Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA
description
Transcript of Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 3. Izolace DNA
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice
rostlin
3. Izolace DNA
Sběr materiálu na izolaci DNA
Obecné zásady:
v principu je možné použít kteroukoli část rostliny (i dřevo)
• ideální je čerstvý materiál
• problematické můžou být kořeny (příp. vzorky půdy)
• brát tkáně s co nejnižším obsahem sek. metabolitů sbírat pokud možno zdravou tkáň (neinfikovanou ostatními
organismy) sběr omezit radši na jeden typ tkáně
• výsledky některých metod mohou být ovlivněné typem tkáně
(např. tkáňově nebo i sezonně specifická methylace DNA může ovlivnit restrikční krok u AFLP)
zabránit rozkladným procesům, kterými vznikají látky poškozující nebo jinak znehodnocující DNA (fixace materiálu)
Fixace materiálu před izolací
Vysoušení
silikagel – asi ideální; při recyklování silikagelu je vhodné aby použitý silikagel nebyl v přímém kontaktu se vzorky (vzorek dát do papírového sáčku a ten teprve to plastikového se silikagelem)
při pokojové teplotě (nebo v sušárně) – taky funguje, vhodné např. pro mechorosty, lišejníky; ale herbářové položky rostlin mohou být problematické
vysušený materiál je vhodné zamrazit (-20º nebo -80ºC) nebo alespoň skladovat v ledničce, a pokud možno co nejdřív dále zpracovat
Nakládání do koncentrovaného NaCl-CTAB roztoku
vhodné pro sukulenty, ale i křehké vodní rostliny, vydrží až měsíce při pokojové teplotě
Fixace materiálu před izolací
Nakládání do ethanolu
asi není moc výhodné (DNA tvoří nerozpustné komplexy s proteiny, nižší výtěžek, řeší to přidání proteinázy)
Zamrazováním čerstvého materiálu
bez problémů, ale není nutné
Vlastní DNA izolace
Volba extrakční metody
jak moc kvalitní DNA potřebujeme a v jakém množství
kolik máme peněz a času:
komerční kity vs. klasické protokoly (běžné chemikálie)
dražší (40-100 Kč/vz.) velmi levné (několik Kč/vz.)
ca 2h ca > 2h (dl. inkubační kroky)
čistá DNA, ale někdy málo vyšší výtěžek DNA, někdy problémy s čistotou
Vlastní DNA izolace
Kroky izolace DNA:
rozrušení buněčné stěny - homogenizace materiálu
lyze buněčných membrán - pomocí detergentu za zvýšené teploty (DNA se uvolní do roztoku, zvýšená teplota denaturuje proteiny, ale může způsobovat fragmentaci DNA)
odstranění kontaminantů:• proteiny – DNázy štěpící DNA, histony a mnoho dalších...• fenolické látky – jejich oxidací vznikají chinonické sloučeniny,
které můžou degradovat DNA nebo inhibovat enzym. reakce• huminové kyseliny – silný inhibitor, vznikají rozkladem tkání• polysacharidy• RNA
čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo vodě
Vlastní DNA izolace
Homogenizace materiálu - mechanicky:
drobné vzorky pomocí homogenizačních tyčinek, v malém množství extrakčního pufru, příp. se sterilním pískem
větší kousky tkáně v mlýnku, drcení kovovými kuličkami (za sucha) – ideální pro větší počty vzorků (ale hlučné)
nebo klasická drtící miska (+ kapalný N2)
Vlastní DNA izolace
Homogenizace materiálu – chemicky nebo jinak:
sodium nebo potassium ethyl xanthogenát rozpouštějící celuózu
střídáním cyklů povaření/zamražení (např. řasy a sinice)
Nevysušený materiál:
je třeba homogenizovat pomocí kapalného N2 (zamražení chrání DNA před degradací DNazami)
pouze v případě materiálu naloženého v NaCl-CTAB je ideální drcení za pokojové teploty
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
NaOH metoda
velmi rychlá a jednoduchá (1 vz. několik minut!)
zvýšené pH denaturuje kromě DNA i proteiny (DNazy), a pomáhá rozložit buněčnou stěnu; centrifugací se odstředí zbytky tkáně a supernatant se naředí pufrem (Tris-HCl)
vhodné i pro malé množství materiálu (mechorosty, lišejníky, cév. rostliny), který by ale neměl obsahovat příliš kontaminantů
nepříliš čistá DNA, použitelná pouze pro PCR; omezená trvanlivost?
