Metodika molekulární detekce virů peckovin · svého prvního popisu v roce 1988 (Chamberlain et...
Transcript of Metodika molekulární detekce virů peckovin · svého prvního popisu v roce 1988 (Chamberlain et...
VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, v.v.i.
Metodika molekulární detekce virů peckovin
pomoci RT-PCR a multiplex-RT-PCR
Metodika pro Státní rostlinolékařskou správu
Jana Jarošová, Jaroslav Polák & Jiban Kumar
Praha, 2008
2
Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a
multiplex-RT-PCR
Ing. Jana Jarošová
Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc.
Ing. Jiban Kumar, PhD. *
Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i.
odbor rostlinolékařství, oddělení virologie
Drnovská 507, 161 06 Praha-Ruzyně
*korespondujicí autor: e-mail: [email protected]
Tato práce byla financována z projektu QG0123.
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008
ISBN: 978-80-87011-86-7
3
Anotace (česky)
Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-RT-PCR
Předkládaná metodika detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-RT-PCR zahrnuje
takové metodické přístupy, které umožňují diagnostikovat tři nejběžnější viry peckovin (virus
šarky švestky - PPV, virus zakrslosti slivoně - PDV, virus nekrotické kroužkovitosti slivoně -
PNRSV) v jedné reakci, čímž snižují ekonomické i časové nároky potřebné pro detekci.
Podstatou zkoušky je zjistit ve vzorku RNA přítomnost nukleotidových sekvencí specifických
pro PPV, PDV a PNRSV. Metodika je využitelná pro potřeby orgánů státní správy při
provádění monitoringu viróz na peckovinách i pro zprostředkované využití soukromými
pěstiteli. Metodika zahrnuje přesný postup od odběru vzorku až po vyhodnocení výsledků.
Anotace (anglicky)
Methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex
RT-PCR
The methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex RT-
PCR includes approaches, which enable to detect the most common stone fruit viruses (Plum
pox virus - PPV, Prune dwarf virus - PDV, and Prunus necrotic ringspot virus - PNRSV) in
one reaction and thus reduces time and money requirements. The essence of the test is to
detect presence of RNA specific for each virus in the sample. The methodology is usable for
state administration bodies when monitoring stone fruit viruses’ occurrence as well as
mediated for purposes of private growers. The methodology includes exact procedure
description, from collecting samples to results evaluation.
Oponenti:
Ing. Gabriela Červená, Ph.D.
Státní rostlinolékařská správa
Šlechtitelů 23/773, 779 00 Olomouc
Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CsC.
ČZU, FAPPZ, Katedra ochrany rostlin
Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 – Suchdol
Metodika byla schválena odborem vědy a výzkumu, MZe ČR pod č. j.:47968/08-18020 ze dne 30.12.2008.
4
Obsah Cíl ............................................................................................................................................................ 5
Úvod ........................................................................................................................................................ 5
Rozšíření virů peckovin v ČR ................................................................................................................. 6
Principy ochrany...................................................................................................................................... 7
Biologie a škodlivost virů peckovin ........................................................................................................ 7
Biologie vektorů PPV ............................................................................................................................ 11
Zjišťování výskytu ................................................................................................................................ 13
Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV .......................................................... 14
Odběr vzorku ..................................................................................................................................... 15
Izolace RNA ...................................................................................................................................... 15
One-step-RT-PCR ............................................................................................................................. 17
Two-step-RT-PCR............................................................................................................................. 19
Vizualizace PCR produktů ................................................................................................................ 20
Srovnání „novosti postupů“ ................................................................................................................... 21
Popis uplatnění metodiky ...................................................................................................................... 21
Seznam použité související literatury .................................................................................................... 21
Seznam publikací, které předcházely metodice ..................................................................................... 24
5
Cíl
Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě
současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti
slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV).
Úvod
Pěstování peckovin je důležitá součást zemědělství mírného a subtropického pásma,
z jak ekonomického, tak i kulturního hlediska. Peckoviny jsou důležitou skupina ovoce, z nějž
nejvýznamnějšími druhy jsou švestky (Prunus domestica), broskvoně (Prunus persica),
meruňky (Prunus armeniaca), třešně (Prunus avium) a višně (Prunus cerasus). Světová
produkce peckovin dosahuje přibližně 30 miliónů tun ročně, přičemž přes deset miliónů tun je
vyprodukováno v Evropě a 30 000 tun v České republice (FAOSTAT databáze). Existuje
mnoho virových původců chorob infikujících peckoviny. Nejzávažnější virovou chorobou je
bezesporu šarka švestky, způsobená virem šarky švestky-Plum pox virus (PPV). Způsobuje
významné ztráty na výnosech, které mohou dosáhnout u náchylných odrůd až 95%, a je široce
rozšířena ve většině států Evropy, v řadě zemí Asie a na severu Afriky - Turecko, Egypt,
Sýrie, Indie (Simon et al., 1997), pravděpodobně i Čína, v Severní i Jižní Americe - Chile,
Argentina, USA a Kanada (Malinowski et al., 2006). PPV je přenášen velkým počtem mšic
necirkulativním, nepersistentním způsobem. PPV virulentní mšice může tudíž strom nakazit
jediným akvizičním sáním na zdroji infekce. Mezi nejzávažnější Ilarviry napadající peckoviny
patří virus zakrslosti slivoně - Prune dwarf virus a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně -
Prunus necrotic ringspot virus. Tyto viry, samotné nebo v kombinaci, mohou snížit výnos,
dozrávání plodů a růst stromů. Krom vegetativního přenosu jsou přenášeny i pylem a
semenem, což napomáhá jejich rozšíření (Saade et al., 2000). Všechny tyto viry mohou být
přítomny v pletivech stromů samostatně nebo v kombinacích. Vyšší rostliny jsou běžně
napadány několika viry současně, a mnoho chorob je způsobeno interakcí dvou nebo více
nezávislých virů (Pruss et al., 1997).
