débit des populations de mutants, appelée TILLING (pour

« Targeted Induced Local Lesion In Genome »), permet désormais d‟isoler des mutations

http://tgrc.ucdavis.edu/

http://solgenomics.net/index.pl

http://www.sgn.cornell.edu/)

http://www.sgn.cornell.edu/)

http://tgrc.ucdavis.edu/

Introduction 4

ponctuelles dans la séquence de gènes d‟intérêt à partir d‟un pool d‟ADN des familles mutées.

Ces travaux mettent à disposition les graines de 3 417 mutants de la variété M82 répertoriés à

partir de 13 000 familles (http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/), et 3500 mutants de la variété

MicroTom répertoriés à partir de 8500 familles

(http://www.bordeaux.inra.fr/umr619/tilling.htm).

Enfin, la dernière approche visant à enrichir les ressources disponibles sur la tomate

concerne le séquençage de son génome. Lancé en 2004 dans le cadre d‟un consortium

international, l’International Tomato Sequencing project regroupant dix pays

(http://sgn.cornell.edu/about/tomato_sequencing.pl), ce projet a abouti à la fin de l‟année

2009. Les 37000 gènes contenus dans ce génome de 900 Mpb sont en cours d‟annotation, la

version la plus récente de cet assemblage étant disponible depuis le mois d‟Août 2010

(http://solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/index.pl). Le projet SOL

(International Solanaceae Genome Project, http://www.sgn.cornell.edu/solanaceae-project/)

regroupe 23 pays répartis dans le monde entier au sein d‟un consortium visant à assurer une

collaboration et un échange de connaissances sur l‟ensemble des modèles appartenant à la

famille des Solanaceae. En France, 7 laboratoires participent à la branche européenne de ce

projet, nommé EUSOL, et s‟intéressent à des thématiques variées comme (i) le

développement et la maturation du fruit, (ii) le métabolisme, le transport et les interactions

sources-puits, (iii) le métabolisme secondaire, (iv) la structure et les modifications de la paroi,

ainsi que (v) la résistance aux maladies.

Parmi les génomes des fruits et légumes cultivés, celui de la tomate renferme une des

plus importantes quantités de caractères monogéniques exploitables. Le grand nombre

d‟espèces sauvages et de mutants disponibles, l‟élaboration de cartes génétiques précises, et la

création de banques de données d‟expression du génome ont permis d‟approfondir la

connaissance des mécanismes impliqués dans le développement et la qualité du fruit de

tomate (Causse et al., 2007). Ainsi, l‟importance agronomique de la tomate et les ressources

génétiques et moléculaires disponibles font de ce fruit un modèle d‟étude pour l‟ensemble des

fruits charnus.

Les laboratoires de l‟INRA et du CNRS, en partenariat avec les professionnels, se sont

donnés pour but de diversifier les gammes disponibles afin d‟améliorer les qualités gustatives

et nutritionnelles des fruits.

http://zamir.sgn.cornell.edu/mutants/

http://www.bordeaux.inra.fr/umr619/tilling.htm

http://sgn.cornell.edu/about/tomato_sequencing.pl

http://solgenomics.net/genomes/Solanum_lycopersicum/index.pl

http://www.sgn.cornell.edu/solanaceae-project/

Introduction 5

I.C Importance agronomique et nutritionnelle

I.C.1 La production

En 2009, la production mondiale de tomates s‟élevait à plus de 141 millions de tonnes

(Mt) selon la FAO (http://faostat.fao.org/) et elle augmente tous les ans de plusieurs millions

de tonnes. Entre 1961 et 2009, la production a été multipliée par 5 dans le monde (figure 2),

et dans certains pays comme l‟Inde, elle a été multipliée par 24. Cette évolution a été très forte

et rapide, particulièrement dans les pays asiatiques, dans lesquels l‟alimentation

s‟occidentalise. La tomate est le premier fruit (ou « légume ») cultivé en terme de volume de

production, avant la pastèque (100 Mt) et la banane (95 Mt) (figure 3). En tant que légume,

seule la pomme de terre et le manioc présentent une production supérieure à celle de la tomate

avec respectivement 329 Mt et 240 Mt en 2009. Cependant, ces chiffres ne tiennent compte

que des fruits commercialisés et pour avoir un chiffre exact, il faudrait y ajouter les tomates

issues des cultures vivrières, non négligeables dans certaines régions. A elle seule, la Chine

représente un quart de la production mondiale avec 34 Mt en 2009. Viennent ensuite les Etats-

Unis avec 14 Mt puis l‟Inde avec 11 Mt suivi de nombreux pays méditerranéens comme la

Turquie, l‟Egypte ou l‟Italie. La France se situe au 22ème

rang mondial, avec une production

de 725 000 tonnes en 2009 (figure 4). La production de tomate se divise en deux secteurs

d‟activité, la tomate en frais et la tomate destinée à la transformation et à la conserve. Dès les

années 70, les sélectionneurs ont cherché à augmenter les rendements de production en tomate

par des croisements entre différentes variétés. Dix ans plus tard, leur objectif était d‟améliorer

le critère conservation du fruit, ce caractère étant essentiel pour le commerce international. La

France importe chaque année des quantités importantes de tomate, souvent en provenance

d‟Espagne et du Maroc, pour des raisons climatiques et économiques. Après des décennies de

recherches pour améliorer les rendements, dans les années 90, sous la pression des

consommateurs, les sélectionneurs ont orienté leur effort pour l‟amélioration des qualités

gustatives de la tomate.

http://faostat.fao.org/

Introduction 6

Figure 2: Evolution de la production de tomate (en rouge) et de la superficie des cultures (en vert) dans le

monde (FAO, 2009).

Figure 3: Production mondiale des principaux fruits dans le monde (FAO, 2009)

Figure 4 : Principaux pays producteurs de tomate. La France arrive au 22ème rang mondial. (FAO, 2009)

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Tomates Pastèques Bananes Raisins Oranges Pommes

Pro

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Mt)

Chine

USA

Inde

France

Reste du monde

Introduction 7

I.C.2 Importance nutritionnelle

Très longtemps considérée comme toxique à cause de son appartenance à la famille de

la belladone et de la morelle noire et de la présence d‟alcaloïdes toxiques (tomatine et

solanine) dans les feuilles et les fruits verts, la tomate représente aujourd‟hui plus de 20 % de

la consommation en légume frais des français. Récemment l‟Etat français a mis en place une

politique nutritionnelle de grande ampleur (le Programme National Nutrition Santé ;

http://www.mangerbouger.fr/) afin de lutter contre des pathologies qui deviennent de plus en

plus préoccupantes depuis une dizaine d‟années en France qu‟il s‟agisse du cancer, des

maladies cardiovasculaires, de l‟obésité, de l‟ostéoporose ou du diabète de type 2. Une

consommation quotidienne de 400g de fruits et légumes frais permettrait d‟éviter de 7 % à 31

% des cancers. Même si il n‟est pas le seul facteur, la nutrition est un déterminant majeur de

l‟état de santé de la population. Le premier objectif nutritionnel de ce programme consiste à

« augmenter la consommation de fruits et légumes ». Trois arguments sous-tendent les

bénéfices des fruits et légumes pour la santé : (i) une contribution aux apports en

micronutriments nécessaires au bon fonctionnement de l‟organisme, (ii) un effet protecteur

contre les grandes pathologies chroniques que sont les maladies cardiovasculaires, neuro-

dégénératives et métaboliques et les cancers, et enfin, (iii) un faible contenu énergétique pour

lutter contre l‟obésité. En effet, les fruits et légumes sont riches en vitamines, minéraux, en

fibres et en antioxydants mais en revanche, ils sont plutôt pauvres en calories.

Dans ce cadre de cette politique de Santé, la tomate possède un rôle important étant

données sa consommation et ses propriétés physico-chimiques. Tout d‟abord, la tomate est

très riche en eau (90 à 95 % de sa matière fraîche) ce qui en fait un aliment très pauvre en

calories (18 à 20 kcal pour 100 grammes). Elle est pauvre en lipides et exempte de

cholestérol. Par ailleurs, la tomate est une source de minéraux, et notamment de potassium

(237 mg pour 100 g) qui est un micronutriment essentiel à l‟Homme pouvant réduire les

risques d‟hypertensions. Elle est aussi source de bien d‟autres substances bénéfiques pour

l‟Homme, parmi celles-ci on peut citer : la provitamine A ( -carotène), la vitamine C et

surtout le lycopène, antioxydant le plus actif des caroténoïdes alimentaires (Agarwal and Rao,

2000), qui donne sa couleur rouge à la tomate mûre.

http://www.mangerbouger.fr/

Introduction 8

II. Structure et développement du fruit de tomate

II.A De la graine au fruit

La graine de tomate peut, si les conditions sont favorables, germer immédiatement

après sa dissémination et ne nécessite pas d‟étape de vernalisation. Après la germination, la

plantule engage son programme de développement végétatif assurant la mise en place du

système racinaire et de la partie aérienne (tige et feuilles), selon une croissance indéterminée

chez la plupart des variétés. La tomate se caractérise par une architecture sympodiale et

contient, en plus des méristèmes apicaux, racinaires et axillaires, un quatrième type de

méristème appelé méristème sympodial (figure 5.A). Contrairement à A. thaliana, le

méristème axillaire situé juste au niveau de l‟inflorescence redémarre précocement pour

former le méristème sympodial. Ce dernier va initier un nombre limité d‟entrenoeuds

végétatifs avant de former une nouvelle inflorescence. Ce cycle est réitéré permettant une

croissance végétative continue sur l‟axe primaire alors que la phase de développement

reproducteur a déjà commencé. Cela donne aux plantes une architecture particulière

caractérisée par une répétition de structures constituées par un nombre limité d‟entre-nœuds

végétatifs terminés par une inflorescence (Szymkowiak and Irish, 2006).

Sous l‟influence de facteurs endogènes (par exemple l‟âge de la plante ou les

régulations hormonales) et exogènes (par exemple la lumière et la température), la plante peut

passer de la phase végétative à la phase reproductive. Néanmoins, les variétés modernes de

tomates qui résultent, comme nous l‟avons vu, d‟une sélection intense, présentent un cycle de

vie beaucoup plus court et une insensibilité à la durée d‟ensoleillement comparés à leurs

ancêtres sauvages, certainement afin de s‟ajuster aux conditions de culture des latitudes

européennes et nord américaines (Jimenez-Gomez et al., 2007). La transition entre la phase

végétative et la phase reproductive correspond à l‟étape « d‟induction florale » au cours de

laquelle le méristème végétatif va se convertir en méristème inflorescenciel (figure 5.B) qui

forme, à son tour, six à dix méristèmes floraux organisés en cyme (Welty et al., 2007). La

fleur de tomate, organisée en verticilles, présente, au niveau de son périanthe, les pièces non

reproductives des deux premiers verticilles : cinq sépales et cinq pétales. Cinq étamines

forment le troisième verticille, appelé androcée. Le pistil, généralement composé d‟un

minimum de deux à trois carpelles soudés renfermant l‟ovaire, forme le gynécée, quatrième et

dernier verticille de la fleur de tomate (figure 5.C). Le développement de la fleur se fait selon

différentes étapes décrites avec precision (Brukhin et al., 2003). Au nombre de 20, elles

Introduction 9

aboutissent à la formation d‟un ovaire abritant les ovules, entouré d‟une corolle d‟anthères. A

maturité, ces dernières vont libérer les grains de pollen qui, une fois déposés sur le stigmate,

vont germer à travers le style jusque dans l‟ovaire pour aller féconder les ovules (figure 5.C).

La fécondation d‟un nombre suffisamment important d‟ovules entraîne le

déclenchement d‟un signal initiant le développement du fruit à partir des tissus de l‟ovaire.

Les graines de tomates se développent alors dans l‟environnement fortement hydraté du fruit

au travers de plusieurs étapes successives : (i) le développement de l‟embryon qui

s‟accompagne de divisions cellulaires dans la partie périphérique des téguments, (Davidovich-

Rikanati et al.) le développement de l‟endosperme puis des cotylédons et enfin (iii)

l‟établissement de l‟axe apico-basal de l‟embryon. Les graines semblent influencer le

Figure 5 Développement de la fleur et du fruit de tomate (Solanum lycopersicum L.). A.

Représentation schématique de l‟axe végétatif de tomate (adapté de Szymkowiak et Irish, 2006). Les

cercles pleins représentent les méristèmes axillaires, les cercles vides les fleurs et la flèche le méristème

sympodial. B. Inflorescence de tomate et schéma d‟une inflorescence de type cyme scorpioïde (d‟après

Welty et al., 2007). Les ronds rouges représentent les fleurs. C. Coupes longitudinales montrant la

structure de la fleur et du fruit de tomate.

Introduction 10

développement du fruit par l‟intermédiaire des multiples hormones qu‟elles synthétisent

(Gillaspy et al., 1993). Parallèlement, il a été proposé que les tissus charnus du fruit

pourraient inhiber la germination précoce de ces graines (Berry and Bewley, 1992).

L‟altération de la signalisation hormonale engendrée par la fécondation peut aboutir au

développement de l‟ovaire en fruit sans qu‟il y ait fécondation des ovules. Les fruits ainsi

obtenus sont parthenocarpiques, c„est à dire dépourvus de graines.

II.B Structure du fruit de tomate

L‟espèce Solanum lycopersicum comprend un très grand nombre de variétés de

tomate, dont les fruits à maturité peuvent avoir des tailles, des formes et des couleurs très

différentes. A l‟heure actuelle, certaines variétés sont considérées comme des modèles

d‟études utilisés par l‟ensemble de la communauté scientifique comme par exemple : Ailsa

Craig qui est une des premières variétés transformée génétiquement (Bird et al., 1988), M82

qui a servi de fond génétique pour l‟élaboration de collections de mutants (Menda et al.,

2004) et de lignées d‟introgression (Eshed and Zamir, 1994); et enfin MicroTom, variété

naine à croissance déterminée qui résulte d‟une double mutation (Meissner et al., 1997).

Les différents tissus du fruit de tomate sont présentés sur la figure 5.C. Le péricarpe

provient de la différenciation des parois de l‟ovaire de la fleur. Il peut être divisé en péricarpe

externe, péricarpe radial ou « septum » (qui divise le fruit en plusieurs loges), et péricarpe

interne ou « columelle ». Le septum et la columelle sont moins pigmentés que le péricarpe

externe. Celui-ci comprend trois tissus : l‟exocarpe ou peau du fruit, le mésocarpe renfermant

les vaisseaux conducteurs et l‟endocarpe qui délimite les loges carpellaires. L‟exocarpe est

composé d‟une couche de cellules supérieures ou épiderme et de deux à quatre couches de

cellules inférieures collenchymateuses ou hypoderme. Il peut être recouvert d'une cuticule qui

s'épaissit avec l'âge (de 4 à 10 µm d‟épaisseur). Le mésocarpe est constitué de cellules

parenchymateuses dont la taille est supérieure dans la partie centrale et diminue vers

l‟épiderme et les locules. Le péricarpe externe subit de nombreux changements anatomiques

lors des premières semaines de développement. Son épaisseur, qui résulte d‟un accroissement

du nombre et de la taille des assises cellulaires, est multipliée par 10 dans les variétés de

tomates cerise et par plus de 50 dans les variétés à gros fruit (Cheniclet et al., 2005).

Les tissus vasculaires s‟organisent en deux réseaux distincts déjà présents avant la

fécondation. Le premier part du pédicelle à travers le péricarpe externe de manière plus ou

moins parallèle à la périphérie du fruit, le second passe à travers la columelle et le péricarpe

Introduction 11

interne pour se diriger vers les graines. A maturité, ce dernier présente un aspect rigide dû à la

présence d‟une importante quantité de vaisseaux conducteurs.

Le placenta, greffés sur les tissus vasculaires centraux, servent de support aux futures

graines qui font jour dans les cavités loculaires dont le nombre varie selon les variétés.

Quelques jours après la fécondation, la différentiation des cellules du placenta assure la

formation du tissu loculaire (ou gel) qui s‟étend dans les loges pour entourer les graines sans

pour autant s‟unifier avec les parois carpellaires. Dans le fruit immature, le tissu loculaire est

ferme et compact mais à maturité, les parois cellulaires se rompent et il devient gélatineux.

II.C Développement du fruit de tomate

Dans des conditions de culture optimales, la mesure du diamètre du fruit au cours du

développement de la tomate décrit une sigmoïde (figure 6) qui fait apparaître trois périodes

distinctes (Joubes et al., 1999). Après la fécondation de l‟ovaire (anthèse), le fruit présente

une phase de croissance lente durant laquelle l‟activité mitotique dans l‟ovaire est intense,

puis une phase de croissance rapide qui correspond à l‟expansion des cellules du fruit et enfin,

une phase finale de croissance lente qui correspond aux modifications biochimiques et

physiologiques du mûrissement. Suite à la mise à fruit, les deux premières phases de

croissance sont regroupées sous le terme de développement précoce du fruit de tomate qui

comporte une phase de division cellulaire et une phase d‟expansion cellulaire. La fécondation

des ovules, ainsi que le développement des embryons, assureraient le déclenchement et le

maintient des processus de développement du fruit en induisant de multiples signalisations

hormonales (Gillaspy et al., 1993; Vriezen et al., 2008). Au cours du mûrissement, et sous

l‟influence de l‟éthylène, le fruit subit de nombreuses modifications biochimiques qui

aboutissent à un fruit coloré, sucré et de texture molle, propre à la consommation (Alexander

and Grierson, 2002).

Introduction 12

Figure 6: Le développement du fruit de tomate (Solanum lycopersicum). A. Fleurs et fruits de tomate à

différents stades de développement. PA, pré-anthèse; A, anthèse; JAA, jour après anthèse; VM, vert mature; O,

orange; LR, rouge léger; RM, rouge mûr. B. Diamètre du fruit au cours des 3 phases de développement. La flèche verticale symbolise la mise à fruit (Joubes et al., 1999).

II.C.1 La mise à fruit

Cette étape correspond au développement de l‟ovaire afin d‟assurer une pollinisation

efficace des ovules par le pollen de la fleur. Une fois ces tissus mis en place, la croissance de

l‟ovaire et des ovules cesse et la sénescence de ces structures survient si aucun événement de

pollinisation n‟a lieu. En effet, la transformation de l‟ovaire en fruit est directement liée à

l‟efficacité de la fécondation : le nombre de graines viables, sources d‟hormones tout au long

du développement du fruit (Gillaspy et al., 1993) va conditionner la croissance de l‟organe. Si

le taux de fécondation est trop faible, l‟effet sur le fruit peut se traduire par une taille réduite

ou un avortement.

II.C.2 La phase de division cellulaire

Suite à la fécondation des ovules, l‟activité de division des cellules redevient

particulièrement intense et se poursuit pendant 7 à 10 jours. Cependant, ces divisions

cellulaires ne surviennent pas de façon uniforme au sein du fruit. Dans les jours qui succèdent

à l‟anthèse (de 2 à 4 JAA), l‟épiderme, le péricarpe et le placenta sont les premiers tissus à se

développer par divisions cellulaires. Dans le péricarpe, les divisions en orientation périclinale

(dont le plan de division est parallèle à la surface du fruit) entraînent l'augmentation du

nombre de couches cellulaires, alors que les divisions anticlinales (perpendiculaires à la

surface du fruit) augmentent le nombre de cellules par assise. Entre 4 et 6 JAA, la partie

PA A 2 5 10 15 20 VM O RL RM

JAA

0

5

10

15

20

25

Dia

mètr

e (

mm

)

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Jour Après Anthèse (JAA)

Développement précoce Mûrissement

Division Expansion

B

A

Introduction 13

externe du péricarpe et le placenta restent des zones de divisions actives. A partir de 6 JAA,

les divisions survenant au niveau de la couche externe du placenta donnent naissance au tissu

loculaire qui commence ainsi à entourer les graines en formation. A partir de 10 JAA, seules

les cellules de l‟épiderme poursuivent leurs divisions jusqu‟au début de la mûrissement pour

supporter l‟augmentation de volume considérable du fruit durant la phase d‟expansion

cellulaire (Joubes and Chevalier, 2000). Il a été observé que le développement des embryons

et des graines, sources de facteurs hormonaux, semble contrôler la vitesse et le maintien des

divisions dans le fruit (Varga and Bruinsma, 1986) : l‟activité mitotique dans l‟ovaire serait

conditionnée par le nombre d‟ovules fécondés.

II.C.3. La phase d’expansion cellulaire

Les vagues successives de divisions cellulaires, avant et après anthèse, définissent la

taille potentielle du fruit, mais c'est l'expansion des cellules entre 10 et 40 JAA qui en

détermine la taille finale (Ho, 1996). Au cours du développement du fruit, le diamètre des

cellules du péricarpe passe de 10 µm à 350 µm (valeur moyenne établie sur 20 lignées de

tomate) entraînant une augmentation du volume cellulaire estimée à 32 000 fois (Cheniclet et

al., 2005). Cet accroissement du volume cellulaire s‟accompagne d‟une forte augmentation de

leur contenu en ADN nucléaire (polyploïdie) qui est souvent associé au phénomène de

grandissement, ainsi qu‟à une activité métabolique intense observée, par exemple, au sein des

grains de mais en développement (Joubes and Chevalier, 2000). Ce phénomène résulte de la

capacité des cellules à entrer dans un cycle d‟endoréduplication de l‟ADN constitué d‟une

alternance de phase S (synthèse d‟ADN) et de phase G, en absence de mitose (Joubes and

Chevalier, 2000). Au sein du fruit de tomate, le péricarpe et le tissu loculaire sont les deux

tissus qui présentent les taux de polyploïdie les plus élevés et les surfaces cellulaires les plus

importantes (Cheniclet et al., 2005). Dans les cellules qui composent ces tissus, les vacuoles,

qui constituent d‟importants compartiments de stockage des métabolites, occupent une grande

partie du volume. L‟expansion des cellules fait intervenir des mécanismes assurant le

relâchement des parois et la diminution du potentiel hydrique des cellules (Schopfer and

Liszkay, 2006). L‟assemblage de polymères de cellulose et d‟hémicellulose qui composent la

paroi des cellules végétale constitue le frein majeur contre l‟expansion des cellules sous l‟effet

de la turgescence. Les mécanismes assurant le relâchement de cette structure jouent un rôle

important dans le grandissement cellulaire et semblent gouvernés par des régulations

hormonales (Catala et al., 2000). Le relâchement des parois s‟accompagne d‟une forte

Introduction 14

accumulation de sucres et d‟acides organiques qui crée un gradient de pression osmotique et

une entrée d‟eau massive assurant le grandissement.

C'est pendant la phase d'expansion cellulaire que le fruit atteint sa vitesse de croissance

et sa teneur en eau maximale (5 à 7% de matière sèche, contre 17% avant fécondation ; Ho et

Hewitt, 1986). A la fin de cette période, le fruit a quasiment atteint son diamètre et son poids

définitif.

Il est à noter que l‟expansion cellulaire ne survient pas de façon homogène dans tous

les tissus (Cheniclet et al., 2005). Dans le péricarpe, les cellules centrales présentent un

accroissement de taille spectaculaire alors que dans les zones épidermique et subépidermique

la taille des cellules reste la même qu‟à l‟anthèse. Le tissu loculaire présente une phase

d‟expansion cellulaire décalée par rapport au péricarpe mais néanmoins très importante et

homogène sur l‟ensemble du tissu. Ce dernier, intimement lié au développement des graines,

est encore peu étudié à l‟heure actuelle : sa fonction au sein du fruit reste encore à

approfondir. Les autres tissus du fruit, tels que la columelle et le placenta, subissent également

ce phénomène de grandissement dans de moindres proportions.

II.C.4. La mûrissement du fruit

La tomate fait partie des fruits climactériques, comme l‟abricot, la pêche, la prune, la

pomme, la banane et la mangue qui sont caractérisés par une augmentation de la vitesse de

respiration dans les stades précoces du mûrissement (« pic » ou « crise climactérique »)

associée à une augmentation transitoire de la production d‟éthylène (Cheniclet et al., 2005).

Ce dernier coordonne et accélère, au travers de l‟activation de ses récepteurs (LeETR 1 à 6),

de multiples mécanismes aboutissant à un pic respiratoire, un changement radical dans la

composition du fruit en sucres, acides organiques, caroténoïdes et chlorophylles, une

dégradation des parois cellulaires, ainsi que la synthèse de composés volatiles (Alexander and

Grierson, 2002). Le mûrissement du fruit est initiée après la maturation des graines, lorsque le

fruit a quasiment atteint sa taille finale (stade "vert mature"). L‟ensemble de ces changements

physiologiques et biochimiques aboutissent à un fruit "rouge mûr" propre à la consommation

(figure 7). Pour les consommateurs, le mûrissement confère aux tomates les attributs

organoleptiques qui les rendent attractives. En revanche, d‟un point de vue agronomique, le

fruit de tomate devient alors plus fragile vis-à-vis des agressions extérieures. Les

modifications majeures du murissement sont les suivantes (Hobson and Grierson, 1993) :

Introduction 15

Couleur : les chloroplastes sont transformés en chromoplastes, avec dégradation

concomitante des chlorophylles et synthèse de caroténoïdes, en particulier le lycopène.

Goût : l'acidité du fruit diminue suite à la dégradation de l'acide malique. Les teneurs en

sucres (hexoses) augmentent sous l‟effet de la dégradation des réserves d'amidon, ils sont

importés puis stockés dans la vacuole.

Arômes : de nombreux composés aromatiques (esters, aldéhydes) sont synthétisés.

Texture : la perte de fermeté du fruit résulte de la dégradation de certains constituants des

parois cellulaires (hémicellulose, cellulose, pectine) et concorde avec une diminution de la

résistance aux agents pathogènes.

Le murissement du fruit de tomate correspond à des modifications métaboliques de la

composition des cellules de la tomate qui ont été schématisés par Carrari et Fernie en 2006

(figure 7) et à des modifications profondes de la structure des parois cellulaires.

Le passage de l‟ovaire au fruit mûr est donc une succession d‟étapes complexes

assurant la croissance de l‟organe par division et expansion des cellules, ainsi que de profonds

changements métaboliques. Les phytohormones sont depuis longtemps connues pour leur

influence sur le développement précoce et le mûrissement du fruit de tomate (Nitsch, 1970).

Figure 7: Evolution métabolique entre le fruit de tomate immature et mûr (Carrari et Fernie, 2006).

Représentation schématique des changements métaboliques qui surviennent dans le fruit de tomate, entre 30 et

60 JAA. Les noms en rouge, vert et gris indiquent respectivement une augmentation, une diminution et une

absence de changement dans les teneurs des métabolites entre les deux stades.

Introduction 16

III. Régulation du développement précoce du fruit

Le fruit, qu‟il soit charnu comme la baie de tomate, ou sec comme la silique

d‟arabette, résulte du développement et de la fécondation d‟une fleur. Après la fécondation

des ovules, le développement des graines et leur maturation s‟effectue de façon synchronisée

avec la transformation des carpelles en un organe complexe composé de différents tissus : le

fruit (Hilhorst et al., 1998; Gillaspy et al., 1993). Chez les fruits charnus, l‟étape ultime du

développement du fruit est son mûrissement, qui va le rendre attrayant pour ses prédateurs qui

le consommeront et disperseront ainsi les graines. Les fruits charnus semblent avoir émergé à

partir d‟ancêtres portant des fruits secs avec des exemples de conversion entre les deux types

de fruit au cours de l‟évolution (Knapp, 2002; Seymour et al., 2008). Dans la famille des

Solanacées, les fruits secs et fruits charnus coexistent puisque la tomate et le poivron

(Capsicum annuum) portent des fruits charnus, tandis que le pétunia (Petunia hybrida)

ou le

tabac (Nicotiana tabacum) portent des fruits secs. Il a donc été proposé que les bases

moléculaires liées à cette différence de nature de fruit ne soit pas très complexes (Knapp,

2002). En conséquence, certains mécanismes moléculaires impliqués dans le développement

des fruits charnus et des fruits secs seraient relativement bien conservés.

Le développement des fruits, au même titre que tous les processus développementaux

chez les végétaux, implique l‟intégration de multiples signaux environnementaux et

endogènes, qui, avec le programme génétique intrinsèque de la plante, vont permettre la

réalisation optimale du programme de développement. Chez la tomate, l‟identification

d‟acteurs moléculaires impliqués dans la régulation du développement du fruit a bénéficié de

plusieurs atouts : i) la disponibilité de différents mutants pléiotropiques de mûrissement du

fruit (pour revue, (Gray et al., 1994), ii) le développement de croisements interspécifiques

entre la tomate cultivée et les espèces sauvages qui ont mis en évidence des QTL

(Quantitative Trait Loci) de taille ou de forme du fruit (Grandillo et al., 1999), iii) la

« transposition » de données disponibles chez Arabidopsis thaliana, notamment en ce qui

concerne les facteurs de transcription (§III.1) et les voies de signalisation hormonales (§III.3),

iv) l‟essor des approches de génomique qui a permis de mettre en évidence l‟expression de

nouveaux gènes régulateurs potentiels (pour revue (Lozano et al., 2009). Les paragraphes ci-

dessous vont s‟attacher à présenter les données disponibles concernant la régulation du

développement précoce du fruit de tomate. Les aspects portant sur la régulation du

mûrissement du fruit, ne seront que très peu abordés, seulement afin de mettre en évidence les

interactions entre développement précoce/mûrissement.

Introduction 17

III.A La famille des gènes à MADS-Box

Les gènes à MADS-box représentent une famille de facteurs de transcription très

conservée chez les angiospermes (Becker and Theißen, 2003). Ces gènes sont impliqués dans

la régulation de nombreux processus développementaux chez Arabidopsis thaliana comme

l‟identité des méristèmes et des organes au niveau des inflorescences et des fleurs (Theissen et

al., 2000), le développement de l‟embryon (Heck et al., 1995), des racines (Rounsley et al.,

1995). Ainsi chez cette plante modèle, des travaux ont montré l‟importance de trois gènes à

MADS-box dans le développement du fruit après la fécondation de la fleur : FRUITFULL et

SHATTERPROOF1 et 2 qui sont impliqués dans l‟élongation et la déhiscence de la silique

(Gu et al., 1998; Ferrandiz et al., 2000).

Chez la tomate, plusieurs gènes à MADS-box ont une forte expression pendant le

développement de la fleur et les premières étapes du développement du fruit (TDR4, TDR6,

TAGL2, TAGL11 et TAGL12) suggérant un rôle important dans ces processus (Busi et al.,

2003). Ces gènes sont les orthologues respectifs de FUL (FRUITFULL) pour TDR4, AP3

(APETALA3) pour TDR6 et AGLx (AGAMOUS-LIKEx) pour TAGLx. Puis l‟utilisation

d‟amorces dégénérées a permis d‟amplifier la séquence de 36 ADNc de MADS-box de

tomate, pour lesquels les profils d‟expression au cours du développement du fruit ont pu être

précisé (Hileman et al., 2006). Ces travaux ont été complétés par une étude systématique des

interactions entre ces différentes protéines, cette dimérisation étant essentielle à l‟activité de

ce type de facteur de transcription (Leseberg et al., 2008).

Les analyses fonctionnelles réalisées sur les gènes à MADS-box de tomate ont montré

que plusieurs d‟entre eux étaient impliqués dans la régulation de différentes phases du

développement du fruit : l‟anthèse (TM29), les phases de division et d‟expansion du fruit

(TAGL1) et le mûrissement du fruit (TAGL1, LeMADS-RIN, TDR4). Ainsi, le gène à MADS-

box TM29, homologue des gènes SEPALLATA d‟Arabidopsis est un gène fortement exprimé

dans les ovaires à l‟anthèse (Ampomah-Dwamena et al., 2002). La génération de plantes

transgéniques dans lesquelles son expression est réduite a montré, non seulement son

implication dans le maintien de l'identité florale, mais également son rôle dans les étapes

précoces du développement du fruit puisque les plantes générées présentent un

développement de fruits parthénocarpiques (Ampomah-Dwamena et al., 2002). D‟autres

auteurs ont également suggéré un rôle important du gène à MADS-box DEFICIENS qui est

Introduction 18

fortement exprimé dans les ovaires autour de l‟anthèse et dont l‟expression est réduite dans

les mutants parthénocarpiques pat (Mazzucato et al., 2008).

Contrairement aux gènes à MADS-box LeMADS-RIN (Vrebalov et al., 2002) et TDR4

(Seymour et al., 2002) dont le rôle régulateur semble être limité au mûrissement du fruit

(Giovannoni, 2007; Eriksson et al., 2004), le gène à MADS-box TAGL1 (Tomato

AGAMOUS-LIKE 1) participe à la régulation du développement précoce du fruit de tomate

ainsi qu‟à la régulation de son mûrissement. Ce gène est l‟orthologue d‟AGL1 d‟Arabidopsis

qui correspond aux gènes SHP1/2 (SHATTERPROOF1 et 2) nécessaires à la mise en place de

la zone de déhiscence de la silique et au développement de l‟ovule (Liljegren et al., 2000;

Pinyopich et al., 2003). Chez la tomate, TAGL1 semble être impliqué dans des processus

d‟expansion cellulaire et de mûrissement du fruit puisque des lignées de transformants sous-

exprimant TAGL1 présentent un péricarpe moins épais et une modification de la coloration du

fruit mature (Itkin et al., 2009; Vrebalov et al., 2009; Pan et al., 2010). Des expériences de

complémentation fonctionnelle des mutants shp1 shp2 d‟Arabidopsis par TAGL1 ont montré

que TAGL1 ne pouvait pas restaurer complètement le phénotype sauvage, et suggèrent que les

fonctions moléculaires des orthologues de tomate et d‟Arabidopsis ont divergé (Vrebalov et

al., 2009).