vyizolovanou DNA nelze kvantifikovat ELFO ani spektrofotometricky
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
CTAB extrakce
NaCl-CTAB pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA) CTAB je detergent; přidání PVP vychytá fenolické látky; RNasa A rozštěpí
RNA
CTAB vytváří komplex s proteiny, polysacharidy i DNA; za vysoké koncentrace solí (NaCl) ale zůstává CTA-DNA komplex rozpustný ve vodě
přidání směsi chloroform - isoamylalkohol, po centrifugaci:
◄ vodní fáze s DNA - opatrně odpipetovat
◄ rozhraní (proteiny) + odpadní organická fáze (lipidy, proteiny)
(krok s přidáním směsi a odpipetováním DNA fáze lze i 1-2 zopakovat)
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
CTAB extrakce
přidáním isopropanolu se vysráží CTA-DNA sůl, centrifugací DNA pelet (většina polyfenolů, proteinů a polysacharidů zůstane v supernatantu)
pozn.: selektivní vysrážení DNA - přidáním CTAB pufru s nižší konc. NaCl, odstranit supernatant, přidat NaCl nutný pro rozpuštění DNA peletu, zopakovat chloroform - isoamylalkoholovou separaci a pokračovat semikvantitativním isopropanolovým přesrážením
bílý DNA pelet(zabarvení značí nečistoty)
DNA pelet přečišťován přesrážením ethanolem a rozpuštěn v TE nebo vodě – použitý objem ovlivní koncentraci DNA roztoku
vhodné i pro malé množství materiálu, někdy problémy s čistotou DNA
zabere ~4 h a víc
Vlastní DNA izolace
Příklady klasických protoklů izolace DNA:
SDS extrakce
izolační pufr s 2-merkaptoethanolem (brání degradaci DNA)
po přidání SDS a octanu draselného se za snížené teploty vysráží kontaminanty (proteiny, polysacharidy)
vysrážené kontaminanty centrifugací sednou na dno, odebere se DNA supernatant, který je dále přečišťován přesrážením např. isopropanolem
RNasa A rozštěpí RNA
podobně jako CTAB někdy problémy s čistotou DNA
výhoda proti CTAB - nepoužívá toxické chemikálie
izolační pufr se sodium nebo potassium ethyl xanthogenátem rozpouštějící polysacharidy – u buněk s obtížně narušitelnými buněčnými stěnami (sinice)
Vlastní DNA izolace
Princip komerčně dostupných kitů na izolaci DNA:
lyzační fáze, odstranění proteinů proteinazou, vysrážení kontaminantů octany, ošetření RNasou A
navázání DNA na matrix – nejčastěji silika membrána (příp. magnetické silika kuličky nebo iontoměničová pryskyřice)
1. za vysoké koncentrace solí se DNA selektivně váže na membránu
2. DNA na membráně je dále promývána (roztoky s ethanolem)
3. uvolnění DNA z membrány snížením koncentrace solí, tj. vymytím TE pufrem nebo vodou
- objem použité kapaliny ovlivní koncentraci DNA (min. objem většinou udáváno 30 µl; čím víc kapaliny, tím více se DNA naředí)
koncentrace získané DNA ale často nižší! existují i speciální CleanUp kity na přečištění vyizolované DNA
1
2
3
Vlastní DNA izolace
Skladování DNA:
čistá DNA je rozpuštěna v TE pufru nebo voděTE pufr brání degradaci DNázami (EDTA vychytává ionty, které jsou kofaktorem enzymů)
krátkodobě (týdny) v ledničce, dlouhodobě v -20º nebo -80ºC
roztok DNA nevortexovat (mechanické poškození)
nevystavovat opakovanému rozmražování a zamražování(používat alikvoty)
DNA teoreticky velmi stabilní (několik let) – nejvíc záleží asi na čistotě
Kontrola kvality a kvantity DNA
1) pomocí spektrofotometru
A260 (vln. délka 260 nm = max. absorbance nukl. kyselin)• přístroj měří ~ 5 µl vzorku• vlastní hodnota A260 by měla být v rozmezí (0.01-)0.1-1.0 (jinak výpočty nepřesné, dá se ovlivnit ředěním vz.)• z ní přístroj vypočítá koncetraci (nutno brát s rezervou)
A260 je zkreslená absorbancí kontaminantů ... (např. proteiny – mají sice max. pík při A280, ale určitá hodnota absorbance je i při A260, proto má směs DNA/protein vyšší celkovou A260)
proto se používá A260/280, A260/230: čistá DNA má obě hodnoty >1.8(absorbance DNA směrem k A230 a A280 klesá)
A320: mělo by být blízké 0
jiné hodnoty indikují znečištění, a odhad koncentrace DNA je nadhodnocený(poměrně časté např. u CTAB izolace)
c [ng/µl] = 50 x A260 x dilution factor(pro odstranění efektu kontaminantů lze od A260 odečíst A320, a teprve výsledné číslo dosadit do vzorce – může pak vyjít i záporná koncentr.)