Ochrana peckovin proti virovým chorobám spočívá v získávání a produkci zdravého
množitelského materiálu, čehož se v Evropě dosahuje certifikačními programy, které
jednotlivé státy samostatně vypracovávají podle certifikačního schématu EPPO. Stromy jsou
pěstovány z otestovaného viruprostého množitelského materiálu v izolaci od potencionálních
zdrojů choroby a před předáním pěstitelům testovány. Nejčastěji používanou metodou je
6
imunologická metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), nicméně její výsledky
by měly být brány s jistou dávkou obezřetnosti, neboť distribuce viru v rostlině není jednotná
a předvídatelná (Ogawa et al., 1995). ELISA také není schopna detekovat virus přítomný ve
velmi nízkém titru, což je u směsných infekcí možné (Sánchez-Navarro et al., 2005).
Alternativně se dají použít klasické biologické testy na indikátorových rostlinách, jako
broskvoně cv. GF 305 nebo višeň plstnatá (Prunus tomentosa) (Ogawa et al., 1995). Tyto
testy jsou ovšem časově velmi náročné (od měsíců po 2-3 roky), drahé a ve většině případů
musí být výsledky potvrzeny jinou detekční metodou (Sánchez-Navarro et al., 2005). Krom
ELISY se v mnoha zemích používá molekulárních metod jako RT-PCR (Ogawa et al., 2005).
Molekulární metody nabízí praktickou alternativu metodám předchozím, díky své vysoké
specifičnosti a detekčním limitům. Multiplex polymerázová řetězová reakce (PCR) je
variantou PCR, v níž dvě a více cílových míst je současně amplifikováno v jedné reakci. Od
svého prvního popisu v roce 1988 (Chamberlain et al, 1998) byla tato metoda úspěšně
uplatněna v mnoha oblastech molekulární biologie (Henegariu et al., 1997). Metody, které
umožní simultánní detekci více virů jsou pro rutinní testování žádoucí, neboť vyžadují méně
času, práce a nákladů. V tomto smyslu multiplex RT-PCR je schopna spolehlivě detekovat
viry a viroidy v rutinní diagnostice (Sánchez-Navarro et al., 2005).
Rozšíření virů peckovin v ČR
V České republice byl výskyt viru šarky švestky prokázán v přírodě i v ovocných sadech na
všech druzích peckovin vyjma třešně a višně. Je široce rozšířen ve stromech švestky a
myrobalánu i v některých výsadbách meruňky a broskvoně. Onemocnění peckovin šarkou se
v současné době vyskytuje plošně nejen v nížinách, ale i v podhůří a vyšších polohách, kde
ještě před třiceti nebo čtyřiceti lety byly švestky zdravé. Slabší výskyt viru je pouze v jižních
Čechách a na jižní Moravě. K přírodním hostitelům tohoto viru patří trnky, které byly
infikovány přenosem mšicemi ze švestek, slivoní a myrobalámu a staly se sekundárním
zdrojem infekce (Polák, 2006). Virus zakrslosti slivoně je v současnosti rozšířen převážně na
trnkách, třešni a myrobalánu. Na třešni a myrobalánu je také rozšířen virus nekrotické
kroužkovitosti slivoně (Polák, 2007). Výskyt viru chlorotické skvrnitosti jabloně (ACLSV) a
viru mozaiky jabloně, které na švestce a slivoních mohou vyvolávat příznaky podobné šarce,
tzv. pseudošarku, je v ČR ojedinělý. Ve výsadbách třešně se může také vyskytnout virus
7
svinutky třešně (Cherry leaf roll virus - CLRV), avšak i jeho výskyt je sporadický. Rozšíření
virů v ČR je uvedeno v tabulce č. 1.
Tab.č.1. Rozšíření virů na peckovinách v ČR, uvedeno v procentech infikovaných rostlin
(Polák, 2007).
Virus→ PPV PDV PNRSV ACLSV ApMV CLRV
Švestka 74% 2% 27% 1% 1% -
Myrobalán 26% 11% 18% 1,8% 0,6% -
Trnka 5% 27% 4% 0% 0% -
Třešně a
višně
0% 25% 22% - - 1,8%
Principy ochrany
Základem ochrany proti virům peckovin je zdravý výsadbový materiál. Vysazení zdravého,
viruprostého školkařského materiálu nám však ještě nemusí zaručit, že během několika málo
let nedojde k infikování mladých stromů virem šarky švestky, který je snadno přenosný
mšicemi. Virem infikované stromy nelze léčit, neexistují žádné chemické ani biologické
prostředky, kterými by bylo možno stromy ošetřit a uzdravit nebo je před virovou infekcí
chránit tak, jako tomu je v případě bakteriálních a houbových chorob. Jedinou možností
účinné ochrany proti rostlinným virům je pěstování odolných – rezistentních, nebo dokonce
imunních odrůd peckovin. Problém viru šarky švestky můžeme proto vyřešit pěstováním
odrůd slivoní, švestky, meruňky a broskvoně rezistentních k viru šarky švestky (Polák, 2006).
Proti ostatním virům nejsou zatím známy zdroje rezistence ani naprosto rezistentní odrůdy.