III.B Contrôle de la taille et de la forme du fruit de tomate

La variation de taille et de la forme des fruits sont des caractères déterminés par

plusieurs loci ou caractères quantitatifs. Ainsi, de nombreux QTL (Quantitative Trait Loci) de

taille et de forme du fruit ont été cartographiés chez la tomate dans différents croisements

interspécifiques (Grandillo et al., 1999). Pour une petite partie de ces QTL, les recherches ont

abouti au clonage et à l‟analyse moléculaire du gène impliqué.

III.B.1 Fw2.2 (Fruit weight 2.2)

Fw2.2 est le QTL majeur de taille du fruit chez la tomate et il peut expliquer à lui seul

la variation de taille d‟environ 30% (figure 8) entre les petits fruits des tomates sauvages et

les gros fruits des espèces domestiquées (Frary et al., 2000). L‟allèle présent chez les variétés

de tomate à gros fruits présente des mutations dans la séquence promotrice du gène FW2.2,

entrainant une diminution de son expression (Frary et al., 2000). Il a été montré que ce gène

est un régulateur négatif de la division cellulaire dans le fruit, qui modifie la taille globale du

fruit sans en modifier la forme (Frary et al., 2000; Tanksley, 2004; Cong and Tanksley, 2006)

Introduction 19

A ce jour, le mécanisme par lequel FW2.2 régule négativement la division cellulaire

dans le fruit n‟est pas encore élucidé. Ce gène code pour une petite protéine G Ras-like,

localisée au niveau de la membrane plasmique (Frary et al., 2000). Par des expériences de

double hybride il a été démontré que FW2.2 interagit physiquement avec la sous-unité β de la

Caséine Kinase II (Cong and Tanksley, 2006) et que cette interaction avait lieu au niveau de

la membrane plasmique suggérant ainsi son implication dans un système de signalisation

activé par des signaux extra-cellulaires, coordonnant au final l‟activité de division cellulaire.

D‟autres travaux suggèrent que FW2.2 fonctionnerait en amont de gènes impliqués dans la

prolifération cellulaire, reliant ainsi la modulation de l‟activité du cycle cellulaire dans le

développement des fleurs et des fruits aux signaux « sucres » ou hormonaux (Baldet et al.,

2006).

III.B.2 Fas (fasciated) et ln (locule-number)

Chez la tomate, le nombre de carpelles dans la fleur détermine le nombre final de

loges ou compartiments présents dans un fruit mature. Ainsi la taille du fruit peut être

augmentée par une augmentation du nombre de carpelles présents dans la fleur. La plupart des

espèces sauvages de tomate, produisant de petits fruits, présentent un nombre réduit de loges

(2 à 4) (figure 8). En revanche, chez la plupart des cultivars consommés aujourd‟hui, le

nombre de loges est souvent supérieur à 8. Il a été proposé que le nombre de loges ait permis

une augmentation de la taille du fruit allant jusqu‟à 50% et représenterait une des dernières

étapes de la domestication de la tomate par l‟homme (Tanksley, 2004; Lippman and Tanksley,

2001).

Deux QTL de taille finale du fruit par le contrôle du nombre de carpelles ont été

identifiés chez la tomate: ln (locule-number) situé sur le chromosome 2 et fas (fasciated) situé

sur le chromosome 11. Il semblerait que ce soit fas qui présente l‟effet le plus fort sur ce

paramètre du développement du fruit (Barrero and Tanksley, 2004). Le gène FASCIATED

code pour un facteur de transcription de type YABBY-like. L‟augmentation du nombre de

loges dans les cultivars modernes de tomate est principalement due à la répression de ce gène

au cours du développement floral (Cong et al., 2008).

Introduction 20

Figure 8 : Evolution de la taille et de la forme du fruit de tomate (d‟après Lippman et al., 2001). A. Fruit de

l‟espèce sauvage à petit fruit S. pimpinellifolium avec deux locules. B. Fruit d‟une espèce commerciale

domestiquée de S. lycopersicum avec de façon classique deux à quatre locules. C. Fruit de S.lycopersicum

variété Giant Heirloom. Les étoiles indiquent les principaux QTL impliqués dans les différences de taille et de

forme entre ces fruits ainsi que le pourcentage de la variation phénotypique observée attribué à chacun d‟eux.

III.B.3 Ovate, sun et fs8.1

La forme du fruit est un caractère quantitatif qui a également fait l‟objet d‟études

génétiques. Ainsi plusieurs QTL contrôlant la forme allongée du fruit dans les variétés

cultivées ont été identifiés (Gonzalo and van der Knaap, 2008) et deux gènes correspondant

clonés.

OVATE code pour une nouvelle classe de protéines hydrophiles avec un signal

d‟adressage nucléaire putatif (Liu et al., 2002). L‟effet récessif de la mutation ovate entraine

une élongation asymétrique du fruit lui conférant une forme en « poire ». Ce phénotype est dû

à l‟apparition d‟un codon stop dans le second exon du gène, aboutissant à une protéine

tronquée. OVATE est exprimé très tôt lors du développement des fleurs, mais ses transcrits

sont détectables dans le fruit deux semaines après l‟anthèse lors des premières étapes de la

formation du fruit (Liu et al., 2002).

SUN code pour une protéine IQD12 appartenant à la famille de protéines comportant

un domaine IQ67 (Xiao et al., 2008). Il affecte la forme du fruit après l‟anthèse et le

phénotype de la mutation de ce gène est du à un évènement de duplication de gène de 24,7 kb

inhabituel induit par le rétrotransposon Rider qui affecte sa transcription (Xiao et al., 2008).

Introduction 21

Le gène SUN, contrairement à OVATE, permet une conservation de la symétrie bilatérale

lorsque le fruit se développe.

Le troisième loci identifié comme étant impliqué dans le contrôle de la forme du fruit

est FRUIT SHAPE 8.1 (FS8.1). Ce gène est exprimé principalement durant le développement

floral, avec une faible activité après l‟anthèse (Ku et al., 2000). Ce QTL, en plus d‟affecter la

forme du fruit, joue également un rôle sur le nombre de fleurs et par conséquence, de fruit par

inflorescence.

III.C Contrôle hormonal du développement du fruit

L‟influence des différents facteurs hormonaux sur le développement du fruit a été

largement étudiée au cours de ces 30 dernières années (Gillaspy et al., 1993; Srivastava and

Handa, 2005). Les données mettant en évidence leur implication dans ce processus

proviennent d‟observations réalisées suite à leur application sur l‟ovaire et le fruit, et plus

récemment d‟études biochimiques, génétiques et moléculaires (Ozga and Reinecke, 2003). Le

bilan de ces travaux met clairement en évidence que de nombreuses phytohormones, les

auxines, les gibbérellines, les cytokinines, l‟acide abscissique (ABA), les brassinostéroïdes

ainsi que d‟autres facteurs régulateurs tels que les polyamines jouent un rôle dans les étapes

successives du développement du fruit. L‟éthylène, dont le rôle dans les processus de

mûrissement du fruit a largement été étudié (Giovannoni, 2004, 2007) semble également jouer

un rôle lors des étapes précoces du développement du fruit en induisant l‟expression de

plusieurs familles de gènes (Balbi and Lomax, 2003).

III.C.1 La mise à fruit et la phase de division cellulaire

Plusieurs études ont mis en évidence un arrêt des mécanismes de développement dans

les jours qui précédent l‟anthèse (Baldet et al., 2006; Brukhin et al., 2003). La fécondation

des ovules marque la reprise des divisions cellulaires et l‟initiation des mécanismes assurant

le développement de l‟ovaire en fruit. L‟enchaînement de ces étapes semblerait gouverné par

des signaux de croissance impliquant l‟auxine, l‟acide gibbérellique et les cytokinines. Ces

hormones sont présentes au niveau des graines en développement (Gillaspy et al., 1993) et il a

été observé que le nombre d‟ovules fécondés conditionne la croissance du fruit. L‟élongation

du tube pollinique, indispensable à la fécondation des ovules, nécessite la synthèse d‟acide

gibbérellique par les grains de pollen (Singh et al., 2002). L‟application d‟acide gibbérellique

au niveau de l‟ovaire, comme la fécondation, entraîne l‟augmentation de la teneur en auxine

Introduction 22

dans le carpelle (Sastry and Muir, 1963), et l‟utilisation d‟inhibiteurs de la synthèse de

gibbérellines comme le paclobutrazol entraîne une diminution l‟initiation du développement

et de la croissance du fruit (Serrani et al., 2007). Parallèlement, il a été observé que

l‟application d‟acide gibbérellique (Vriezen et al., 2008), d‟auxine (Nitsch, 1970), de

cytokinine (Ozga et al., 2004) ou directement d‟extraits de pollen (Gustafson, 1937) au niveau

du carpelle déclenche le développement du fruit sans que la fécondation des ovules soit

nécessaire. On obtient alors des fruits parthénocarpiques, dépourvus de graines viables. Il a

été proposé que ce développement de fruit parthénocarpique soit dû à une modification de la

balance hormonale dans les fruits, qui se substituerait à la pollinisation/fécondation pour

induire le développement des tissus carpellaires en fruit (Schwabe and Mills, 1981; (Gorguet

et al., 2005). Les recherches ont principalement porté sur l‟implication de l‟auxine et de

l‟acide gibbérellique dans ce processus.

La caractérisation de mutants parthénocarpiques naturels (pat-2 et pat-3 / pat-4) ainsi

que de transformants affectés dans l‟expression de gènes impliqués dans la signalisation

gibbérellique (Martí et al., 2007; Serrani et al., 2007; de Jong et al., 2009), la biosynthèse ou

la signalisation auxinique (Ficcadenti et al., 1999; Carmi et al., 2003; Rotino et al., 2005;

Wang et al., 2005; Pandolfini et al., 2007; de Jong et al., 2009) a permis d‟approfondir le rôle

de ces hormones dans la mise à fruit. Plus récemment, les découvertes fondamentales faites

chez Arabidopsis thaliana (Chapman and Estelle, 2009; Kieffer et al., 2009) ont permis de

tracer les grandes lignes de la régulation par l‟auxine de la mise à fruit chez la tomate, en

impliquant un complexe Aux/IAA – ARF au centre de cette régulation (pour revue, (de Jong

et al., 2009). L‟étude des lignées parthénocarpiques sous exprimant les gènes AUX/IAA9 et

ARF8 a souligné leur rôle dans la répression de la reprise du développement du fruit jusqu‟à

ce que la fécondation ait lieu (Goetz et al., 2007; Wang et al., 2005). D‟autres travaux

suggèrent également l‟importance d‟un transporteur d‟efflux d‟auxine dans cette régulation

(Lemaire-Chamley et al., 2005).

Cependant, les interconnections entre les voies de signalisation par l‟acide

gibbérellique et par l‟auxine ne sont pas encore élucidées (Serrani et al., 2008; de Jong et al.,

2009; Serrani et al., 2010). L‟acide gibbérellique semble bien lié à l‟homéostasie et à la

transmission du signal auxinique, cependant les traitements appliqués sur l‟ovaire

n‟influencent pas les gènes de réponse à l‟auxine. De plus, les fruits parthénocarpiques induits

par l‟acide gibbérellique diffèrent de ceux induits par l‟auxine: l‟activité de division cellulaire

semble moins importante mais l‟expansion des cellules est supérieure (Vriezen et al., 2008).

Introduction 23

Quand à l‟implication des cytokinines dans le développement précoce du fruit, si elle

semble logique de par l‟action stimulatrice de ces hormones sur les divisions cellulaires, elle

n‟est cependant pas établie avec certitude. Leur effet inducteur sur la parthénocarpie, ainsi

qu‟une concordance entre l‟augmentation des teneurs en cytokinines et la reprise des divisions

cellulaires de l‟ovaire, justifie néanmoins cette hypothèse (Gillaspy et al., 1993; Ozga et al.,

2004).

III.C.2 Auxines et gibbérellines influencent l’expansion des cellules

Les phytohormones joueraient également un rôle important dans l‟expansion

cellulaire. La teneur en auxine atteint un maximum environ 10 JAA, puis un autre vers 30

JAA, suggérant un rôle de cette hormone à la fois au niveau de l‟initiation de la phase

d‟expansion et au niveau du développement final des embryons (Srivastava and Handa,

2005). L‟auxine initierait la croissance des cellules en activant les mécanismes d‟expansion de

la paroi. Deux schémas d‟action sont envisagés : (i) l‟intervention de plusieurs familles de

protéines comme les expansines, les -glucanases et les xyloglucanes-endotransglycosylases

(Kotake et al., 2000), et (ii) l‟activation d‟une pompe ATP / H+ dont le fonctionnement

acidifierait l‟apoplasme (Théorie de la croissance acide), permettant ainsi la dissociation des

liaisons qui relient les constituants de la paroi (Kutschera and Grebe, 2006; Rayle and

Cleland, 1992). De la même façon, les gibbérellines semblent permettre le maintien de

l‟expansion cellulaire au cours de la phase de grandissement Cette hypothèse est étayée par

des observations tant physiologiques que moléculaires. D‟une part, l‟application d‟acide

gibbérellique entraîne la croissance du fruit par expansion plus que par division (Vriezen et

al., 2008). D‟autre part, une étude a mis en évidence l‟induction du gène codant pour la GA-

20-oxydase-1 au sein de tissus en forte expansion (Lemaire-Chamley et al., 2005).

III.D Autres types de régulation

La régulation du développement du fruit de tomate est donc un ensemble complexe de

facteurs et de signaux interagissant entre eux afin de mener à bien ce processus

développemental. Au-delà des gènes et hormones décrits plus haut, d‟autres paramètres

interviennent également dans la régulation du développement du fruit.

Introduction 24

III.D.1 Régulation épigénétique

L‟étude du contrôle de l‟expression des gènes a été, au cours de ces dernières années,

révolutionnéee par la mise en évidence des régulations épinénétiques. Chez le fruit de tomate,

peu de choses sont connues à ce jour sur les régulations épigénétiques du contrôle du

développement du fruit. Des études récentes ont montré que des variations au niveau de

certaines marques épigénétiques étaient présentes au cours du développement du fruit

(Teyssier et al., 2008). En effet, le niveau de méthylation globale des cytosines dans le

péricarpe augmente au cours du développement du fruit pour diminuer à partir du stade

orange. Des variations dans le profil d‟expression d‟ADN méthyltransférases sont aussi

observées, suggérant des régulations épigénétiques dans le fruit (Teyssier et al., 2008).

Le mécanisme de régulation épigénétique le mieux décrit lors du développement du

fruit de tomate concerne le gène résidant au locus Cnr impliqué dans le murissement du fruit.

Ce gène code pour un facteur de transcription de la famille des SBP-box (SQUAMOSA

promoter binding protein) nommé LeSPL-CNR (Manning et al., 2006) et le phénotype des

mutants Cnr liés au murissement résulte de changements épigénétiques spontanés au niveau

du promoteur SBP-box. En effet, le promoteur de l‟épiallèle du mutant Cnr est méthylé, et il

est connu que l‟hyperméthylation d‟un gène est lié à son silencing (Martienssen and Colot,

2001), ce qui concorde avec la baisse du niveau de transcrit de LeSPL-CNR noté chez les

mutants Cnr.

Avec la disponibilité du génome de la tomate, différents programmes de recherche sur

l‟épi-génome ont été initiées, qui permettront certainement de préciser le rôle de la régulation

épigénétique dans le développement du fruit.

III.D.2 Les petits ARNs (sRNAs)

Les petits ARNs sont des séquences de 20 à 24 nucléotides d‟ARN non codant

générées par une des protéines Dicer-like (DCL)(Bartel, 2004). Par homologie de séquence,

les sRNAs s‟hybrident de façon spécifique à des molécules d‟ARN ou d‟ADN et guident ainsi

jusqu‟à leur cible le complexe de silencing RISC (RNA-induced silencing complex). Il en

résulte le silencing post-transcriptionnel ou transcriptionnel des cibles ainsi impliquées

(Reinhart et al., 2002; Brodersen et al., 2008). Il existe deux principaux types de sRNAs : les

micro-ARN (miRNAs) et les petits ARNs interférents (siRNA).

Introduction 25

Chez la tomate, deux études majeures se sont attachées à séquencer ces sRNAs. Ainsi,

(Pilcher et al., 2007) ont séquencés plus de 4000 sRNAs isolés à partir de péricarpe de fruits

au stade Vert Mature. La seconde étude (Itaya et al., 2008) a permis le séquençage de 1210

sRNAs issus de quatre tissus différents : les feuilles matures, les bourgeons floraux, les jeunes

fruits et les fruits matures. Les données générées par ces deux études ont été regroupées au

sein d‟une même base de données disponible publiquement (http://ted.bti.cornell.edu/cgi-

bin/TFGD/sRNA/home.cgi). Cette base de données a depuis été incrémentée par les données

de séquençage à haut débit de nouvelle génération réalisés par (Moxon et al., 2008) à partir de

jeunes feuilles et de jeunes fruits verts.

Quelques miRNAs ont été démontré comme impliqués dans la mise en place de

l‟identité florale et dans le développement des feuilles (mir160, mir164 et mir 172 ; (Itaya et

al., 2008), d‟autres dans la réponse à l‟auxine (mir167) et dans le contrôle du temps de

floraison (mir159). En revanche, peu de sRNAs ont été mis en évidence dans la régulation de

gènes impliqués dans le développement précoce du fruit, malgré la corrélation négative

démontrée entre leur profil d‟expression et celui des ARN messager dont il cible

potentiellement la dégradation, suggérant ainsi malgré tout une implication des sRNAs dans

ces processus développementaux (pour revue Dalmay, 2010).

III.D.3 Régulation métabolique

Le développement du fruit et son métabolisme sont clairement interconnectés (pour

revue (Carrari and Fernie, 2006). Le fruit subit des transitions importantes au niveau

métabolique qui coïncident avec les différentes phases de son développement (Lemaire-

Chamley et al., 2005; Carrari et al., 2007). Des approches de génétiques inverses ont montré

qu‟une altération dans la composition en métabolites du fruit pouvait affecter son

développement et inversement. Par exemple, une augmentation du contenu en sucres des

fruits par la dérégulation de gènes codant pour des invertases ou des ATPases vacuolaires

affecte la croissance du fruit et sa taille finale (Klann et al., 1996; Amemiya et al., 2006).

Une étude réalisée en 2009 par (Mounet et al., 2009) à partir de données

transcriptomiques et métobolomique a permis par, une analyse de réseau de corrélation, de

mettre en évidence des nœuds importants dans ce réseau correspondants à des gènes candidats

impliqués dans des processus clés du développement du fruit et de son métabolisme.

http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/sRNA/home.cgi

http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/sRNA/home.cgi

Introduction 26

IV Présentation du travail de thèse

Le programme de recherche de l'UMR 619 Biologie du Fruit porte sur la biologie du

développement des fruits charnus avec pour modèle d‟étude la tomate (Solanum

lycopersicum). Les différents projets développés ont pour objectif de mieux connaître les

facteurs biologiques qui, au cours des phases précoces du développement, conduisent à la

formation de fruits de qualité. Il s'agit non seulement d'acquérir des connaissances sur des

processus biologiques fondamentaux mais aussi d'avancer vers des objectifs concrets qui

permettent aux professionnels d'améliorer leur maîtrise de la production de fruits sur les plans

quantitatif et qualitatif.

Dans ce cadre, l'équipe «Génomique fonctionnelle du développement du fruit», dans

laquelle ce travail de thèse a été effectué, s'intéresse plus particulièrement aux processus de

régulation de la phase d‟expansion cellulaire du fruit et à leurs impacts sur la taille et la

composition/qualité du fruit. En effet, l‟expansion cellulaire peut contribuer jusqu‟à 90 % de

l‟augmentation du poids du fruit. De plus, le grandissement des cellules du fruit est

accompagné du stockage de solutés (amidon, sucres solubles, acides organiques, métabolites

secondaires) et de modifications de la texture du fruit qui vont influencer la qualité sensorielle

et nutritionnelle du fruit à maturité. Par ailleurs, il a été montré que la taille du fruit et sa

qualité sont souvent des caractères opposés, ce qui pose une limite aux stratégies

d‟amélioration des variétés visant à introduire des caractéristiques gustatives meilleures dans

une tomate de calibre moyen. L‟identification de gènes clé dans le contrôle de la taille et de la

composition des cellules pourra aider à l‟amélioration des variétés de tomate, en rompant

l‟antagonisme taille/qualité du fruit. Par ailleurs, l‟expansion cellulaire est, au même titre que

le mûrissement du fruit, un processus spécifique des fruits charnus. Malgré cela, il a été peu

étudié, la majorité des travaux ayant été consacrés soit au développement très précoce

(carpelle/ovaire quelques jours avant et après la fécondation) ou au développement très tardif

(mûrissement) du fruit. L‟étude des processus ayant lieu pendant la phase d‟expansion

cellulaire va permettre de mettre en évidence les mécanismes et les régulations impliqués dans

l‟acquisition du caractère charnu du fruit.

Afin d‟identifier des gènes impliqués dans ces processus, une approche sans à priori, à

l‟aide de puces à ADNc dédiées (Lemaire-Chamley et al., 2005) avait été menée dans

l‟équipe, visant à caractériser les profils d‟expression dans les fruits de tomate pendant le

développement précoce et dans deux tissus de fruits contrastés : l‟exocarpe (cellules en

Introduction 27

division) et le tissu loculaire (cellules en expansion). Les résultats obtenus ont montré que le

programme génétique mis en place lors du développement précoce du fruit résulte de

l‟expression coordonnée de gènes également exprimés dans d‟autres parties de la plante et

que les différents tissus du fruit montrent des programmes d‟expression spécifiques. Par

ailleurs, ce travail a également mis en évidence des gènes candidats potentiellement impliqués

dans la différenciation des tissus du fruit et sa croissance, parmi lesquels plusieurs gènes étant

reliés à la signalisation hormonale (Lemaire-Chamley et al., 2005). Par la suite, une approche

intégrative de la phase d‟expansion cellulaire du fruit de tomate a été réalisée, combinant des

études de cytologie, du métabolome et du transcriptome. L‟analyse des données générées a

permis de mettre en évidence des corrélations entre taille des cellules, quantité de métabolites

et niveau de transcrits dans le mésocarpe et le tissu loculaire (Mounet et al., 2009).

Ainsi, l‟ensemble de ces analyses transcriptomiques sans à priori à permis de mettre en

évidence différents gènes candidats, potentiellement impliqués dans la régulation du

développement du fruit, comme des gènes impliqués dans la signalisation hormonale. Mon

travail de thèse s‟est inscrit dans la continuité de ces travaux et a porté sur la validation

fonctionnelle de gènes candidats au contrôle du développement du fruit. Ce travail s‟est

organisé selon trois axes dont les résultats sont présentés dans le chapitre 2 de ce manuscrit :

1) la validation de l‟utilisation de quatre promoteurs de tomate et d‟un promoteur

d‟Arabidopsis thaliana dans des constructions permettant la surexpression ou le silencing de

gènes dans le fruit de tomate, à des phases particulières de son développement ou dans des

tissus spécifiques du fruit, 2) l‟analyse fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à F-

Box chez la tomate et 3) l‟analyse fonctionnelle du gène SlGEM1.

Le premier axe développé concerne la caractérisation des promoteurs des gènes de

tomate IMA (INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY), TPRP (TOMATO PROLIN-RICH

PROTEIN), PPC2 (phosphoenolpyruvate carboxylase 2), et PG (POLYGALACTURONASE),

ainsi que du promoteur du gène CRC (CRABS CLAW) d‟Arabidopsis thaliana. Des plantes

transgéniques ont été générées permettant d‟exprimer, sous le contrôle de ces différents

promoteurs, le gène rapporteur GUS seul ou fusionné à la GFP (Green fluorescent protein) et

à un signal d‟adressage au noyau (NLS). Par ailleurs, ces promoteurs ont été utilisés dans des

constructions permettant d‟éteindre le gène codant pour la phytoène désaturase (PDS) par des

micro-ARN artificiels ou des constructions RNAi en « hairpin ». Après sélection des lignées

homozygotes pour les différents transformants, l‟étude de ces plantes a permis de mettre en

évidence la spécificité spatio-temporelle de l‟expression de ces différents promoteurs lors du

développement du fruit. Dans le cas du promoteur LePPC2, la fusion transcriptionnelle avec

Introduction 28

la GFP et le signal NLS a permis de montrer une activité spécifique dans les cellules du

péricarpe des fruits de tomate en phase d‟expansion cellulaire. Cette partie du travail de thèse

a validé l‟utilisation de ces différents promoteurs pour de futures analyses fonctionnelles de

gènes régulateurs du développement du fruit chez la tomate. Ce travail a fait l‟objet d‟une

publication dans le journal Plant Physiology (Fernandez et al., 2009).

Le second axe de cette thèse concerne l‟identification et la validation fonctionnelle de

protéines portant un motif à F-Box en tant que nouveaux gènes candidats potentiellement

impliqués dans la régulation du développement du fruit de tomate. Plusieurs études ont

montré que la signalisation hormonale était un élément central d‟un réseau complexe de

régulations gouvernant ce processus. Parmi ces régulations, la dégradation de protéines par le

protéasome 26S après leur ubiquitinylation par des complexes E3 ubiquitine ligases comme le

complexe SCF (SKP1-Cullin-F-Box) joue un rôle clé dans la signalisation hormonale. La

spécificité de reconnaissance des cibles du complexe SCF est due aux protéines portant un

motif à F-Box qui font partie d‟une grande famille de plus de 700 membres chez les plantes,

parmi lesquelles seul un petit nombre a été caractérisé. Parmi les 95 séquences de protéines à

F-Box disponibles dans les bases de données d‟EST de tomate au début de ce travail, quatre

gènes candidats ont été retenus pour leur expression tissu-spécifique lors du développement

précoce du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) ont été générées pour

chacun de ces gènes candidats, dont la caractérisation phénotypique macroscopique et

moléculaire est encore en cours actuellement. Peu de lignées ont présenté des phénotypes

pouvant être reliés aux modifications d‟expression des gènes analysés. Cependant, les

analyses préliminaires réalisées ont permis de proposer un rôle dans le développement chez la

tomate pour une des protéines à F-Box étudiée.

Le troisième axe de ce travail de thèse a porté sur la caractérisation fonctionnelle d‟un

gène candidat pour lequel une étude précédemment réalisée au laboratoire avait mis en

évidence une corrélation entre son niveau de transcrits et la taille des cellules du fruit. Ce gène

a été nommé arbitrairement SlGEM1 car il est l‟orthologue du gène AtGEM (GLABRA2-

EXPRESSION MODULATOR) identifié chez Arabidopsis thaliana. AtGEM est impliqué dans

le contrôle de la division et de la différenciation des cellules (Caro et al., 2007), processus

biologiques jouant également un rôle important dans le développement du fruit de tomate.

Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) pour le gène SlGEM1 ont été générées, et

des mutants de ce gène ont été identifiés par TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN

Genomes) dans la banque de mutants EMS (Ethyl Methane Sulfonate) de la variété Microtom

de tomate disponible au laboratoire. Les analyses moléculaire, cytologique et phénotypiques

Introduction 29

réalisées sur les transformants n‟ont pas permis à ce jour d‟attribuer un rôle à SlGEM1 dans le

développement de la plante et du fruit de tomate. En revanche, le phénotypage des plantes

mutantes a révélé une potentielle implication de SlGEM1 dans le développement des fleurs et

dans la fertilité des grains de pollen. Des analyses supplémentaires tels que l‟étude des

interactions protéine-protéine, la génération de plantes pluri-silencées ainsi que le

« nettoyage » des mutations identifiées fournira très probablement des pistes intéressantes

quant au rôle de SlGEM1 chez la tomate.

L‟ensemble des résultats obtenus seront discutés et les perspectives à ce travail seront

présentées dans le Chapitre 3.

Chapitre 2 : RESULTATS

Résultats 30

Chapitre 2 : RESULTATS ET DISCUSSION

I. Nouveaux vecteurs pour l’analyse fonctionnelle du développement du fruit

de tomate

Les approches de génomique fonctionnelle basées sur des expériences de

transgénèse ont permis d‟accumuler des connaissances fondamentales sur le

fonctionnement des plantes. Par l‟introduction de nouveaux gènes, ou par la modification

de leur expression, il est relativement aisé d‟étudier la manière dont les plantes se

développent et se défendent contre les pathogènes, les ravageurs ou encore contre les

conditions environnementales défavorables (Peremarti et al., 2010). Au-delà de la

fonction du gène étudié, les promoteurs utilisés pour réaliser les expériences de

transgénèse jouent un rôle déterminant dans l‟apparition de phénotypes en contrôlant

l‟expression tissulaire et/ou temporelle du transgène. Les différents promoteurs utilisés en

biotechnologie peuvent être divisés en trois catégories : (i) les promoteurs constitutifs,

actifs continuellement et dans la majorité des tissus, (ii) les promoteurs inductibles qui

sont régulés par l‟application de signaux physiques ou chimiques extérieurs, et (iii) les

promoteurs dits « spatio-temporels » présentant une activité tissus et/ou stade de

développement spécifique (Potenza et al., 2004).

Les promoteurs constitutifs peuvent être classés en deux groupes distincts en

fonction de leur origine. Un premier groupe est constitué des promoteurs de gènes dits

« de ménage » (housekeeping genes). Ces gènes codent pour des protéines dont la

fonction est requise par toutes les cellules pour leur fonctionnement de base. Ce sont

principalement des gènes impliqués dans le métabolisme primaire ou dans le maintien de

la structure et de l‟intégrité des cellules comme l’actine, la tubuline, ou les ubiquitines

(pour revue Peremarti et al., 2010). Le second groupe est constitué de promoteurs de gène

d‟origine virale. Le plus largement utilisé lors de la conception de vecteurs de

transformation est le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV)(pour

revue Peremarti et al., 2010). Ces types de promoteurs présentent l‟avantage d‟exprimer

le transgène étudié à des niveaux importants et de façon ubiquitaire dans la plante. Tous

ne sont cependant pas utilisables à la fois chez les monocotylédones et les dicotylédones,

et ne permettent pas d‟exprimer spécifiquement un transgène dans un organe ou à un

moment déterminé.

Résultats 31

Les promoteurs inductibles présentent l‟avantage de n‟être actifs que lors de

changements perçus dans l‟environnement. Cette classe de promoteurs peut être divisée

en trois groupes : (i) les promoteurs répondant à des signaux endogènes tels que les

hormones, (ii) ceux répondant à des stimuli physiques externes comme les stress

biotiques et abiotiques, et (iii) les promoteurs de gène répondant aux signaux chimiques

extérieurs (pour revue Potenza et al., 2004; Peremarti et al., 2010). Les promoteurs

inductibles sont très largement utilisés par les industriels de l‟agro-alimentaire dans les

variétés génétiquement modifiées commercialisées, mais également pour des recherches

plus fondamentales car ils permettent aux manipulateurs de contrôler l‟induction de

l‟expression du transgène étudié.

La dernière catégorie de promoteurs utilisés pour la construction de vecteurs de

transformation sont les promoteurs de gènes présentant une expression spatio-temporelle

spécifique. L‟utilisation de tels promoteurs permet de limiter l‟expression du transgène à

des stades et de tissus bien ciblés évitant ainsi (i) de perturber le développement général

de la plante ou (ii) une quelconque intervention du manipulateur puisque le transgène sera

exprimé sous le contrôle du programme génétique de la plante (pour revue Potenza et al.,

2004; Peremarti et al., 2010).

La première partie de ce travail de thèse concerne la caractérisation de promoteurs

identifiés comme étant spécifiques du fruit et leur possible utilisation pour des études de

génomique fonctionnelle portant sur le développement du fruit de tomate. Les résultats

sont présentés dans l‟article suivant.

Résultats 32

Résumé de l’article :

En tant que plate-forme de génétique, la tomate (Solanum lycopersicum) bénéficie

d‟importantes collections de ressources génétiques et présente des facilités de culture et

de transformation permettant l'analyse de processus biologiques impossible à étudier dans

d‟autres espèces modèles. Afin de faciliter la mise en place d‟outils de génétique

disponibles pour l'étude des Solanacées, nous avons initié une collection d‟outils pour la

manipulation de gènes. Nous nous sommes concentrés sur la caractérisation de

promoteurs exprimés lors de fenêtres de temps très précises au cours du développement

du fruit, pouvant être utilisés pour réguler l'expression ou réprimer des gènes d'intérêts.

Cinq séquences promotrices ont été utilisées en tant que clones d‟entrée compatibles avec

le format MultiSite Gateway : PPC2, PG, TPRP, et IMA issus de tomate, et CRC

d‟Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Les fusions transcriptionnelles correspondantes ont

été réalisées avec le gène GUS, avec une fusion GUS-GFP adressée au noyau des

cellules, et avec le facteur de transcription chimérique LhG4. L'activité des promoteurs au

cours du développement du fruit et des tissus du fruit a été confirmée dans des lignées de

tomates transgéniques. De nouveaux vecteurs de destination Gateway ont été générés

pour la transcription de précurseurs de microARN artificiels (amiRNA) et d‟ARN en

hairpin sous le contrôle de ces promoteurs, ne nécessitant que des réactions de BP et LR

clonase de la technologie Gateway. L‟efficacité du silencing du gène de la phytoène

désaturase endogène a été démontrée dans des lignées de tomates transgéniques

produisant un amiRNA correspondant sous la dépendance du promoteur 35S du virus de

la mosaïque du chou fleur ou du promoteur PPC2. Enfin, profitant du système pOP/LhG4

à deux composants, nous avons constaté que des promoteurs spécifiques de la fleur

d‟Arabidopsis pouvaient diriger l‟expression de gènes reporteurs dans un système

d‟expression hétérologue. Les lignées de tomates et les plasmides seront distribués par le

biais d'une nouvelle unité du Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) dédiée aux

ressources sur les Solanacées.

