Zaawansowane metody biologii obliczeniowejmikromacierze: przykłady zastosowan

Anna Gambin

aniag@mimuw.edu.pl

Wydział Matematyki, Informatyki i Mechaniki UW

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.1

Plan na dzis

pierwsze eksperymenty z macierzami DNA: drózdzjako organizm modelowy.

reakcja genomu na stres (białka ESR).

aneuploidy – jak czesto ?

po co grupowac kolumny macierzy ekspresji ?

historia szczepionki BCG.

testujemy nowe leki na drozdzu.

dobór leków w terapii nowotworów.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.2

schemat eksperymentu

drozdze rosna w dwóch róznych warunkach (np. ztlenem i bez tlenu),

wyciagamy dwie populacje mRNA i ”tłumaczymy” nacDNA.

kazda z populacji cDNA zawiera barwione nukleotydy,czyli jeden transkryptom zielony (odnosnik) a drugiczerwony (eksperymentalny).

czerwone i zielone cDNA mieszamy i zanurzamy w nimpłytke DNA: łancuchy podoczepiaja siekomplementarnie do odpowiednich genów.

zostawiamy na noc, rano płuczemy i suszymy.Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.3

mikromacierze DNA: eksperyment

www.vetmed.iastate.edu/

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.4

czerwono-zielona skala

skanowanie płytki trwa ok 20 min.

porównujemy intensywnosc czerwonego do zielonego.

zamiast ułamków - znów kolory (indukowany =czerwony, represowany = zielony).

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.5

eksperyment deRisi c.d.

głodzimy drozdza bez cukru.

ponad połowa genów zmieniajacych ekspresje madotychczas nieznana funkcje.

odkrywanie nowych sciezek metabolicznych,

wnioskowanie o funkcji genu o ile jego profil ekspresjiprzypomina profil genu o znanej funkcji.

regulacja przez ten sam czynnik transkrypcyjny ? tensam proces komórkowy ?

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.6

wygłodzone drozdze

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.7

DNA chip DeRisi

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.8

regulacja genów

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.9

skoordynowana regulacja enzymów

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.10

eksperyment DeRisi’1997

klasteryzacja wzorców ekspresji =⇒ konserwowaneregiony sekwencji promotorowych ≈ miejsca wiazanczynników transkrypcyjnych (TF).

o ile to TF reguluja ekspresje to jak sie ona zmieni ?

co sie stanie jak wyrzucimy gen kodujacy białko(∆tup1)?

a jesli sztucznie podniesiemy poziom ekspresji (zapomoca plazmida) Y AP1 + ++ ?

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.11

efekty manipulacji

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.12

niezastapiony drózdz

drózdz jako organizm modelowy:

diploid/haploid, metabolizm aerobowy/anaerobowy,

sery, jogurty, alkohol...

mitoza - taka sama u wszystkich organizmów,

mechanizmy odbierania sygałow.

P. Brown: bada ekspresje 6200 genów drozdza w 142stresujacych warunkach.

nowa jakosc: dane z eksperymentów ogólniedostepne.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.13

eksperyment Gash’2000

mierzy czas reakcji na zmiany srodowiska(podgrzewanie, brak aminokwasów, brak azotu,DDT...).

odpowiedz genomu w zaleznosci od nasilenia stresu.

jak reaguje drózdz, który juz przywykł do przykrychwarunków, gdy ponownie narazimy go na stres ?

natezenie stresu: przezywa 80% komórek.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.14

wnioski

mozemy wywnioskowac (pierwotnie nieznana) funkcjegenu poprzez jego klasteryzacje z genami o znanejfunkcji.

zklasteryzowane razem geny czesto maja wspólnekonserwowane motywy w sekwencjachpromotorowych.

zklasteryzowane geny odpowiadaja za wykonaniepojedynczego zadania w komórce (mała podsiecregulacji).

małe podsieci koordynuja swoje działanie w celuwykonania bardziej złozonych zadan.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.15

efekty stresu

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.16

wnioski, c.d.

widoczny trend: 900 genów wspólnie reaguje nawiekszosc (ale nie wszystkie - patrz: czarne kolumny)warunków stresowych: geny ESR (environmentalstress response).

reakcja na stres - gwałtowna na poczatku, upokaja sie;genom przywyka do warunków srodowiska - ciagłaaktywnosc 900 genów ESR jest nieuzasadniona.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.17

do wszystkiego mozna przywyknac

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.18

po co grzybowi izozymy ?

izozymy: enzymy (białka) o bardzo podobnychsekwencjach podejrzewane o wykonywanie zupełnieredundantnych funkcji.