Biologie a škodlivost virů peckovin
Všechny výše zmíněné viry jsou jednovlákné RNA viry. Existuje šest skupin viru šarky
švestky: PPV-D (Dideron), PPV-M (Marcus), PPV-EA (El Amar), PPV-C (Cherry), PPV-Rec
(Recombinant) a nedávno identifikovaný PPV-W (W3174) (James a Varga, 2004). PPV-D a
PPV-M jsou dvě hlavní skupiny viru, obě široce rozšířené v Evropě, a vykazují závažné
rozdílnosti v patogenitě a některé ve svých epidemiologických vlastnostech. Liší se hlavně
v intenzitě choroby mezi jednotlivými druhy Prunus spp. a schopnosti infikovat broskvoň (P.
persica) přenosem mšicemi (Quijot et al., 1995). Skupina kmenů PPV-M a konkrétně
originální kmen PPV-M izolovaný ve Francii vykazuje nejvyšší patogenitu a nejsilnější
8
příznaky na listech i plodech peckovin. Ve střední Evropě v Polsku (Malinowski, 2003),
České republice (Polák a Pívalová, 2005) i v Rakousku (Laimer et al., 2003) převládá
rozšíření slaběji patogenního kmenu PPV-D, více než 90% infikovaných stromů je infikováno
PPV-D. Mezi přírodními hostiteli se jiný kmen než PPV-D téměř nevyskytuje. Přesto existují
sady meruněk a broskvoní infikovaných PPV-M. Ojedinělě byl zjištěn i rekombinantní kmen
PPV-Rec. Jiná situace je v dalších evropských zemích a v jihovýchodní Evropě, v Bulharsku
a Řecku, kde převládají kmeny ze skupiny PPV-M. Např. Kamenova et al. (2003) zjistili
v Bulharsku na meruňkách a broskvoních pouze PPV-M, na švestkách dosahuje podíl PPV-M
88%.
Virus zakrslosti slivoně byl pojmenován svými objeviteli v roce 1936. Jméno zůstalo, ačkoli
výskyt PDV na slivoni je mnohem méně běžný než na jiných druzích rodu Prunus. Nejčastěji
se vyskytuje na višni (P. avium) (Németh, 1986). Příznaky se obvykle několik let po infekci
vůbec neprojeví, občas může být v prvním roce infekce zaznamenáno žloutnutí listů. Projev
příznaků je nejpravděpodobnější asi dva týdny poté, co se noční teploty pohybují okolo 10-
15°C a denní vyšplhají nad 30°C. Napadené listy jsou zkroucené, žlutozelené, zelené podél
hlavních žil. Může docházet k opadávání listů. U napadených stromů se může vyvinout
„vrbovitý vzhled“ s růstem dlouhých holých větví. Na třešních (P. cerasus) napadených PDV
mají listy normální zabarvení a vigor, ale jsou užší a delší než je obvyklé. Symptomy mohou
být omezeny jen na část stromu. Výnos u višní může být snížen až o 50% (Pscheidt, 2008).
PNRSV je lehce přenosné očkováním a roubováním. Šíří se také přirozeně v sadech
infikovaných semenem a pylem, tudíž, přirozené šíření je až do věku stromů, kdy začnou
kvést, značně omezené. Virus se šíří rychleji na višních (P. avium) než na třešních (P.
cerasus). Díky šíření pylem může vysoké procento semen obsahovat PNRSV (Pscheidt,
2008). Některé izoláty nejsou symptomatické, zatímco jiné vyvolávají tvorbu
charakteristických chlorotických kroužků a dírek v mladých listech. U třešní byly popsány
dva izoláty podle toho, zda tvoří jemné kadeřavění listů (M) nebo mozaiku (R) (Aparicio et
al., 1999). Mezi klasické příznaky patří také deformace listů a zakrslost. Postiženy mohou být
celé rostliny nebo jen část. Na rozdíl od PDV, příznaky jsou více viditelné při vysokých
teplotách (Németh, 1986). Výnos stromů napadených běžným izolátem klesá o cca 5%
(Pscheidt, 2008). Stubbs a Smith (1971) a Scott et al. (2001) zaznamenali synergickou reakci
Prune dwarf virus a Prunus necrotic ringspot virus způsobující zakrslost broskvoně. Častým
příznakem této směsné infekce je tvorba rozet.
9
Obrázek č. 1. Plody meruňky (P. armeniaca) se symptomy PPV. Zdravý plod je vpravo dole.
(foto INRA Bordeaux, France). Plod meruňky (P. armeniaca) s charakteristickými
kroužkovými mozaikami na pecce (foto J. Kumar, VÚRV v.v.i.).
Obrázek č. 2. Kroužky a difúzní skvrny na listech meruňky (P. armeniaca)cv. Carola,
infikované PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.)
Obrázek č. 3. Symptomy na listech slivoně (P. domestica) způsobené PPV. (foto J.Kumar,
VÚRV v.v.i.).
10
Obrázek č. 4. Povrchové propadliny a vnitřní nekrózy způsobené PPV na plodech švestky
domácí (P. domestica). (foto INRA Bordeaux, France).
Obrázek č. 5. Symptom na listech náchylné broskvoně (P. persica). (foto J. Polák, VÚRV
v.v.i.).
Obrázek č. 6. Plod broskvoně cv. Catherina s typickými kroužky a difuzními skvrnami
vyvolanými PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.).
Obrázek č. 7. Příznaky PNRSV na listech broskvoně (P. persica). (foto E.V.Podleckis, West
Virginia University)
11
Obrázek č. 8. Listy třešně s příznaky chlorotické skvrnitosti a kroužkovitosti v nichž byla
prokázána přítomnost PNRSV (P. cerasus) (foto a. Oregon State University; b. J. Polák,
VÚRV v.v.i.)
Obrázek č. 9. Příznaky PDV na listech a) višně (P. avium) (foto Oregon State University) a
b) třešně (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.).
Biologie vektorů PPV
V přírodě je šarka šířena mšicemi. Virus šarky švestky je přenášen mšicemi nepersistentním
způsobem na stiletech mšic. Mšice je schopna virus získat nasátím již při zkusmém sání
během několika minut. Po nabývacím sání je schopna jej přenést na zdravou rostlinu během
několika minut inokulačního sání. Použití insekticidů je prospěšné pro hubení mšic, ale
nezabrání přenosu viru v případě, že mšice již má virus na stiletech a přilétá z neošetřených
stromů. V tom případě může virus přenést dříve, než se projeví působení insekticidu. PPV
přenáší řada druhů mšic, proto jmenujeme jen ty nejvýznamnější a nejrozšířenější vektory:
mšice broskvoňová (Myzus persicae) - obr.14, mšice chmelová (Phorodon humuli) - obr.13, a
12
mšice slívová (Brachycaudus helichrysi) - obr.11. Zdroji infekce pro přenos šarky mšicemi
jsou nemocné stromy peckovin v sadech a zahradách. Infikované stromy švestky, meruňky,
broskvoně, ale především i planě a přirozeně rostoucí stromy myrobalánu, švestky, a v
oblastech se silným výskytem šarky i keře trnky, jsou zde sekundárním zdrojem infekce.