Kontrola kvality a kvantity DNA
nanodrop - spektrofotometr pro malé objemy vz. (~ 1µl)
2) fluorimetricky• barvivo selektivní pro DNA (např. ethidium bromid, PicoGreen)• přesné stanovení koncentrace DNA: není ovlivnění kontaminanty, ale
nezjistíme jejich přítomnost!
Kontrola kvality a kvantity DNA3) elektroforéza (ELFO)
pro DNA stačí horizontální, agarózový gel (0.8-2% w/v) v TAE nebo TBE pufru
vzorky DNA se smíchají s loading buffer (glycerol pro zapadnutí vz. do jamky, obvykle 2 modrá barva pro detekci migrace vzorku)
záporně nabité molekuly DNA migrují k anodě (+), délková separace
Kontrola kvality a kvantity DNA3) elektroforéza (ELFO)
vlastní vizualizace DNA:
fluorescenční barviva, které se vážou na DNA – potenciální mutageny
• UV transluminátor – ethidium bromid (EtBr, asi mutagen), Sybr Green, Gel Red ...
• modré světlo – Sybr Green, Sybr Safe
◄ produkty restrikce PCR produktu: Sybr Green přidán do loading bufferu, stejné fragmenty migrují rozdílně (ovlivněno koncentrací DNA)
barvivo možné přidat do gelu nebo loading bufferu, ale způsobuje posuny a deformace bandů (kromě Sybr Safe); stačí pro hrubou kontrolu DNA
nebo obarvením gelu v roztoku barviva po dojetí forézy (post-staining) - dražší, ale nejvíc senzitivní a nezpůsobuje deformace a posuny bandů
Kontrola kvality a kvantity DNAELFO genomové DNA
• fragmentace příliš nevadí, pokud plánujeme PCR metody; obvyklá u klasických protokolů (u kitové izolace se fragmenty <100 bp nezachytí na membránu a jsou tak odstraněny)
• pokud na gelu vidíme alespoň nějakou DNA, je koncentrace dostačující na PCR • zabarvení izolátu: kontaminanty, které můžou inhibovat enzym. reakce!
... důležité je, aby DNA fungovala na další aplikace (i DNA viditelná na gelu nemusí fungovat, a naopak neviditelná DNA může dát PCR amplifikaci)
◄ ´stín´ jamek může indikovat špinavou DNA
◄ vysokomolekulární genomová DNA (intenzita bandu koreluje s koncentrací)
smear: fragmenty DNA (degradace) nečistoty, zbytky RNA
čistá, kvalitní DNA:
Kontrola kvality a kvantity DNA
Příklad rozdílné efektifity izolačních metod: kořeny Festuca rubra, PCR amplifikace DNA mykorhizních hub (AMF)
MoBio Soil Kit
kvalitní, čistá DNA,
ale malý výtěžek,nutné použít
>15 mg kořenů
(na další 4 druhy Poaceae ze stejné lokality stačí klasická CTAB izolace)
Qiagen Plant Kit
dostatek DNA,ale nepoužitelné, zbarvený izolát,
inhibuje PCR
CTAB izolace
+ purifikace MoBio CleanUp kitem
ztráta části DNA, ale PCR funguje
CTAB izolace
dostatek DNA, ale nepoužitelné,
silně zbarvený izolát,
inhibuje PCR
Kontrola kvality a kvantity DNA
Co s herbářovým materiálem?
recentní položky (<15? let) můžou být celkem bez problémů pro běžnou PCR, ale může se velmi lišit druh od druhu!
u staršího materiálu nutno vyzkoušet, nadějnější jsou klasické protokoly (CTAB, SDS; asi ale nemá cenu NaOH)
pozor na kontaminaci recentním materiálem!
• např. z úlomků čerstvých položek skladovaných se starým materiálem
• u mechů a lišejníků patrně i sporami aj. mikroskopickými částicemi! • při manipulaci s položkou zacházet opatrně, pinzety atd. čistit lihem
• výhodná je povrchová UV sterilizace herb. materiálu
doporučuje se separace místností na DNA izolaci, od prostor na další (PCR) zpracování, použití filtrovaných špiček