Breakthrough Technologies

Flexible Tools for Gene Expression and Silencingin Tomato1[W][OA]

Ana I. Fernandez2, Nicolas Viron2, Moftah Alhagdow, Mansour Karimi, Matthew Jones, Ziva Amsellem,Adrien Sicard, Anna Czerednik, Gerco Angenent, Donald Grierson, Sean May, Graham Seymour,Yuval Eshed, Martine Lemaire-Chamley, Christophe Rothan3, and Pierre Hilson3*

Department of Plant Systems Biology, Flanders Institute for Biotechnology, 9052 Ghent, Belgium (A.I.F.,M.K., P.H.); Department of Plant Biotechnology and Genetics, Ghent University, 9052 Ghent, Belgium (A.I.F.,M.K., P.H.); Institut National de la Recherche Agronomique, Unite Mixte de Recherche 619, CentreBordeaux-Aquitaine, 33883 Villenave d’Ornon, France (N.V., M.A., A.S., M.L.-C., C.R.); Plant and CropScience Division, University of Nottingham, Loughborough, LE12 5RD, United Kingdom (M.J., D.G., S.M., G.S.);Department of Plant Sciences, Weizmann Institute of Science, 76100 Rehovot, Israel (Z.A., Y.E.); RadboudUniversiteit Nijmegen, 6525 HP Nijmegen, The Netherlands (A.C.); and Plant Research International,6700 Wageningen, The Netherlands (G.A.)

As a genetic platform, tomato (Solanum lycopersicum) benefits from rich germplasm collections and ease of cultivation andtransformation that enable the analysis of biological processes impossible to investigate in other model species. To facilitate theassembly of an open genetic toolbox designed to study Solanaceae, we initiated a joint collection of publicly available genemanipulation tools. We focused on the characterization of promoters expressed at defined time windows during fruitdevelopment, for the regulated expression or silencing of genes of interest. Five promoter sequences were captured as entryclones compatible with the versatile MultiSite Gateway format: PPC2, PG, TPRP, and IMA from tomato and CRC fromArabidopsis (Arabidopsis thaliana). Corresponding transcriptional fusions were made with the GUS gene, a nuclear-localizedGUS-GFP reporter, and the chimeric LhG4 transcription factor. The activity of the promoters during fruit development and infruit tissues was confirmed in transgenic tomato lines. Novel Gateway destination vectors were generated for the transcriptionof artificial microRNA (amiRNA) precursors and hairpin RNAs under the control of these promoters, with schemes onlyinvolving Gateway BP and LR Clonase reactions. Efficient silencing of the endogenous phytoene desaturase gene wasdemonstrated in transgenic tomato lines producing a matching amiRNA under the cauliflower mosaic virus 35S or PPC2promoter. Lastly, taking advantage of the pOP/LhG4 two-component system, we found that well-characterized flower-specificArabidopsis promoters drive the expression of reporters in patterns generally compatible with heterologous expression.Tomato lines and plasmids will be distributed through a new Nottingham Arabidopsis Stock Centre service unit dedicated toSolanaceae resources.

Solanaceae provide the world’s most importantvegetable crops, including tomato (Solanum lycopersi-cum), potato (Solanum tuberosum), and pepper (Capsi-cum annuum), and are a model eukaryote family forevolutionary, genetic, and genomic studies. More than3,000 Solanaceous species grow in habitats rangingfrom rain forests to deserts and mountains with reg-ular snowfall. Thanks to conserved genome organiza-

tion, this family is an excellent subject to explore thegenetic and molecular basis of adaptation to diverseenvironments. Within the Solanaceae, tomato is abroadly used model system for studying plant-microbe interactions and the biology of fleshy fruits,owing to its simple diploid genetics, the short gener-ation time, the routine protocols for production oftransgenic plants, and its exceptional publicly avail-able genetic and genomic resources. These resourcesinclude large collections of single-gene mutations, anextensive EST database, a high-density genetic map,microarrays, an emerging genome sequence, and well-characterized populations designed for genetic map-ping of simple and quantitative trait loci, and they areused by an active Solanaceae research communityinvolving research laboratories in more than 30 coun-tries focusing on both basic and strategic research(Knapp, 2002; Mueller et al., 2005; Wu et al., 2006).

The first draft sequence of the entire euchromaticportion of the tomato genome will soon be available(Mueller et al., 2009). As already witnessed for otherresearch communities dedicated to key species, the

1 This work is supported by the European Solanaceae Integratedproject, EU-SOL, through the 6th Framework Programme of theEuropean Commission (FOOD–CT–2006–016214).

2 These authors contributed equally to the article.3 These authors contributed equally to the article.* Corresponding author; e-mail [email protected] author responsible for distribution of materials integral to the

findings presented in this article in accordance with the policydescribed in the Instructions for Authors (www.plantphysiol.org) is:Pierre Hilson ([email protected]).

[W] The online version of this article contains Web-only data.[OA] Open Access articles can be viewed online without a sub-

scription.www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.109.147546

Plant Physiology�, December 2009, Vol. 151, pp. 1729–1740, www.plantphysiol.org � 2009 American Society of Plant Biologists 1729

availability of a well-annotated genome will mark theonset of new lines of investigations and will greatlyfacilitate the characterization of genetic functions.Taking advantage of the EU-SOL European integratedproject (http://www.eu-sol.net/), we initiated a col-laborative effort for the construction of publicly avail-able tools enabling gene manipulation at specificstages of tomato fruit development and in well-defined tissues and cell types. Tomato is a berry witha thick pericarp that encloses many seeds. The fruitresults from the fusion of a number of carpels, theovary wall becoming the fleshy pericarp. Pollinationtriggers cell proliferation, followed by extensive cellexpansion, resulting in a mature fruit that ranges from1 to 1,000 g (Gillaspy et al., 1993; Lemaire-Chamleyet al., 2005; Gonzalez et al., 2007). Fruit developmentand ripening are also characterized by dramatic met-abolic shifts, including the conversion of starch tosugars, chloroplasts to chromoplasts, and extensivecell wall disassembly, all under tight genetic control(Giovannoni, 2004). Changes in the spatial or temporalexpression of regulatory genes or downstream effectorscontrolling these processes will substantially affect fruittissue properties and the ripening process (Manninget al., 2006; Giovannoni, 2007). Indeed, the ability toalter subtly the timing and location of expression of keyregulators is an important goal for crop biotechnologybut is often constrained by lack of suitable promoters.

To this end, a core set of versatile resources designedfor temporal and tissue-specific manipulation of geneexpression in the tomato fruit has been created byindependent laboratories. All clones and vectors wereconstructed with the flexible Gateway recombina-tional cloning technology (for review, see Karimiet al., 2007a). Promoters that displayed tissue-specifictranscriptional activity have been captured as Gate-

way entry clones. These regulatory sequences can becombined at will with any gene, hairpin RNA(hpRNA), expression cassette, or artificial microRNA(amiRNA) via MultiSite Gateway protocols for thecreation of novel binary T-DNAvectors. Expression ofreporter genes in specific cell types illustrated thefunctionality of such vectors. Silencing of the endog-enous gene coding for phytoene desaturase withamiRNA in stable transgenic tomato plants demon-strated that such vectors can be used to efficientlycontrol transcript abundance in fruit tissues. In addi-tion, tomato driver lines were generated for the tran-scriptional activation of any responder transgenelocus, based on the LhG4 two-component system.Expression of several reporters and phenotypes in-duced within these lines facilitated their communaluse for genetic manipulations. The assembly of aSolanaceae genetic toolbox is an important asset forfuture functional analysis in tomato and related crops.

RESULTS AND DISCUSSION

Cloning Strategy and Structure of the Vector Collection

The Gateway MultiSite recombinational cloningframework is ideally suited for constructing versatilecollections of genetic elements to be assembled inpredetermined order, orientation, and open readingframe (ORF) registry (Karimi et al., 2005, 2007a, 2007b).The overall strategy underlying our vector resources isillustrated in Figure 1. Three types of elements havebeen considered so far: plant promoters, to direct thetranscription of any gene of interest in well-definedtomato tissues; ORFs, to produce the encoded proteins;and gene-specific sequence tags (GSTs) or amiRNAprecursors, to silence targeted genes.

Figure 1. Assemblage of differentgenetic elements captured into en-try clones via LR reaction to facil-itate genetic studies in tomato. B1,B2, B4, L1, L2, L4, and R1: corre-sponding att Gateway recombina-tion sites. Sp, spectinomycin; Sm,streptomycin; Km and Kan, kana-mycin bacterial and plant select-able markers, respectively; LB, leftT-DNA border; RB, right T-DNAborder; Prom, promoter; pdk-catintron, pHELLSGATE12-derived in-tron spacer; ccdB, counter-select-able bacterial marker; and 3#OCS,octopine synthase terminator.

Fernandez et al.

1730 Plant Physiol. Vol. 151, 2009

Each element was first captured in an entry clone,either via restriction/ligation cloning in a plasmidcarrying multiple restriction sites flanked by attL andattR recombination sites or via PCR amplification andaddition of flanking attB sites, followed by a BPClonase reaction. We chose to clone all promoters inattL4-promoter-attR1 cassettes and all other elementsin attL1-sequence-attL2 cassettes. The resulting entryclones can be recombined with various Gateway des-tination vectors in LR Clonase reactions to createexpression vectors. Interestingly, two or more ele-ments available as entry clones can be assembled viaa single MultiSite LR Clonase reaction in the order andorientation defined by the position of the attL and attRsites flanking the recombined sequences (Cheo et al.,2004; Karimi et al., 2007b). In our configuration, anypromoter can be positioned easily upstream of an ORF,a GST, or an amiRNA precursor and drive its tissue-specific transcription in transgenic plants. Lastly,novel modular destination vectors can be constructedfrom any expression clone via reverse BP Clonasereactions, further expanding the possible cloningschemes (Karimi et al., 2007b).

Fruit-Specific Promoters

Flowers and fruits are the main targets for geneticimprovement of fruit crops. However, these organs arethe last to form, and their manipulation with broadlyexpressed promoters is therefore restricted to non-pleiotropic genetic perturbations. Promoters activesolely in these organs bypass this limitation and per-mit the functional analysis of all genes involved infruit development. Such sequences facilitate the engi-neering of fruit quality, either directly or by providingproof-of-concept information from which strategiescan be developed to harness natural variation.As an initial set of regulatory sequences of interest,

we chose four promoters from tomato genes shownpreviously to be transcribed specifically at differentstages of fruit growth and maturation. In addition, weincluded a well-characterized Arabidopsis (Arabidop-sis thaliana) promoter of which the activity is restrictedto specific carpel and nectary tissues during flowerdevelopment (Table I). The five promoter sequencesare documented in Supplemental Table S1. The antic-ipated temporal and spatial transcriptional activity in

the fruit for each cloned promoter is summarizedbelow. The size of each captured sequence is alsoindicated in parentheses. They all end in a window of1 to 34 nucleotides upstream of their cognate ORF.

INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY (0.5 kb)

INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY (IMA; acces-sion number AM261628) encodes a 90-amino-acidtomato protein that harbors a putative central zincfinger domain similar to the recently characterizedMINI ZINC FINGER proteins (Hu and Ma, 2006;Sicard et al., 2008). While absent from vegetativeorgans, IMA expression is detected in all floral organsand to a greater extent in carpels and petals. However,the highest expression was observed in the developingfruit. IMA transcripts are detected as early as thepreanthesis stage corresponding to isolated carpels,accumulate gradually and strongly in fruit to reach amaximum at 10 d after anthesis (daa), and then de-crease to reach basal levels at the mature green stage.IMA acts as an inhibitor of cell proliferation duringflower termination (Sicard et al., 2008). Its promotersequence was identified via the Solanaceae GenomeNetwork (SGN) database in a BAC clone encompass-ing the IMA gene sequence (accession numberAC122544).

CRABS CLAW (3.7 kb)

The Arabidopsis CRABS CLAW (CRC) gene belongsto the YABBY transcription factor family (Bowman andSmyth, 1999). It is required for nectary development inArabidopsis flowers and for abaxial-adaxial polarityspecification of carpels. The CRC promoter is activethroughout carpel primordium initiation but becomesrestricted to the valve abaxial domain upon anthesis.In addition, it is expressed in central placental do-mains and in nectaries throughout their development(Lee et al., 2005). This promoter was chosen because itmarks the earliest stages of carpel initiation, a patternnot presently available from endogenous tomato pro-moters.

TPRP (2.6 kb)

TPRP is a cell wall tomato Pro-rich protein (Saltset al., 1991). TPRP expression levels are high in all

Table I. Genetic elements in entry clones

Class Element(s) Recipient pDONR Entry Clone att Sites

Promoter PPC2 pDONR P4-P1R pEN-L4-PPC2-R1 attL4–attR1Promoter TPRP pDONR P4-P1R pEN-L4-TPRP-R1 attL4–attR1Promoter IMA pDONR P4-P1R pEN-L4-IMA-R1 attL4–attR1Promoter CRC pEN-L4-R1 pEN-L4-CRC-R1 attL4–attR1Promoter PG pEN-L4-R1 pEN-L4-PG-R1 attL4–attR1Reporter enzyme SI pDONR221 pEN-L1-SI-L2 attL1–attL2amiRNA PDS pDONR221 pEN-L1-miRpds-L2 attL1–attL2Two component LhG4AtO pDONR221 pEN-L1-LhG4ATO4-L2 attL1–attL2

Flexible Tools for Gene Expression and Silencing in Tomato

Plant Physiol. Vol. 151, 2009 1731

tissues of young tomato fruits, corresponding withcell division phases II and III of fruit development(Gillaspy et al., 1993). Promoter activity is dramaticallyreduced in mature green and ripe fruits and com-pletely absent in all other parts of the plant (Salts et al.,1991; Carmi et al., 2003). The TPRP promoter has beenused successfully to down-regulate the expression ofthe DE-ETIOLATED1 gene, resulting in an increase ofthe carotenoid and flavonoid content restricted to thefruit (Davuluri et al., 2005).

PPC2 (2.0 kb)

The PPC2 gene codes for a phosphoenolpyruvatecarboxylase isoform present in developing tomatofruits that is presumably involved in organic acidaccumulation and CO2 fixation. LYCes;PPC2 is highlyand specifically expressed during the phase of rapidfruit growth, corresponding to cell expansion. Expres-sion increases initially at the end of cell division anddecreases at the beginning of ripening. In younggrowing fruits, LYCes;PPC2 mRNA has been specifi-cally located by in situ hybridization in the pericarpand the gel surrounding the seeds (Guillet et al., 2002).Accordingly, the 2.0-kb promoter fragment has re-cently been shown to direct fruit-specific GUS expres-sion during the cell expansion phase in the placenta,gel, and later in the pericarp tissues in transgenictomato plants (C. Guillet and C. Rothan, unpublisheddata).

Polygalacturonase (4.8 kb)

Polygalacturonase (PG) is a cell wall hydrolaseabundantly secreted during fruit ripening and con-

tributing to fruit softening. PG expression is tightlyrelated to the ripening process. Transcriptional activa-tion at the onset of ripening results in a high level ofPG mRNA (Biggs and Handa, 1989; DellaPenna et al.,1989). Within the ripening fruit, a 1.4-kb promoterfragment has been shown to direct GUS expressionmostly to the outer region of the pericarp and the col-umella tissue in transgenic tomato plants (Montgomeryet al., 1993). However, a longer (4.8 kb) PG promoter waspreferred because it yields higher levels of chloram-phenicol acetyl transferase reporter activity in ripeningtransgenic tomato fruits (Nicholass et al., 1995) and hasbeen successfully used to engineer metabolite fruitcontent (Davidovich-Rikanati et al., 2007; Kovacs et al.,2007).

The PPC2, TPRP, and IMA promoters were ampli-fied by PCR with sense and antisense primers includ-ing the attB4 and attB1 sequences, respectively. Theamplified fragments were recombined with pDONRP4-R1 to produce the corresponding entry clones. Thelarger PG and CRC promoters were introduced byconventional restriction/ligation cloning into pEN-L4-R1 in which a multicloning site is flanked by the attL4and attR1 sequences.

Expression of the GUS Reporter in Tomato Fruits

In the context of MultiSite Gateway expressionconstructs, the described promoters (pEN-L4-promoter-R1) were fused to theGUS gene (pEN-L1-SI-L2; Karimiet al., 2007b) in the pK7m24GW destination vector viaMultiSite LR Clonase reaction (Karimi et al., 2005;Table II). Initial validation of promoter activity wasachieved with a previously described fruit transientexpression assay (Orzaez et al., 2006). Briefly, the

Table II. Expression vectors

Destination and Modular

VectorRecombined Entry Clones

Resulting Expression

Vector

pK7m24GW pEN-L4-PPC2-R1 3 pEN-L1-SI-L2 pXK7SIPPC2pK7m24GW pEN-L4-PG-R1 3 pEN-L1-SI-L2 pXK7SIPGpK7m24GW pEN-L4-TPRP-R1 3 pEN-L1-SI-L2 pXK7SITPRPpK7m24GW pEN-L4-IMA-R1 3 pEN-L1-SI-L2 pXK7SIIMApK7m24GW pEN-L4-CRC-R1 3 pEN-L1-SI-L2 pXK7SICRCpMK7S*NFm14GW pEN-L4-PPC2-R1 pXK7S*NFPPC2pMK7S*NFm14GW pEN-L4-PG-R1 pXK7S*NFPGpMK7S*NFm14GW pEN-L4-TPRP-R1 pXK7S*NFTPRPpMK7S*NFm14GW pEN-L1-IMA-R1 pXK7S*NFIMApMK7S*NFm14GW pEN-L4-CRC-R1 pXK7S*NFCRCpK7GW2 pEN-L4-miRpds-L2 pXK7miRpds2pK7m24GW pEN-L4-PPC2-R1 3 pEN-L1-miRpds-L2 pXK7miRpdsPPC2pK7m24GW pEN-L4-PG-R1 3 pEN-L1-miRpds-L2 pXK7miRpdsPGpK7m24GW pEN-L4-TPRP-R1 3 pEN-L1-miRpds-L2 pXK7miRpdsTPRPpK7m24GW pEN-L4-IMA-R1 3 pEN-L1-miRpds-L2 pXK7miRpdsIMApK7m24GW pEN-L4-CRC-R1 3 pEN-L1-miRpds-L2 pXK7miRpdsCRCpK7m24GW pEN-L4-PPC2-R1 3 pEN-L1-LhGATO4-L2 pXK7LhGATO4PPC2pK7m24GW pEN-L4-PG-R1 3 pEN-L1-LhGATO4-L2 pXK7LhGATO4PGpK7m24GW pEN-L4-TPRP-R1 3 pEN-L1-LhGATO4-L2 pXK7LhGATO4TPRPpK7m24GW pEN-L4-IMA-R1 3 pEN-L1-LhGATO4-L2 pXK7LhGATO4IMApK7m24GW pEN-L4-CRC-R1 3 pEN-L1-LhGATO4-L2 pXK7LhGATO4CRC

Fernandez et al.


promoter-GUS binary expression vectors were trans-formed intoAgrobacterium tumefaciens and injected intofruits of different developmental stages, from 20 daa tobreaker + 11 d (Br+11). Several days after injection,fruits were sampled and thin sections were analyzedfor GUS activity via classical histochemical assays(Supplemental Fig. S1 and Supplemental Materialsand Methods S1). GUS staining consistent with previ-ously published expression results were obtained forlate stage promoters, such as in PGpro:GUS-injectedripening fruits, but the assessment of the promoteractivity in the transient assay was restricted to morethan 20-daa fruits and concurrent with wounding andstress. These technical constraints probably explainwhy temporal and spatial expression might be partlyartifactual in agroinjected fruits. For example, theearly-stage IMA promoter was active in ripeningfruits, and higher level of GUS staining was observedin placenta and gel, presumably because of a betterpenetration of Agrobacterium in these tissues. Never-theless, transient expression data provided the initialevidence that the Gateway cloning framework wascompatible with gene expression in tomato, a prereq-

uisite for in-depth analysis of promoter activity instable transgenic plants.

To this end, the MicroTom cultivar was agroinfectedwith an improved protocol yielding transformationfrequency consistently .80% (see “Materials andMethods”). The ploidy of regenerated plantlets wasmeasured with flow cytometry, and polyploid plantswere discarded. Between 12 and 25 independentlytransformed plants were generated for each promoter-GUS transgene (Table II). Following GUS staining andselection of plants with one or two transgene copies,two representative lines were selected for each con-struct, and the GUS staining pattern of 10 kanamycin-resistant T1 plants per original line was characterizedat specific stages of development: flower, 6-mm buds(approximately stage 9 according to Baldet et al., 2006),and anthesis; fruit, 6 daa (cell division), 10 daa, 15 daa(cell expansion stage; Lemaire-Chamley et al., 2005),mature green (MG; transition to ripening), and Br+7(ripe fruit). GUS staining of T1 leaves and entire youngT2 plantlets completed the analysis.

As expected, strong GUS activity was observed in all35Spro-GUS tissues, while no staining was detected in

Figure 2. GUS activity in tomato (cv MicroTom) stably transformed with promoter:GUS transgenes generated via MultiSiteGateway cloning. Bars = 10 mm.



wild-type controls (Fig. 2). The five selected fruitpromoters only resulted in fruit-specific expression,with no GUS staining in vegetative organs (Fig. 2).Flower buds showed weak GUS staining only in theIMApro:GUS, TPRPpro:GUS, and PPC2pro:GUS lines.

In agreement with earlier reports (Sicard et al.,2008), IMApro:GUS fruits displayed weak but consis-tent GUS staining at early stages of development,particularly in placental and vascular tissues. Addi-tional staining of seed tegument was observed in ripefruit (Fig. 2). In CRCpro:GUS fruits, GUS staining wasrestricted to the outer carpel wall from early stagesuntil MG (Fig. 2). This result is reminiscent of the CRCnative expression that is largely restricted to the ab-axial epidermis in the Arabidopsis carpel (from thebase to the tip of the carpel, along its entire circum-ference), where it promotes abaxial cell fate (Eshedet al., 1999). In TPRPpro:GUS fruits, GUS stainingpeaked at the immature green stage (Fig. 2), consistentwith earlier reports (Gillaspy et al., 1993). In PPC2pro:GUS fruits, strong GUS staining was limited to thefruit expansion phase (Fig. 2), in agreement withprevious data (Guillet et al., 2002; C. Guillet and C.Rothan, unpublished data). In PGpro:GUS fruits, GUSactivity was not detected in early stages, was weakat the onset of ripening (MG), and high in the ripefruit (Br+7; Fig. 2), again as published previously(Montgomery et al., 1993).

In summary, the temporal regulation of the fivepromoters observed in stable transgenic tomato fruitswas in agreement with the data reported in wild-typeor stable transgenic plants. In addition to markingselected stages of fruit development, several testedpromoters also offer the possibility to direct transgeneexpression to specific fruit tissues. For example, theCRC promoter can specifically target genes expressedin the epidermis of developing tomato fruit and in-volved in cuticle or phenylpropanoid synthesis(Mintz-Oron et al., 2008).

GFP Markers Specific to Fruit Cell Types

Promoter-GUS transgenes were useful to reporttissue-specific transcription. Yet higher spatial resolu-tion can be achieved via the transcriptionally regu-lated expression of a nuclear localization signal (NLS)fused to fluorescent proteins. Such markers enable theselection of particular cell types, as well as the trackingof cell proliferation and enlargement in the course offruit development. Therefore, we generated a promoter:NLS-GFP-GUS construct for each of the five selectedpromoters via LR recombination into the modulardestination vector pK7S*NFm14GW (Karimi et al.,2007b; Table II). Stable tomato (cv MicroTom) reporterlines carrying one of each promoter:NLS-GFP-GUStransgene (Table II) were generated, screened, andanalyzed as described above. In addition, GFP pro-duction was verified in fresh 150-mM-thick pericarpsections with epifluorescence microscopy. Promoter:

GUS and promoter:NLS-GFP-GUS lines displayed sim-ilar GUS staining patterns (data not shown).

The NLS fused to GFP proved very effective becausethe fluorescence signal was detected in the nucleus ofall cell types in the pericarp and gel of 35Spro:NLS-GFP-GUS fruits (Fig. 3, A and B). In the pericarp ofPPC2pro:NLS-GFP-GUS fruits, GFP was absent fromthe fruit epidermis and from most underlying divid-ing cells and was essentially limited to the largeexpanding mesocarpic cells (Fig. 3, C and D). Thisobservation is consistent with the hypothesis thatmalate synthesized via PECase serves as a counterionfor potassium that accumulates in the vacuole, thusproviding the driving force for fruit cell enlargement(Guillet et al., 2002).

Figure 3. Detection of nuclear GFP in cells of tomato fruit pericarp.Sections were prepared from 8-daa fruits. A and B, 35Spro:NLS:GUS-GFP tissues showing GFP signal in all fruit tissues. B, Magnified imageshowing localization of GFP in the nucleus. C and D, Fruit pericarpcross section from 8-daa tomato fruits transformed with PPC2pro:NLS:GUS-GFP showing preferential GFP localization in expanding cellsfrom fruit mesocarp. D, Magnified image of mesocarp showing local-ization of GFP in polyploid nucleus from large cell. Bars = 400 mm in Aand C and 100 mm in B and D.

Fernandez et al.


To conclude, in addition to the information pro-vided by promoter-GUS transgenic lines about expres-sion targeted at specific developmental stages and inparticular tissues, promoter:NLS-GFP-GUS lines can beused to define the spatial distribution of a transgenedriven by a selected promoter in tomato fruits withhigher cellular resolution.

Vectors for Silencing Genes in Fruits

RNA-mediated gene silencing, or RNA interference,is a method of choice to generate loss-of-functionphenotypes caused by partial to complete gene knock-down. amiRNAs have been shown to efficiently si-lence genes inmultiple plant species, including tomato(Alvarez et al., 2006; Schwab et al., 2006; for review, seeOssowski et al., 2008). This approach entails the ex-pression of an endogenous plant microRNA precursorengineered to yield a 21-nucleotide double-strandedamiRNA that is chosen to silence a gene, or severalgenes, of interest according to experimentally definedtarget selection parameters. The DNA sequence cod-ing for an amiRNA can easily be synthesized byoverlapping PCR amplification (Schwab et al., 2006)with the addition of the attB1 and attB2 recombinationsites at their 5# and 3# ends, respectively, and subse-quently captured as an amiRNA entry clone (attL1-amiRNA-attL2). Once in this format, any amiRNAprecursor can be cloned downstream of any promoterof interest, including those described above, in asimple MultiSite LR Clonase reaction. The additionof attB-flanking sites to an amiRNA precursor (i.e. tothe MIR319a backbone in this particular case) did notalter its ability to silence a target gene in Arabidopsis(Supplemental Fig. S2 and Supplemental Materialsand Methods S1).

To confirm silencing in tomato, we generated Micro-Tom lines in which the PDS gene was silenced via thetranscription of a matching amiR-pds precursor underthe control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35Sor PPC2 promoter (Tables I and II). The PDS enzyme isinvolved in carotenoid biosynthesis and protects chlo-rophyll from photooxidation in developing tissues.PDS silencing causes photobleaching that can be read-ily recorded in the course of development. Bleachingwas observed in all tissues of the 35Spro:amiR-pdstomato plants (Fig. 4, B and C). The most severely af-fected plantlets did not survive in the greenhouse (datanot shown). In contrast, the 18 PPC2pro:amiR-pdsprimary transformants did not display any visualphenotype during vegetative growth. However, one-third of these T0 plants produced fruits that remainedlight orange during ripening and only turned light redwhen left on the plant (Fig. 4, D and E). Our observa-tions are consistent with the PPC2 profile documentedthrough reporter expression and indicating that thepromoter activity is the highest at the early stages offruit development (Fig. 2) and in the mesocarp (Fig.3C), i.e. at developmental stages and in fruit tissuesless sensitive to light than the exocarp where the 35S-driven expression is very high (Fig. 3A) and thephotobleaching more likely to occur. Our results fur-ther illustrate how fruit promoters and constructsdeveloped herein can be used to target specific fruittissues and alter expression of candidate genes intomato.

Because amiRNA target recognition relies on a short21-nucleotide sequence, amiRNAs yield more specificsilencing than the numerous small interfering RNAsderived from the long (hundreds of base pairs) double-stranded hpRNA molecules. However, because manygenes encoded in Solanaceae have yet to be identified,

Figure 4. Tissue-specific amiRNA silenc-ing in tomato fruits. Flowers at anthesis(top), mature leaves (middle), and ripefruits (Breaker +7; bottom). A, The wildtype (cv MicroTom). B and C, 35Spro:amiR-pds plants with strong to extremephotobleaching in all organs. D and E,PPC2pro:amiR-pds plants with moderateand transient photobleaching restricted tothe fruit. Bars = 10 mm.



hpRNA silencing is still valuable: for example, toavoid the degradation of a gene different from thetarget but serendipitously containing sequencesmatch-ing a selected amiRNA or to silence simultaneouslymultiple closely homologous transcripts.

Therefore, we constructed a new series of hpRNAexpression vectors with the aim to restrict gene silenc-ing to specific tissues or organs (Supplemental TableS5). For this purpose, we implemented novel cloningschemes involving only BP and LR Clonase reactionsto position any promoter available as an entry clonein front of a silencing transgene (Supplemental Figs.S3–S5 and Supplemental Materials and Methods S1).The constructs generated were derived from thepHELLSGATE12 vector (Wesley et al., 2001; Helliwelland Waterhouse, 2003; Hilson et al., 2004) in which thesequence targeted for silencing (GST), originallycaptured in an entry clone (attL1-GST-attL2), wastransferred simultaneously in two independent Gate-way cassettes separated by an intron spacer (attR1-ccdB-attR2-intron_spacer-attR2-ccdB-attR1). This spacerconsisted of two head-to-head introns that enabledsplicing of the encoded transcript regardless of itsorientation. In this configuration, the attR1 and attR2recombination sites were inverted with respect to oneanother, so that the two copies of the target sequencewere inserted as inverted repeats into the resultinghpRNA expression clone (Helliwell and Waterhouse,2003).

For both hpRNA and amiRNA silencing, software isavailable that selects the most likely specific targetsites taking into consideration entire genome se-quences: for example, SPADS for the design of GSTscloned into hpRNA expression vectors (Thareau et al.,2003; Sclep et al., 2007) and Web MicroRNA Designerfor the selection of amiRNA sequences introduced intothe microRNA precursor backbone by overlappingPCR (http://wmd3.weigelworld.org/). Nevertheless,some amiRNAs and hpRNAs fail to yield efficientsilencing, and current algorithms cannot accuratelypredict silencing efficiency.

Driver Constructs and Tomato Lines

In tomato, as in most crop plants, transformationprotocols require tissue culture. However, becausemany tissue- and cell-type-specific promoters displayextensive expression in callus, transgenes with dele-terious effects might be selected against during tissueculture. A solution to this problem is to dissociate thetarget gene expression locus from its transcriptionalregulator. For this purpose, we established referencetomato driver lines facilitating both gene misexpres-sion and silencing. These lines were constructed withelements of the pOp/LhG4 system engineered fortranscriptional activation into plant species (Mooreet al., 1998; Rutherford et al., 2005; Wielopolska et al.,2005; Ori et al., 2007). Its main components are theLhG4 chimeric transcription factor, consisting of thebacterial LacI DNA-binding and yeast GAL4 activa-

tion domains, and the synthetic pOp promoters con-taining multiple copies of the lac operator bound byLhG4. The driver locus codes for the LhG4 gene underthe control of a promoter with a particular spatio-temporal pattern. The responder locus contains asynthetic pOp promoter driving the transcription ofa gene, hpRNA, or amiRNA of interest and is onlyactive in the presence of LhG4. Both loci were com-bined in the same plant either by crossing or bytransformation.

Figure 5. Tissue-specific transactivation in tomato with selected Arab-idopsis promoters. A and B, Expression of dsRED or GUS, activated intrans by the organ primordia and abaxial domain pFIL:LhG4 driver.Abaxial expression is evident after leaf primordium has expanded. Cand D, Flower-specific growth arrest stimulated by specific transacti-vation of a pOP:KAN1 reporter, with the pAP1:LhG4 driver. E and F,Petal-only radialization stimulated by specific transactivation of a pOP:KAN1 reporter, with the pAP3:LhG4 driver. G and H, Carpel-specificgrowth arrest stimulated by transactivation of the pOP:KAN1 reporterwith the pCRC:LhG4 driver. WT, Wild type; SlKAN, KANADI1 gene oftomato.

Fernandez et al.