Významnými rezervoáry viru jsou stará stromořadí švestky, keře a stromy myrobalánu
rostoucí podél venkovských silnic a cest (Polák, 2002).
Obrázek č. 10. Mšice švestková – Hyalopterus pruni. (foto W.Cranshaw, Colorado State
University)
Obrázek č. 11. Mšice slívová – Brachycaudus helichrysi. (foto H.J.Buhr, Germany)
Obrázek č. 12. Mšice bodláková – Brachycaudus cardui. (foto INRA Bordeaux, France)
13
Obrázek č. 13. Mšice chmelová – Phorodon humuli (foto G. Eickelmann, Geisenfeld,
Germany)
Obrázek č. 14. Mšice broskvoňová - Myzus Persicae (foto University of Minnesota)
Zjišťování výskytu
Jediná možná spolehlivá metoda zjišťování výskytu je testování rostlin. Mnohé infikované
rostliny nevykazují, alespoň ze začátku, příznaky choroby, stejné příznaky mohou být
vyvolány různými viry, a je tudíž u mnoha případů nemožné chorobu diagnostikovat čistě
symptomaticky. Symptomatika tedy slouží pouze jako pomocné kritérium hodnocení infekce
(Pscheidt, 2008). Virus nemusí být ve stromech rovnoměrně rozšířen, je distribuován
nerovnoměrně, a jeho koncentraci ovlivňují klimatické podmínky a roční období. Pro
diagnostiku za pomoci testu ELISA jsou nejvhodnější listy a květy. V podmínkách ČR se
provádí stanovení PPV v květech během měsíce dubna a května, a v listech koncem května a
v červnu, později obsah viru v listech klesá. V diagnostice méně příznivých obdobích, jako je
zima, kdy je nutno odebírat vzorky zelené kůry, by tedy neměly být výsledky dosažené
metodou ELISA brány jako spolehlivé (Spiegel and Martin, 1993). Polymerázová řetězová
reakce (PCR) je vysoce citlivá spolehlivá metoda, která našla uplatnění při mnoha
„problematických detekcích“, obzvláště v diagnostice kmenů virů a stanovení přítomnosti
14
virů v odrůdách se zvýšenou rezistencí. Multiplex RT-PCR je schopna detekovat více virů
současně a tudíž je výhodná z hlediska časového i ekonomického.
Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV
Předkládaná multiplex RT-PCR byla otestována na vzorcích odebraných ze švestky domácí
(Prunus domestica L.), třešně ptačí (P. avium (L.) L.), třešně višně (P. cerasus L.), višně
plstnaté (P. tomentosa Thunb.), meruňky obecné (P. armeniaca L.), broskvoně obecné (P.
persica (L.) Batsch), a trnky obecné (P. spinosa L.) a na její citlivost nebyl zaznamenám vliv
druhu rostliny. Dále byla otestována a potvrzena schopnost detekovat jednotlivé kmeny viru
šarky švestky nacházející se na území ČR, a to PPV-D, PPV-M a PPV-Rec. U PDV a PNRSV
jsme testovali dostupné izoláty z ČR a Rumunska. Diagnostická citlivost a specifičnost byla
testována celkem na 80 vzorcích a porovnána s metodou simplex RT-PCR schopnou
detekovat v jedné reakci pouze jeden virus (viz tabulka č. 2). Mezi oběma metodami nebyly
shledány žádné rozdíly.
Tabulka č. 2: Porovnání diagnostické citlivosti a specifičnosti metody simplex one-step-RT-PCR a multiplex
one-step-RT-PCR.
Izolát Hostitel Původ Počet vzorků Simplex
one-step-RT-PCR
Multiplex
one-step-RT-PCR
PPV PDV PNRSV PPV
PDV PNRSV
Peach Broskvoň CZ 5 + + + + + +
Cherry Třešeň CZ 12 + + + +
Sour
cherry
Višeň CZ 14 + +
Blackthorn Trnka CZ 3 + +
Plum1 Slivoň CZ 5 + + + +
Plum2 Slivoň Rumunsko 8 + + + +
Plum3 Slivoň CZ 5 + + + +
Nanking
Cherry
Višeň
plstnatá
Itálie 2 + +
Plum4(a)
Slivoň(a)
CZ 5 + +
Plum5(b)
Slivoň(b)
CZ 20 + +
Apple(c)
Jabloň(c)
CZ 1 - - - - - -
(a)PNRSV isolates,
(b)PPV isolates,
(c)ApMV isolates., CZ-Česká republika
15
Odběr vzorku
Správný odběr vzorku je nesmírně důležitý pro úspěšnou detekci. Ideální čas k odběrům je
pozdní jaro, kdy je obvykle koncentrace viru ve stromech vysoká. Odebíráme nejlépe
symptomatické středně staré listy, pokud možno rovnoměrně ze čtyř míst po obvodu koruny a
z jednoho místa středu koruny stromu. Odebereme 1-2 g vzorku k homogenizaci. Listy
dopravíme v chladu do laboratoře, kde je buď ihned zpracujeme, nebo uchováváme při -80°C.
Je také možno odebírat kůru nebo okvětní plátky, přičemž platí stejná pravidla.
Izolace RNA
Dalším důležitým krokem pro úspěšnost reakce je izolace kvalitní RNA v dostačující kvantitě
a kvalitě. Pletiva dřevitých rostlin, obzvláště venku rostoucích, obsahují vyšší množství
fenolických složek a polysacharidů, které mají inhibující vlastnosti (Nassuth et al., 2000).