mikromacierze DNA wyprowadzaja z błedu: drózdzskrupulatnie odróznia izozymy – dlaczego ?

enzym moze miec inne zadanie w zaleznozci odumiejscowienia w komórce;

izozymy katalizuja te sama reakcje in vitro, ale niein vivo;

w zaleznosci od stresu zadziała inny enzym.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.19

izozymy w akcji

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.20

kontrola ekspresji

ekspresja kontrolowana na poziome transkrypcji.

przebadano gruntownie czyniki transkrypcyjne: Msn2,Msn4, Yap1.

jak delecja Msn2, Msn4, Yap1 wpłynie na ekspresje 15genów, które maja miejsca wiazace te czynniki ?

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.21

zabawa w ciepło-zimno

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.22

DNA chipy maksymalnie uzyteczne

cel: wycisnac jak najwiecej informacji z danych oekspresji.

znamy poziom mRNA, wiemy ile go jest, ale nie wiemydlaczego ?

ilosc informacji przytłaczajaca...

naukowy recycling: nowe wnioski ze starych danych.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.23

co odkryła Rosetta Inpharmatics ?

indukcja kilku genów: nie maja ze soba nicwspólnego....poza połozeniem – blisko telomeruchromosomu 7.

współczynnik korelacji (Pearsona) spada do zera jakwyłaczymy z rozwazan chromosom 7.

klastrujemy kolumny, czyli eksperymenty !

mozliwe wyjasnienie: duplikacja – mamy doczynienia zaneuploidem.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.24

wpółczynnik korelacji

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.25

aneuploid: jak czesto ?

obydwa muntanty drozdza posiadały zduplikowanychromosom 7: jak czesto to sie zdarza ?

przepadano 290 drozdzy mutantów – u 22 cos siezduplikowało: duzo czesciej niz podejrzewanowczesniej.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.26

biomedyczne zastosowania

zmutowane genomy sa niestabilne =⇒ utrata kontrolinad cyklem komórkowym =⇒ zmiany nowotworowe.

diagnostyka medyczna – pierwsze zastosowania:białaczka, rak piersi (trudniej);

klasyfikacja odmian nowotworów =⇒(przeciw)wskazania dotyczace terapii.

jak ewoluowała przez ostatnie 100 lat szczepionka nagruzlice ?

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.27

diagnostyka

badano poziom ekspresji 17856 genów w komórkachlimfocytów.

96 pacjentów porównano z cDNA limfocytówhodowlanych.

wynik: chaos – wiekszosc genów o nieznanychfunkcjach.

ale klasteryzacja hierarchiczna poziomów ekspresjiwyróznia dwie grupy.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.28

ekspresja limfocytów

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.29

ekspresja limfocytów,cd.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.30

ekspresja limfocytów,cd.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.31

ekspresja limfocytów,cd.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.32

szczepionka na gruzlice

Mycobacterium tuberculosis zabija rocznie 2 mln ludzi.

pierwsza szczepionka ok. 1900 w Lille dziekiwspółpracy Albert Calmette i Camille Guérin. BCG(bacille de Calmette et Guérin)

uzyto bakterii M. bovis (atakujacej bydło); testy naswiniach, pierwszy sukces w 1921, kolejne latadowodza skutecznosci szczepionki.

1930: wpadka w Lubece (zakazenie szczepionek),

1960 bakteria BCG zamrozona w instytucie Pasteura(zeby zminimalizowac mutacje).

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.33

szczepionaka BCG

jak genom M. bovisewoluował ?

3902 ORFów na płytce,3756 ulega ekspresji.

13 genomów BCG zcałego swiata porównanedo dzikiego M. bovis.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.34

szczepionka BCG, c.d.

ORF obecny w obydwu genomach, ORF, który uległdelecji w genomie BCG.

namierzono 16 regionów delecji.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.35

szczepionka BCG, c.d.

jak wiele ORFów znikneło ? wyrazny przykładniestabilnosci genomów.