First, we created an array of reporter lines to vali-date the use of the pOp/LhG4 system in tomato,including pOP:GUS, pOP:ER-GFP, pOP:dsRFP, andpOP:KANADI1 (KAN1). The first three reporters wereuseful for the detailed examination of promoter activ-ity. The pOP:KAN1 reporter drove the potent tomatoKANADI1 gene that imposes abaxial identity andsevere growth arrest whenever expressed ectopicallyoutside of its normal domain (Eshed et al., 2001). Thisreporter provided a simple and sensitive test forspatial activity of any examined driver line becauseeven low level of expression, possibly escaping detec-tion with the other reporters, might result in clearlyvisible phenotypes. The KAN1 reporter is particularlyrelevant to reveal background activity within largeorgans, such as the tomato fruits, that are difficult tocharacterize via classical histological staining or mi-croscopy analysis.Second, we crossed these reporter lines with tomato

driver lines in which the LhG4 transgene was underthe control of one of five Arabidopsis flower-specificpromoters (described in Pekker et al., 2005). Signifi-cantly, the Arabidopsis FIL, AP1, AP3, and CRC pro-moters maintained their specific expression domainsin F1 tomato plants expressing both a driver andreporter construct. The FIL promoter stimulated ex-pression in all organ primordia but not in the shootapical meristem proper (Fig. 5, A and B). The AP1promoter drove expression in the sepals, petals, andflower meristems because all were strongly inhibitedupon transactivation of KAN1 (Fig. 5, C and D) and theAP3 promoter only in the petals and stamens, of whichthe petals became radialized upon transactivation ofKAN1 (Fig. 5, E and F). The CRC promoter stronglyinhibited carpel development upon KAN1 transacti-vation but nowhere else (Fig. 5, G and H). Only onepromoter, FUL, failed to show the expected earlyexpression in the pericarp (data not shown). Theproportion of observed versus expected patterns wasin the same range as that obtained when attempting tosystematically recapitulate transcription pattern withcloned promoter sequences (Lee et al., 2006). To con-clude, defined Arabidopsis promoters are a usefulresource to misexpress or silence genes in other spe-cies, such as tomato.Finally, we have expanded the repertoire of driver

constructs by generating via MultiSite LR recombina-tion all of the transcriptional fusions between each ofthe tomato fruit promoters described above and theLhG4AtO ORF, optimized for expression in plants(pEN-L1-LhATOG4-L2; Karimi et al., 2007b; Table II).

Perspectives

All plasmids with tomato sequences and tomatoseed stocks described here are made available via theNottinghamArabidopsis Stock Centre (NASC; http://Arabidopsis.info) to ensure long-term distribution andappropriate documentation of the materials. The cen-tralization of resources and related information at the

SGNWeb site (Mueller et al., 2005) and complementedat NASC will also facilitate their integration intoreference genome browsers as well as genotype andphenotype databases. As demonstrated by the Arabi-dopsis community, shared genetic tools promote rapidand significant scientific achievements, which is par-ticularly relevant for a plant family of high commercialvalue. For example, the tomato promoters available asGateway entry clones might be used to characterizegenes involved in key processes taking place duringthe successive phases of fruit development, namely,cell proliferation (TPRP and CRC; mitotic cycle), cellexpansion (PPC2; endoreduplication, starch synthesisand storage, and cell wall synthesis), and ripening(PG; cell wall and starch breakdown and soluble sugarand carotenoid accumulation), or in specific fruit tis-sues (IMA, vascular tissues; CRC, cuticle formationand secondary metabolism). Promoters only, ormainly, active in flower or fruit should avoid some ofthe common pitfalls associated with strong constitu-tive promoters (such as CaMV 35S) that also affectvegetative plant parts and therefore hamper the anal-ysis of gene function, as clearly illustrated for PDSamiRNA silencing in tomato.

Finally, it is worth noting that the Gateway clonesdescribed here and in a recent companion article(Estornell et al., 2009) are compatible with a widerange of complementary entry clones (coding foralternative terminators, reporters, or activators) anddestination vectors designed for various functionalassays in plants or in other heterologous systems (forreview, see Karimi et al., 2007a).

MATERIALS AND METHODS

Bacterial Strains

Host Escherichia coli strains were either DH5a (with entry and expression

clones) or DB3.1 (with destination vectors; Invitrogen). Bacterial cultures were

grown at 37�C in Luria broth medium with appropriate antibiotics.

BP and LR Clonase Reactions

Additional information about the basic Gateway site-specific recombina-

tional cloning protocols is provided online by the manufacturer (http://www.

invitrogen.com/). Entry clones were created in BP Clonase reactions with 50

to 100 ng of PCR product and 50 ng of donor vector. Expression clones were

created in LR Clonase II reactions with 30 ng of each entry clones and 50 to 80

ng of destination vector. Reactions were done in 10 mL total volume containing

2 mL of BP or LR Clonase, incubated at 25�C overnight. The reaction was

inactivated by addition of 1 mL of proteinase K, and 5 mL from each reaction

was used to transform E. coli competent cells as described.

Promoter Entry Clones

Specific oligonucleotides were designed to amplify the PPC2, TPRP, and

IMA promoters, including the attB4 and attB1 sites upstream of the 5# and 3#gene-specific priming sequences, respectively (Supplemental Table S2). Pro-

moters were amplified by PCR with either tomato genomic or plasmid DNA

as template. PCR mix contained 0.5 mM of each primer, 25 ng template DNA,

200 mM of each dinucleotide triphosphate, 2.5 units of Platinum HiFi DNA

polymerase (Invitrogen), 13 PCR buffer, and 1 mM MgSO4. Programmed

cycles were as follows: 5 min initial denaturing step at 94�C; 30 cycles of 30 s

denaturation at 94�C, 30 s annealing at 50�C, 1 to 3 min extension (1 min per kb)



at 68�C, and 5 min termination at 68�C. PCR products were purified with the

High Pure PCR Purification Kit (Roche Diagnostics). BP Clonase recombination

reactions were done with the purified PCR products and pDONR P4-P1R to

generate the entry clones. After transformation into DH5a competent cells,

colonies were screened by PCR for the correct insert size and clones were

sequence validated.

Large DNA fragments are more difficult to capture into entry clones.

Because the PG and CRC promoters were 4.8 and 3.7 kb, respectively, we chose

conventional restriction/ligation techniques to build the corresponding entry

clones. The PG promoter originally cloned into pBIN19 (Nicholass et al., 1995)

was isolated as a fragment obtained by BamHI and partial HindIII digestion.

The isolated fragment was ligated to pBlueScript (CLONTECH) plasmid

linearized by BamHI-HindIII digestion to generate an intermediate clone. Two

complementary PG fragments were ligated at once into SalI-XhoI-linearized

pEN-L4-R1: from 5# to 3#, a XhoI-XbaI fragment isolated from the PG

intermediate clone, and an XbaI-XhoI fragment isolated from the original PG

pBIN19 derivative. The plasmid pEN-L4-R1 carried a multiple cloning site

flanked by the attL4 and attR1 recombination sites (attL4-XmnI-SalI-BamHI-

KpnI-ccdB-XhoI-attR1; O. Nyabi, M. Karimi, P. Hilson, and J. Haigh, unpub-

lished data). The CRC promoter originally cloned into pBS (Lee et al., 2005)

was isolated as a SalI-XhoI fragment and cloned into the same sites within

pEN-L4-R1. Digested fragments were separated by electrophoresis in agarose

gels, extracted, and purified with the High Pure PCR Purification Kit (Roche

Diagnostics). After transformation into DH5a competent cells, clones were

screened by restriction analysis to identify plasmids with the expected insert

in the correct orientation and subsequently sequence validated.

Creation of amiRNAVectors

According to Schwab et al. (2006), the plasmid pRS300 was used as

template to introduce an amiRNA sequence targeting the tomato (Solanum

lycopersicum) and Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) PDS gene (5#-TCCATG-

CAGCTACCTTTCCAC-3#) into the miR319a precursor by site-directed muta-

genesis. Overlapping PCR amplification steps were done as described in the

original cloning protocol except that, in the final PCR reaction, the oligonu-

cleotides A and B (based on the pBSK backbone) were replaced by two

alternative oligonucleotides, attB1-amiRNA-fw and attB2-amiRNA-rev, car-

rying the attB1 and attB2 sites, respectively. These two primers can be used for

the amplification of any amiRNA derived from the miR319a precursor

backbone (see Supplemental Materials and Methods S1 for details). The

resulting PCR product containing the amiR-pds precursor was cloned into

pDONR221 by BP Clonase reaction, resulting in the pEN-L1-miRpds-L2 entry

clone (Table I) and then subcloned into the pK7WG2 or pK7m24GW destina-

tion vectors by LR Clonase reaction to yield the expression vectors driving

amiR-pds silencing under the control of the CaMV 35S, PPC2, PG, TPRP, IMA,

or CRC promoters (Table II).

Transactivation Clones

Reporter OP clones were sequence verified after restriction-ligation sub-

cloning downstream of an OP array (10xOP-TATA-MCS-3#OCS in BJ36) and

transferred into the NotI site of the pART27 binary vector. pOP:GUS and pOP:

RFP were described previously (Lifschitz et al., 2006). pOP:KAN1 was gener-

ated by PCR amplification of the ORF of the tomato KAN1 ortholog, desig-

nated SGN-U321055. Driver lines were generated by transcriptional fusion of

promoters in front of the chimeric LhG4 (MCS-LhG4-3#OCS in BJ36; Moore

et al., 1998) and transferred into the NotI site of pART27. The Arabidopsis

LhG4 promoter lines were described before (Pekker et al., 2005), but briefly, a

6.1-kb FILAMENTOUS FLOWER, a 1.7-kb APETALA1, a 0.5-kb APETALA3,

and 3.5-kb CRC Arabidopsis promoter fragments were subcloned in front of

LhG4 in pART27.

Tomato Transformation and Transactivation

MicroTom tomato lines were transformed with the Agrobacterium tumefa-

ciens strain GV3101. Briefly, 8-d-old MicroTom cotyledons were cut at both

extremities and in the middle, placed on solid KCMS in petri dishes,

incubated at 25�C for 24 h, soaked for 30 min with shaking in Agrobacterium

suspension (Agrobacterium was grown in Luria broth to OD = 1, pelleted, and

resuspended in liquid KCMS to OD = 0.05–0.08), blotted dry on sterile

Whatman paper, and incubated on solid KCMS in petri dishes in the dark for

48 h at 25�C. For regeneration, the cotyledons were laid on 2Z medium with

250 mg L21 timentin (ticarcillin and clavulanate; GlaxoSmithKline) and 100

mg L21 kanamycin and incubated during 15 d at 25�C in the light. Regener-

ation medium was changed every 15 d when necessary, with timentin

concentration reduced to 150 mg L21. In case of Agrobacterium overgrowth,

timentin concentration was kept at 250 mg L21. Regenerated plantlets were

transferred to rootingmedium supplementedwith 100mg L21 kanamycin and

75 mg L21 timentin. With this protocol and the vectors described herein,

transformation frequencies observed using MicroTom cotyledons were con-

sistently .80% and up to 90%. Less than 15% of the transgenic plantlets were

polyploid according to flow cytometry analysis. Cultivation from cotyledon

explants to transfer of transgenic plants into the greenhouse lasted 2 to 3

months, and 2 to 3 additional months were required to collect transgenic

seeds. The composition of in vitro culture media is provided in Supplemental

Tables S3 and S4.

Cotyledon transformation of M82 tomato and leaf discs were carried out

according to McCormick (1991) with the Agrobacterium strain GV3101.

promoter:LhG4 lines were crossed to 10xe lines to generate the F1 promoter..reporter plants.

Upon request, all novel materials described will be made available in a

timely manner for noncommercial research purposes, subject to the requisite

permission from any third-party owners of all or parts of the material.

Obtaining any permissions will be the responsibility of the requestor.

GUS Histochemical Staining

Tissues from stably transformed tomato plants were soaked, vacuum-

infiltrated, and incubated for 30 min (PG), 1 h (35S, PPC2, and TPRP), 2 h

(CRC), or overnight (IMA) at 37�C in GUS staining solution [0.5 mM X-gluc,

0.15 M NaH2PO4, pH 7, 2 mM K3Fe(CN)6, 2 mM K4Fe(CN)6, and 0.05% Triton

X-100]. GUS-stained tissues were cleared overnight in 100% ethanol and

stored in 70% ethanol.

Supplemental Data

The following materials are available in the online version of this article.

Supplemental Figure S1. GUS activity in tomato fruits (cv MicroTom)

agroinjected with promoter:GUS transgenes generated via MultiSite

Gateway cloning.

Supplemental Figure S2. Albino phenotype resulting from PDS silencing

in Arabidopsis.

Supplemental Figure S3. Creation of novel hpRNA destination vectors.

Supplemental Figure S4. Construction of the intron-spacer donor vector

pDONR P1-R2-I-R2-P1.

Supplemental Figure S5. Alternative scheme to generate specific hpRNA

destination vectors.

Supplemental Table S1. Theoretical promoter sequences.

Supplemental Table S2. Primers designed for PCR amplification of genetic

elements and for validation of recombined plasmids.

Supplemental Table S3. Composition of cv MicroTom transformation

media (per liter).

Supplemental Table S4. Vitamins for cv MicroTom transformation media.

Supplemental Table S5. Specific hpRNA destination vectors.

Supplemental Materials and Methods S1.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank Wilson Ardilez for sequencing and Martine De Cock for help in

preparing the manuscript.

Received September 16, 2009; accepted September 30, 2009; published October

7, 2009.

Fernandez et al.


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Fernandez et al.


Résultats 45

II. Analyse fonctionnelle de protéines à F-Box

Les protéines à F-Box sont des composantes du complexe SCF (Skp1 – Cullin –

Fbox). Ce complexe appartient à la famille des E3 ubiquitin-ligases qui interviennent

dans le processus de dégradation par le protéasome 26S en fixant des résidus d‟ubiquitine

sur la protéine cible à dégrader (Hershko, 2005). La liaison de cette cible au complexe

SCF se fait par l‟intermédiaire des protéines à F-Box. Le grand nombre de protéines

possédant ce motif chez Arabidopsis thaliana (environ 700 protéines) permet d‟obtenir

une spécificité de reconnaissance de la cible à adresser au protéasome 26 (Gagne et al.,

2002). Il existe une grande diversité de séquences au sein de cette famille de protéines.

Elles sont caractérisées par la présence d‟un domaine F-Box conservé en N-terminal,

composé d‟une cinquantaine d‟acides aminés fonctionnant comme un site d‟interaction

protéine – protéine (Bai et al., 1996). En C-terminal de ce domaine F-Box, différents

types de domaines ont été identifiés qui sont supposés intervenir dans la reconnaissance

du substrat (Gagne et al., 2002).

Des études réalisées chez Arabidopsis thaliana ont montré que les protéines à F-

box et les complexes SCF jouaient un rôle crucial dans divers aspects de la croissance et

du développement des plantes (Callis and Vierstra, 2000). ASK1, une des 19 protéines

Skp d‟Arabidopsis (Farras et al., 2001), est impliquée dans la gamétogenèse mâle et

l‟identité des organes floraux (Yang et al., 1999; Zhao et al., 1999). D‟autres protéines F-

box d‟Arabidopsis sont impliquées dans la signalisation auxinique (TIR1) (Gray et al.,

1999), gibbérellique (SLY1) (McGinnis et al., 2003), éthylénique (EFB1/EFB2) (Guo and

Ecker, 2003) et jasmonique (COI1) (Gray et al., 1999; Xie et al., 1998). Les protéines

avec un motif F-Box interviennent aussi dans l‟homéosis florale (UFO) (Samach et al.,

1999) et dans le contrôle du temps de floraison et du cycle circadien (ZTL, FKF, LKP2)

(Somers et al., 2000; Nelson et al., 2000; Schultz et al., 2001). Certaines protéines à F-

box jouent également un rôle dans la sénescence des feuilles et la ramification latérale

(ORE1, MAX2) (Woo et al., 2001; Stirnberg et al., 2002), ainsi qu‟au niveau de la

photomorphogenèse (EID1) (Dieterle et al., 2001).

Des travaux réalisés précédemment au laboratoire ont permis de mettre en

évidence l‟importance de la dégradation protéique dans les mécanismes de régulation du

cycle cellulaire lors du développement du fruit de tomate (Mathieu-Rivet et al., 2010).

Cette régulation est dirigée par les complexes APC (Anaphase Promoting Complex)

jouant un rôle similaire aux complexes SCF en adressant les protéines ciblées au

Résultats 46

protéasome 26S. De plus, d‟autres études ont démontré l‟importance de la signalisation

auxinique lors du développement précoce du fruit de tomate (Lemaire-Chamley et al.,

2005 . Mounet, communication personnelle) et plus généralement pour le développement

de la plante entière (Quint and Gray, 2006; Paciorek and Friml, 2006). Les complexes

SCF tel que SCFTIR1

se présentent comme des éléments clés dans la perception et la

transduction de ce signal (Dharmasiri et al., 2005; Kepinski and Leyser, 2005; Tan et al.,

2007). L‟implication des complexes SCF dans les différents processus développementaux

cités précédemment, ainsi que le grand nombre de protéines identifiées comme possédant

un motif F-Box mais n‟ayant pas encore été étudiées justifie l‟intérêt porté à cette famille

protéique.

Ce chapitre décrit l‟analyse fonctionnelle de protéines à F-Box potentiellement

impliquées dans le développement du fruit de tomate.

II.A Analyse in silico

Etant donné le grand nombre de protéines à F-Box existant chez Arabidopsis, et

donc à priori chez la tomate, différentes bases de données ont été consultées afin de

dégager une liste pertinente de gènes candidats potentiellement impliqués dans le

développement du fruit de tomate. En premier lieu, les protéines à F-Box exprimées chez

la tomate ont été recherchées dans la base de données TGI qui contient 300000 EST de

tomate assemblées en 28000 TC (Tentative Consensus) et 24000 singletons, soit un total

d‟environ 52000 séquences uniques (Tomato Gene Indices, The Gene Index Project,

http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/). Une requête portant sur les séquences annotées en tant

que protéines à F-Box a permis d‟identifier 95 séquences. Afin de ne retenir que les

séquences en relation avec le développement du fruit, un crible a été effectué selon la

fréquence de présence des EST dans les différentes banques de tomate et les séquences

étant représentées dans les banques de développement précoce du fruit ont été retenues.

Ce crible a été complété par une recherche des données d‟expression disponibles pour ces

séquences dans la base de données « Tomato Expression Database » (TED,

http://ted.bti.cornell.edu/) qui regroupe différentes analyses d‟expression par microarrays.

http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/

http://ted.bti.cornell.edu/

Résultats

Tableau 1 : Liste des gènes candidats retenus à l’issu de l’analyse in silico. Le numéro d‟unigène SGN-UXXXXXX renvoi à l‟identification des gènes sur le site du Sol Genomics Network

(SGN ; http://solgenomics.net/). Le numéro de TC renvoi à l‟identification des séquences sur le site du DFCI (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=tomato). * gènes

candidats pour lesquels la séquence codante complète n‟a été obtenue que depuis les résultats du séquençage du génome de la tomate

.

N° F-Box

Tomate Arabidopsis

Unigène (SGN-)

Protéine prédite

N° Gène Annotation

N° Gène Annotation E-value

FB1

TC233446 U586311 293 aa SL1.00sc06183 F-box family protein

AT5G52880 F-box family protein 9.00E-41

FB2

TC179590 U574471 344 aa SL1.00sc05992 kelch repeat-containing F-box family protein

AT2G44130 kelch repeat-containing F-box family protein 4.00E-54

FB9

TC177076 U573127 382 aa * SL1.00sc04687 kelch repeat-containing F-box family protein

AT1G16250 kelch repeat-containing F-box family protein e-144

FB10


AT1G23780 F-box protein family 2.00E-51

FB11

TC170139 U567358 443 aa * SL1.00sc05575 F-box protein SKIP16

AT1G06110 SKP1/ASK-interacting protein 16 e-136

FB12

TC188199 U565968 641 aa SL1.00sc02227 Flavin-binding kelch repeat F-box

AT1G68050 F-box family protein (FKF1) / adagio 3 (ADO3) 0.0

FB17

TC170164 U570676 665 aa SL1.00sc02302 EIN3-binding F-box protein

AT2G25490 EIN3-binding F-box protein 1 0.0

FB18

TC170164 U581531 637 aa SL1.00sc07122 EIN3-binding F-box protein

AT2G25490 EIN3-binding F-box protein 1 e-169

FB19


AT1G13570 Cyclin-like F-box 4.00E-37

FB20


AT5G45360 F-box family protein-like 1.70E-84

FB21


AT5G67140 F-box family protein-like 7.70E-82

FB23

TC178013 U581820 623 aa * SL1.00sc03736 Auxin F-Box protein 5

AT5G49980 Auxin F-Box protein 5 0.0

FB24

TC178013 U569207 " " "

AT5G49980 Auxin F-Box protein 5 0.0

FB25

TC178908 U564772 581 aa * SL1.00sc07266 TIR1, cyclin like F-Box

AT3G62980 TIR1 0.0

FB26 TC178908 U580825 571 aa * SL1.00sc00226 TIR1, cyclin like F-Box AT3G62980 TIR1 0.0

http://solgenomics.net/

http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=tomato

Résultats 48

Quinze unigènes codant pour des protéines à F-box de tomate ont été retenues par

ce tri (Tableau 1). Pour six de ces protéines à F-box, nous ne disposions alors que de

séquences d‟ADNc partielles (FB9, FB11, FB23, FB24, FB25 et FB26). Récemment, les

données du génome de la tomate ainsi qu‟une annotation provisoire (ITAG1) ont été

rendu accessibles à la communauté scientifique. Par recherche d‟homologie (BLAST), il

a ainsi été possible d‟obtenir la séquence codante complète des 15 F-box sélectionnées

ainsi que les séquences protéiques prédites. Par ailleurs, cette analyse a également permis

d‟identifier les gènes correspondant à ces protéines à F-Box et nous a révélé que les

unigènes des protéines à F- Box FB23 et FB24 correspondaient en fait aux extrémités 5‟

et 3‟ du même ADNc codant pour une "Auxin F-Box".

II.B Sélection des gènes candidats pour la transformation de tomate cv. Micro-Tom

II.B.1 Agro-injection dans le fruit de tomate

Avant d‟initier l‟analyse fonctionnelle des gènes candidats par transformation

stable, nous avons entrepris un criblage de ceux-ci en transformation transitoire dans le

but de sélectionner rapidement les candidats les plus intéressants ayant un rôle dans le

développement du fruit. Pour cela, nous avons choisi de tester une technique décrite dans

la littérature qui consiste à injecter dans le fruit une solution d‟agrobactéries transformées

avec la construction à tester (Orzaez et al., 2006). Les gènes sélectionnés par l‟analyse in

silico ont donc été clonés grâce à la technique GATEWAY™ (Karimi et al., 2002) dans

des vecteurs permettant leur surexpression dans la tomate sous le contrôle du promoteur

35S et/ou des vecteurs permettant l‟extinction du gène dans la tomate grâce à l‟ARN

interférent (RNAi). Les constructions obtenues ont été utilisées afin de réaliser une agro-

injection dans le fruit de tomate (Orzaez et al., 2006).

Cette technique n‟ayant pas encore été utilisée pour l‟étude de gènes candidats

impliqués lors du développement précoce du fruit, nous avons voulu tester l‟effet de

l‟agro-injection sur de jeunes fruits. Une première série d‟injections a été réalisée avec

quatre candidats. Les fruits de Micro-Tom ont été agro-injectés à 15 JAA avec pour

contrôle une solution d‟agrobactéries non transformées (GV3101). Les résultats obtenus

ont montré que l‟injection dans le fruit provoque un arrêt net de la croissance de celui-ci,

aussi bien avec les agrobactéries transformées avec les gènes étudiés qu‟avec les

agrobactéries non transformées (figure 9). De plus, les fruits ayant subit une injection

présentent des nécroses importantes (figure 10).

Résultats 49

Figure 9 : Courbes de croissance de fruits de tomate cv. Micro-Tom avec et sans agroinjection de

bactéries GV3101 vides, ou transformées avec les gènes candidats FB2, FB21, et FB22.

Figure 10 : coupes transversales de fruits de tomate avec et sans agro-injection de bactéries GV3101.

Des injections réalisées sur des stades un peu plus tardifs (23 JAA) ainsi que

l‟utilisation d‟une souche moins virulente d‟agrobactérie (1D1249) ont donné de

meilleurs résultats (figure 11). En effet, avec cette souche d‟agrobactérie et à ce stade de

développement, nous n‟avons pas remarqué d‟arrêt net de la croissance des fruits comme

c‟était le cas avec les souches GV3101 à 15 JAA. En revanche, les fruits ayant subit une

agro-injection présentent toujours des signes de nécroses importants qui provoquent leur

abscission et une coloration précoce des fruits évoquant un stress.

Si cette technique semble efficace pour la transformation transitoire de fruits de

tomate à des stades tardifs de son développement comme la maturation (Orzaez et al.,

2006), en revanche l‟injection dans des fruits au cours de leur développement précoce

semble provoquer un stress trop important, bloquer leur croissance et provoquer des

nécroses. L‟expression transitoire par agro-injection est donc apparue peu adaptée à notre

étude qui s‟intéresse aux phases précoces du développement du fruit de tomate.

0

5

10

15

20

25

30

4 9 14 19 24 29 35 40 45 50

Dia

mèt

re (

mm

)

Jours après anthèse

WT

FB2 OE

FB21 OE

FB22 OE

GV3101

Injection à 15 JAA

Résultats 50

Figure 11 : Courbes de croissance de fruits de tomate cv. Micro-Tom avec et sans agroinjection de

bactéries 1D1249 transformées ou non-transformées avec le gène candidat FB1.

II.B.2 Analyse d’expression par qRT-PCR

Etant donné que nous ne pouvions pas trier par expression transitoire les candidats

les plus intéressants parmi les 15 protéines à F-Box initialement retenues (Tableau 1) et

notre intérêt particulier pour la phase d‟expansion cellulaire du développement du fruit de

tomate, nous avons choisi de sélectionner les gènes candidats pour la transformation

stable sur la base de leur expression préférentielle dans les tissus en cours d‟expansion

cellulaire. Pour cela, nous avons donc initié une analyse d‟expression par qRT-PCR.

Pour trois gènes (FB1, FB10 et FB21) la définition d‟amorces spécifiques

répondant aux critères et conditions de la qRT-PCR n‟a pas été possible. Leur étude

d‟expression n‟a donc pas été réalisée. Pour les autres candidats, nous avons pu définir un

couple d‟amorce spécifique (dans la partie 5‟ ou 3‟ UTR) qui donnait une bonne efficacité

de PCR (90 à 100 %). Nous avons étudié l‟expression de ces gènes par qRT-PCR dans un

tissu principalement en division cellulaire (exocarpe à 20 JAA) et dans deux tissus en

expansion cellulaire (le péricarpe et le tissu loculaire de fruits à 20 JAA)(figure 12).

Parmi ces gènes, seul FB26 présentait une plus forte expression dans l‟exocarpe que dans

les tissus en expansion cellulaire (figure 12) et quatre gènes ne présentaient pas de

variation nette d‟expression entre les trois tissus considérés (FB9, FB17, FB18, FB19).

Six gènes présentaient une expression préférentielle dans les tissus en cours d‟expansion

cellulaire soit préférentiellement dans le péricarpe (FB2, FB11 et FB12) soit

préférentiellement dans le tissu loculaire (FB20, FB23 et FB24).

0

5

10

15

20

25

30

4 9 14 19 24 29 35 40 45 50

Dia

mèt

re (

mm

)

Jours après anthèse

WT

FB1 RNAi

1D1249

Injection à 23 JAA

Résultats 51

Figure 12 : Analyse de l’expression des gènes candidats dans les tissus du fruit de tomate par qRT-

PCR. E20 : exocarpe à 20 JAA ; P20 : péricarpe à 20 JAA ; TL20 : tissu loculaire à 20 JAA. L‟expression

relative (Unité Arbitraire) correspond à l‟expression des différents gènes normalisée avec l‟expression de

l‟actine, la β-tubuline et EiF4a. Les barres verticales représentent l‟écart-type (3 réplicats techniques).

L‟expression de FB2 est deux fois plus importante dans le péricarpe que dans

l‟exocarpe. Pour FB11 et FB12, cette différence d‟expression est encore plus marquée

puisque FB11 est trois fois plus exprimé dans le péricarpe que dans les autres tissus, et

celle de FB12 est cinq à dix fois supérieure dans le péricarpe. Pour les gènes candidats

préférentiellement exprimés dans le tissu loculaire, les différences de niveau d‟expression

sont moins fortes (x 1.5 entre exocarpe et tissu loculaire pour FB20 et FB23, x 2 entre

exocarpe et tissu loculaire pour FB24). D‟après ces données d‟expression, quatre

candidats présentant une expression préférentielle dans le péricarpe (FB2, FB11 et FB12)

ou dans le tissu loculaire (FB24) ont été retenus pour une analyse fonctionnelle.

II.C Génération de lignées transgéniques affectées dans l’expression des gènes FB2,

FB11, FB12 et FB24

Pour les quatre gènes codants pour une protéine à F-box retenus (FB2, FB11,

FB12, FB24), une séquence spécifique de 100-150 b située dans la partie 3‟ UTR a été

clonée dans le vecteur d‟expression pK7GWIWG2 permettant une extinction de leur

expression par la méthode de l’ARN interférent (RNAi) sous le contrôle du promoteur

constitutif 35S. Pour le gène FB2, la totalité de la séquence codante étant disponible, une

construction permettant sa surexpression dans les plantes sous le contrôle du promoteur

constitutif 35S a également été générée (vecteur pK2GW7).

Pour toutes les constructions utilisées, les plantules transgéniques T0 générées

(variété Micro-Tom) ont été sélectionnées selon leur niveau de ploïdie (2C) et la présence

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

FB2 FB9 FB11 FB12 FB17 FB18 FB19 FB20 FB23 FB24 FB25 FB26

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

) E20

P20

TL20

Résultats 52

du transgène a été contrôlée par PCR sur ADN génomique. Un résumé des différentes

lignées ainsi disponibles et de l‟avancement des travaux est présenté dans le tableau 2.

Tableau 2 : Récapitulatif des différentes lignées transgéniques générées.

Transformants Annotation du plus proche

homologue chez Arabidopsis

Nb de transformants

T0 indépendants

Transformants T0

2C, une insertion

Génération

disponibles

Nb lignées

Homozygotes

P35S:FB2OE

Kelch repeat containing F-Box protein 8 4 T0, T1 0

P35S:FB2RNAi

Kelch repeat containing F-Box protein 8 6 T0, T1 0

P35S:FB11RNAi

F-Box SKIP 16 8 4 T0, T1 0

P35S:FB12RNAi

Flavin-binding kelch repeat protein 10 4 T0, T1,T2 4

P35S:FB24RNAi

Auxin F-Box protein 5 14 9 T0, T1 0

II.C.1 Lignées P35S:FB2OE

et P35S:FB2

RNAi

A la génération T0, ces différentes lignées n‟ont pas présenté de phénotype

notable au niveau macroscopique. Le développement végétatif ainsi que le

développement des fruits de ces plantes n‟ont pas montré de variation en comparaison

avec une plante sauvage, aussi bien pour les plantules sur-exprimant FB2 (figure 13) que

pour les plantules le sous-exprimant (figure 14).

Un test de ségrégation réalisé sur les graines issues de l‟autofécondation des

plantes T0 (graines T1) a permis d‟évaluer le nombre d‟insertion du transgène dans le

génome des plantes. Parmi les lignées sur-exprimant FB2, 4 lignées ne présentent qu‟une

insertion du transgène (lignées 1, 4, 6 et 7) et parmi les lignées sous-exprimant FB2, les

lignées à insertion unique sont les plantes 2, 4, 5, et 7. Seules les plantes présentant une

insertion unique du transgène ont été conservées pour la suite de l‟étude.

Une analyse d‟expression par qRT-PCR sur les fruits des lignées P35S:FB2OE

a

montré que seules les lignées 1 et 4 présentent une sur-expression du gène FB2 avec des

niveaux respectivement 2,5 fois et 1,5 fois supérieurs au WT (figure 15). La lignée 6

montre une expression équivalente à celle du WT tandis que la lignée 7 a un niveau

d‟expression de FB2 inférieur à celui trouvé dans les fruits sauvages, probablement lié à

de la co-suppression (figure 15). Concernant les lignées RNAi, l‟analyse d‟expression par

qRT-PCR montre que la lignée 2 ne présente pas de diminution de l‟expression de FB2

(figure 15). En revanche, dans les autres lignées, FB2 semble exprimé avec un niveau

inférieur de moitié à celui mesuré chez les plantes WT.

Résultats 53

Figure 13 : Transformants P35S :FB2OE

de génération T0

Figure 14 : Transformants P35S :FB2RNAi

de génération T0

Le phénotypage de la génération T1 des 2 lignées P35S:FB2OE

sur-exprimant FB2

(lignées 1 et 4) est actuellement en cours. Le développement des parties végétatives, des

inflorescences et des fruits n‟est pas notablement différent de ceux des plantes sauvages

(figure 16).

Résultats 54

Figure 15 : Analyse d’expression du gène FB2 réalisée par qRT-PCR sur des fruits au stade breaker

issus de plantes P35S:FB2OE

et P35S:FB2RNAi

de génération T0. L‟expression relative (Unité Arbitraire)

correspond à l‟expression de FB2 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a.

L‟expression a été mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales

représentent l‟écart-type (3 réplicats techniques).

Figure 16 : Transformants P35S :FB2OE

de génération T1. Les plantes 1-1 à 1-5 sont les descendants de génération T1 de la plante T0 1. Les plantes 4-1 à 4-5 sont les descendants de génération T1 de la plante T0

4.