Tyto látky tvoří chemické vazby s nukleovými kyselinami i proteiny při homogenizaci vzorku
(Newbury & Possingham, 1977). Přítomnost inhibitorů poté ovlivňuje aktivitu reversní
transkriptázy anebo polymerázy a tím i spolehlivost celé reakce. Výsledek může být tedy
negativní, ačkoli je virus v pletivu přítomen (Nassuth et al., 2000). Doporučujeme tedy
modifikovaný postup izolace přizpůsobený pro pletiva stromů jako je popsána v Singh et al.
(2002), pokud upřednostňujete izolaci fenol-chloroformem; nebo v případě používaní
„kolonkové“ metody izolace, modifikaci podle Mekuria et al. (2003). Kvalitu izolované RNA
je vhodné zkontrolovat spektrofotometricky a na agarózovém gelu. Při spektrofotometrickém
měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou, obvykle 1:9 (RNA:H2O). Měří se při
vlnových délkách 260, 230 a 280 nm. To umožní hodnocení čistoty vzorku, očekávané
poměry 260/280 a 260/230 jsou 2.0 pro RNA. Poměr absorbancí 260/280 menší než 1.75
svědčí pro obsah kontaminujících bílkovin. Absorbance při 230 nm značí nečistoty, jako jsou
karbohydráty, fenolické sloučeniny, aromatické složky. Při výpočtu koncentrace optická
hustota 1 odpovídá přibližně 40 ng/µl pro RNA. Vypočtená koncentrace by se „měla“
pohybovat mezi 200 - 1000 ng/µl. Tyto hodnoty slouží pouze k orientačnímu odhadu čistoty
a koncentrace RNA, hodnoty, které nám umožní utvrdit se v konečném výsledku RT-PCR
(např. v případě izolace RNA o koncentraci 700 ng/µl, poměrům 260/280 a 260/230 rovným 2
a negativního výsledku RT-PCR, kdy byl pozitivní výsledek u pozitivní kontroly, máme
jistotu, že v daném vzorku virus opravdu není).
Integritu izolované RNA je dále dobré zkontrolovat na denaturujícím agarózovém gelu.
Většinu izolované RNA tvoří RNA rostlinná a opět z rostlinné RNA převládá ribozomální
RNA. Ta se na gelu rozdělí na dva silné „bandy“ - 18s a 28s ribozomální RNA, přičemž
16
intenzita bandu 28s by měla být u intaktní neporušené RNA přibližně dvojnásobná intenzitě
bandu 18s. Pokud nesouhlasí poměr 2:1 nebo jsou na gelu viditelné jen „šmouhy“, celistvost
RNA byla porušena.
Protokol I. Izolace RNA modifikovanou „kolonkovou metodou“ firmy Qiagen - RNeasy
Plant Mini Kit
A) Homogenizace vzorku za použití tekutého dusíku
1. Pro izolaci RNA potřebujeme 0,2 g rostlinného pletiva. Výhodnější je ovšem
homogenizovat více a z homogenátu 0,2 g navážit. Vzorky homogenizujeme
v tekutém dusíku, u vzorků uchovávaných na -80°C dbáme na to, aby nedošlo k jejich
rozmražení, ideálně odebíráme z mrazicího boxu po každém vzorku zvlášť. Vzorek
pečlivě homogenizujeme v předmražené třecí misce.
2. Homogenát vpravte do min. 3 ml sterilní zkumavky (pokud jsou uchovávány na -80°C
v 2 ml mikrozkumavkách, doporučujeme celou zkumavku před začátkem izolace
ponořit do tekutého dusíku a poté obsah jednoduše přesypat do větší zkumavky). 3 ml
zkumavky je také možno předmrazit krátkým ponořením do tekutého dusíku. Je velmi
důležité nepřesáhnout danou váhu, neboť u kolonkových metod izolace RNA dochází
v tomto případě ke sníženému výtěžku i kvalitě RNA. Jakmile máme vzorky
navážené, je opět nutno zabránit jejich rozmražení před samotnou izolací - vhodné je
uchování v tekutém dusíku nebo v mrazicím boxu.
3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a
sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem).
4. Krátce vortexujte.
B) Homogenizace vzorku bez tekutého dusíku
Bez tekutého dusíku lze homogenizovat pouze listy čerstvé. Jeho druhou nevýhodou je, že je
před homogenizací nutno odvážit 0,2 g, a tedy ztrácíme možnost homogenizovat větší
množství materiálu a zvýšit tím pravděpodobnost výskytu viru právě v daném odebraném
materiálu.
1. Připravte si modifikovaný RLT pufr z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit
(Qiagen) - k pufru přidejte PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite
(1% - hmotnost/objem). Na jeden vzorek bude zapotřebí 2 ml takto připraveného
extrakčního pufru.
2. 0,2 g rostlinného pletiva vložte do homogenizačního igelitového pytlíku (stejný jako
pro přípravu vzorků na ELISA test).
17
3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit
(Qiagen) s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1%
- hmotnost/objem)
4. Pečlivě homogenizujte.
Izolace RNA
5. 500 µl homogenátu odeberte do 2 ml mikrozkumavky, přidejte 60 µl 20% sarcosylu
(N-lauroyl-sarcosine, Sigma).
6. Inkubujte při 70°C po dobu 10 minut.
7. Obsah přeneste do QIAshredder mini kolonky (fialová) a centrifugujte 5 min při
rychlosti 14 000 rpm.
8. Do nové 2 ml mikrozkumavky odeberte supernatant (cca 350 µl) a přidejte 315 µl
95% etanolu.
9. Promíchejte a celkový obsah napipetujte do QIA spin kolonky (růžová) a centrifugujte
15 s při 8000 x g (10,000 rpm).
10. Supernatant odstraňte.
11. Přidejte 700 µl RW1 promývacího pufru. Centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000
rpm).
12. Supernatant odstraňte.
13. Přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem. Centrifugujte 15
s při 8000 x g (10,000 rpm).
