Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA
description
Transcript of Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA
![Page 1: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/1.jpg)
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin
3. Izolace DNA
Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013
Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických
oborů PřF JU
reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364
![Page 2: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/2.jpg)
Sběr materiálu na izolaci DNA
Obecné zásady:
v principu je možné použít kteroukoli část rostliny
• ideální je čerstvý materiál
• problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy), herbáře
• brát tkáně s co nejnižším obsahem sek. metabolitů pokud možno zdravou tkáň, neinfikovanou ostatními organismy radši na jeden typ tkáně
• výsledky některých metod mohou být ovlivněné typem tkáně
(např. tkáňově nebo i sezonně specifická methylace DNA může ovlivnit restrikční krok u AFLP)
zabránit rozkladným procesům, kterými vznikají látky poškozující nebo jinak znehodnocující DNA (fixace materiálu)
![Page 3: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/3.jpg)
Fixace materiálu před izolací
Vysoušení
silikagel – asi ideální; při recyklování silikagelu je vhodné aby použitý silikagel nebyl v přímém kontaktu se vzorky (vzorek dát do papírového sáčku a ten teprve to plastikového se silikagelem)
při pokojové teplotě nebo v sušárně taky funguje (mechorosty, lišejníky); ale herbářové položky rostlin mohou být problematické
vysušený materiál je vhodné zamrazit (-20º nebo -80ºC) nebo alespoň skladovat v ledničce, a pokud možno co nejdřív dále zpracovat
Nakládání do koncentrovaného NaCl-CTAB roztoku
vhodné pro sukulenty, ale i křehké vodní rostliny, vydrží až měsíce při pokojové teplotě
![Page 4: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/4.jpg)
Fixace materiálu před izolací
Nakládání do ethanolu
není příliš výhodné (DNA tvoří nerozpustné komplexy s proteiny, nižší výtěžek, řeší to přidání proteinázy)
Zamrazováním čerstvého materiálu
bez problémů, ale není nutné
![Page 5: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/5.jpg)
Vlastní DNA izolace
Volba extrakční metody
jak moc kvalitní DNA potřebujeme a v jakém množství
kolik máme peněz a času:
komerční kity vs. klasické protokoly (běžné chemikálie)
dražší (50-150 Kč/vz.) velmi levné (několik Kč/vz.)
ca 2h ca > 2h (dl. inkubační kroky)
čistá DNA, ale někdy málo vyšší výtěžek DNA, někdy problémy s čistotou
![Page 6: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/6.jpg)
Vlastní DNA izolace
Kroky izolace DNA:
homogenizace - rozrušení buněčné stěny
lyze buněčných membrán - pomocí detergentu za zvýšené teploty (DNA se uvolní do roztoku, zvýšená teplota denaturuje proteiny, ale může způsobovat fragmentaci DNA)
purifikace DNA - odstranění kontaminantů:• proteiny – DNázy štěpící DNA, histony a mnoho dalších...• fenolické látky – jejich oxidací vznikají chinonické sloučeniny,
které můžou degradovat DNA nebo inhibovat enzym. reakce• huminové kyseliny – silný inhibitor, vznikají rozkladem tkání• polysacharidy• RNA
čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě
![Page 7: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/7.jpg)
Vlastní DNA izolace
Homogenizace materiálu - mechanicky:
drobné vzorky pomocí homogenizačních tyčinek, v malém množství extrakčního pufru, příp. se sterilním pískem
středně velké kousky tkáně (<10 cm) v mlýnku, drcení kovovými kuličkami (za sucha) – ideální pro větší počty vzorků (ale hlučné)
nebo klasická drtící miska (+ kapalný N2) pro velké vzorky
![Page 8: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/8.jpg)
Vlastní DNA izolace
Homogenizace materiálu – chemicky nebo jinak:
sodium nebo potassium ethyl xanthogenát rozpouštějící celuózu
střídáním cyklů povaření/zamražení (např. řasy a sinice)
Nevysušený materiál:
je třeba homogenizovat pomocí kapalného N2 (zamražení chrání DNA před degradací DNazami)
pouze v případě materiálu naloženého v NaCl-CTAB je ideální drcení za pokojové teploty
![Page 9: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/9.jpg)
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
NaOH metoda
velmi rychlá a jednoduchá (1 vz. několik minut!)