Le phénotypage des lignées T1 des plantes P35S :FB2RNAi a également été réalisé

(lignées 2, 4, 5, 7). La plupart des plantes de ces différentes lignées ne montrent pas de

différences phénotypiques en comparaison d‟une plante sauvage. Cependant, quelques

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

WT 1 4 6 7

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

)

P35S:FB2OE -T0

0

0,5

1

1,5

WT 2 4 5 7

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

)

P35S:FB2RNAi -T0

Résultats 55

individus présentent des modifications notables au niveau du développement végétatif

(plantes 4-7, 4-10, 7-5). Ces plantes présentent une croissance altérée avec une forte

diminution de taille, avec le développement de nombreux bourgeons axillaires pour les

plantes de la lignée 4 et des entre-nœuds très raccourcis pour la plante de la lignée 7 lui

donnant un aspect trapu (figure 17).


de génération T1. A : plantes des lignées 4 et 7 présentant une croissance altérée. B et C : développement de bourgeons axillaires aboutissant à la formation de tiges

secondaires. D : raccourcissement des entre-nœuds da la plantule. Les autres plantes de génération T1 ne

présentent pas de phénotypes au niveau macroscopique.

II.C.2 Lignées P35S:FB11RNAi

Les plantes P35S:FB11RNAi

de génération T0 sont présentées sur la figure 18. La

plante 6 présentait une forte altération du développement végétatif et n‟a pu s‟acclimater

aux conditions de la serre lors de son introduction après la culture in vitro. La plante 3

semblait également être affectée au niveau du développement végétatif, mais ce

phénotype n‟a pas été retrouvé lors de la suite du développement de la plante. Les autres

plantes T0 ne laissaient pas apparaitre de phénotypes notables en comparaison avec une

plante WT.

Les tests de ségrégation réalisés sur les graines issues de l‟autofécondation de ces

plantes T0 (graines T1) a permis d‟évaluer le nombre d‟insertion du transgène dans le

génome des plantes. Les individus présentant une insertion unique du transgène (plante 1,

Résultats 56

2, 3 et 4) ont été conservés pour la suite de l‟analyse. Les analyses d‟expression réalisées

par qRT-PCR sur des ADNc extraits de fruits breakers montrent que les 4 lignées RNAi

sélectionnées présentent une diminution de l‟expression de FB11 (figure 19).

L‟expression de FB11 dans les lignées 1 et 2 est diminuée respectivement de 73% et 82%,

alors que les lignées 3 et 4 sont moins fortement silencées avec des niveaux d‟expression

de FB11 correspondant respectivement à 61% et 52% du niveau relevé dans les fruits

sauvages.


de génération T0. La plante 6 présentait une forte altération du

développement végétatif et n‟a pu être conservée pour la suite de l‟étude.

Si aucun phénotype notable n‟a été remarqué sur les primo-transformants, la

génération T1 a permis de révéler des phénotypes au niveau du développement végétatif

et reproducteur de certaines plantes (figure 20). Après l‟introduction en serre, le

développement du méristème apical semble avoir stoppé et l‟hypocotyle apparait très

épais, poilu, et présente une coloration violacée. Puis, un développement abondant de

structures foliaires reprend au niveau du méristème apical, ainsi qu‟un développement des

bourgeons axillaires donnant lieu à un ou plusieurs gourmands qui se substituent à l‟axe

principal de la plante. Ces plantes présentent une taille inférieure à celle du WT et

développent des fruits présentant des phénotypes surprenants. Ces phénotypes ont été

retrouvés dans trois lignées indépendantes P35S:FB11RNAi

(lignées 2, 3 et 4) (figure 20).

Résultats 57


issus de plantes P35S:FB11RNAi

de génération T0.L‟expression relative (Unité Arbitraire) correspond à l‟expression de FB11 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a. L‟expression a été mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales représentent l‟écart-type (3

réplicats techniques).


de génération T1. A : altération du développement végétatif

des plantules de différentes lignées T1. B : développement de feuilles au niveau du méristème apical des

plantules. C : développement de bourgeons axillaires aboutissant à l‟établissement de tiges secondaires. D :

développement de fruits morphologiquement très affectés, résultant de la fécondation de plusieurs fleurs

fusionnées.

0

0,4

0,8

1,2

WT 1 2 3 4

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

)

P35S:FB11RNAi -T0

Résultats 58

L‟expression du gène FB11 a également été évaluée par qRT-PCR dans les

différents organes de la plante, dans les différentes parties des fleurs, ainsi qu‟au cours du

développement du fruit (figure 21). Ces données indiquent que FB11 est exprimé dans

tous les organes de la plante de manière relativement stable puisqu‟on observe au

maximum une variation d‟un facteur 2 excepté au cours de la phase de murissement du

fruit pendant laquelle l‟expression de FB11 est très fortement augmentée.

Figure 21 : Analyse d’expression du gène FB11 réalisée par qRT-PCR dans différents organes de la

plante et de la fleur, et au cours du développement du fruit de tomate cv. Micro-Tom. L‟expression

relative (Unité Arbitraire) de chaque gène correspond à l‟expression de ce gène normalisée avec l‟expression

de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a. L‟expression a été mesurée au cours du développement du fruit à 0, 4, 8, 12,

20 et 27 JAA, aux stades Vert Mature (VM), breaker (Bk), Bk +3 jours et Bk + 7 jours et dans des organes

végétatifs : jeune feuille (Jf), feuille mature (Fm), Tige (Ti) et Racine (Ra). Les barres verticales représentent

l‟écart-type (4 réplicats biologiques).


A la génération T0, les plantes P35S:FB12RNAi

n‟ont pas présenté de phénotype au

niveau du développement végétatif en comparaison avec le témoin. En revanche, lors de

l‟analyse des fruits produits par plusieurs de ces plantes, un nombre importants de fruits

fusionnés ou multi-carpellaire a été noté. Ce phénotype a été retrouvé sur plusieurs

plantes de génération T1 identifiées comme étant homozygotes pour le transgène (figure

22).

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

) FB11

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

) FB11

Résultats 59

Figure 22 : Fruits fusionnés et multicarpellaires produits par les plantes P35S:FB12RNAi

de génération

T0 et T1. Les fruits 3 et 4 sont issus de plantes T0. Les fruits 5-8, 8-1 et 8-9 sont issus de plantes T1.

Les analyses de qRT-PCR réalisées sur des fruits au stade breaker montrent que le

niveau d‟expression du gène FB12 a été fortement réduit dans des lignées transgéniques

générées (figure 23). Le niveau de d‟expression résiduel du gène FB12 n‟est que de 6 à

11% comparé au niveau mesuré dans les fruits de plantes WT. Après identification des

lignées T1 homozygotes, le phénotypage de ces individus a été réalisé au niveau

macroscopique, sans pouvoir noter de différences entre les plantes sous-exprimant FB12

et les témoins WT au niveau des parties végétatives (figure 24). Seules quelques plantes

présentaient quelques fruits fusionnés comme décrit sur la figure 24.



de génération T0. L‟expression relative (Unité Arbitraire) correspond à l‟expression de FB12 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a. L‟expression a été

mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales représentent l‟écart-type (3


0,0

0,4

0,8

1,2

WT 3 5 8 9

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

)

P35S:FB12RNAi -T0

Résultats 60


de génération T1. Les plantes présentées sont issus de lignées

identifiées comme étant homozygotes pour le transgène.


A la génération T0, ces différentes lignées P35S:FB24RNAi

n‟ont pas présenté de

phénotype notable au niveau macroscopique. Le développement végétatif ainsi que le

développement des fruits de ces plantes n‟ont pas montré de variation en comparaison

avec une plante sauvage.

Les tests de ségrégation réalisés avec les graines récoltées sur ces plantes ont

permis d‟identifier neuf plantes T0 présentant une insertion unique du transgène (plantes

1, 2, 5, 9, 11 12, 14, 21, 22). Les analyses d‟expression réalisées par qRT-PCR montrent

que parmi ces neuf plantes, le niveau de répression de FB24 est très variable (figure 25).

La lignée présentant la plus faible diminution de FB24 est la lignée 21 où FB24 n‟est

exprimé qu‟à 7 % du niveau mesuré chez une plante sauvage. On peut ensuite distinguer

deux groupes de plantes : un premier groupe de plantes composé des individus 9 et 11 qui

présente une faible diminution d‟expression de FB24 (20 % de réduction d'expression par

rapport au WT). L‟expression résiduelle de FB24 dans les autres plantes T0 (plantes 1, 2,

5, 7, 14 et 22) correspond à 28 à 60 % de celle du WT (figure 25).

Le phénotypage de la génération T1 de transformants n‟a pas permis à ce jour de

mettre en évidence de différences macroscopiques en comparaison des plantes WT.

Résultats 61



de génération T0. L‟expression relative (Unité Arbitraire) correspond à

l‟expression de FB24 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a. L‟expression a été

mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales représentent l‟écart-type (3


0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

WT 1 2 5 7 9 11 14 21 22

Exp

ress

ion

Rel

ati

ve

(UA

) P35S:FB24RNAi -T0

Résultats 62

III. Caractérisation fonctionnelle d’un homologue de tomate d’AtGEM

(Glabra2-Expression Modulator)

Avant mon arrivée au laboratoire, une analyse combinée du transcriptome et du

métabolome du fruit de tomate avait été réalisée dans deux tissus du fruit, le mésocarpe et

le tissu loculaire, au cours de la phase d‟expansion cellulaire (Mounet et al., 2009). Ce

travail avait permis de mettre en évidence des corrélations entre des teneurs en

métabolites et le niveau d‟expression de différents gènes impliqués dans des processus de

régulation. Ainsi, plusieurs gènes candidats avaient été proposés comme gènes

régulateurs de la teneur en certains métabolites ou comme nœuds de régulation du

métabolisme du fruit. Ce travail de caractérisation du mésocarpe et du tissu loculaire avait

été complété par une étude cytologique de ces tissus et la détermination de la taille

cellulaire moyenne au cours de la phase d‟expansion cellulaire (figure 26 ).

Figure 26. Structure du mésocarpe et du tissu loculaire de fruit de tomate de la variété Ailsa Craig

pendant la phase d’expansion cellulaire. (A) Représentation schématique d‟une coupe de fruit. (B)

Sections de péricarpe de fruits collectés à 12, 20 et 35 JAA. (C) Sections tissu loculaire de fruits collectés à

12, 20 et 35 JAA Les barres horizontales correspondent à 500 µm. Pour chaque tissu et stade la taille

cellulaire moyenne est indiquée (10-3 mm2) dans le cadre (moyenne de 9 réplicats). E, exocarpe; En, endocarpe; TL, Tissu loculaire; M, mésocarpe; G, graines; Sep, Septum; F, faisceaux vasculaires.

Dans le but d‟identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans la détermination

de la taille des cellules dans le mésocarpe et dans le tissu loculaire, une analyse de

corrélation avait été réalisée entre les paramètres de taille des cellules (longueur, surface,

volume), les teneurs en métabolites et les taux de transcrits. Avec un coefficient de

corrélation stringent (P< 0.001), deux corrélations significatives avaient été mise en

Résultats 63

évidence (figure 27), impliquant le volume cellulaire et deux transcrits codant

respectivement pour un facteur d‟initiation de la traduction (spot ID 4.4.18.21) et une

protéine de fonction inconnue contenant un domaine POZ (spot ID 5.1.20.7). Avec un

coefficient de corrélation plus faible (P< 0.01), trois corrélations supplémentaires avaient

été révélées entre le volume cellulaire et la teneur en mannose ainsi que entre la longueur

cellulaire et deux transcrits codant pour une sérine/thréonine-protéine kinase (spot ID

4.4.8.20) et une protéine à domaine GRAM (spot ID 1.1.18.2).

Figure 27. Scatter plots représentant les corrélations significatives entre la taille des cellules et la

teneur en métabolite ou le niveau d’expression des gènes dans le mésocarpe et le tissu loculaire à trois

stades de développement au cours de la phase d’expansion cellulaire dans les fruits de tomate de la

variété Ailsa Craig. La valeur indiquée sur chaque courbe correspond au coefficient de corrélation de

Pearson (P< 0.001 pour les corrélations avec la longueur cellulaire et P< 0.01 pour les corrélations avec le

volume cellulaire). Les cercles clairs représentent les échantillons de tissu loculaire. Les Carrés noirs

représentent les échantillons de mésocarpe.

Le transcrit codant pour une protéine à domaine GRAM (spot ID : 1.1.18.2 ; SGN-

U567637) a particulièrement retenu notre attention. En effet, la protéine correspondante

possède 57 % d‟identité avec la protéine GEM (Glabra2-Expression Modulator) décrite

chez Arabidopsis thaliana (Caro et al., 2007). Ces travaux ont montré que cette protéine

GEM est un facteur qui coordonne la balance entre division cellulaire et le devenir des

cellules au niveau des épidermes foliaires et racinaires : GEM inhibe la division cellulaire

en interagissant avec CDT1, une protéine de réplication de l'ADN (figure 28). Il inhibe

également l'expression du gène à homéobox GLABRA2 (GL2) qui détermine la

différenciation ou non des cellules en poils absorbants et en trichomes, respectivement au

niveau des racines et des feuilles. Enfin, GEM interagit avec TTG1 (TRANSPARENT

Résultats 64

TESTA GLABRA1), une protéine avec des motifs WD40 répétés, nécessaire à

l‟établissement d‟un complexe transcriptionnel multiprotéique régulant l‟expression de

GL2 (Caro and Gutierrez, 2007; Caro et al., 2007). GEM semble également être crucial

dans le contrôle de l'équilibre de l'activation/répression des modifications des histones

(acétylation et méthylation) au niveau des promoteurs de ses gènes cibles (figure 28).

Figure 28 : Voie de signalisation de GEM chez Arabidopsis thaliana (d‟après Caro et al., 2007).

III.A Les homologues de AtGEM chez la tomate

Le gène initialement mis en évidence dans les analyses de corrélations correspond

à l‟unigène SGN-U567637 et a été nommé arbitrairement SlGEM1. Cependant, les données

génomiques disponibles chez la tomate (EST/unigènes et génome) ont permis d‟identifier

deux autres gènes homologues à AtGEM chez la tomate. Le gène le plus proche de

SlGEM1 correspond à l‟unigène SGN-U567635 et a été arbitairement nommé SlGEM2.

La protéine prédite SlGEM2 présente 65% d‟identité avec la protéine SlGEM1 (figure

29), mais peut présenter localement 100 % d‟identité de séquence. SlGEM2 semble coder

pour une protéine plus courte que SlGEM1 (242 acides aminés au lieu de 300), cette

dernière présentant deux extensions de séquences en N- et C- terminal (figure 29). Un

autre gène correspondant à l‟unigène SGN-582842 a été nommé arbitrairement SlGEM3.

Il code également pour une protéine très proche de SlGEM2 et SlGEM3. L‟analyse

Résultats 65

phylogénétique réalisée montre que SlGEM1 est l‟homologue de tomate le plus proche de

AtGEM (figure30).

Figure 29: Alignement des séquences protéiques SlGEM1, SlGEM2 et SlGEM3. Le programme

MultAlin a été utilisé (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html).

Figure 30 : Arbre phylogénétique des protéines GEM d’Arabidopsis et de tomate ainsi que de leurs

plus proches homologues. L‟arbre a été réalisé avec le logiciel MEGA3 (http://www.megasoftware.net/)

en utilisant les séquences protéiques des différents gènes et selon la méthode Neighbor-Joining (NJ).

Le seul domaine protéique identifié chez GEM est un domaine GRAM. Ce type de

domaine protéique est retrouvé chez des glucosyltransférases, des myotubularines, et

d‟autres protéines associées à la membrane (Doerks et al., 2000). Le domaine GRAM est

constitué d‟environ 70 acides aminés. Il est supposé être un domaine de liaison protéique

ou lipidique intracellulaire et jouerait donc un rôle important dans les processus liés à la

membrane. Chez Arabidopsis thaliana, 13 protéines ont été identifiées comme possédant

un domaine GRAM, et sont exprimées dans des tissus différents ou sous des conditions

de stress différentes. Ces protéines joueraient un rôle régulateur dans la perception de

SlGEM1 U567637

SlGEM2 U567635

AtGEM AT2G22475

AtGEML3 AT4G40100

SlGEM3 U582842

FIP AT1G28200

AtGEML5 AT5G13200

U569382

U580380

AtGEML2 AT4G01600

AtGEML8 AT5G08350

AtGEML6 AT5G23350

AtGEML4 AT5G23370

AtGEML7 AT5G2336052

98

100

90

99

6781

99

10090

99

0,1

http://www.megasoftware.net/

Résultats 66

signaux environnementaux et hormonaux (Jiang et al., 2008). L‟importance de ce

domaine pour la fonction de la protéine AtGEM n‟a pas été décrite.

L‟expression des gènes SlGEM1 et SlGEM2 a été mesurée par qRT-PCR dans

différents organes de plantes de Micro-Tom sauvage, ainsi qu‟au cours du développement

du fruit. Les données présentées sur la figure 31montrent que les deux gènes n‟ont pas le

même profil d‟expression. SlGEM1 est exprimé à des niveaux comparables dans tous les

organes végétatifs testés tandis que SlGEM2 est plus fortement exprimé dans les tiges et

les racines par rapport aux feuilles. L‟expression de SlGEM2 augmente tout au long du

développement précoce du fruit (de 0 JAA au stade Vert Mature), puis est relativement

stable pendant le murissement du fruit. Au contraire, l‟expression de SlGEM1 est forte à

l‟anthèse (0 JAA), diminue pendant la phase de division cellulaire (4 -> 8 JAA), puis se

stabilise pendant la phase d‟expansion cellulaire (8 -> 27 JAA) avant d‟augmenter

pendant le murissement du fruit (Bk -> Bk + 7).

Figure 31 : Analyse d’expression des gènes SlGEM1 et SlGEM2 réalisée par qRT-PCR dans

différents organes et au cours du développement du fruit de tomate cv. Micro-Tom. L‟expression

relative (Unité Arbitraire) de chaque gène correspond à l‟expression de ce gène normalisée avec

l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a. L‟expression a été mesurée au cours du développement du

fruit à 0, 4, 8, 12, 20 et 27 JAA, aux stades Vert Mature (VM), breaker (Bk), Bk +3 jours et Bk + 7 jours et

dans des organes végétatifs : jeune feuille (Jf), feuille mature (Fm), Tige (Ti) et Racine (Ra). Les barres

verticales représentent l‟écart-type (4 réplicats biologiques).

Résultats 67

III.B Génération de plantes transgéniques affectées dans l’expression du gène

SlGEM1

Pour débuter une analyse fonctionnelle du gène SlGEM1 nous avons généré des

plantes transgéniques sur-exprimant le gène SlGEM1 ainsi que des plantes silencées pour

ce gène. Pour cela les constructions ont été respectivement réalisées dans les vecteurs

pK2GW7 et pK7GWIWG2 sous le contrôle du promoteur 35S. Les plantules

transgéniques T0 générées (variété Micro-Tom) ont été sélectionnées selon leur niveau de

ploïdie (2C) et la présence du transgène a été contrôlée par PCR sur ADN génomique.

III.B.1 Analyse des transformants P35S : SlGEM1OE

Parmi les plantules transformées avec la construction P35S : SlGEM1OE

, six plantes

diploïdes ont été sélectionnées (figure 32). La plante T0 P35S : SlGEM1OE

2 présentait une

forte altération de son développement végétatif, et n‟a pu être conservée pour le reste de

l‟étude. Le phénotypage des autres plantes T0 P35S : SlGEM1OE

n‟a pas permis de mettre

en évidence de différence avec la plante sauvage, aussi bien au niveau des parties

végétatives, qu‟au niveau du développement des fleurs et des fruits.

Figure 32 : Transformants P35S:SlGEM1OE

de génération T0

Une analyse d‟expression par qRT-PCR a montré que seules deux plantes (plante

3 et plante 5) présentent une sur-expression du gène SlGEM1 (figure 33). Ces plantes

présentent un niveau d‟expression de SlGEM1 plus de 3 et 5 fois supérieur à celui

retrouvé dans la plante sauvage. Les trois autres plantes P35S : SlGEM1OE

(plante 1, plante

4 et plante 6) présentent un niveau d‟expression de SlGEM1 inférieur à celui retrouvé

dans la plante contrôle (WT). Ce résultat est probablement dû à un phénomène de co-

Résultats 68

suppression par lequel le niveau d‟ARNm du transgène et du gène endogène a été

fortement réduit (van der Krol et al., 1990).

Figure 33 : Analyse d’expression du

gène SlGEM1 réalisée par qRT-

PCR sur des fruits au stade breaker

issus de plantes P35S:SlGEM1OE

de

génération T0. L‟expression relative

(Unité Arbitraire) correspond à

l‟expression de SlGEM1 normalisée

avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a. L‟expression a été

mesurée sur un pool de 3 fruits

collectés au stade breaker. Les barres

verticales représentent l‟écart-type (3


Nous avons poursuivi ce travail en sélectionnant des plantes T1 homozygotes pour

les lignées sur-exprimant SlGEM1 (lignées 3.3 et 5.2). L‟analyse d‟expression par qRT-

PCR montre que l‟expression du gène SlGEM1 est très fortement augmentée dans les

fruits des deux lignées T2 homozygotes (x5 dans la lignée 3.3 et x16 dans la lignée 5.2)

par rapport au niveau d‟expression dans la plante WT (figure 34). Ces niveaux

d‟expression apparaissent plus importants que ceux mesurés sur la génération T0. Cette

augmentation du niveau d‟expression peut probablement s‟expliquer par l‟état

homozygote du transgène dans ces lignées, alors qu‟en génération T0, les transformants

sont à l‟état hétérozygote. Malgré cette forte augmentation de l‟expression du SlGEM1

dans ces lignées, aucun phénotype visible n‟a été identifié à ce jour sur ces plantes ni sur

les parties végétatives, ni sur les inflorescences et ou les fruits de ces plantes.

Figure 34: Analyse d’expression du gène

SlGEM1 réalisée par qRT-PCR sur des fruits

au stade breaker issus de plantes

P35S:SlGEM1OE

de génération T2 homozygotes. L‟expression relative (Unité Arbitraire) correspond à l‟expression de SlGEM1 normalisée avec

l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a.

L‟expression a été mesurée sur un pool de 3 fruits

collectés au stade breaker. Les barres verticales


0

2

4

6

8

WT 1 3 4 5 6

Expre

ssio

n R

elat

ive

(UA

)

P35S:SlGEM1OE

0

5

10

15

20

WT 3.3 5.2

Expre

ssio

n r

elat

ive

(UA

) P35S:SlGEM1OE

Résultats 69

III.B.2 Analyse des transformants P35S:SlGEM1RNAi

Parmi les plantules transformées avec la construction P35S : SlGEM1RNAi

, 16

plantes diploïdes ont été sélectionnées. Comme dans le cas des plantes transgéniques

P35S:SlGEM1OE

, le phénotypage des plantes silencées n‟a pas révélé de modifications

notables par rapport aux plantes sauvages au niveau des parties végétatives ou au niveau

du développement des fruits (figure 35).

Figure 35 : Transformants

P35S:SlGEM1RNAi

de génération T0

L‟analyse d‟expression par qRT-PCR réalisée sur les 12 plantes T0 ne présentant

qu‟une seule insertion du transgène a montré que seule la plante P35S : SlGEM1RNAi

-1 ne

présentait pas de diminution de l‟expression de SlGEM1, les autres plantes présentant une

réduction de l‟expression du gène étudié d‟au moins 90% (figure 36).

Résultats 70

Figure 36 : Analyse d’expression du gène SlGEM1 réalisée par qRT-PCR sur des fruits au stade

breaker issus de plantes P35S:SlGEM1RNAi

de génération T0. L‟expression relative (Unité Arbitraire)

correspond à l‟expression de SlGEM1 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a.

L‟expression a été mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales


Lors du semis des graines T1, destiné à évaluer le nombre d‟insertions dans les

plantes T0, la lignée 6 a présenté un phénotype remarquable. En effet, sur les 90 graines

semées pour le test de ségrégation, sept apparaissaient plus petites que les autres et ont

donné des plantules qui ne présentaient pas de développement du limbe des feuilles, leur

donnant ainsi un aspect filiforme. De plus, lors du développement des fleurs, cet aspect

filiforme a été retrouvé au niveau des sépales et des pétales (figure 37). Le phénotype très

altéré des fleurs a rendu très difficile leur pollinisation, et de rares fruits ont pu se

développer et être observés. Ces fruits, la plupart du temps parthénocarpiques,

présentaient une morphologie particulière comme le montre la figure 37.

Parmi la descendance T2 des plantules T1 P35S :SlGEM1RNAi

-6 présentant un phénotype

WT, des plantules aux phénotypes filiformes ont également été retrouvées, avec des

proportions allant de 10 à 20%, aussi bien parmi des plantes homozygotes

qu‟hétérozygotes. Cette ségrégation et la fréquence d‟apparition du phénotype filiforme

évoque un processus de régulation épigénétique. Cependant, ce phénotype n‟ayant été

remarqué que dans la descendance d‟une seule lignée T0 P35S :SlGEM1RNAi

, il paraît

difficile de le relier à l‟extinction de l‟expression de SlGEM1.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

WT 1 3 5 6 7 8 9 12 13 14 15 16

Expre

ssio

n R

elat

ive

(UA

)P35S:SlGEM1RNAi

Résultats 71

Figure 37: Phénotypes présentés par le transformant P35S :SlGEM1RNAi

T1 6. A : comparaison d‟une

plante sauvage de Micro-Tom avec un des transformant de la lignée P35S :SlGEM1RNAi T1 6. B :

inflorescence du transformant P35S :SlGEM1RNAi T1 6 présentant un aspect filiforme des sépales et des

pétales. C : fruit des transformants de la lignée P35S :SlGEM1RNAi T1 6.

Pour les autres lignées T0, des plantes T2 homozygotes ont elles aussi été

phénotypées sans noter de différence avec les plantes contrôle WT. Le niveau

d‟expression de SlGEM1 a été ré-évalué dans ces lignées homozygotes (figure 38). Les

résultats montrent qu‟en génération T2 homozygote, SlGEM1 est toujours fortement

réprimé bien que les niveaux d‟expression du gène diffèrent quelque peu du niveau

d‟expression noté sur les lignées T0.

Figure 38 : Analyse d’expression du gène SlGEM1 réalisée par Q-RT-PCR sur des fruits au stade

breaker issus de plantes P35S:SlGEM1RNAi

de génération T2 homozygotes. L‟expression relative (Unité

Arbitraire) correspond à l‟expression de SlGEM1 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et

EiF4a. L‟expression a été mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales représentent l‟écart-type (3 réplicats techniques).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

WT 5-3 6-8 7.1 8-5 9.4 12.2 14.8 15.1

Exp

ress

ion R

elav

ive

(UA

) P35S:SlGEM1RNAi

B A C

WT P35S :SlGEM1RNAi

T1 6

Résultats 72

III.B.3 Analyse de l’expression de SlGEM2 chez les lignées transformées

L‟expression du gène SlGEM2 a été évaluée par qRT-PCR dans les différentes

lignées homozygotes de transformants P35S :SlGEM1RNAi

et P35S :SlGEM1OE

(figure 39).

Les résultats obtenus montrent que la modification de l‟expression de SlGEM1

n‟influence pas celle de SlGEM2 dans les lignées OE. En revanche les lignées

homozygotes P35S:SlGEM1RNAi

présentent des variations de l‟expression de SlGEM2, les

lignées RNAi 9-4 et 12-2 étant particulièrement affectées avec une très forte

augmentation du niveau de SlGEM2 (respectivement x10 et x6). Ces résultats de qRT-

PCR montrent également que dans l‟ensemble des lignées, le silencing du gène SlGEM1 a

bien ciblé spécifiquement ce gène et non son homologue SlGEM2.

Figure 39 : Analyse d’expression du gène SlGEM2 réalisée par qRT-PCR dans les différentes lignées

homozygotes de transformants pour le gène SlGEM1. L‟expression relative (Unité Arbitraire)

correspond à l‟expression de SlGEM2 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et EiF4a.

L‟expression a été mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales représentent l‟écart-type (3 réplicats techniques).

III.B.4 Analyse cytologique des péricarpes de fruit des transformants

Des analyses cytologiques ont été réalisées sur des coupes de péricarpes de fruits

récoltés au stade breaker. Les observations réalisées sur les lignées P35S :SlGEM1OE

et

P35S :SlGEM1RNAi

homozygotes pour le transgène n‟ont pas permis de mettre en évidence

de variation par rapport aux plantes témoins analysées (figure 40). L‟organisation des

assises cellulaires ainsi que la taille des cellules composant le péricarpe de ces fruits ne

semblent pas affectés pas les modifications d‟expression de SlGEM1 mis en évidence

chez ces transformants.

Résultats 73

Figure 40 : Observation des péricarpes des lignées homozygotes P35S :SlGEM1OE

et P35S :SlGEM1RNAi

.

L‟échelle représente 1mm

III.C Identification et caractérisation de mutants de SlGEM1 par TILLING

En parallèle de cette approche de transgenèse, et notamment après avoir identifié

les plantes présentant un phénotype filiforme dans la descendance de la plante

P35S :SlGEM1RNAi

-6, nous avons initié la recherche de mutants au niveau du gène

SlGEM1. Pour cela, le Laboratoire Biologie du Fruit possède une collection de 8500

familles mutantes M2 obtenues par mutagenèse à l‟EMS (Ethyl methanesulfonate) sur des

graines de tomate cv Micro-Tom. Parmi cette collection, des familles présentant une

mutation au niveau du gène SlGEM1 ont été recherchées et identifiées par TILLING.

Le screening de la collection de mutants a permis d‟identifier une série allélique

de quatre familles présentant une mutation au niveau du gène SlGEM1. Le logiciel SIFT

(Sorting Intolerant From Tolerant ; http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) a été utilisé afin

de prédire l‟impact de la mutation ponctuelle détectée sur le changement d‟acide aminé

induit et l‟affectation potentielle de la fonction de la protéine finale (Ng and Henikoff,

2003). Ces résultats sont présentés dans le tableau 3.

Tableau 3 : Identification des familles de mutants EMS de tomate cv. Micro-Tom présentant une mutation dans le gène SlGEM1. La colonne Mutation Nt indique la position de la mutation dans la sequence d‟acides

nucléiques. La colonne Mutation AA indique la position de la mutation dans la séquence d‟acides aminés. La

colonne Mutation indique le type de mutation impliquée. La colonne Prédiction SIFT indique le résultat fourni par le

logiciel SIFT sur la prédiction de l‟affectation de la fonction de la protéine engendrée par la mutation identifiée. Nt =

Nucléotide ; AA = Acide Aminé.

Famille M2 Mutation Nt Mutation AA Mutation Prédiction SIFT

P18H12 G43A V15I Missense AFFECT PROTEIN FUNCTION

with a score of 0.00

P11A1 T47A V16E Missense AFFECT PROTEIN FUNCTION


P14H2 C206A S69* KO AFFECT PROTEIN FUNCTION


P15H1 G310A E104K Missense TOLERATED with a score of 0.91

http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html

Résultats 74

La position des différentes mutations identifiées se situe dans la partie N-terminale

de la protéine, ciblée par les amorces choisies pour le TILLING. Le domaine GRAM,

situé plutôt dans la partie C-terminale, n‟est pas affecté par ces mutations (figure 41).

Cependant, la mutation KO abouti à une protéine tronquée ne possédant pas la partie C-

terminale et donc pas de domaine GRAM. Pour chaque famille où une mutation a été

identifiée, deux individus homozygotes ont été isolés, hormis pour la mutation KO pour

laquelle seulement un individu homozygote a pu être trouvé.

Figure 41 : Position des mutations ponctuelles identifiées par TILLING sur la protéine SlGEM1.

III.C.1 Phénotypes des fruits des plantes mutantes.

Le phénotypage de ces lignées mutantes n‟a pas révélé de différences marquées au

niveau des parties végétatives des plantes. En revanche, les mesures réalisées sur le

diamètre et le poids des fruits de ces mutants ont présentés des différences significatives

par rapport aux fruits de plantes sauvages (figures 42 et 43).

Figure 42 : Diamètre moyen des fruits rouges matures issus des plantes mutantes pour le gène

SlGEM1 et de plantes sauvages. Le diamètre a été mesuré selon une coupe équatoriale. Les barres

représentent les écart-types. Les étoiles représentent les valeurs significativement différentes de celle du

WT selon un test de Student (p < 0,05).

*

**

* *

*

0

10

20

30

WT P18 H12 2 P18 H12 18 P15 H1 5 P15 H1 15 P14H2 12 P11A1 6 P11A1 12

Dia

mèt

re (

mm

)

VI EK KO VE

Résultats 75

Toutes les familles pour lesquelles une mutation de SlGEM1 a été identifiée

présentent une diminution significative du diamètre du fruit excepté la famille P18H12 2

pour laquelle le diamètre n‟est pas significativement différent de celui des fruits WT.

Cette diminution de diamètre s‟élève à plus de 25% pour les familles P14H2 12 (mutant

KO) et P11A1 6.

Figure 43: Poids moyen des fruits rouges matures issus des plantes mutantes pour le gène SlGEM1 et

de plantes sauvages. Les barres représentent les écart-types. Les étoiles représentent les valeurs

significativement différentes de celle du WT selon un test de Student (p < 0,05).

Comme observé pour le diamètre, seuls les mutants P18H12 2 ne montrent pas de

différences significatives au niveau du poids moyen par rapport aux plantes sauvages.

Tous les autres mutants présentent un poids moyen significativement inférieur à celui du

WT (p > 0,05). Cette diminution de poids s‟élève à 66% pour le mutant KO chez qui ce

caractère est le plus marqué.