1000 generacji genomu w warunkach laboratoryjnych:selekcja na genomy lubiace ziemniaki z cukrem, a niete, które najlepiej uodparniaja :)

szansa na lepsza szczepionke – odtworzeniepierwotnego genomu.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.36

szczepionka BCG, c.d.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.37

znowu niezastapione drozdze

jak genom in vivo reaguje na podanie leku.

cel: wykorzystac ogromna wiedze o metabolizmiedrozdza.

jest łatwiej jesli znamy sciezke (siec zaleznosci), wktórej uczestniczy białko docelowe (ang. target).

drozdzowe chipy DNA po raz kolejny w uzyciu.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.38

niezastapiony drózdz, c.d.

testujemy działanie dwóch lekówimmunosupresyjnych: CsA i FK506

stosowane w chorobach autoimmunologicznych,

po transplantacji organów,

UWAGA: drózdz nie ma układu immunologicznego !

ale badane leki blokuja białka odpowiedzialne zaprzewodzenie sygnałów w komórce (ich silniezakonserwowane homologi sa tez u człowieka).

Calcineurin ma dwa inhibitory bedace kompleksamibiałko-lek.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.39

działanie leków

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.40

eksperyment

drózdz wt rosnie spokojnie oraz w obecnosci lekuFK506 (obrazek z lewej).

ekspresja drozdza wt porównana z ekspresja drozdzamutanta cna (delecja genu kodujacego Calcineurin) –obrazek z prawej.

teoretycznie efekt powinien byc ten sam (szare kropkina wykresie).

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.41

ekspresja leczonego drozdza

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.42

reakcja na lek, c.d.

indukcja lub represja genów u drozdzy mutantów wporównaniu do dzikiego nieleczonego drozdza (wt -).

druga kolumna = drug signature genes.

cna, fpr1, oraz cna/fpr1 to mutanty, które niereaguja na FK506.

podobnie cph, cna, cna/fpr nie reaguja na CsA,czyli uszkadzaja odpowiednia sciezke.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.43

leczymy drozdze c.d.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.44

wtórny target

dlaczego dziki drózdz po podaniu leków nie reagujedokładnie tak samo jak drózdz mutant, któregopozbawiono białka wiazacego lek ?

mutant jednak produkuje “wyciete” białka,

sa inne białka wiazace lek (alternative targets)

wariancja jest nieunikniona w tej metodzie.

odpowiedz ewidentna po przeanalizowaniu reakcji naduze stezenie leku.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.45

wtórny target

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.46

terapia nowotworów

NCI (National Cancer Institute) uzywa 60 linii komóreknowotworowych przy testowaniu chemioterapii.

zbadac transkryptom i sklasyfikowac te komórki.

pod lupa 8000 genów, jako kontrola mieszankazdrowych komórek ludzkich.

1611 OFRów których ekspresja jest co najmniej 7 razywyzsza lub nizsza u co najmniej 4 sposród 60badanych linii.

klasteryzacja podobnych wzorców ekspresji.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.47

klasteryzacja komórek rakowych

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.48

terapia nowotworów, c.d.

pewne rodzaje łatwiej sie odrózniaja, rak piersiszczególnie trudny w klasyfikacji.

melanoma (czerniak) duzo lepiej “sie klastruje” –wyraznie widac geny które odrózniaja ten rodzajkomórek od innych.

sposób ma trudne komórki: powtórzyc ekspermenttylko dla tych OFRów, które sie eksprymuja.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.49

klasteryzacja komórek rakowych

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.50

terapia nowotworów, c.d.

czy mikromacierze moga pomóc w doborzechemioterapii dla pacjenta ?

integrujemy dwa zbiory danych: dane o profilachekspresji 60 komórek rakowych oraz dane o reakcjachtych komórek na 118 substancji chemicznych.

przeciecie tych eksperymentów zilustrowane jako CIM(ang. clustered image map) os X – geny (1376), os Y –118 leków.

czerwony punkt = wysoka korelacja pomiedzyskutecznoscia leku a indukcja genu, niebieski = lekbardziej skuteczny jesli gen ulega represji.

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.51

clustered image map

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.52

terapia nowotworów, c.d.

przypadek szczególny białaczka:

komórkom nowotworowym brakuje syntetazyasparginy (gen ASNS),

jesli wyeliminujemy dostarczanie tego aminokwasu –zagłodzimy raka,

dostepny na rynku lek L-asparginaza (czyli enzymktóry tnie aspargine).

CIM pokazuje negatywna korelacje pomiedzyskutecznoscia leku a aktywnoscia białka ASNS.

dla komórek białaczki współczynnik korelacji jest−0.98. Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.53

głodzimy raka

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.54

blaski i cienie mikromacierzy

wskazówki dot. funkcji genu,

pewne zwiazki i zaleznosci miedzu genami,

ograniczona rozdzielczosc: ogólny schemat widocznyale zachowanie specyficznego genu ...

pointylizm [wymawiaj puentylizym] :)

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.55

Georges Seurat: Grande Jette

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.56

Georges Seurat: Honfleur

Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.57