zvýšené pH denaturuje proteiny (DNazy), pomáhá rozložit buněčnou stěnu; centrifugací se odstředí zbytky tkáně, supernatant se naředí pufrem (Tris-HCl)
i pro malé množství materiálu (mechorosty, lišejníky, cév. rostliny), který by ale neměl obsahovat příliš kontaminantů
nepříliš čistá DNA, použitelná pouze pro PCR (nikdy ne např. AFLP!)
vyizolovanou DNA nelze kvantifikovat
![Page 10: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/10.jpg)
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
CTAB extrakce
NaCl-CTAB pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) CTAB je detergent; přidání PVP vychytá fenolické látky; RNasa A rozštěpí
RNA
CTAB vytváří komplex s proteiny, polysacharidy i DNA; za vysoké koncentrace solí (NaCl) ale zůstává CTA-DNA komplex rozpustný ve vodě
přidání směsi chloroform - isoamylalkohol, po centrifugaci:
◄ vodní fáze s DNA - opatrně odpipetovat
◄ rozhraní (proteiny) + odpadní organická fáze (lipidy, proteiny)
(krok s přidáním směsi a odpipetováním DNA fáze lze i 1-2 zopakovat)
![Page 11: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/11.jpg)
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
CTAB extrakce
přidáním isopropanolu se vysráží CTA-DNA sůl, centrifugací DNA pelet (většina polyfenolů, proteinů a polysacharidů zůstane v supernatantu)
pozn.: selektivní vysrážení DNA - přidáním CTAB pufru s nižší konc. NaCl, odstranit supernatant, přidat NaCl nutný pro rozpuštění DNA peletu, zopakovat chloroform - isoamylalkoholovou separaci a pokračovat semikvantitativním isopropanolovým přesrážením
bílý DNA pelet(zabarvení značí nečistoty)
DNA pelet přečišťován přesrážením ethanolem a rozpuštěn v TE nebo vodě – použitý objem ovlivní koncentraci DNA roztoku
vhodné i pro malé množství materiálu, někdy problémy s čistotou DNA zabere ~4 h a víc
![Page 12: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/12.jpg)
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
SDS extrakce
izolační pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA)
po přidání SDS a octanu draselného se za snížené teploty vysráží kontaminanty (proteiny, polysacharidy)
vysrážené kontaminanty centrifugací sednou na dno, odebere se DNA supernatant, který je dále přečišťován přesrážením např. isopropanolem
RNasa A rozštěpí RNA
podobně jako CTAB někdy problémy s čistotou DNA
výhoda proti CTAB - nepoužívá toxické chemikálie
izolační pufr se sodium nebo potassium ethyl xanthogenátem rozpouštějící polysacharidy – u buněk s obtížně narušitelnými buněčnými stěnami (sinice)
![Page 13: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/13.jpg)
Vlastní DNA izolace
Princip komerčně dostupných kitů na izolaci DNA:
lyzační fáze, příp. odstranění proteinů proteinazou, vysrážení kontaminantů octany a ošetření RNasou A
navázání DNA na matrix – nejčastěji silika membrána (příp. magnetické silika kuličky nebo iontoměničová pryskyřice)
1. za vysoké koncentrace solí se DNA selektivně váže na membránu
2. DNA na membráně je dále promývána (roztoky s ethanolem)
3. uvolnění DNA z membrány snížením koncentrace solí, tj. vymytím TE pufrem nebo vodou
- objem použité kapaliny ovlivní koncentraci DNA (min. objem většinou udáváno 30 µl; čím víc kapaliny, tím více se DNA naředí)
koncentrace získané DNA ale často nižší! existují i speciální CleanUp kity na přečištění vyizolované DNA
1
2
3
![Page 14: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/14.jpg)
Vlastní DNA izolace
Skladování DNA:
čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo voděTE pufr brání degradaci DNázami (EDTA vychytává ionty, které jsou kofaktorem enzymů)
krátkodobě (týdny) v ledničce, dlouhodobě v -20º nebo -80ºC
roztok DNA nevortexovat (mechanické poškození - fragmentace)
nevystavovat opakovanému rozmražování a zamražování(používat alikvoty)
DNA teoreticky velmi stabilní (několik let) – nejvíc záleží asi na čistotě
![Page 15: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/15.jpg)
Kontrola kvality a kvantity DNA
1) fluorimetricky barvivo selektivní pro DNA (např. PicoGreen aj. komerční barviva) vysoce přesné stanovení koncentrace DNA senzitivní i pro koncentrace ~0.1 ng/µl naměřená koncentrace není ovlivnění kontaminanty, ale nezjistíme
jejich přítomnost!