La diminution observée sur les paramètres diamètre et poids est intimement liée,

puisque comme le montrent les données récoltées sur les fruits issus de plantes sauvages,

le diamètre et le poids sont corrélés avec un facteur R2 = 0,88 (figure 44).

*

*

*

**

*

0

2

4

6

8


Poid

s (g

)

VI EK KO VE

Résultats 76

Figure 44 : Représentation du poids des fruits rouges matures de plantes sauvages en fonction de leur

diamètre. Le coefficient de corrélation R2 est de 0,88.

III.C.2 Altération de la fécondation

Lors de la récolte des fruits, le nombre de graines contenus dans chacun d‟eux a

été compté. Les données sont présentées sur la figure 45. toutes les lignées mutantes

présentent une diminution significative du nombre de graines par fruits. Dans le cas du

mutant KO, les plantes mutantes produisent des fruits avec un très faible nombre, voir une

absence, de graines.

Figure 45 : Nombre moyen de graines dénombrées dans les fruits rouges matures issus des plantes

mutantes pour le gène SlGEM1 et de plantes sauvages. Les barres représentent les écart-types. Les

étoiles représentent les valeurs significativement différentes de celle du WT selon un test de Student (p < 0,05).

R² = 0,884

0

5

10

15

20

25

30

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Dia

mèt

re (

mm

)

Poids (g)

* *

*

*

*

*

*

0

20

40

60

80


Nom

bre

de

gra

ines

VI EK KO VE

Résultats 77

Ce très faible nombre de graines contenues dans les fruits des plantes KO est à

mettre en relation avec la structure particulière présentée par de nombreuses fleurs de ces

plantes. En effet, le style de ces fleurs est anormalement développé, et le stigmate

apparaît à l‟extérieur du cône staminal (figure 47). Une telle configuration florale ne

facilite probablement pas l‟autofécondation des fleurs qui est altérée chez les plantes KO.

Cependant ce phénotype n‟est pas retrouvé chez les autres plantes mutantes et semble

spécifique de la mutation KO.

Figure 47 : Fleur de tomate cv. Micro-Tom prélevées sur une plante sauvage (WT) et sur le mutant KO (P14H2 12) pour le gène SlGEM1. L‟échelle représente 1cm.

De plus, des tests de germination du pollen réalisés avec du pollen issu de fleurs

WT et de fleurs KO ont montré que chez le mutant, le pollen a un faible taux de

germination (10%) alors que le pollen issu de plantes sauvages présente un taux de

germination de plus de 42% (figure 48). Les plantes KO présentent donc un défaut de

fécondation probablement lié au faible taux de germination du pollen.

Figure 48: Test de germination de pollen prélevé sur des fleurs WT et KO. A : pourcentage de

germination du pollen récolté sur des fleurs WT et KO. B : Observation au microscope de grains de pollen

WT et KO après 3h dans un milieu de germination.

Afin de confirmer l‟altération de fertilité du pollen chez les fleurs du mutant KO,

des croisements ont été effectués entre une plante sauvage de Micro-Tom et le mutant.

WT KO

A

B

Résultats 78

Pour cela, le cône staminal d‟une fleur WT ou d‟une fleur KO a été prélevé et inséré

respectivement sur la partie femelle d‟une fleur KO ou WT.

La figure 49 présente les résultats des croisements effectués ainsi que les résultats

des autofécondations correspondantes. On remarque que si le pollen WT n‟a aucun

problème pour féconder une fleur WT ou une fleur KO, le pollen KO en revanche n‟a pas

la capacité de féconder une fleur WT ou KO. La mutation KO de la protéine SlGEM1

semble donc n‟affecter que la partie reproductrice mâle des fleurs. Ce résultat confirme

l‟observation effectuée sur le nombre de graines contenus dans les fruits KO. En effet, en

absence de pollinisation effective, le fruit qui se développe présente une parthénocarpie

qui est retrouvée ici avec les fruits issus des croisements "fleur WT x pollen KO".

Figure 49 : Croisement entre une fleur

WT et une fleur KO. ♀ indique le

génotype de la partie femelle réceptrice du

pollen. ♂ indique le génotype du pollen

utilisé pour le croisement.

Résultats 79

III.D Implication de SlGEM1 dans les processus de différentiation chez la tomate

Développement racinaire

Il a été montré que, chez Arabidopsis thaliana, GEM interagit avec la protéine

TRANSPARENT TESTA GLABRA 1 (TTG1) et joue ainsi un rôle dans le

développement racinaire. Une analyse du développement des racines de plantules de

tomate cv. Micro-Tom a donc été réalisée, sur des plantules WT et sur des transformants

homozygotes OE et RNAi, ainsi que des plantules homozygotes KO. La figure 50

présentant ces résultats indique que chez la tomate, SlGEM1 ne semble pas affecter le

développement des racines puisque aucune différence n‟apparaît entre les différents

génotypes étudiés.

Figure 50: Test de développement racinaire de plantules WT, P35S :SlGEM1OE

5-2, P35S :SlGEM1RNAi

6-8 et KO pour le gène SlGEM1. Les racines ont été observées au même stade de développement (1,5 cm).

L‟expression du gène TTG1, responsable du phénotype observé sur les racines

chez Arabidopsis, a été évaluée par qRT-PCR chez les transformants homozygotes de

tomate pour le gène SlGEM1 ainsi que chez les différents mutants de ce même gène. Les

résultats obtenus (figure 51) indiquent que l‟expression de SlTTG1 est fortement induite

dans les lignées P35S :SlGEM1RNAi

9-4 et 12-2 pour lesquelles l‟expression de SlGEM2

apparait également modifiée. (§III.B.3). Les lignées P35S :SlGEM1RNAi

7-1, 14-8 et 15-1,

et la lignée P35S :SlGEM1OE

3-3présentent également une légère augmentation de

l‟expression de SlTTG1.

Résultats 80

WT KO

Figure 51: Analyse d’expression du gène SlTTG1 réalisée par qRT-PCR sur des fruits au stade

breaker issus de plantes P35S:SlGEM1OE

, P35S:SlGEM1RNAi

, KO et WT. L‟expression relative (Unité Arbitraire) correspond à l‟expression de SlTTG1 normalisée avec l‟expression de l‟actine, la β-tubuline et

EiF4a. L‟expression a été mesurée sur un pool de 3 fruits collectés au stade breaker. Les barres verticales


Observation du développement et de la densité de trichomes foliaires

Chez Arabidopsis thaliana, la modification de l‟expression du gène GEM entraine

un phénotype marqué au niveau des trichomes foliaires. En effet la sur-expression de ce

gène diminue la densité de trichomes présents à la surface des feuilles, alors que le mutant

d‟insertion gem-1 présente une densité accrue de trichomes.

Les trichomes présents à la surface des 3ème

et 4ème

feuilles de plantules de tomate

cv Micro-Tom WT et KO pour le gène SlGEM1 ont été observés à la loupe binoculaire.

Les résultats présentés sur la figure 52 montrent que, chez la tomate, la modification du

gène SlGEM1 ne semble pas influencer ni le développement, ni la densité des trichomes

foliaires.

Figure 52 : Observation des trichomes foliaires à la loupe binoculaire. Les observations ont été réalisées

sur la 3ème feuille de plantule WT et KO de Micro-Tom

Chapitre 3 : DISCUSSION ET PERSPECTIVES

Discussion et Perspectives 81

Chapitre 3 : DISCUSSION ET PERSPECTIVES

Au cours de ma thèse, mon travail s‟est découpé autour de trois axes : 1) la

validation de l‟utilisation de quatre promoteurs de tomate et d‟un promoteur

d‟Arabidopsis dans des constructions permettant la surexpression ou le silencing de gènes

dans le fruit de tomate, à des phases particulières de son développement ou dans des

tissus spécifiques du fruit, 2) l‟analyse fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à

F-Box chez la tomate et 3) l‟analyse fonctionnelle du gène SlGEM1.

Le premier point ne sera pas discuté dans cette partie car il s‟agissait du

développement de nouveaux outils pour l‟analyse fonctionnelle chez la tomate. Ce travail

a été mené à son terme et a donné des résultats très intéressants, notamment dans le cas du

promoteur du gène LePPC2, pour lequel une fusion transcriptionnelle avec la GFP a

permis de montrer son activité spécifique des cellules du péricarpe des fruits de tomate en

phase d‟expansion cellulaire (Fernandez et al., 2009). Ces nouveaux outils constituent des

atouts pour de futures analyses fonctionnelles et en particulier pour la poursuite des

travaux sur les gènes candidats auxquels je me suis intéressé. A ce titre, leur utilisation

sera évoquée dans les parties I et II de ce chapitre qui présentent respectivement la

discussion/perspectives des résultats obtenus pour la caractérisation fonctionnelle des

gènes codant pour les protéines à F-Box et pour SlGEM1.

I. Analyse fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à F-Box chez la

tomate

Le but de cette partie de ma thèse était d‟identifier, dans la grande famille de

protéines possédant un motif F-Box, celles qui jouent un rôle important dans la régulation

du développement du fruit chez la tomate. En effet, malgré l‟implication importante de

ces protéines dans la régulation de processus variés du développement des plantes, très

peu de travaux se sont attachés à leur caractérisation chez cette espèce. Des travaux

montrent l‟importance des protéines à F-Box coronatine-insensitive 1 ou COI1 (Katsir et

al., 2008) et ACRE189/ACIF1 (van den Burg et al., 2008) dans les relations plante-

pathogène. En ce qui concerne le développement du fruit, un travail récent décrit la

caractérisation des deux protéines à F-Box SlEBF1 et SlEBF2, impliquées dans la

signalisation par l‟éthylène (Yang et al., 2010).

Lorsque j‟ai initié ce travail, le séquençage du génome de la tomate n‟était pas

terminé, et nous ne disposions «que» de banques d‟EST pour cette espèce. Celles-ci


contenaient 95 séquences d‟ADNc annotées comme protéines à F-Box. Comme nous

nous intéressions au développement du fruit, dans un premier crible, nous avons retenus

les 15 ADNc qui présentaient des EST dans les banques de fruits immatures. Afin de

restreindre cette liste aux candidats les plus pertinents, nous avons initié une analyse

fonctionnelle par expression transitoire, en utilisant la technique d‟agroinjection dans le

fruit de tomate (Orzaez et al., 2006). Malheureusement, cette approche s‟est avérée

inutilisable dans le cas du développement précoce du fruit car elle entraîne un stress trop

violent au niveau des jeunes fruits, ce qui stoppe leur croissance ou provoque leur

abscission. Une technique telle que le VIGS (Virus-Induced Gene Silencing) serait

probablement plus adaptée à ce genre d‟étude. Cette technique a déjà été décrite pour

éteindre l‟expression de gènes dans le fruit de tomate (Fu et al., 2005; Yang et al., 2010)

mais le problème majeur de cette approche réside dans la localisation des parties silencées

sur les fruits. A cet égard, différentes équipes développent des couples plantes/vecteurs

permettant une localisation des zones éteintes par le silencing dans les fruits à l‟aide d‟un

gène rapporteur. Quand ces outils seront disponibles, un criblage de gène candidat par

VIGS pourra être envisagé.

Dans le cadre de ce travail, les gènes candidats codant pour des protéines à F-Box

ont donc été criblés selon la base de leur expression préférentielle dans les tissus charnus

du fruit : le péricarpe et le tissu loculaire. Quatre gènes codant pour des protéines à F-Box

ont ainsi été retenus pour lesquels des plantes transgéniques ont été générées :

P35S:FB2RNAi

et P35S:FB2

OE, P35S:FB11

RNAi, P35S:FB12

RNAi et P35S:FB24

RNAi. Le problème

majeur que nous avons rencontré dans cette partie du travail est l‟absence de phénotypes

sur les plantes T0, et la rareté des phénotypes sur les plantes T1, et en particulier au

niveau du fruit, ce que nous recherchions au départ. Plusieurs hypothèses peuvent être

émises pour expliquer ces résultats : 1) ces protéines ne jouent aucun rôle dans le

développement chez la tomate, 2) les protéines à F-Box choisies jouent un rôle régulateur

dans un processus de développement très particulier qui n‟a pas été révélé dans cette

étude, comme par exemple la résistance à des pathogènes, 3) le rôle de ces protéines à F-

Box pourrait être masqué par l‟existence d‟une redondance fonctionnelle entre la protéine

ciblée et d‟autres protéines à F-Box proches, comme cela a été décrit dans le cas de

SlEBF1 et SlEBF2 (Yang et al., 2010), 4) la modification d‟expression de la protéine à F-

Box ciblée n‟est pas suffisante pour avoir un effet au niveau du développement de la

plante.


Les paragraphes suivant vont s‟attacher à discuter des résultats que nous avons

obtenus concernant la caractérisation des plantes transgéniques générées pour les

différents gènes candidats retenus et à proposer des perspectives à ce travail.

I.A Rôle de la protéine à F-Box FB2 chez la tomate

Peu de données sont disponibles dans la littérature sur ce gène candidat. La

fonction de son orthologue chez Arabidopsis (At2g44130), n‟a pas été étudiée, mais il est

classé dans la famille des F-Box contenant un motif kelch répété. Il existe 95 protéines à

F-Box de ce type chez Arabidopsis, et environ une trentaine chez le riz et le peuplier (Xu

et al., 2009). Les motifs kelch sont des segments de 44 à 56 acides aminés caractérisés

par la conservation de huit résidus incluant quatres résidus hydrophobes suivi par deux

résidus de Glycine et deux résidus aromatiques (Adams et al., 2000), impliqués dans les

interactions protéines-protéines. Le motif F-Box de la protéine permettrait l‟interaction

avec les autres composants du complexe SCF, tandis que le motif kelch répété permettrait

de lier une protéine cible à ce complexe afin qu‟elle soit ubiquitinylée et adressée au

protéasome 26S pour être dégradée. Une autre façon d‟avoir quelques pistes sur la

fonction de ce gène candidat serait donc de rechercher les protéines avec lesquelles la

protéine FB2 interagit chez la tomate par la technique du double-hybride (Lalonde et al.,

2008), cette technique ayant été fructueuse dans le cas de plusieurs protéines à F-box chez

Arabidopsis (Risseeuw et al., 2003; Griffiths et al., 2006; Sheard et al., 2010).

Pour ce gène candidat FB2, peu de transformants ont finalement pu être étudiés

(quatre plantes T0 P35S:FB2RNAi et 4 plantes T0 P35S:FB2OE

). De plus, ces plantes T0

présentent de faibles variations d‟expression de FB2 dans les fruits par rapport à la plante

WT puisque l‟expression de ce gène est au maximum diminuée que d‟un facteur 2 dans

les plantes RNAi et est augmentée au maximum d‟un facteur 2,5 dans les plantes sur-

expresseur. Enfin, des phénotypes affectant le développement végétatif de quelques

individus P35S:FB2RNAi ont été observés uniquement dans la descendance de deux lignées

T0 (4 et 7). La poursuite du travail sur ces transformants passe impérativement par la

sélection et l‟étude de plantes transgéniques homozygotes dans lesquelles les phénotypes

observés devront être confirmés. Dans ce but, la récolte des graines des plantes T1 est

actuellement en cours. De plus, la génération d‟un plus grand nombre de plantes

transgéniques parait indispensable, avec une gamme plus large de modification du niveau

d‟expression du gène FB2. L‟identification et la caractérisation de mutants EMS perte de


fonction FB2 permettrait peut-être également de préciser la fonction de cette protéine à F-

Box.

I.B Rôle de la protéine à F-Box FB11 chez la tomate

Le gène candidat FB11 code pour l‟orthologue chez la tomate de la protéine à F-

Box SKIP16 (SKP1/ASK-Interacting Protein16 ; At1g06110) identifiée chez Arabidopsis

thaliana. Les seules données disponibles dans la littérature concernant cette protéine

SKIP16 sont l‟interaction, démontrée par double hybride, avec la protéine ASK2 au sein

d‟un complexe SCF via son motif à F-Box (Risseeuw et al., 2003). Les interactants de

SKIP16 qui seraient ubiquitinylés par ce complexe protéique ne sont pas connus à ce jour.

Chez la tomate, l‟analyse d‟expression de ce gène FB11 a montré que, comme chez le

soja, il est exprimé dans tous les organes de la plante (Libault et al., 2008; Hu et al.,

2009). Cependant, dans le fruit, on note une expression plus forte au moment de l‟anthèse

et surtout au cours du mûrissement.

En génération T1, les transformants sous-exprimant l‟orthologue de tomate de

SKIP16 (P35S:FB11RNAi)

ont montré une altération du développement végétatif des

plantules. En effet, dans plusieurs lignées, les plantules T1 semblent subir un arrêt de leur

croissance après la mise en place de quelques feuilles à partir du méristème apical. Après

quelques jours, un ou plusieurs axes secondaires émergent de l‟hypocotyle et se

substituent à l‟axe principal pour poursuivre le développement de la plante. Ces tiges

secondaires donnent naissance à des inflorescences fertiles permettant le développement

de fruits dont l‟architecture est également très altérée chez plusieurs plantes et semble liée

à une fusion d‟ovaires. Ce phénotype devra avant tout être confirmé et précisé dans les

plantes T2 homozygotes, notamment pour savoir si le développement des tiges

secondaires est une conséquence de l‟arrêt du méristème apical, ou si c‟est une

conséquence directe de la modification d‟expression du gène FB11. En effet, chez

Arabidopsis, il a été montré que la protéine à F-Box MAX2 (At2g42620) était impliquée

dans la répression du développement des bourgeons axillaires (Stirnberg et al., 2002).

Cependant cette protéine à F-Box MAX2 ne présente aucune homologie de séquence avec

FB11 ou SKIP16.

Avec les données dont nous disposons actuellement, qui demandent cependant à

être confirmées, nous pouvons émettre l‟hypothèse que la protéine à F-Box FB11 pourrait

être impliquée dans le maintien du méristème apical des tiges (SAM pour Shoot Apical


Meristem) chez la tomate. Le SAM permet la génération des feuilles, des tiges et des

structures florales tout au long du développement de la plante. Au niveau du SAM, la

plante maintient en permanence une population de cellules souches tout en initiant le

développement de feuilles (Barton, 2009). Cette régulation très complexe implique

différents facteurs de transcription ainsi que l‟action de l‟auxine et des cytokinines. Bien

que les voies de signalisation par les hormones soient connues pour passer par une

dégradation protéolytique impliquant des protéines à F-Box (Vanneste and Friml, 2009;

Gfeller et al., 2010; Tan and Zheng, 2009), aucune implication de protéines à F-Box ne

semble avoir été mise en évidence à ce jour dans la régulation du SAM. Les mutants

affectés au niveau du SAM, chez la tomate (Shani et al., 2009) comme chez Arabidopsis

(Barton, 2009) provoquent souvent des phénotypes au niveau du développement des

feuilles ou de la phyllotaxie de la plante. Dans les transformants P35S:FB11RNAi

, seules les

cellules souches du méristème semblent être affectées, les feuilles qui se développent sur

les tiges secondaires étant parfaitement normales.

Pour progresser dans la caractérisation fonctionnelle de cette protéine à F-Box de

tomate, le travail se poursuivra par une caractérisation fine de ces phénotypes dans les

plantes homozygotes T2. Là encore, la recherche des interactants de la protéine FB11

serait complémentaire de l‟approche de transgénèse, pour donner des pistes quand aux

voies de régulation dans lesquelles cette protéine est impliquée.

I.C Rôle de la protéine à F-Box FB12 chez la tomate

FB12 est l‟orthologue chez la tomate du gène FKF1 (FLAVIN-BINDING

KELCH DOMAIN F BOX PROTEIN 1) largement décrit chez Arabidopsis thaliana

(Nelson et al., 2000). FKF1 est impliqué dans le contrôle circadien de la floraison, en

permettant la dégradation de CDF1 (Cycling Dof Factor 1), un répresseur du gène CO

(CONSTANS) dont le produit régule la transcription du gène FT ou FLOWERING

LOCUS T (pour revue Demarsy and Fankhauser, 2009). Il existe 75% d‟identité de

séquence entre les protéines FKF1 et FB12 et les trois domaines protéiques dont la

fonction a été décrite chez FKF1 sont bien conservés dans la protéine de tomate: (i) un

domaine LOV (Light Oxygen Voltage) qui est impliqué dans la perception du signal

lumineux et qui permet l‟interaction de FKF1 avec GI (GIGANTEA) nécessaire à la

dégradation de CDF1 (Sawa et al., 2007), (ii) un motif F-Box nécessaire à l‟interaction

avec les autres partenaires du complexe SCF E3 ligase, et (iii) un motif kelch répété


participant à l‟interaction avec une autre protéine, probablement la protéine

spécifiquement ciblée par cette F-Box.

Contrairement à Arabidopsis thaliana qui est une plante de jours longs, la tomate

est une plante pour laquelle la floraison est indépendante de la photopériode. Cependant,

il semblerait que des processus commun de régulation par la lumière puissent exister

entre Arabidopsis et la tomate. En effet, la floraison de certains cultivars de tomate est

sensible à des variations des conditions lumineuses (Lozano et al., 2009). Par ailleurs, il a

été montré que le gène SFT, l‟orthologue chez la tomate du gène FT d‟Arabidopsis, est

impliqué dans la régulation de la floraison chez la tomate (Lifschitz and Eshed, 2006).

Enfin, la surexpression comme le silencing du photorécepteur de lumière bleue CRY2

entraine une modification de floraison, suggérant une implication de ce signal lumineux

dans le floraison chez la tomate (Giliberto et al., 2005). Au cours de ce travail, la

caractérisation phénotypique des plantes P35S:FB12RNAi

a été réalisée en serre, dans des

conditions lumineuses non contrôlées. Il serait probablement nécessaire de cultiver ces

plantes dans des conditions lumineuses contrôlées, et de les soumettre à des stress

lumineux afin de rechercher d‟éventuels phénotypes. Par ailleurs, des analyses

d‟expression de l‟orthologue du gène CO dans ces transformants de tomate permettrait

peut-être de relier FB12 aux processus de perception de la lumière dans cette plante.

Enfin, comme dans le cas des autres protéines à F-Box, l‟identification des protéines

interagissant avec FB12 apparait nécessaire pour pouvoir interpréter les phénotypes

observés sur les fruits des transformants générés.

I.D Rôle de la protéine à F-Box FB24 chez la tomate

Le gène candidat FB24 est l‟orthologue de tomate le plus proche du gène AFB5

(AUXIN F-BOX PROTEIN 5) d‟Arabidopsis thaliana. Ce gène est l‟un des cinq

homologues de TIR1 (TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1) décrit comme étant

impliqué dans la signalisation auxinique. TIR1 et AFB5 sont les protéines à F-Box d‟un

complexe SCF qui, en présence d‟auxine, va permettre la dégradation de protéines

AUX/IAA qui sont des répresseurs des gènes de réponse à l‟auxine ARF (AUXIN

RESPONSE FACTOR) (Dharmasiri et al., 2005). Cependant, AFB5 est un homologue

distant de TIR1-AFB1-AFB2-AFB3, ces quatre protéines ayant des fonctions qui se

recouvrent (Dharmasiri et al., 2005), et sa fonction n‟a pas été étudiée chez Arabidopsis.

Un travail récent a montré que si TIR1 et ses homologues sont impliqués dans la

perception de molécules auxiniques telles que l‟acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-


D) et l‟acide indole-3-acétique (IAA) (Ruegger et al., 1998), AFB5 semble pouvoir lier

d‟autres classes de molécules auxiniques comme les picolinates (Walsh et al., 2006).

Les plantes transgéniques P35S:FB24RNAi

de génération T1 sont en serre

actuellement, et nous n‟avons pas encore mis en évidence de phénotype particulier. La

sélection de plantes homozygotes pourra être réalisée dans les prochains mois, sur

lesquelles une éventuelle modification de la réponse à l‟auxine pourra être recherchée. Si

un phénotype d‟intérêt était mis en évidence dans ces plantes transgéniques, le travail

pourrait se poursuivre par une caractérisation fine de ces phénotypes et l‟analyse

fonctionnelle du gène FB24 pourrait être complétée avec les outils disponibles par comme

la recherche d‟interactants et des approches spécifiques pourraient être mises en œuvre

selon le phénotype mis en évidence.

II. Caractérisation fonctionnelle d’un homologue de tomate d’AtGEM

(Glabra2-Expression Modulator)

Le but de cette étude était d‟initier la caractérisation fonctionnelle du gène

SlGEM1 dont le niveau d‟expression était corrélé à la taille des cellules dans le fruit de

tomate. En effet, les analyses du transcriptome et de cytologie réalisées sur le mésocarpe

et le tissu loculaire du fruit de tomate au cours de la phase d‟expansion cellulaire avaient

montré que la le niveau d‟expression de ce gène, orthologue du gène AtGEM

d‟Arabidopsis, était corrélé à la taille des cellules dans ces tissus.

Chez Arabidopsis thaliana les protéines GEM/GEM-like forment une petite

famille multigénique qui contient neuf membres: AtGEM, AtFIP1 et sept protéines

annotées comme AtGEM-like 2 à 8. AtGEML3 et AtFIP1 sont les plus proches

homologues de AtGEM avec respectivement 69 % et 52 % d‟identité de séquence au

niveau protéique. Chez la tomate, cinq unigènes codant pour des protéines GEM/GEM-

like ont été identifiés, dont SlGEM1 qui présente 57% d‟identité de séquence avec

AtGEM. SlGEM2 et SlGEM3 sont les plus proches homologues de SlGEM1 avec

respectivement 65 % et 56 % d‟identité de séquence au niveau protéique. Au niveau

nucléotidique, les séquences codantes de SlGEM1, SlGEM2 et SlGEM3 présentent

également des zones très conservées. On peut penser que les résultats d‟hybridation

obtenus dans les analyses d‟expression en microarrays pourraient résulter d‟une

hybridation croisée des transcrits correspondant à ces trois gènes, les microarrays ayant

été utilisés pour cette analyse étant les lames à ADNc TOM1 (Alba et al., 2004).

Cependant, les données disponibles dans les banques d‟EST de tomate suggèrent que le


gène SlGEM2 est très peu exprimé par rapport à SlGEM1 et SlGEM3, car il n‟est

représenté que par 3 EST contre 17 EST pour SlGEM1 et 20 EST pour SlGEM3. Selon

ces données, le gène SlGEM3 présenterait un profil d‟expression voisin de SlGEM1. Les

analyses d‟expression que nous avons réalisées par qRT-PCR avec des amorces

spécifiques de chaque gène confirment des différences d‟expression entre SlGEM1 et

SlGEM2, et ces résultats devront être complétés par une analyse d‟expression de SlGEM3

ainsi que par l‟analyse de l‟activité des promoteurs de ces trois gènes en fusion

transcriptionnelle avec le gène rapporteur GUS.

Parmi les protéines GEM/GEM-like d‟Arabidopsis seules les protéines AtGEM et

AtFIP1 ont fait l‟objet d‟une caractérisation fonctionnelle. Il est à noter que le gène

AtFIP1 (At1g28200) est incorrectement annoté dans la base de données du TAIR,

notamment en ce qui concerne ses « autres noms », car il existe différentes protéines

d‟Arabidopsis appelées FIP1. Un blastN au NCBI avec la séquence codante de ce gène

nous a permis de retrouver la séquence partielle d‟ADNc originellement identifiée pour ce

gène, ainsi que la publication correspondante (AF174428 (Banno and Chua, 2000).

AtFIP1 est une protéine qui a été identifiée comme interactant de la protéine AFH1 pour

Arabidopsis Formin Homology par un crible double-hybride. Le rôle de AtFIP1 n‟a pas

été étudié, cependant, différents travaux ont été menés sur la protéine AFH1 et suggèrent

que cette protéine jouerait un rôle central dans l‟initiation et l‟organisation des filaments

d‟actine (Michelot et al., 2005), sa surexpression entrainant une modification des

filaments d‟actine dans le tube pollinique (Cheung and Wu, 2004). Concernant la protéine

AtGEM, les données disponibles montraient son implication dans la coordination de la

prolifération et la différenciation des cellules (Caro et al., 2007), deux processus

particulièrement importants pour le développement du fruit de tomate, et pouvant jouer

un rôle dans le déterminisme de la taille des cellules du fruit. C‟est cette fonction

attribuée à la protéine AtGEM qui a guidé notre choix de gène candidat vers le gène

SlGEM1. Cependant, l‟analyse fonctionnelle des gènes SlGEM2 et SlGEM3 ainsi que la

génération de lignées transgéniques ciblant l‟extinction des gènes SlGEM1, SlGEM2 et

SlGEM3 est également une des perspectives de ce travail.

Au cours de ce travail de thèse, je me suis donc orienté vers la caractérisation

fonctionnelle de SlGEM1, le plus proche homologue de AtGEM chez la tomate. J‟ai

étudié l‟expression du gène SlGEM1 dans différents organes chez la tomate. Puis j‟ai

généré des lignées transgéniques homozygotes sur-exprimant SlGEM1 (2 lignées


homozygotes P35S :SlGEM1OE

) ou silencées pour SlGEM1 (8 lignées homozygotes

P35S :SlGEM1RNAi

). Par ailleurs, des familles de plantes mutées au niveau du gène

SlGEM1 ont été identifiées par TILLING : un mutant KO (expression d‟une protéine

tronquée, famille P14H2) et trois mutants avec une modification d‟un acide aminé V16-

>E (famille P11A1), E104->K (famille P15H1) et V15->I (famille P18H12). Pour ces

familles EMS, j‟ai généré une (P14H2-12) ou deux plantes homozygotes (P11A1-6 et -12,

P15H1-5-12 et -15-9 et P18H12-2 et -18). Les premiers résultats qui ont été obtenus au

cours de cette thèse avec la caractérisation des plantes transgéniques et des mutants EMS

vont être discutés dans les paragraphes suivant, d‟après les données existant sur la

protéine AtGEM et les données disponibles chez la tomate.

II.A Implication de SlGEM1 dans la régulation du cycle cellulaire ?

Initialement, AtGEM a été identifié dans un criblage par double-hybride visant à

trouver des protéines interagissant avec CDT1, un facteur impliqué chez les eucaryotes

dans le contrôle de l‟initiation de la réplication de l‟ADN durant les phases M et G1 du

cycle cellulaire (pour revue Arias and Walter, 2007). Il a été montré que, lors des phases

S et G2 du cycle cellulaire, CDT1 devait être inactivé afin de prévenir une ré-initiation de

la synthèse d‟ADN. Chez les animaux, cette inactivation de CDT1 se fait par

l‟intermédiaire de son association avec Geminin (Wohlschlegel et al., 2000), une protéine

qui n‟existe pas chez les végétaux, chez lesquels elle serait remplacée par la protéine

GEM (Caro and Gutierrez, 2007). GEM et Geminin seraient donc deux protéines jouant

un rôle analogue chez les plantes et chez les animaux, placées à un point de contrôle du

cycle cellulaire (Caro and Gutierrez, 2007). En lien avec cette fonction, il a été montré

chez Arabidopsis qu‟une sur-expression de AtGEM entrainait une diminution de la

division cellulaire des cellules épidermiques tandis qu‟une diminution de son expression

entrainait une augmentation des divisions cellulaires.

A l‟heure actuelle nous ne disposons pas d‟éléments permettant d‟attribuer à

SlGEM1 un rôle dans la régulation de la division cellulaire, comme c‟est le cas pour la

protéine d‟Arabidopsis. En effet, les transformants générés au cours de ma thèse, sur-

exprimant ou silençant SlGEM1, n‟ont pas présenté de phénotype suggérant une

modification de la division cellulaire, que ce soit au niveau des organes végétatifs ou au

niveau du fruit. Dans cet organe, les divisions cellulaires après l‟anthèse sont localisées

dans les couches cellulaires épidermiques (divisions anticlinales), permettant ainsi une

augmentation du diamètre du fruit, et dans les couches sous-épidermiques (divisions


périclinales) permettant une augmentation du nombre de couches cellulaires dans le fruit

(Cheniclet et al., 2005). Les fruits des plantes transgéniques affectées dans l‟expression

de SlGEM1 ne sont pas affectés au niveau de leur taille et l‟observation de coupes de

fruits récoltés au stade breaker issus de différentes plantes homozygotes (P35S :SlGEM1OE

5-2 et P35S :SlGEM1RNAi

5-3, 6-8 et 8-5) n‟a pas révélé de modification du nombre

d‟assises cellulaires dans les fruits. De même, l‟analyse de ploïdie des fruits de ces

lignées par cytométrie en flux n‟a pas montré de différences significatives avec les fruits

des plantes de type sauvage, alors que plusieurs études réalisées au laboratoire ont montré

qu‟une modification d‟expression de gènes régulateurs du cycle cellulaire pouvait

entraîner une variation du niveau de ploïdie dans les fruits des transformants générés

(Gonzalez et al., 2007; Mathieu-Rivet et al., 2010).

Cependant, ces premiers résultats ne sont pas définitifs. En effet, on peut noter que

chez Arabidopsis les modifications de division cellulaire ont été observées dans des

couches cellulaires très particulières comme les cellules épidermiques racinaires (Caro et

al., 2007), qui n‟ont pas été observées dans nos transformants. Par ailleurs, les

observations microscopiques de fruits que nous avons réalisées n‟ont été effectuées que

sur la première série de lignées homozygotes disponibles (P35S :SlGEM1OE

5-2 et

P35S :SlGEM1RNAi

5-3, 6-8 et 8-5), l‟observation des autres plantes transgéniques

homozygotes permettrait peut-être de mettre en évidence des modifications au niveau de

la division cellulaire dans les fruits. Enfin, contrairement aux lignées transgéniques

générées, les mutants EMS identifiés présentent une diminution de taille du fruit, ce qui

pourrait être dû à une altération du nombre ou de la taille des cellules dans le fruit. Une

analyse cytologique des fruits de ces mutants EMS pourrait donner des résultats

intéressants. Ces résultats devront toutefois être analysés avec prudence car les fruits de

ces plantes contiennent un nombre réduit de graines et on sait que la taille du fruit de

tomate est lié au nombre de graines qu‟il contient (Varga and Bruinsma, 1986), celles-ci

étant source de signaux hormonaux nécessaires au développement du fruit (Ozga and

Reinecke, 2003).