14. Supernatant odstraňte.
15. Ještě jednou přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem.
Centrifugujte 2 min při 8000 x g (10,000 rpm).
16. Supernatant odstraňte.
17. Vložte kolonku do nové zachycovací 2 ml mikrozkumavky a na sucho centrifugujte po
dobu 1 min na nejvyšší rychlost centrifugy.
18. Kolonku přendejte do 1,5 mikrozkumavky; přímo na membránu napipetujte 40 µl
RNase free vody a stočte na 10,000 rpm po dobu 1 min. Tím se uvolní RNA.
19. Kolonku odstraňte, RNA uchovávejte v -20°C nebo -80°C.
One-step-RT-PCR
Z hlediska rychlosti a spolehlivosti je vhodnější používat one-step-RT-PCR, neboť redukcí
kroků je sníženo riziko chyby a kontaminace. Při použití kitu QIAGEN OneStep RT-PCR je
protokol následující:
18
1) 5 µl 5x pufr (konečná koncentrace 2.5 mM MgCl2), 1 µl dNTPs (konečná koncentrace
200 µM každý nukleotid), 1 µl Q solution, 0.6 µl každého primeru (viz tabulka č. 3) o
koncentraci 10 µM, doplnit RNase a DNase free H2O do 23 µl a přidat 2 µl RNA.
2) Podmínky reakce jsou:
I) 50°C po dobu 30 min (reverzní transkripce);
II) 95°C po dobu 10 min (aktivace HotStarTaq polymerázy);
III) 35 cyklů ve třech krocích: 94°C po 20 s (denaturace), 51°C po 30 s (dosedání) a
72°C po dobu 1 min (polymerizace);
IV) 72°C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a
V) 10°C uchovávání.
Obrázek č. 15. Schéma zpracování vzorků metodou One Step RT-PCR.
19
Two-step-RT-PCR
Při two-step-RT-PCR v jedné reakci nejprve dojde reverzní transkripcí k tvorbě cDNA a
v druhé reakci (PCR) k amplifikaci daných cílových úseků nukleové kyseliny. Protokol je
následující:
1) Pro reverzní transkripci použijeme
I) 10 µl H2O, 0.6 µl reverzních primerů (viz tabulka č. 3) o koncentraci 10 µM (PPV-
RR, PNcpinR, PDVdpR) a 2 µl RNA a necháme po dobu 5 minut při 70°C
dosednout primery.
II) Okamžitě zchladíme a
III) podle návodu výrobce používané reverzní transkriptázy pokračujeme. Zde je pro
ukázku protokol za použití AMV reverzní transkriptázy (Promega). V mastermixu
smícháme 5μl AMV Reverse Transcriptase 5X Reaction pufru, 2 μl dNTPs mix
(konečná koncentrace 200 µM každého nukleotidu), 40 jednotek (40mM)
RNasin® Ribonuclease Inhibitor sodium pyrofosfát (předehřátý na 42°C), 2.5μl
AMV RT (30 jednotek) a doplníme vodou bez nukleáz tak aby celkové množství i
s již předtím namíchanou směsí „RNA-primer-voda“ bylo 25 µl, tedy v tomto
mastermixu do 12.4 µl.
IV) Rozpipetujeme do směsi „RNA-primer-voda“ - při pipetování „jednou špičkou“
pozor na možnost kontaminace!
2) Při PCR použijeme v mastermixu
I) 0.6 µl každého primeru o koncentraci 10 µM (při konečném obsahu jedné reakce
25 µl) a 2 µl cDNA.
II) PCR podmínky se mohou lišit podle používané polymerázy, proto zde jen pro
ilustraci uvedeme protokol za použití Go Taq polymerázy s 5X Green GoTaq™
reakčním pufrem, který v sobě již obsahuje barvivo DNA (Promega). Mastermix
se v tomto případě skládá z
(1) 5 µl pufru (1.5 mM MgCl2), 2 µl dNTPs (200 µM každého nukleotidu), 0.6 µl
každého primeru o koncentraci 10 µM, 0.2 µl (2,5 U) GO Taq polymerázy
(Promega, Medison, USA) a doplníme RNase-free H2O do celkového množství
23 µl.
(2) Rozpipetujeme do jednotlivé mikrozkumavky velikosti 0,5 ml nebo 0,2 ml (dle
typu termocycleru) a přidáme 2 µl cDNA.
III) Podmínky reakce jsou 95°C po dobu 2 min (iniciální denaturace);
20
IV) 35 cyklů po třech krocích - 95°C po dobu 20s (denaturace), 51°C po dobu 30s
(dosedání primeru neboli aneling), 72°C po dobu 1 min (polymerizace);
V) 72°C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a
VI) 10°C uchovávání.
Vizualizace PCR produktů
Vizualizace PCR produktů probíhá za pomoci eletroforetického rozdělení fragmentů v
agarózovém gelu (je doporučeno použití 1,5 - 2,5 % gelu pro lepší oddělení jednotlivých
produktů) s předchozím označením DNA za použití etidium bromidu (0,5 µg/ml) nebo Syber
Greenu (0,1 µl Syber Green/ 10 ml gel). Agarózový gel se připravuje v TAE (40 mM
Trisacetát, 1 mM EDTA, pH 8) nebo TBE pufru (89 mM Tris base, 89 mM kyseliny
trihydrogenborité, 1 mM EDTA, pH 8). Etidium bromid nebo Syber Green se dá používat
buď přímo do gelu nebo namíchat do PCR produktu. Z hlediska bezpečnosti práce však
doporučujeme používat Sybr Green, u kterého nebyl prokázán negativní dopad na lidský
organismus. 5 μl produktu obarveného barvivem (6x loading dye), je nanášeno na gel a
podstoupeno 3-9 V/cm po dobu 60 - 90 min dle velikosti gelu. V případě použití zeleného
pufru dodávaného k enzymu Go Taq (Promega) - viz. two step RT-PCR - již není zapotřebí
produkty barvit a můžeme přímo z cykleru nanášet na gel. Produkt primerů PPV-RR a F3 je
dlouhý 345 bp; PDVdpR a PDVdpuF 220 bp a PNcpR a PNcpinF tvoří 425 bp dlouhý
produkt (viz. Obrázek č. 16).