![Page 16: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/16.jpg)
Kontrola kvality a kvantity DNA
2) pomocí spektrofotometru
A260 (vln. délka 260 nm = max. absorbance nukl. kyselin)• přístroj měří ~ 5 µl vzorku• z vlastní hodnoty A260 přístroj vypočítá koncetraci DNA • nutno brát s rezervou!!!
A260 je zkreslená absorbancí kontaminantů... (např. proteiny – mají sice max. pík při A280, ale určitá hodnota absorbance je i při A260, proto má směs DNA/protein vyšší celkovou A260)
proto se používá A260/280, A260/230: čistá DNA má obě hodnoty >1.8(absorbance DNA směrem k A230 a A280 klesá)
A320: mělo by být blízké 0
jiné hodnoty → znečištění, odhad koncentrace DNA je nadhodnocený(časté zejm. u CTAB izolace)
![Page 17: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/17.jpg)
Kontrola kvality a kvantity DNA
nanodrop - spektrofotometr pro malé objemy vz. (~ 1 µl)
3) ´od oka´ zelené, hnědé, žluté nebo jiné zabarvení roztoku DNA, nebo přítomnost
sraženin indikuje kontaminaci nežádoucími látkami, které můžou, ale taky nemusí inhibovat enzymatické reakce
![Page 18: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/18.jpg)
Kontrola kvality a kvantity DNA4) elektroforéza (ELFO)
pro DNA stačí horizontální, agarózový gel (0.8-2% w/v) v TAE nebo TBE pufru
vzorky DNA se smíchají s loading buffer (glycerol pro zapadnutí vz. do jamky, obvykle 2 modrá barva pro detekci migrace vzorku)
záporně nabité molekuly DNA migrují k anodě (+), délková separace
vizualizace fluorescenčními barvivy, které se vážou na DNA (GelRed, SybrGreen, ethidium bromid) – potenciální mutageny
![Page 19: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/19.jpg)
Kontrola kvality a kvantity DNAELFO genomové DNA
• fragmentace příliš nevadí, pokud plánujeme PCR metody; obvyklá u klasických protokolů (u kitové izolace se fragmenty <100 bp nezachytí na membránu a jsou tak odstraněny)
• pokud na gelu vidíme alespoň nějakou DNA, je koncentrace dostačující na PCR • zabarvení izolátu: kontaminanty, které můžou inhibovat enzym. reakce!
... důležité je, aby DNA fungovala na další aplikace (i DNA viditelná na gelu nemusí fungovat, a naopak neviditelná DNA může dát PCR amplifikaci)
◄ ´stín´ jamek může indikovat špinavou DNA
◄ vysokomolekulární genomová DNA (intenzita bandu koreluje s koncentrací)
smear: fragmenty DNA (degradace) nečistoty, zbytky RNA
čistá, kvalitní DNA:
![Page 20: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/20.jpg)
Shrnutí
Jakou metodu izolace DNA zvolit?
(aneb některé typické situace, které můžou nastat) potřebujeme kvalitní DNA v dostatečné kvantitě (např. AFLP), nebo
pracujeme s problematickým materiálem (sek. metabolity):
• komerční DNA kity; nepodcenit fixaci materiálu! (např. silikagel)
máme hodně vzorků (desítky-stovky), ale plánujeme metodu nepříliš náročnou na kvalitu a kvantitu DNA (sekvenování, SSR, příp. ISSR), a pracujeme s neproblematickým materiálem:
• ideálně NaOH izolace
zpracováváme vzorky z malého množství tkáně, a kitová izolace má malý výtěžek; navazující metody nepříliš náročné na kvalitu DNA:
• zkusit NaOH nebo CTAB protokol
nemáme dost peněz, nebo kitová izolace s malým výtěžkem, a potřebujeme metodu středně (ISSR) nebo vysoce (AFLP) náročnou na kvalitu a kvantitu DNA:
• zkusit CTAB nebo SDS protokol (bez záruky, zejm. pro AFLP!)