II.B Implication de SlGEM1 dans la différenciation cellulaire ?

En complément de son rôle dans le contrôle de la prolifération cellulaire, AtGEM

est impliqué dans le contrôle de la différenciation des cellules épidermiques en trichomes

dans les feuilles et en poils racinaires dans les racines (Caro et al., 2007). Cette régulation


passe par une répression de l‟expression de GLABRA2 (GL2) et CAPRICE (CPC), deux

gènes impliqués dans la différenciation des cellules épidermiques, dont l‟expression est

régulée par un complexe multi-protéique comprenant TTG1 (TRANSPARENT TESTA

GLABRA1), GL3 (GLABRA3), EGL3 (ENHANCER OF GLABRA3) et WER

(WEREWOLF) (Caro et al., 2007).

Chez la tomate, la modification de l‟expression de SlGEM1 ou l‟expression d‟une

protéine SlGEM1 tronquée ne semble pas affecter la différenciation des cellules

épidermiques racinaires ou foliaires puisque aucune différence n‟a pu être notée entre les

feuilles/racines de transformants ou de mutants SlGEM1 et celles d‟un contrôle WT. Ce

résultat n‟est pas nécessairement surprenant car les trichomes d‟Arabidopsis et de tomate

sont des structures très différentes et des auteurs ont suggéré que les voies impliquées

dans leur différenciation seraient elles-aussi différentes (Serna and Martin, 2006). De

même, une étude des méristèmes racinaires a mis en évidence l‟absence de trichoblastes,

les cellules de l‟épiderme racinaire se différenciant en poils racinaires, chez la tomate

(Clowes, 2000), contrairement à la situation décrite chez Arabidopsis. On peut donc

émettre l‟hypothèse que chez la tomate, la protéine SlGEM1, pourrait être impliqué dans

des processus de différenciation différents de ceux décrit chez Arabidopsis pour la

protéine AtGEM, qui restent encore à mettre en évidence, même si les familles de plantes

EMS mutées au niveau du gène SlGEM1 semblent fournir quelques pistes.

II.C Implication de SlGEM1 dans le développement du pollen et du fruit ?

En effet, si nous n‟avons noté à l‟heure actuelle aucun phénotype au niveau des

fruits des plantes transgéniques P35S :SlGEM1OE

et P35S :SlGEM1RNAi

, les plantes des

quatre familles présentant une mutation ponctuelle dans la séquence du gène SlGEM1 ont

toutes présenté une modification de diamètre, de poids et de quantité de graines produites

par le fruit. De plus une graduation des phénotypes a été observée, cohérente avec la

sévérité de la mutation. Les plantes les plus affectées sont les plantes de la famille P14H2

qui produisent une protéine SlGEM1 tronquée à 68 acides aminés au lieu de 300, puis les

plantes de la famille P15H1 pour lesquelles la mutation entraîne un double changement

de charge puisque l‟acide glutamique (résidu acide) 104 est changé en lysine (résidu

basique), et les plantes de la famille P11A1 pour lesquelles la mutation entraîne un simple

changement de charge puisque la valine 16 est changé en acide glutamique (résidu acide).

Les plantes les moins affectées sont celles de la famille P18H12 pour lesquelles la valine

15 est changée en isoleucine ce qui n‟entraine aucune modification de charge mais une


modification modérée de l‟encombrement stérique avec l‟ajout d‟un CH3- sur la chaine

latérale. On peut penser que ces modifications, selon l‟endroit où elles sont placées dans

la protéine, vont perturber le fonctionnement normal de la protéine SlGEM1 et

notamment son interaction avec d‟autres partenaires dans des complexes protéiques. La

caractérisation de ce type de mutant peut-être plus informative que celles de lignées

RNAi, dans lesquelles seule la quantité de protéine SlGEM1 est affectée, ce qui peut

n‟avoir aucune conséquence fonctionnelle selon le niveau de protéine requit et la

possibilité d‟une complémentation fonctionnelle par d‟autres protéines.

Une caractérisation plus approfondie des plantes homozygotes KO nous a permis

de relier ce phénotype de taille de fruit et de nombre de graines à une altération de la

structure de la fleur et à une diminution du taux de germination du pollen. Un tel

phénotype de stérilité du pollen n‟est pas rare chez la tomate. Il a en effet été récemment

décrit dans des plantes transgéniques affectées au niveau du métabolisme des sucres

(Nashilevitz et al., 2009; Zanor et al., 2009) comme dans des plantes affectées au niveau

de la signalisation par l‟acide jasmonique (Li et al., 2004). D‟une façon plus générale, le

développement d‟un grain de pollen fonctionnel est un processus complexe qui est régulé

à de multiples niveaux et nécessite la coordination des différents types cellulaires qui

composent l‟anthère (Wilson and Zhang, 2009). Une protéine SlGEM1 fonctionnelle

pourrait être requise pour la régulation des divisions mitotiques ayant lieu dans les

anthères pour donner naissance aux cellules mères du pollen et aux couches cellulaires

pariétales (tapis et endothécium). Par ailleurs, une protéine SlGEM1 fonctionnelle

pourrait être requise pour la régulation de complexes tripartite de facteurs de transcription

WD-40/bHLH/MYB, similaires au complexe TTG1/GL3, EGL3/WER, ce type de

facteurs de transcription étant décrits comme impliqués dans la régulation du

développement du tapis et la formation de la paroi du grain de pollen (Wilson and Zhang,

2009). A l‟heure actuelle les possibilités sont très larges et une caractérisation plus

approfondie des mutants est nécessaire afin de préciser l‟origine du phénotype observé.

Dans un premier temps, une analyse cytologique des anthères et des grains de pollen

pourrait être envisagée. De plus, une étude de la sensibilité aux hormones (acide

jasmonique, auxine) qui sont impliquées dans le développement du pollen (Wilson and

Zhang, 2009) devrait compléter cette caractérisation.

Ces premiers résultats obtenus sur les mutants KO devront également être

confirmés sur les autres mutants EMS, et les phénotypes également recherchés dans les

plantes transformées RNAi. En ce qui concerne les mutants EMS, la confirmation du rôle


de la mutation du gène SlGEM1 dans le phénotype observé passe par un nettoyage des

mutants. En effet, les collections de mutants EMS destinés au TILLING sont mutées à

saturation de façon à ce que plusieurs mutants alléliques soient disponibles pour chaque

gène. En conséquence chaque plante de la collection porte un grand nombre de mutations

(Henikoff et al., 2004; Minoia et al., 2010). Dans le cas de la collection EMS Micro-Tom

qui a été utilisée dans cette étude, la fréquence de mutations varie de ~1 mutation/200 kb

à ~1 mutation/500 kb suivant la région génomique analysée (Cécile Bres, communication

personnelle). La taille du génome de la tomate étant de 950 Mb, le nombre de mutations

présentes par plante est probablement de quelques milliers (2000-4000). En théorie, 12

rétro-croisements avec le WT seraient donc nécessaires pour éliminer toutes les mutations

non désirées et non liées au gène SlGEM1. Cependant, des travaux réalisés sur chez

Arabidopsis et d‟autres espèces ont montré que dès la génération M3 ou M4, les

phénotypes observés pouvaient être associés sans équivoque à la mutation étudiée

(Henikoff et al., 2004). In fine, la complémentation du phénotype dans des plantes mutées

homozygotes transformées avec une construction SlGEM1OE

permettra d‟éliminer

définitivement l‟hypothèse selon laquelle un autre locus lié au gène SlGEM1serait

responsable du phénotype. Le «nettoyage» des plantes a été initié pour les sept individus

homozygotes identifiés.

II.D Mécanisme moléculaire d’action de SlGEM1

Chez Arabidopsis, la mécanistique des régulations impliquant la protéine AtGEM

n‟est pas complètement élucidée. Cependant, il a été montré que sa fonction passe par des

interactions protéine-protéine avec CDT1 pour la régulation du cycle cellulaire et TTG1

pour la régulation de la différenciation des trichomes et des poils racinaires, ces

interactions ayant lieu au niveau de la moitié N-terminale de AtGEM (acides aminés 1-

170) (Caro et al., 2007). La moitié C-terminale de AtGEM (acides aminés 175-252),

contenant un domaine GRAM, serait quant à elle impliquée dans la spécification des

cellules épidermiques (Caro et al., 2007). Il semblerait que l‟effet régulateur de AtGEM

sur l‟expression des gènes GL-2 et CPC passe par une interaction directe de GEM avec

TTG1 au niveau des promoteurs de ces gènes cibles. Par ailleurs, il a été montré que le

statut des marques épigénétiques de l‟histone H3 était modifié en amont de l‟ORF des

gènes GL-2 et CPC (Caro et al., 2007).

Les résultats que nous avons obtenus à ce jour chez la tomate ne permettent pas de

proposer un rôle pour la protéine SlGEM1. Afin de progresser dans l‟analyse


fonctionnelle de cette protéine, il parait indispensable de rechercher les protéines avec

lesquelles elle va interagir chez la tomate par la technique du double-hybride (Lalonde et

al., 2008). Dans un premier temps, une analyse ciblée pourra être réalisée avec les

homologues de tomate des interactants connus chez Arabidopsis thaliana (CDT1 et

TTG1). Cependant, si les processus de régulation sont différents chez la tomate, c‟est un

criblage sans à priori qui devra être réalisé. Pour cela nous disposons au laboratoire de

deux banques de double-hybride d‟ADNc de fruits de tomate en phase de division

cellulaire (ovaires de l‟anthèse à 5 JAA) et de fruits de tomate en phase d‟expansion

cellulaire (péricarpe à 20 JAA) (Nafati et al., 2010). Si le phénotype de stérilité du pollen

se confirme, un criblage d‟une banque d‟ADNc d‟étamines permettrait de cibler les

interactions spécifiques à cette problématique. Si des interactants sont mis en évidence

par le crible double-hybride, l‟effet sur cette interaction des mutations ponctuelles de

SlGEM1 trouvées dans les plantes EMS devra être étudié, ces mutations se situant dans la

région N-terminale de la protéine, zone d‟interaction décrite pour AtGEM et TTG1 ou

CDT1. De même, il faudra déterminer si SlGEM2 et/ou SlGEM3 peuvent remplir la

même fonction que SlGEM1 en interagissant avec ses partenaires protéiques. En effet,

une telle complémentation fonctionnelle pourrait expliquer l‟absence de phénotype

observé dans les plantes P35S :SlGEM1RNAi

et la présence de phénotypes dans les plantes

mutantes EMS, dans lesquelles la protéine SlGEM1, est toujours produite, mais sous une

forme altérée.

Au cours de ce travail, nous avons pu montrer que, comme c‟est le cas dans le

transformant gem-1

d‟Arabidopsis (Caro et al., 2007), l‟expression de SlTTG1 est

augmentée dans deux lignées RNAi (lignées 9-4 et 12-2). Afin de compléter ce résultat,

une analyse d‟expression ciblée sur les autres gènes régulés par AtGEM pourra être

réalisée dans ces transformants de tomate (homologues chez la tomate de CPC et de GL-

2). Cependant, si les processus régulés chez la tomate par SlGEM1 sont différents de ceux

régulés par AtGEM chez Arabidopsis, une approche d‟analyse de transcriptome non

ciblée devra être envisagée afin de trouver les cibles régulées par SlGEM1. A cet égard, le

développement des nouvelles générations de technologies de séquençage («next-

generation sequencing technologies», Metzker, 2010) et leur utilisation pour l‟étude du

transcriptome est un outil particulièrement puissant pour les analyses d‟expression

maintenant que le génome de la tomate est disponible (International Tomato Sequencing

Project, http://solgenomics.net/).

http://solgenomics.net/


Un de mécanismes de l‟action régulatrice de AtGEM semble passer par une

régulation épigénétique (Caro et al., 2007). Au cours de ce travail de thèse, une des

lignées générées (P35S :SlGEM1RNAi

-6) a présenté un phénotype filiforme de type « wiry »

(Kim et al., 2003), caractérisé par une absence de développement du limbe, des pétales et

des sépales. Ce phénotype, étant apparu à la génération T1 dans des proportions non-

mendéliennes, puis ayant été transmis à la génération T2 toujours dans des proportions

non-mendéliennes (ie à 10 à 20 % de la descendance pour un T1 donné), nous a évoqué

une mutation épigénétique. Cependant, seules les plantes issues de la lignée

P35S :SlGEM1RNAi

-6 ont présenté ce phénotype, il n‟a été retrouvé ni dans les sept autres

lignées générées, ni dans les mutants EMS et est donc probablement dû à une mutation

insertionnelle. Le séquençage des régions flanquantes à la zone d‟insertion du transgène

permettrait de répondre à cette question.

Les différentes fonctions de la protéine AtGEM sous-entendent une localisation

nucléaire. Or les analyses bioinformatiques que nous avons réalisées d‟après les

séquences protéique de AtGEM et de SlGEM1, ne prédisent pas la présence de signal de

localisation dans le noyau (ou NLS pour « nuclear localization signal »). Même si les

protéines de petites tailles peuvent diffuser dans le noyau par les pores nucléaires, la

présence d‟un signal de localisation nucléaire est indispensable pour un adressage

efficace de la protéine (Schlenstedt, 1996) Les signaux NLS sont caractérisés par des

motifs de résidus basiques Arginine et Lysine présent dans la protéine, mais si des

motifs « canoniques » sont actuellement décrits dans la littérature et recherché par les

programmes de prédiction, il existe également d‟autres motifs (Christophe et al., 2000),

en particulier chez les végétaux (Krebs et al., 2010). Pour la protéine AtGEM, il n‟existe à

notre connaissance aucune preuve de sa localisation nucléaire. Pour étudier la localisation

cellulaire de la protéine SlGEM1, nous avons réalisé des constructions permettant une

fusion traductionnelle avec la GFP en N-terminal et en C-terminal de la protéine entière et

tronquée à 69 acides aminés.


CONCLUSION

Au cours de ces trois années de thèse, le travail que j‟ai réalisé a permis de mettre

au point de nouveaux outils pour l‟analyse fonctionnelle de gènes candidat dans le fruit de

tomate et d‟explorer, sans toutefois le succès escompté, le rôle de nouveaux régulateurs

potentiel du développement du fruit. J‟ai généré de nombreuses lignées transgéniques

pour quatre gènes codant pour des protéines à F-Box et la protéine SlGEM1 et sélectionné

des plantes mutantes EMS. La caractérisation de ces différentes lignées étant très

préliminaire, elle offre la voie à de nombreuses perspectives. Cependant, les gènes

candidats les plus pertinents devront être choisis pour la poursuite du travail, en accord

avec l‟axe de recherche principal du laboratoire qui porte sur le développement du fruit.

Chapitre 4 : MATÉRIELS ET MÉTHODES

Matériels et Méthodes 97

Chapitre 4 : MATERIELS ET METHODES

I. Matériel biologique

I.A Matériel végétal et conditions de cultures

La variété de tomate (Solanum lycopersicum) Micro-Tom a été utilisée pour cette

étude en tant que contrôle (WT) et pour la génération de plantes transgéniques. Les plants

de tomate ont été cultivés en serre dans des pots de 9 x 9 x 7 cm ou des pots d‟un litre

contenant du terreau Agrofino® (Peltracom) avec un arrosage en sub-irrigation 2 fois par

semaine par une solution nutritive à pH 5,8 (KNO3 3,5 mM, K2SO4 1 mM, KH2PO4 2

mM, Ca(NO3)2 6 mM, MgSO4 2 mM) jusqu‟à la mise à fruit. Par la suite, la fréquence

d‟arrosage reste identique mais la solution nutritive est composée de KNO3 4 mM, K2SO4

1,5 mM, KH2PO4 1,5 mM, Ca(NO3)2 4 mM, MgSO4 1,5 mM.

La culture pour la sélection des plantes transgéniques s‟est effectuée en chambre

de culture avec une photopériode de 14 h de lumière et 10 h d‟obscurité, une

thermopériode de 25°C le jour et 20°C la nuit. La sélection s‟est faite sur des graines

préalablement stérilisées pendant dix minutes dans une solution d‟hypochlorite de sodium

à 3,2 % de chlore actif puis rincées avec de l‟eau stérilisée. La germination et le

développement des plantules s‟effectue sur du milieu MS ½ (tableau 4) additionné de

150 mg/L de kanamycine.

Pour les analyses d‟expression dans la plante WT, une culture de 40 plantes a été

réalisée. Les fleurs ont été baguées au moment de l‟anthèse et des fruits en

développement récoltés à l‟anthèse (0 JAA), puis à 4, 8, 12, 20, 27 et 35 JAA (vert

mature). Les stades de mûrissement du fruit ont été repérés par rapport au stade Breaker.

Par ailleurs, des jeunes feuilles, des feuilles matures, tiges et racines ont été collectés,

ainsi que les différents organes des fleurs au moment de l‟anthèse : pétales, sépales,

étamines, pistil. Quatre réplicats biologiques ont été récoltés pour tous les échantillons,

sauf pour la fleur et le fruit à l‟anthèse pour lequel nous ne disposons que d‟un réplicat

biologique, congelés dans l‟azote liquide puis broyés et stockés à – 80°C.

Pour les analyses d‟expression dans les plantes transgéniques, les péricarpes de

fruits ont été récoltés au stade breaker. Un seul échantillon biologique a été collecté

contenant au minimum 3 fruits, congelé dans l‟azote liquide puis broyé et stocké à –

80°C.


Tableau 4 Composition des milieux utilisés pour la culture des plantes

Milieu de culture Composition

MS MS (Including vitamins, Duchefa , MO222) 4,4 g/L

Saccharose 30 g/L

Phytoagar 8 g/L

pH 5,8

MS 1/2 MS (Including vitamins, Duchefa , MO222) 2,2 g/L

Saccharose 15 g/L

Phytoagar 5 g/L

pH 5,8

Pré-culture Milieu MS additionné de :

KH2PO4 200 mg/L

Thiamine 0,9 mg/L

Acétophenone 200 µM

2,4 D 200 µg/L

Kinétine 100 µg/L

Régénération Milieu MS additionné de :

Zéatine Riboside (Duschefa) 2 mg/L

Vitamine de Nitsch 1X

Timentin (Duschefa) 250 mg/L puis 150 mg/L

Kanamycine (Duschefa) 100 mg/L

Enracinement MS (Basal salt, Duchefa MO221) 2,2 g/L

Saccharose 10 g/L

Phytoagar 5 g/L

Vitamine de Nitsch 1X

Timentin (Duschefa) 75 mg/L puis 150 mg/L

Kanamycine (Duschefa) 150 mg/L

Vitamines de Nitsch Biotine 0,05 mg/l

Acide folique 0,5 mg/l

Glycine 2 mg/l

Myo-inositol 100 mg/l

Acide nicotinic 5 mg/l

Pyridoxine HCl 0,5 mg/l

Thiamine HCl 0,5 mg/l

I.B Souches bactériennes et milieu de culture

La souche DH5α™ F-(U169recA1, hsdR17, complémentation lacZα, Invitrogen)

est utilisée pour l‟amplification des vecteurs de clonage et des plasmides recombinants


utilisés dans cette étude. Les souches d‟Agrobacterium tumefaciens GV3101 et 1D1249

ont été utilisées pour la transformation stable ou transitoire des plantes. Elles possèdent

un plasmide Ti ("Tumor inducing") désarmé contenant les gènes de virulence Vir

permettant la translocation de l‟ADN de transfert (ADN-T) dans le noyau et son insertion

dans l'ADN génomique des cellules végétales.

Toutes les souches bactériennes sont cultivées sous agitation (150 rpm) dans du

milieu LB [Bactotryptone 1% (p/v) ; extrait de levure 0,5% (p/v) ; NaCl 1% (p/v)] en

présence ou non d‟antibiotique et à la température de 37°C pour les souches DH5α™ et

de 28°C pour A. tumefaciens. Pour les milieux solides, 15 g.L-1 d‟agar bactériologique

sont ajoutés. La stérilisation des milieux est effectuée par autoclavage pendant 20 min à

120°C.

II. Méthodes d’analyse des acides nucléiques

II.A Extraction d’ADN génomique

L‟ADN génomique de tomate est extrait selon un protocole dérivé du protocole

décrit par Murray et Thompson (Murray and Thompson, 1980), destiné à la purification

d‟ADN génomique destiné à la réalisation de PCR. Les feuilles de tomate (100 mg de MF

congelée) sont broyées à l‟aide d‟un pilon dans un mortier en présence d‟azote liquide. Le

broyat (100 mg) est ajouté à un tube contenant 500 µL de tampon d‟extraction préchauffé

à 65°C (Tris-HCl 220 mM pH 8, EDTA 22 mM pH 8, NaCl 800 mM, sorbitol 140 mM,

CTAB 12 mM et Sarcosyl 1%). Le mélange est homogénéisé en agitant énergiquement, il

est incubé à 65°C pendant 20 min, puis placé sur la glace pendant 30 min. Après ajout de

500 µL de chloroforme le tube est agité durant 20 min. Après centrifugation (20 min,

6000 g), la phase aqueuse est transférée dans un nouveau tube et 500 µL d‟isopropanol

sont ajoutés. Après 20 min d‟incubation sur la glace, le tube est centrifugé 15 min à 6000

g. Le culot d‟acides nucléiques est séché à l‟air puis repris dans 20 µL de TE (Tris-HCl

10 mM pH 8, EDTA 1 mM pH 8). Un traitement à la RNase (20 µg/mL) est effectué suivi

d‟une déprotéinisation par extraction au phénol-chloroforme (1:1, v/v) suivie d‟une

extraction au chloroforme-alcool isoamylique (24:1, v/v). Les acides nucléiques sont

ensuite précipités à -20°C après ajout d‟éthanol 95% (2,5 volumes) et d‟acétate de sodium

3 M pH 5,7 (1/10 volume). Après centrifugation (45 min, 6000 g), le culot est rincé à

l‟éthanol 70%, séché et repris dans 20 µL de TE. La concentration d‟ADN génomique est

déterminée par spectrophotométrie à 260 nm (1 uA260 nm <-> 50 µg ADN/mL). La


qualité de l‟ADN préparé est analysée par électrophorèse en gel d‟agarose 1% (cf

paragraphe II.E).

II.B Extraction d’ADN plasmidique

L‟ADN plasmidique est extrait en utilisant le kit QIAprep® Spin Miniprep

(Qiagen) selon le protocole du fournisseur. L‟ADN extrait est visualisé après séparation

électrophorétique en gel d'agarose (cf paragraphe II.E) puis quantifié à l‟aide d‟un

spectrophotomètre par mesure de l'absorbance à 260 nm (1 uA260 nm <-> 50 µg

ADN/mL).

II.C Extraction d’ARN

Pour l‟extraction et la manipulation des ARN, toutes les solutions sont traitées

avec du DEPC (diéthyl pyrocarbonate, Sigma) 0,1% (v/v) ou préparées avec de l‟eau

traitée au DEPC. Tout le matériel est nettoyé au chloroforme, rincé à l‟éthanol 100% et

stérilisé par autoclavage pendant 20 min à 120°C.

L‟extraction d‟ARN totaux est réalisée à partir de chaque réplicat biologique

collecté (100 mg de MF en poudre congelée à -80°C) à laquelle est rajouté 1 mL de

TRI®-Reagent (Sigma). Le mélange obtenu est agité au vortex une minute et centrifugé

10 minutes à 12000 g à 4°C. Le surnageant est transféré dans un tube propre et laissé à

température ambiante pendant 5 minutes. Le chloroforme (200 µL) est ajouté et le tout est

agité au vortex une minute et laissé à nouveau 5 minutes à température ambiante. Les

tubes sont ensuite centrifugés 15 minutes à 12000 g à 4°C et 400µL de la phase aqueuse

(supérieure) contenant les ARNs sont récupérés. Après l‟ajout de 400 µL d‟isopropanol,

les tubes sont inversés plusieurs fois pour mélanger la solution et sont ensuite laissés à

température ambiante pendant 10 minutes. Les ARNs sont précipités et récupérés par

centrifugation, 10 minutes à 12000 g à 4°C. Le surnageant est alors éliminé et le culot est

lavé à l‟aide d‟éthanol 70%-eau DEPC. L‟éthanol est ensuite éliminé et le culot est séché

à l‟air avant d‟être repris dans 30 à 50 µL d‟eau DEPC.

La qualité des ARN est analysée par électrophorèse sur gel d‟agarose dans du

TAE 0,5X (TAE 50X: Tris-acetate 2 M, EDTA 50 mM, pH 8.0) et leur concentration est

déterminée par mesure spectrophotométrique à 260 nm (cf paragraphe II.E). L‟éventuelle

contamination des ARN par de l‟ADN génomique est évaluée par PCR. S‟il y a

contamination par de l‟ADN, celui-ci est éliminé par un traitement DNAse.


II.D Traitement DNAse

Le protocole utilisé est fourni par le fournisseur de la TURBO DNA-free™

(Ambion). Aux ARNs obtenus précédemment (45 µL) sont ajoutés 3 µL de tampon et 1

µL de DNAse. Le mélange ainsi obtenu est placé 25 minutes à 37°C. 5 µL de tampon

d‟inactivation sont ajoutés et les tubes sont agités au vortex puis centrifugés 2 minutes à

10000 g. Le surnageant est transféré dans un tube propre et contrôlé comme décrit

précédemment.

II.E Electrophorèse des acides nucléiques

Les extraits d‟ADN, les produits PCR ou les ARN sont analysés par

électrophorèse non dénaturante. Un dixième de volume de tampon de charge [glycérol

30% (v/v), bleu de bromophénol 0,25% (p/v), xylène cyanol 0,25% (p/v)] est ajouté aux

échantillons puis ceux-ci sont séparés en fonction de leur taille sur gel d‟agarose [0,8 à

2% (p/v)] dans du tampon TAE 0.5X (TAE 50X: Tris-acetate 2 M, EDTA 50 mM, pH

8.0). Les fragments d‟ADN sont visualisés avec un Dark Reader® (Clare Chemical

Research) grâce à l‟incorporation de Gel green™ (FluoProbes®

) dilué au 1/50000 dans le

gel d‟agarose lors de sa préparation.

La séparation des fragments d‟ADN sur gel d‟agarose est également utilisée pour

isoler des fragments d‟ADN d‟une taille déterminée (suite à une digestion enzymatique

par exemple). Les fragments d‟ADN sont découpés au scalpel après migration et purifiés

par fixation de l‟ADN sur des billes de silice après dissolution de l‟agarose à 50°C en

utilisant le kit «Qiaex II» de Qiagen, selon les recommandations du fournisseur.

II.F Amplification de séquences nucléiques

II.F.1 Réaction de transcription inverse (RT)

La synthèse des ADN complémentaires (ADNc) est réalisée avec la reverse

transcriptase SuperScript® II selon le protocole du fournisseur (Invitrogen) à partir de 1

µg ou 500 ng d‟ARN totaux. Les ARN totaux sont ajoutés à 100 pmoles de l‟amorce

oligodT et 10 pmoles dNTP dans un volume final de 12 µL. Le mélange est dénaturé

pendant 5 min à 65°C dans un thermocycleur (Crocodile II et III, Appligene) puis

rapidement mis dans la glace. Quatre µL de tampon “First strand ” 5X, 2 µL de DTT 0,1

M et 20 unités de RNasin (Promega) sont ajoutés aux échantillons. Après

homogénéisation, la stabilisation des hybrides amorce/matrice est effectuée durant 5


minutes à 42°C et 1 µL de reverse transcriptase SuperScript® II est ajouté (volume final

de 20 µL). La synthèse des ADNc est réalisée pendant 1h à 42°C. La réaction est stoppée

par inactivation de l‟enzyme à 70°C pendant 15 min. Une fraction de la réaction est

ensuite utilisée pour analyser la quantité de transcrits par PCR.

II.F.2 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

La technique de PCR décrite (Saiki et al., 1985) permet d‟amplifier des séquences

géniques grâce à plusieurs cycles d‟amplification comprenant trois étapes: la dénaturation

thermique de l‟ADN bicaténaire matriciel, l‟hybridation des amorces sur l‟ADN

matriciel, et la synthèse, à partir des amorces, d‟ADN complémentaire grâce à une ADN

polymérase thermostable.

Suivant les applications, les réactions de PCR sont réalisées à partir de matrices

correspondant soit à de l‟ADN génomique (0,1 µg), de l‟ADN plasmidique (0,1 ng), des

ADNc (2 µL d‟une dilution au dixième du produit de retrotranscription), ou directement

avec une colonie de bactéries transformées avec un plasmide d‟intérêt.

Les réactions de PCR sont réalisées dans un mélange réactionnel de 25 µL

comprenant le tampon d'activité de la Taq polymérase, une combinaison d‟amorces (0,2

µM chaque) correspondant à la séquence d'intérêt, les dNTPs (0,2 mM chaque) et 1,5 U

de Taq polymérase (GoTaq® DNA Polymerase, Promega). Les différents couples

d‟amorces utilisés au cours de cette étude sont présentés dans le tableau 5.

Les réactions d‟amplification sont réalisées dans un thermocycleur (Applied

Biosystem et MWG Primus HT multiblocks). Les échantillons sont soumis à une

dénaturation préalable à 95°C pendant 5 min, puis à plusieurs cycles d‟amplification

comprenant une étape de dénaturation à 95°C pendant 30 s, une étape d‟hybridation des

amorces sur la matrice à la température adéquate (température de fusion des amorces -

2°C) pendant 30 s, et une étape de synthèse d'ADN à 72°C dont la durée varie en fonction

de la taille du fragment à amplifier. Une extension finale à 72°C pendant 5 min termine le

programme de PCR.

II.F.3 RT-PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)

La PCR quantitative en temps réel a été utilisée afin de quantifier, de façon

relative, l‟expression de gènes candidats dans les plantes transgéniques et de type


sauvage, rapportée à l‟expression de gènes constitutifs. Les couples d‟amorces utilisés

sont présentés dans le tableau 5

L‟amplification PCR est réalisée en présence de SYBR® Green, un intercalant

fluorescent de l‟ADN, qui permet de détecter la présence/accumulation d‟acides

nucléiques double brin dans le milieu réactionnel à chaque cycle de PCR (longueur

d‟onde d‟excitation maximum 497 nm, longueur d‟onde d‟émission maximum 520 nm).

L‟enregistrement en temps réel de la fluorescence émise permet ainsi de visualiser la

phase exponentielle de la réaction de PCR, pendant laquelle le signal est proportionnel à

la quantité de cible présente dans l‟échantillon de départ. L‟intégration du signal de

fluorescence par le programme CFX-Manager (Bio-Rad) restitue le nombre de cycles

nécessaires (noté Ct pour threshold cycle) pour que le signal mesuré soit égal à un certain

seuil (« Ct threshold »). Arbitrairement, nous avons fixé la valeur seuil « Ct threshold » à

200 pour tous les gènes.

Les réactions d‟amplification sont réalisées dans un thermocycleur Biorad CFX 96

Real Time System avec 2 µL de matrice (réaction de transcription inverse diluée au

1/10ème

ou fragment PCR dilué) selon le protocole du fournisseur (Bio-Rad) dans un

volume final de 20 µL comprenant le tampon iQTM

SYBR® Green Supermix 1x (50 mM

KCl ; 20 mM Tris-HCl ; pH 8,4 ; 0,2 mM de chaque dNTP ; 25 u/mL de iTAQTM

DNA

polymerase, 3 mM de MgCl2, 10 nM de SYBR® Green I) et 0,2 µM d‟amorces

spécifiques (sens et anti-sens) du gène à amplifier. Les échantillons sont soumis à (i) une

dénaturation préalable à 95°C pendant 3 min, puis à (ii) 40 cycles d‟amplification

comprenant une étape de dénaturation à 94°C pendant 15 s et une étape de 25 s à 60°C

qui permet à la fois l‟hybridation des amorces sur la matrice et la synthèse d'ADN, enfin

(iii) au cours de la dernière étape la température augmente de 60°C à 95°C par pas de

0,5°C toutes les 5 s afin d‟établir une courbe de fusion.

Dans un premier temps, chaque couple d‟amorce a été validé en réalisant une

gamme étalon de 7 dilutions en série au 1/7ième du fragment PCR correspondant, purifié

sur colonne S-400 (MicroSpinTM

GE-Healthcare). Cette analyse a permis de calculer

l‟efficacité de la PCR. Une efficacité de 100 % est idéale, elle indique que le nombre de

copie double à chaque cycle de PCR. Par ailleurs, la réalisation des courbes de fusion a

permis de vérifier la synthèse d‟un seul produit PCR lors de la réaction. En effet, celle-ci

permet de déterminer la température de dissociation des double-brins produits. La


représentation graphique (dérivée de la vitesse de dissociation) permet de représenter

graphiquement le nombre de produits amplifiés : un seul pic doit apparaître.

L‟acquisition des données et les analyses sont réalisées en utilisant le logiciel CFX

Manager version 1 .1.308.1111 (Biorad). Les gènes EiF4a, actine et tubuline sont utilisés

comme gènes de référence pour calculer l‟expression relative des transcrits. Un test de

Student est réalisé en utilisant les valeurs moyennes et la déviation standard des réplicats.