Tabulka č. 3 Seznam primerů
Primer Sekvence 5’-3’ Tm Target By
PPV-RR CTCTTCTTGTGTTCCGACGTTTC 59°C PPV Varga & James,
2005
F3 GGAATGTGGGTGATGATGG 57°C PPV Varga & James,
2006
PDVdpR CCT TTA ATG AGT CCG T 56°C PDV
PDVdpuF CCG AGT GGA TGC TTC ACG 58°C PDV
PNcpR CTTTCCATTCGGAGAAATTCG 54°C PNRSV
PNcpinF GAGTATTGACTTCACGACCAC 57°C PNRSV
21
Obrázek č. 16. Multiplex RT-PCR. Vzorky 1 - 7, postupně:1) PPV, PDV a PNRSV směsná
infekce; 2) PPV a PNRSV směsná infekce; 3) PDN a PNRSV směsná infekce; 4) PPV a PDV
směsná infekce; 5) PNRSV infekce; 6) PDV infekce; 7) PPV infekce; M) 100bp DNA ladder
marker (Fermentas).
Srovnání „novosti postupů“
V rutinní diagnostice se běžně určuje jeden cílový organismus v jedné reakci. Metoda,
umožňující detekce tří organismů současně je ekonomicky i časově výhodná.
Popis uplatnění metodiky
Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě
současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti
slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV).
Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu k zjednodušení rutinních detekcí virů
na peckovinách. Zprostředkovaně může sloužit i pro soukromé pěstitele peckovin.
Seznam použité související literatury
Al Rwahnih M., Turturo C., Minafra A., Saldarelli P., Myrta A., Pallás V., Savino V., 2004.
Molecular variability of Apple chlorotic leaf spot virus in different hosts and geographical
regions. J. Plant Pathol. 86 (2): 117-122.
Aparicio F., Myrta A., Di Terlizzi B., Pallás V., 1999. Molecular Variability Among Isolates
of Prunus Necrotic Ringspot Virus from Different Prunus spp. Virology 89(11): 991-999.
22
Candresse T., Lanneau M., Revers F., Macquaire G., German S., Grasseau N., Dunez J.,
Malinowski T., 1995. An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis
of the molecular variability of the Apple chlorotic leaf spot virus. Acta Hortic. 386: 136-147.
Chamberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier J.E., Nguyen P.N., Caskey C.T., 1988. Deletion
screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification.
Nucleic Acids Res. 16: 11141-11156.
Desvignes, J.C., Boye R., 1989. Different diseases caused by chlorotic leaf spot virus on the
fruit trees. Acta Hortic. 235: 31-38.
Henegariu O., Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H., 1997. Multiplex PCR:
Critical Parameters and Step-by-Step Protocol. BioTechniques 23: 504-511.
James D., Varga A., 2004: Preliminary molecular characterisation of plum pox potyvirus
isolate W3174: evidence of a new strain. Acta Horticulturae 657: 177-182.
Kamenova V., Milusheva S., Borisova A., Stoev A., Myrta A., 2003: Plum pox virus strains
in Bulgaria. Options Mediterranéennes, Serie B, 45: 65-67.
Laimer M., Mendonca D., Arthofer W., Hanzer V., Myrta A., Boscia D., 2003: Occurrence of
different Plum pox virus strains in several stone fruit specias in Austria. Options
Mediterranéennes, Serie B., 45: 79-83.
Liberti D., Marais A., Svanella-Dumas L., Dulucq M. J., Alioto D., Ragozzino A., Rodoni B.,
Candresse T., 2005. Characterization of Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus, a Novel
Trichovirus Isolated from Stone Fruit Trees. 10.1094/PHYTO-95-0420. Phytopathology –
Virology. The American Phytopathological Society.
Malinowski T., 2003: Plum pox disease in Poland: the past and current situation. Options
Medirranéennes, Serie B., 45: 99-101.
Malinowski T., Cambra M., Capote N., Zawadzka B., Gorris M.T., Scorza R., Ravelonandro
M., 2006. Field trials of plum clones transformed with the Plum pox virus coat protein (PPV-
CP) gene. Plant Dis. 90:1012-1018.
Mekuria G., Ramesh S.A., Alberts E., Bertozzi T., Wirthensohn M., Collins G., Sedgley M.,
2003. Comparison of ELISA and RT-PCR for the detection of Prunus necrotic ring spot virus
and prune dwarf virus in almond (Prunus dulcis). J. Virol. Methods 114: 65–69.
Nassuth A., Pollari E., Helmeczy K., Stewart S., Kofalvi S.A., 2000. Improved RNA
extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus
several viruses in plant extracts. J. Virol. Methods 90: 37–49.
23
Nemeth M., 1986. Virus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Martinus
Nijhoff Publishers, The Netherlands and Akademini Kiado, Hungary, 840p.
Newbury H.J., Possingham J.V., 1977. Factors Affecting the Extraction of Intact Ribonucleic
Acid from Plant Tissues Containing Interfering Phenolic Compounds. Plant Physiol. 60: 543-
547.
Ogawa J.M., Zehr E.I., Bird G.W., 1995. Plum Pox Virus. From the Compendium of Stone
Fruit Diseases. APS press, 98 pp, USA.
Polák J., 2002. Virus šarky švestky – nejškodlivější virus peckovin v České republice – II.
Díl. Dostupné na http://www.zahradaweb.cz/projekt/clanek.asp?pid=2&cid=5192.
Polák J., 2006. Hosts and symptoms of Plum pox virus: woody species other than fruit and
ornamental species of Prunus. OEPP/EPPO bulletin 36: 225–226.
Polák J., 2007. Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and
sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1–4.