![Page 21: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/21.jpg)
Co s herbářovým materiálem?
cenný zejména typový materiál taxonů, histor. sběry vzácných taxonů,
histor. populační sběry apod. recentní položky (< 15? let) můžou být celkem bez problémů pro běžné
PCR metody - ale může se velmi lišit druh od druhu! obvykle použitelné pouze pro některé metody analýzy DNA (zejména
sekvenace PCR produktů nebo analýza SSR)
Herbářový a historický materiál (Ancient DNA)
Andreasen et al. 2009. Successful DNA amplification of a more than 200-year-old herbarium specimen: recovering genetic material from the Linnaean era. Taxon 58: 959-962.
zatím nejstarší sekvenovaná herbářová položka rostliny je stará ca 200 let (Phaulopsis talbotii – Acanthaceae, Andreasen et al. 2009)
názory na optimální metodiku nejsou jednotné, každý druh (položka) funguje jinak...
... radši nemít přehnaná očekávání
![Page 22: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/22.jpg)
Co s herbářovým materiálem?
Herbářový a historický materiál (Ancient DNA)
pozor na kontaminaci recentním materiálem!
• např. z úlomků čerstvých položek skladovaných se starým
herbářovým materiálem
• u mechů a hub patrně i sporami aj. mikroskopickými částicemi!
• při manipulaci s položkou zacházet opatrně, pinzety atd. čistit lihem
• výhodná je povrchová UV sterilizace herb. materiálu
• doporučuje se separace místností na DNA izolaci, od prostor na
další (PCR) zpracování, použití filtrovaných špiček
![Page 23: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/23.jpg)
Co tvrdí ti, kterým se povedlo získat data z herbářového materiáu:
patrně preferovat čistotu DNA nad její kvantitou; uváděné úspěšné metody izolace se často navzájem liší, nutné optimalizovat (pokus-omyl)
Herbářový a historický materiál (Ancient DNA)
Drábková et al. 2002. Comparison of seven DNA extraction and amplification protocols in historical herbarium specimens of Juncaceae. Plant Molecular Biology Reporter 20: 161-175.
Särkinen T. et al. 2012. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS One 7: e43808.
• Särkinen et al. (2012) preferuje kombinaci CTAB izolace (vysoký výtěžek) + následné přečištění izolátu na kitové silika membráně (zvýší čistotu)• Drábková et al. (2002) preferuje pro Juncaceae kitovou izolaci (Qiagen), popř. CTAB protokol• u hub a lišejníků byly úspěšné pokusy s kitovou izolací (Qiagen, Sohrabi et al. 2010), CTAB protokol (Redchenko et al. 2012), příp. jejich kombinace (May et Ristiano 2004)
![Page 24: Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062304/56814061550346895dabd6cd/html5/thumbnails/24.jpg)
Co tvrdí ti, kterým se povedlo získat data z herbářového materiáu:
Herbářový a historický materiál (Ancient DNA)
• některé typy komerčních polymeráz dávají lepší úspěšnost PCR amplifikace
Särkinen T. et al. 2012. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS One 7: e43808.
Telle et Thines 2008. Amplification of cox2 (~620 bp) from 2 mg of up to 129 years old herbarium specimens, comparing 19 extraction methods and 15 polymerases. PLoS One 3: e3584.
nejnižší úspěšnost u materiálu naloženého v lihu; nepotvrdil se negativní vliv vysoušení za vyšších teplot (Särkinen et al. 2012)
velmi záleží i na metodice následného zpracování vyizolované DNA:
fragmenty genomové DNA
(CTAB izolace Spergularia sp., 2 položky staré ca 70
let)
►
• DNA hist. vzorků je fragmentovaná → větší šance na úspěch při amplifikaci kratších úseků DNA (< ca 300 bp, např. SSR)