Tableau 5 : Séquences nucléotidiques des différentes amorces utilisées en PCR

Gène Utilisation Séquence primer 5' Séquence primer 3'

SlFB1 RNAi AAAGTGATCTGCATCGATTGG TGATGCTTCTGTGGCCATT

OE TGATGGAGAGGTATCAAAAACTAGG TATGCTTCCACATCATGCATG

SlFB2 RNAi TGCTCATTTAGTGGTCTTCTTCTG AAAACGATAAATAATGATTCGATAC

OE AATGAATCAAAATAAGTTCACTGAATTA CAAAATTTCATTTCAGATCTCCAC

qPCR AGCATGTGGTGTGGATCTTG TCTACGAAAAAGAACCCATGC

SlFB3 RNAi TGCATTTGACATGTTTGTGC TTCCCCTACGGTAGTTGCAT

OE ATGTCACGAAGGTATGATAGCCG AAGGCATTCTACGACTATTCTTCTG

SlFB9 RNAi AAGAAAATCGGCCGTCGT CAGGGAATCGGTCATGAAAT

SlFB11 RNAi CATCTTAACTCACTTTGGCGTTT ATCGACAGCCCACCTAACCT

qPCR AAGGTTAGGTGGGCTGTCG TGGACCATAGCAAATCATCG

SlFB12 RNAi GCTTAGCGAGCAAGCAAGAT TGGCAAGGTGTATTCCAGTG

qPCR CAGTGTACCTGGGCAACCTC GGCCTCCTAGGACAAAGACC

SlFB17 RNAi TTTCAACTCGTGATGGTTGG GGTTGTCATGGCAGAAAAGG

SlFB18 RNAi TCCATCATGCCATGGTCTC AATGCGCGATGAATCTTGTC

SlFB21 RNAi TTGTCTTTGGAAGGGCAATC CAGCAGGCAATGTCCAAATA

OE TCATGAAAAGAAAGGGGATGGA GGAACTTAAAGGCTCCTCAGAAGAC

SlFB23 RNAi TCGGGAAATCTGTTGCAAAT ATGACATCCAGGGAGACCAG

SlFB24 RNAi GGGGGTTTATTTAATATTTTTGTTT GTGGGGTGGGGGTAAAAG

qPCR TTCTTCAACTCTTCCTGGATCTG GGGAAGTGTTTCTCTGAAATCTG

SlFB25 RNAi AGCTCGTTAATGTCGATTCAGA GTGGGAAGGGCAAAAGTGTA

SlFB26 RNAi AATGCGGTGTCTTTGGATGT GCATAGTCATCGCTGTGCTC

SlGEM1 RNAi AAGAAAGAACGGTAGTGAATTTGG TTCACATTCTAAAGCTCGTTAAACC

OE TTATGGAGCAGTCAAACGGTTTAG AACAACAGACTCACACGGAATG

qPCR CCACAGCTAAGCTTGCCTTC TGCCTTGAGCTGGTGTAATG

SlGEM2 OE CGAAGATGACGAAGCAGC GGTTGTCAATAGAGATAGCTTGGA

qPCR TCACCTTCATACATCTGGTTGC TCCGTTAGTTGCCAAGAAATC

SlTTG1 qPCR GGCTGTCTTTCTTTGTTAGAGATG GCGGATTGAGTTCTTTCTCC

Actine qPCR GGACTCTGGTGATGGTGTTAG CCGTTCAGCAGTAGTGGTG

βtubuline qPCR AACCTCTCGTGGATCACAGC GGCAGAAGCTGTCAGGTAACG

eIF4A qPCR AGTGGACGATTTGGAAGGAAG GCTCCTCGATTACGACGTTG

attB1 GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT

attB2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT

attL1 TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC

attL2 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC

III. Méthode de clonage par recombinaison (système Gateway™)

Le clonage des séquences des gènes d‟intérêt de tomate est réalisé grâce à la

technologie Gateway™ développée par Invitrogen. Le principe de cette méthode est


présenté dans la figure 53. Cette technologie repose sur l‟utilisation des capacités du

bactériophage lambda à reconnaître des sites spécifiques sur le chromosome

d‟Escherichia coli pour induire des phénomènes de recombinaison d‟ADN (Landy,

1989). La recombinaison a lieu entre des séquences d‟ADN spécifiques appelées «att :

site-specific attachment»: attB sur le chromosome d‟E. coli et attP sur le bactériophage

lambda. La recombinaison consiste en un échange suivi d‟une ligation de deux brins

d‟ADN pour donner un nouvel ADN. Cette technologie fournit donc un moyen efficace et

rapide pour intégrer une séquence d‟ADN possédant les sites attB dans un vecteur

intermédiaire dit «d‟entrée» possédant les sites attP. L‟intégration dans ce premier vecteur

permet de transférer rapidement, toujours par recombinaison, cette séquence d‟intérêt

dans différents vecteurs dits «de destination» suivant les applications désirées.

Figure 53 : Principe de la technologie Gateway™. Clonage du fragment d‟intérêt (ORF) dans le vecteur

d‟entrée puis dans le vecteur de destination grâce aux séquences att qui assurent une double recombinaison

III.A Plasmides utilisés pour l’agroinjection et la génération de plantes

transgéniques

La technologie Gateway™ (Invitrogen) est utilisée pour générer le vecteur utilisé

dans l‟expérience de transgénèse visant à diminuer ou augmenter l‟expression d‟un gène

par la stratégie RNAi ou de sur-expression (OE). Elle a nécessité un vecteur d‟entrée, le

plasmide pDONR™201 (figure 54.A) et un vecteur de destination, le plasmide

pK7GWIWG2(1),0 (figure 54.B) dans le cas de la stratégie RNAi, et le vecteur

pK2GW7,0 (figure 54.C) dans le cas de la stratégie de sur-expression.


Figure 54 : Vecteurs utilisés avec la technologie Gateway™. A. Vecteur d‟entrée pDONR™201. B.

Vecteur de destination pK7GWIWG2(1),0 utilisé pour générer les transformants RNAi. C. Vecteur de

destination pK2GW7,0 utilisé pour générer les transformants sur-expresseurs.

Le plasmide pDONR™201 est utilisé pour introduire le fragment du gène d‟intérêt

entre les séquences de recombinaison att, caractéristiques du système Gateway (figure

53). Le plasmide pK7GWIWG2(1),0 est un vecteur permettant la transformation de

plantes à l‟aide d‟A. tumefaciens. Il est utilisé dans le cas d‟une stratégie RNAi. Il possède

deux sites de clonage par recombinaison (les séquences attR1 et attR2), en orientation

inversée l‟un par rapport à l‟autre, situé entre le promoteur constitutif fort 35S et le

terminateur du gène VI du CaMV (Cauliflower Mosaic Virus). Il contient également la

cassette de sélection des plantes transformées conférant la résistance à la kanamycine

(KanR) aux plantes transformées. Le plasmide pK2GW7,0 possède également les sites de

recombinaison attR1 et attR2 permettant l‟insertion de la séquence codante du gène

candidat sous la dépendance du promoteur constitutif fort 35S et le gène de sélection

conférant la résistance à la kanamycine.

III.B Préparation de l’insert

La séquence du gène d‟intérêt destinée à être insérée dans le vecteur de destination

est obtenue à partir d‟ADNc de tomate par amplification PCR à l‟aide d‟une polymérase

haute fidélité (Phusion®

High-Fidelity DNA Polymerase – Finnzymes) selon les

recommandations du fournisseur. Cette PCR est réalisée en présence d‟un couple

d‟amorces contenant dans leur moitié 3‟ la séquence spécifique de la séquence d‟intérêt et

dans leur moitié 5‟ la moitié des séquences attB : 1/2attB1 (AAAAAGCAGGCT) et

1/2attB2 (AGAAAGCTGGGT) (Gateway® pDONR™ Vectors, Catalog nos. 11798-014,

12536-017, and 12535-035, Invotrogen™). Les conditions de cette PCR sont un peu

différentes des conditions usuelles: après dénaturation à 95°C pendant 5 min, la première


étape comprend 5 cycles de 15 s à 95°C, 30 s à 45°C et 1 min/kb de gène cible à 72°C,

suivi d‟une deuxième étape de 25 cycles de 15 s à 95°C, 30 s à Tm spécifique des couple

d‟amorces, et 1 min /kb de gène cible à 72°C. Une étape de synthèse d‟ADN par

extension d‟amorces réalisée à 72°C pendant 5 min termine la réaction. Cette première

PCR permet ainsi d‟obtenir l‟insert à étudié flanqué du demi-site attB1 en 5‟ et du demi-

site attB2 en 3‟. Une seconde PCR est réalisée dans des conditions classiques (II.F.2)

avec les amorces attB dans leur intégralité. Cette seconde PCR permet d‟obtenir l‟insert

voulu flanqué des sites de recombinaison attB complets. Les fragments attB-PCR sont

purifiés sur colonne S-400 (MicroSpinTM

GE-Healthcare)

III.C Insertion dans le vecteur d’entrée

L‟insertion du fragment attB-PCR purifié dans le vecteur d‟entrée pDONR™ 201

est réalisé grâce à la réaction de «recombinaison BP» selon le protocole du fournisseur

(Invitrogen). La réaction de recombinaison est réalisée à partir 150 ng du produit PCR

d'attB dans 10 µL de mélange réactionnel constitué de 2 µL de tampon de réaction BP, de

150 ng pDONR201™ vecteur (vecteur d'entrée), de 2 µL d‟enzyme BP clonase. La

réaction est incubée pendant 2h à 25°C. Quatre µL de cette réaction est utilisé pour

transformer 200 µL de cellules thermocompétentes DH5α F-.

III.D Transfert dans le vecteur de destination

Le clonage s‟effectue également par recombinaison dite «recombinaison LR» et

permet de transférer la séquence d‟intérêt dans différents vecteurs de destination. Cette

réaction s‟effectue sur le produit de la «recombinaison BP» après sélection et

amplification des clones recombinants. A 75 ng de vecteur d‟entrée recombiné sont

ajoutés 75 ng du vecteur de destination, 2 µL de tampon de réaction LR et 1 µL d‟enzyme

LR clonase (Invitrogen) dans un volume final de 5 µL. La réaction est incubée pendant 2h

à 25°C. Quatre µL de réaction est utilisé pour transformer 200 µL de cellules

thermocompétentes DH5α F-comme précédemment.

III.E Transformation des bactéries thermocompétentes

III.E.1 Préparation des bactéries thermocompétentes

Les bactéries compétentes Library Efficiency® DH5 α ™ F- sont cultivées sur un

milieu LB solide et incubées pendant une nuit à 37°C. Une colonie est alors prélevée et


utilisée pour ensemencer 10 mL de milieu LB. La préculture est soumise à agitation (200

rpm) pendant une nuit à 37°C. Cinq cent mL de milieu LB sont ensemencés avec 2 mL de

la préculture, et placés sous agitation douce (200 rpm) à 37°C jusqu‟à l‟obtention d‟une

DO600nm de 0,6. Toutes les étapes ultérieures sont réalisées à 4°C afin d‟éviter les chocs

thermiques. Comme précédemment, il s‟en suit une série d‟étapes de centrifugations et de

remises en suspension dans 250 mL de CaCl2 (100 mM) puis dans 20 mL de CaCl2 (100

mM) préalablement refroidi et contenant 15% de glycérol. La suspension bactérienne est

répartie en fractions aliquotes de 200 µL qui sont conservées à 4°C pendant 24 heures

afin d‟augmenter la compétence des cellules puis congelées dans l‟azote liquide et

conservées à -80°C.

III.E.2 Transformation des bactéries thermocompétentes

La transformation s‟effectue selon la méthode décrite précédemment (Sambrook

et al., 1989). Les bactéries thermocompétentes DH5α™ F- (200 µL) sont décongelées

dans la glace puis mélangées à 4 µL du mélange réactionnel BP ou LR. Après incubation

pendant 30 min sur la glace, le mélange est soumis à un choc thermique à 42°C pendant

45 s puis remis dans la glace pendant 2 min. Les bactéries sont ensuite cultivées dans 1

mL de milieu LB sous agitation (200 rpm) à 37°C pendant 1 h.

III.E.3 Sélection des bactéries transformées

Une fraction des bactéries transformées est étalée sur un milieu LB solide

supplémenté par l‟antibiotique approprié. Les colonies obtenues à partir des bactéries

résistantes sont utilisées pour ensemencer une culture liquide de 10 mL de milieu LB

placée dans les mêmes conditions que précédemment. Au bout de 24 h, les bactéries sont

centrifugées 5 min à 5000g et le culot bactérien est utilisé pour extraire le plasmide

d‟intérêt selon le protocole décrit dans la section II.B précédente. Deux types de contrôles

sont réalisés sur ces plasmides :

- une PCR permettant de vérifier rapidement que les réactions BP et LR ont abouti

à la synthèse des constructions attendues au sein des vecteurs d‟entrée et de destination.

Les amorces attL1 et attL2 (tableau 5) ont permis de mettre en évidence l‟insertion de la

séquence d‟intérêt dans le vecteur d‟entrée suite à la réaction BP. Les couples d‟amorces

Fw/attB1, Rv/attB2 (tableau 5) ont permis de mettre en évidence l‟insertion de la


séquence d‟intérêt en position sens et anti-sens dans le vecteur de destination suite à la

réaction LR.

- un séquençage des plasmides purifiés avec utilisation des couples d‟amorces

attB1/B2 ou attL1/L2 suivant l‟étape du clonage (GATC-Biotech, http://www.gatc-

biotech.com/fr).

IV Transformation et sélection des plantes

IV.A Transformation des agrobactéries

La transformation s‟effectue par électroporation en utilisant le MicroPulser™

(Bio-Rad). Les agrobactéries GV3101 compétentes (40 µL) sont décongelées dans la

glace puis mélangées à 200 ng de plasmide de destination modifié obtenu comme décrit

dans le paragraphe III.D. Le mélange est placé dans une cuve à électroporation

(électrodes distantes de 0,2 cm). Le générateur est réglé pour délivrer un pulse de 1800

Volt en quelques millisecondes. Après l‟impulsion électrique, les bactéries sont

immédiatement transférées dans 1 mL de milieu LB et soumises à une agitation pendant 1

h à 28°C. Les bactéries transformées sont étalées sur un milieu LB solide contenant les

antibiotiques appropriés et incubées 48 h à 28°C. Une colonie résistante est sélectionnée

pour ensemencer 10 mL de LB contenant les mêmes antibiotiques. La culture liquide est

maintenue à 28°C sous agitation durant une nuit.

IV.B Agroinjection dans le fruit de tomate

Le protocole est basé sur les travaux de Spolaore et al.en 2001et Orzaez et al.en

2006. Une colonie d’Agrobactérium transformée est ensemencée dans 5 mL d‟une

solution de YEB (0,5 % beef extract, 0,1% yeast extract, 0.5 % peptone,

0.5 % saccharose, 2 mM MgSO4, pH 5,6) additionnée des antibiotiques

adéquats et cultivée 24h à 28°C sous agitation. La culture est ensuite

transférée dans 50 mL de milieu d‟induction (solution YEB + 10 mM

MES, 20µM acétophénone, pH 5,6) additionné des antibiotiques

adéquats. La culture est laissée 24h à 28°C sous agitation puis la DO580

est mesurée. La solution est centrifugée 10 min à 3500g puis les

bactéries sont resuspendues dans le milieu d‟infiltration (10 mM MgCl2,

10 mM MES, 200 µM acétophénone, pH 5,6) de façon à avoir une

Figure 55 :

Agroinjection dans

le fruit de tomate.

http://www.gatc-biotech.com/fr

http://www.gatc-biotech.com/fr


DO580 de 0,6. La solution est laissée à incuber pendant 3h à 28°C sous agitation douce

puis injectée doucement au niveau de l‟apex du fruit (figure 55) à l‟aide d‟une seringue

(1 mL) et d‟une aiguille 0.45 x12 (TERUMO) jusqu‟à ce que la solution commence à

ressortir au niveau des sépales. Les fruits injectés sont récoltés entre 4 et 7 jours après

l‟injection.

IV.C Transformation des cotylédons de tomate

La transformation des cotylédons de tomate est réalisée selon le protocole modifié

de Hamza et Chupeau (Hamza and Chupeau, 1993). Les cotylédons de tomate sont

coupés en deux explants afin d‟induire une meilleure réponse à la blessure nécessaire

pour l‟infection par A. tumefaciens puis mis en culture pendant 2 jours à l‟obscurité sur du

milieu de pré-culture (tableau 4). Les explants sont ensuite immergés pendant 30 min

dans une culture en phase exponentielle de croissance d‟A. tumefaciens transformées par

les plasmides recombinants d‟intérêt et resuspendues dans du milieu de pré-culture

liquide. L'excès de suspension bactérienne est éliminé entre deux feuilles de papier

absorbant stérile. Le matériel végétal est ensuite co-cultivé avec les agrobactéries pendant

48 h sur le milieu de pré-culture à 25°C et à l‟obscurité. Puis, les explants sont transférés

sur le milieu de régénération (tableau 4) jusqu‟à la formation de cals. Les plantules

régénérées se développant à partir des cals sont repiquées sur milieu d‟enracinement

(tableau 4). Les régénérants résistants aux antibiotiques et enracinés sont transférés en

serre.

IV.D Méthodes de sélection et d’analyses des plantes transgéniques

IV.D.1 Sélection des plantes transgéniques

Plusieurs étapes sont nécessaires pour vérifier l‟insertion du transgène, son

expression et le caractère diploïde des plantes.

- Analyses moléculaires:

Les plantes transformées sont analysées respectivement par PCR et RT-PCR afin

de vérifier l‟intégration de l‟ADN-T dans l‟ADN génomique de la plante et la

transcription des ARNm correspondants.


- Cytométrie en flux:

Après transformation des cotylédons de tomate, il arrive que certaines plantes

obtenues soient tétraploïdes. Afin d‟être sûr que les phénotypes observés soient dus à

l‟effet du transgène et non à ce niveau anormal de ploïdie, il est nécessaire d'évaluer le

niveau de ploïdie des plantes générées par des analyses de cytométrie en flux sur de

jeunes feuilles. Ces analyses de cytométrie en flux sont réalisées sur des noyaux isolés de

tissus végétaux. Les tissus végétaux sont placés dans une boîte de Pétri et sont lacérés à la

lame de rasoir dans 1 mL de tampon « Cystain UV ploidy » (Partec) contenant du DAPI.

Les échantillons sont ensuite filtrés à travers un film de nylon (taille des pores, 100 µm).

Les préparations de noyau sont analysées avec un cytomètre Partec Pas-II (Münster,

Allemagne). Le système informatique associé (DPAC, Partec) au cytomètre permet de

traiter les signaux pour les représenter sous forme d‟histogrammes de populations de

noyaux. Les mesures de cytométrie en flux sont réalisées sur 10000 noyaux en moyenne

(figure 56). Seules les plantes diploïdes et exprimant le transgène sont conservées pour

les analyses ultérieures.

Figure 56 : Analyse de la ploïdie des

plantes de tomates transformées par

cytométrie en flux. A., Populations de

noyaux de jeunes feuilles de plantes

sauvages en fonction de la quantité

d‟ADN qu‟ils contiennent. B. Populations

de noyaux de jeunes feuilles de plantes

transformées (génotype X et Y) en

fonction de la quantité d‟ADN qu‟il

contiennent. C. Profil de ploïdie d‟un mélange de noyaux issus de la plante

sauvage (WT) et de la plante transformée

analysée (X ou Y). La colonne de gauche

montre l‟analyse de la ploïdie d‟une

plante transformée X diploïde qui

présente un profil de ploïdie identique au

sauvage. Elle est donc sélectionnée pour

analyse. La colonne de droite représente

l‟analyse du profil de ploïdie de la plante

transformée Y qui ne présente aucun

noyau de contenu en ADN de 2C. Cette plante est donc tétraploïde et ne sera pas

sélectionnée pour l‟analyse.


IV.D.2 Etude de la ségrégation du transgène

Afin d‟étudier la ségrégation du transgène via le marqueur de sélection, les graines

des plantes transgéniques de génération T1 sont stérilisées et semées sur un milieu MS1/2

additionné de 150 mg/L de kanamycine. Le rapport entre le nombre de plantes résistantes

et le nombre de plantes sensibles, sur 100 plantules, permet de déterminer le nombre de

loci d‟intégration du marqueur de sélection présent sur l‟ADN-T. Les plantes étudiées au

cours de ce travail ont présenté une insertion du transgène (un profil de ségrégation 3/1).

La même ségrégation est réalisée avec 100 graines de génération T2 afin de déterminer

les individus homozygotes (100% de plantules résistantes). Les plantes étudiées au cours

de ce travail sont des homozygotes pour le transgène.

V Analyses réalisées sur les transformants et les mutants

V.A Analyse du développement racinaire

Les graines de tomate cv microtom WT, des transformants P35S :SlGEM1OE

et

P35S :SlGEM1RNAi

, ainsi que des mutants SlGEM1 ont été semées sur du milieu MS1/2

dans des boites maintenues verticalement pour un développement rectiligne des racines.

Les observations ont été réalisées cinq jours après la germination sur de jeunes racines de

1,5 cm de long à l‟aide d‟une loupe binoculaire (Olympus SZX16, Japon).

V.B Observations du développement des trichomes

Le développement des trichomes a été étudié sur les troisièmes et quatrièmes

feuilles de jeunes plants de tomate WT, des transformants P35S :SlGEM1OE

et

P35S :SlGEM1RNAi

, ainsi que des mutants SlGEM1. Les folioles principales ont été

observées à l‟aide d‟une loupe binoculaire (Olympus SZX16, Japon).

V.C Test de germination de pollen

Les tests de germination de grains de pollen de tomate sont réalisés selon un

protocole décrit précédemment avec quelques modifications (Hernould et al., 1993). Le

tampon de germination est composé de 3,75 ppm d‟acide borique, 5% de saccharose et

ajusté à pH 5,7 par du KOH. Les fleurs sont disséquées pour prélever le cône d‟anthère et

les anthères sont éventrées de façon à libérer le pollen dans le tampon. L‟ensemble est

maintenu 4 h à la température de la serre et à l‟obscurité pour induire la germination. Les

grains de pollen sont ensuite observés au microscope inversé (Olympus, IM) afin de


dénombrer le pourcentage de germination sur les différentes lignées. Le test de

germination a été appliqué à au moins 1000 grains de pollen, récoltés sur au moins cinq

fleurs, pour les lignées mutantes et sauvages. Pour chaque série de mesures sur les lignées

mutantes, une valeur de germination de pollen sauvage est faite dans les mêmes

conditions.

V.D Analyses cytologiques

Les observations et mesures cytologiques ont été réalisées sur des fruits prélevés

au stade breaker sur des plantes WT, P35S :SlGEM1OE

et P35S :SlGEM1RNAi

. Une fine

section des fruits a été découpée selon une coupe équatoriale, et colorée dans un bain de

bleu de toluidine (0,05 % p/v) pendant 30 secondes. Après rinçage à l‟eau, les

observations et les prises de vues ont été réalisées avec une loupe binoculaire Leica MZ

FLIII (Leica Microsystems) équipée d‟une caméra Leica DC300F. Les images ont été

analysées avec le logiciel ImagePro-Plus (Media Cybernetics) sur le Pôle d‟Imagerie du

Végétale du Bordeaux Imaging Center (BIC).

V.E TILLING

Le TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) est une méthode de

génétique inverse permettant de détecter des points de mutation uniques induits par une

mutagénèse chimique. Cette technique est repose sur l‟utilisation d'une endonucléase

(EndoI) détectant et coupant les mésappariements dans un double brin d'ADN. Les

mésappariements surgissent lorsque deux brins d'ADN ne possèdent pas la même

séquence, créant ainsi des hétéroduplexes lors de leur appariement. Cette technique

permet l'identification d'une série d'allèles pour 1 gène donné et peut être adaptée à un

screening à haut débit de mutations induites par l'EMS ou de variations génétiques

naturelles.

Cette technique a été utilisée afin de détecter des mutants du gène SlGEM1 parmi

les 8500 familles mutagénéisées à l‟EMS disponibles dans la collection du laboratoire.

Pour cela, des amorces spécifiques ont été utilisées pour l‟amplification d‟une région de

1kb d‟ADN génomique (amorce 5‟ : CCGTCACGGCTGAAATAACT – amorce 3‟ :

CCCATCTACCAAGCACACCT). Ce travail a été réalisé par C. Brès et J. Jorly sur la

Plateforme Génome Transcriptome (PGT) du Centre de Génomique Fonctionnelle de

Bordeaux (CGFB).

RÉFÉRENCES

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ARTICLES ET COMMUNICATIONS

Articles et communications 124

ARTICLES ET COMMUNICATIONS

Publications

- Fernandez AI*, Viron N

*, Alhagdow M, Karimi M, Jones M, Amsellem Z, Sicard A,

Czerednik A, Angenent G, Grierson D, May S, Seymour G, Eshed Y, Lemaire-Chamley

M, Rothan C, Hilson P (2009) Flexible Tools for Gene Expression and Silencing in

Tomato. Plant Physiol. 151: 1729-1740

* These authors contributed equally to the article

Posters

- Viron N, Alhagdow M, Fernandez AI, Karimi M, Hilson P, Rothan C and Lemaire-

Chamley M. Expression analysis of tomato fruit-specific promoters. Journée de l'Ecole

Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, avril 2009, Arcachon, France.

- Viron N, Fernandez A, Alhagdow M, Karimi M, Seymour G, Hilson P, Rothan C and

Lemaire-chamley M. Expression analysis of tomato fruit-specific promoters. 8ème

Colloque National de la SFBV Société Française de Biologie Végétale, 8-10 Juillet 2009,

Strasbourg, France.

- Viron N, Fernandez A, Alhagdow M, Karimi M, Angenent G, Eshed Y, Seymour G,

Hilson P, Rothan C and Lemaire-chamley M. Expression analysis of tomato fruit-specific

promoters. 4th meeting EU-SOL Toledo, 2009, Oct 4-6, Toledo, Spain

- Viron N, Bres C, Mounet F, Moise A, Petit J, Garcia V, Moing A, Rothan C and

Lemaire-Chamley M. Functional characterization of a tomato homologue of AtGEM

(Glabra2-Expression Modulator). Journée de l'Ecole Doctorale Sciences de la Vie et de la

Santé, avril 2010, Arcachon, France.



(Glabra2-Expression Modulator). 13ème Congrès FESPB (Federation of European

Societies of Plant Biology), 4-9 juillet 2010, Valencia, Spain.



(Glabra2-Expression Modulator). 7th Solanaceae conference, 5-9 September 2010,

Dundee, Scotland.

SUMMARY

Tomato (Solanum lycopersicum) is a model species for studying fleshy fruit development. It has

been shown that hormone signaling plays a crucial role in the complex regulatory network governing

this developmental process. The aim of this thesis was to perform the functional validation of new

candidate genes potentially involved in the regulation of fruit development. For this, the work was

divided into three parts: 1) validate the use of four tomato promoters and one promoter of Arabidopsis

thaliana in recombinant vectors for the overexpression or silencing of genes in tomato fruit at particular

phases of development or in specific fruit tissues, 2) functional analysis of genes encoding F-Box

proteins in tomato and 3) functional analysis of SlGEM1 gene.

The first part of this work has focused on the characterization of tomato promoters from IMA

(INHIBITOR ACTIVITY OF MERISTEM), TPRP (TOMATO Proline-Rich Protein), PPC2

(PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE 2) and PG (polygalacturonase), as well as the

promoter of Arabidopsis thaliana CRC gene (CRABS-CLAW). Transgenic plants were generated to

express the GUS reporter gene alone or fused to GFP and a NLS signal for nucleus targeting, under

the control of the different promoters. The study of these transgenic plants highlighted the specific

spatio-temporal expression of these promoters during fruit development. In the case of LePPC2

promoter, the transcriptional fusion with NLS-GFP revealed a specific activity in the large cells of

tomato fruit pericarp. This part of the thesis work validated the use of the five different promoters for

future functional analysis of genes regulating fruit development in tomato.

The second part of this work focused on the identification of F-Box proteins involved in the

regulation of tomato fruit development. In plants, it has been shown that F-Box proteins play an

important role in regulating processes, due to their specific interaction with regulatory proteins targeted

by the SCF complex (SKP1-Cullin-F-Box), leading to their ubiquitination and degradation by the 26S

proteasome. Among the 95 sequences of F-Box proteins available in tomato databases at the

beginning of this work, four candidate genes were selected for their tissue-specific expression during

tomato fruit early development. Transgenic plants (RNAi and over-expression) were generated for

each of these candidate genes and their preliminary analysis allowed to propose a role in tomato

vegetative development for one of them.

The third part of this work focused on the functional characterization of SlGEM1, orthologous to

AtGEM (GLABRA2-EXPRESSION MODULATOR). Indeed, a previous work revealed that the

expression level of SlGEM1 was correlated with tomato fruit cell size. Available data on AtGEM

showing its involvement in the coordination of cell proliferation and differentiation made it an attractive

candidate to the control of fruit size and development. Transgenic plants (SlGEM1 RNAi and over-

expression) were generated, and mutants of this gene were identified by TILLING in the Microtom

mutant collection available in the laboratory. Phenotyping of these plants suggested the involvement

of SlGEM1 in flower development and in the fertility of pollen grains.

Keywords: Solanum lycopersicum, tomato, fruit development, F-Box, GEM (GLABRA2-

EXPRESSION MODULATOR), promoter

Résumé

La tomate (Solanum lycopersicum) est l’espèce modèle pour l’étude du développement des

fruits charnus. Il a notamment été montré que la signalisation hormonale était un élément central d’un

réseau complexe de régulations gouvernant ce processus. Le but de ce travail de thèse était de

réaliser la validation fonctionnelle de nouveaux gènes candidats potentiellement impliqués dans la

régulation du développement du fruit. Pour cela, le travail s’est découpé autour de trois axes : 1) la

validation de l’utilisation de quatre promoteurs de tomate et d’un promoteur d’Arabidopsis thaliana

dans des constructions permettant la surexpression ou le silencing de gènes dans le fruit de tomate, à

des phases particulières de son développement ou dans des tissus spécifiques du fruit, 2) l’analyse

fonctionnelle de gènes codant pour des protéines à F-Box chez la tomate et 3) l’analyse fonctionnelle

du gène SlGEM1.

Le premier axe de ce travail a porté sur la caractérisation des promoteurs des gènes de

tomate IMA (INHIBITOR OF MERISTEM ACTIVITY), TPRP (TOMATO PROLIN-RICH PROTEIN),

PPC2 (PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYLASE 2) et PG (POLYGALACTURONASE), ainsi que

du promoteur du gène CRC (CRABS-CLAW) d’Arabidopsis thaliana. Des plantes transgéniques ont

été générées permettant d’exprimer, sous le contrôle de ces différents promoteurs, le gène rapporteur

GUS seul ou fusionné à la GFP (Green fluorescent protein) et à un signal d’adressage au noyau

(NLS). L’étude de ces plantes a permis de mettre en évidence la spécificité spatio-temporelle de

l’expression de ces différents promoteurs lors du développement du fruit. Dans le cas du promoteur

LePPC2, la fusion transcriptionnelle avec la GFP et un signal NLS a permis de montrer une activité

spécifique dans les cellules du péricarpe des fruits de tomate en phase d’expansion cellulaire. Cette

partie du travail de thèse a validé l’utilisation de ces différents promoteurs pour de futures analyses

fonctionnelles de gènes régulateurs du développement du fruit chez la tomate.

Le deuxième axe de ce travail a porté sur l’identification de protéines à F-Box impliquées dans

la régulation du développement du fruit chez la tomate. En effet, il a été montré que ces protéines à F-

Box jouent un rôle particulièrement important dans les processus de régulation chez les plantes grâce

à leur fonction de reconnaissance de protéines régulatrices cibles par les complexes SCF (SKP1-

Cullin-F-Box), qui sont alors marquées par ubiquitinylation, pour leur dégradation par le protéasome

26S. Parmi les 95 séquences de protéines à F-Box disponibles dans les bases de données d’EST au

début de ce travail, quatre gènes candidats ont été retenus pour leur expression tissu-spécifique lors

du développement précoce du fruit. Des plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) ont été

générées pour chacun de ces gènes candidats et leur analyse préliminaire a permis de proposer un

rôle dans le développement chez la tomate pour une d’entre elles.

Le troisième axe de ce travail a porté sur la caractérisation fonctionnelle du gène SlGEM1,

l’orthologue du gène AtGEM (GLABRA2-EXPRESSION MODULATOR), dont le niveau d’expression

semblait corrélé à la taille des cellules dans le fruit de tomate. En effet, les données disponibles sur

AtGEM montrant son implication dans la coordination de la prolifération et la différenciation des

cellules en faisaient un candidat intéressant au contrôle de la taille et du développement du fruit. Des

plantes transgéniques (RNAi et sur-expression) SlGEM1 ont été générées, et des mutants de ce gène

ont été identifiés par TILLING dans la banque de mutants EMS de la variété Microtom de tomate

disponible au laboratoire. Le phénotypage de ces plantes a permis de mettre en évidence une

potentielle implication de SlGEM1 dans le développement des fleurs et dans la fertilité des grains de

pollen.

Mots clés : Solanum lycopersicum, tomate, fruit, développement, F-Box, GEM (GLABRA2-

EXPRESSION MODULATOR), promoteur

N° d’ordre : 3125 -...

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