Polák J., Pívalová J., 2005: Sporadic distribution of Plum pox virus M strain in natural
sources in the Czech Republic. Hort. Sci. (Prague), 32: 85-88.
Polák J., Zieglerová J., Bouma J., 1997. Diagnostika a rozšíření viru chlorotické skvrnitosti
jabloně na jádrovinách v České republice. Hort. Sci. Prague 24: 89-94.
Pruss G., Ge X., Shi X.M., Carrington J.C., Vance V.B., 1997. Plant Viral Synergism: The
Potyviral Genome Encodes a Broad-Range Pathogenicity Enhancer That Transactivates
Replication of Heterologous Viruses. The Plant Cell .9: 859-868.
Pscheidt J.W., 2008. An online guide to Plant Disease Control. Oregon State University.
Dostupné na http://plant-disease.ippc.orst.edu/disease.cfm?RecordID=293
Quiot J.B., Labonne G., Boeglin M., Adamolle C., Renaud L.Y., Candresse T., 1995.
Behavior of two isolates of Plum pox virus inoculated on peach and apricot trees: First results.
Acta Hortic. 386:290-297.
Saade M., Aparicio F., Sanchez-Navarro J.A., Herranz M.C., Myrta A., di Terlizzi B., Pallas
V., 2000. Simultaneous detection of the three ilarviruses affecting stone fruit trees by
nonisotopic molecular hybridization and multiplex reverse-transcripton polymerase chain
reaction. Phytopathology - Virology p. 1330-1336.
Sanchez-Navarro J.A., Aparicio F., Herranz M.C., Minafra A., Myrta A., Pallas V., 2005.
Simultaneous detection and identification of eight stone fruit viruses by one-step RT-PCR.
Eur. J. Plant Pathol. 111: 77–84.
24
Scott S.W., Zimmerman M.T., Yilmaz S., Zehr E.I., Bachman E., 2001. The interaction
between Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus in peach stunt disease. Acta
Hortc. 550: 229-236.
Simon L., Saenz P., Garcia J.A., 1997. Filamentous viruses of woody plants. Chapter 7 Plum
pox virus. pp. 75-86. Edited by P. Monnette. Trivandrum, India: Research Singspost.
Singh R.P., Nie X., Singh M., Coffin R., Duplessis P., 2002. Sodium sulphite inhibition of
potato and cherry polyphenolics in nucleic acid extraction for virus detection by RT-PCR. J.
Virol. Methods 99: 123–131.
Spiegel S., Scott S.W., Bowman-Vance V., Tam Y., Galiakparov N.N., Rosner A., 1996.
Improved detection of prunus necrotic ringspot virus by the polymerase chain reaction. Eur. J.
Plant Pathol. 102: 681-685.
Spiegel S., Thompson D., Varga A., James D., 2005. An Apple chlorotic leaf spot virus
isolate from Ornamental Dwarf Flowering Almond (Prunus glandulosa ‘Sinensis’): Detection
and Characterization. HortScience 40(5): 1401-1404.
Stubs L.L., Smith P.R., 1971. The association of Prunus ringspot, prune dwarf, and dark green
sunken mottle viruses in the rosetting and decline disease of peach. Austral. J. Agricul. Res.
22: 771–785.
Varga A., James D., 2005. Detection and differentiation of Plum pox virus using real-time
multiplex PCR with SYBR Green and melting curve analysis: a rapid method for strain
typing. J. Virol. Methods 123: 213–220.
Varga A., James D., 2006. Use of reverse transcription loop-mediated isothermal
amplification for the detection of Plum pox virus. J. Virol. Methods 138: 184–190.
Yoshikawa N., 2007. Apple chlorotic leaf spot virus. Dostupné na
http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=386
Seznam publikací, které předcházely metodice
Jarošová J. 2008. Interaction of Plum pox virus with Ilarviruses and Trichoviruses in stone
fruit. MSc Thesis. Czech University of Life Sciences. 82pp.
Polák J., Pívalová J., Kumar Kundu J., Jokeš M., Scorza R., Ravelonandro M. 2008.
Behaviour of transgenic Plum pox virus-resistant Prunus domestica L. clone C5 grown in the
open filed under a high and permanent infection pressure of the PPV-Rec strain. Journal of
Plant Pathology 90 (1, Supplement): S1.33-S1.36.
25
Polák J., Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Pívalová J., Scorza R., 2008. Interactions of
Plum pox virus strain Rec with Apple chlorotic leafspot virus and Prune dwarf virus in field-
grown transgenic plum Prunus domestica L., clone C5 , Plant Protect. Sci. 44(1): 1-5.
Kumar Kundu J., Briard P., Hilly M.J., Ravelonandro M., Scorza R. 2008. Role of the 25-26
nt siRNA in the resistance of transgenic Prunus domestica graft inoculated with plum pox
virus. Virus Genes 36(1):251-220.
Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Briard P., Monsion M., Scorza R., 2007. The effect of co-
existing prunus viruses on transgenic Plum pox virus resistant plums. Acta Horticulturae 738:
653-656.
Polák J., 2007. Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and
sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1–4.
Polák J., Pívalová J., Jokeš M., Svoboda J., Scorza R., Ravelonandro M., 2005. Preliminary
results of interactions of Plum pox (PPV), prune dwarf (PDV), and apple chlorotic leafspot
(ACLSV) viruses with transgenic plants of plum, Prunus domestica, clone C5 grown in an
open field. Phytopathol. Pol. 36: 115-122.
Kumar Kundu J. 2003. A rapid and effective RNA release procedure for virus detection in
woody plants by reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta virologica 47: 147-
151.
(foto J.Kumar, VÚRV v.v.i.)
Název: Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-RT-
PCR
Autoři: Jarošová J., Polák J. & Kumar J.
Vydal: Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i.
Drnovská 507, 16106 Praha 6–Ruzyně
Tisk: CD
Počet stran: 26
Vydání: první
Rok vydání: 2008
ISBN: 978-80-87011-86-7
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008