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SEAP

Calle Ancora, 3, 2º B 28045 MADRID

Tfno. y Fax 91 539 86 28 MAIL: SEAP@SEAP.ES

Programa de Garantía de

Calidad en Patología

Módulo de IHQ GENERAL Ronda nº 31 Antígeno probado: HMB45 Tejido probado: SEAP GCP: cortical renal y melanoma LOCAL: El tejido más frecuentemente

empleados como control local ha sido melanoma (primario o metastático) y una pequeña proporción de lesiones melanocíticas benignas (Nevus Spitz, nevus azul y nevus melanocítico compuesto) y piel sin tumor

Instrucciones: Los participantes fueron invitados a teñir con HMB-45 la preparación remitida por el programa (sección de cortical renal y sección de melanoma, fijados en formol al 10%, ph 7, durante 24 horas), y su propia preparación control, devolviendo ambas preparaciones para su evaluación (Fig 1).

Los criterios de tinción óptima de HMB-45 fueron: -Melanoma: Tinción citoplasmática de moderada a fuerte en

la mayoría de las células neoplásicas (Fig2) -Riñón: Ausencia de tinción en el tejido renal (Fig 3). Número de laboratorios participantes: -Remitidos: 77 -Contestados: 70 (90,9%) GCP y 68 (88,3%) control local

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Estudio de los controles remitidos por el programa GCP: Los resultados de la evaluación externa fueron los siguientes

Considerando que una puntuación igual o superior a 12 se

considera aceptable, el 92,8% de las preparaciones remitidas se consideraron aceptables. El 48,5% de las preparaciones fueron consideradas óptimas, un porcentaje parecido a las preparaciones consideradas buenas (45,7%). Sólo el 7,1% de los centros participantes no alcanza el nivel mínimo para considerar que la técnica pueda aplicarse de manera rutinaria, correspondiendo todos ellos a resultados regulares y ninguno pobre.

Los problemas más frecuente por los que las técnicas no han alcanzado el nivel óptimo en orden decreciente de frecuencia se ha observado: En un 62% de los centros participantes se observó tinción de fondo (Fig 4) (con mayor frecuencia tinción de fondo ligera), en un 34,2% pretratamiento excesivo con degradación de los tejidos(Fig 5), en un 24,2% problemas con el contraste(con mucha mayor frecuencia contraste escaso), en un 22,8% tinción ligera o muy ligera, en un 15,7%

Nº centros

05

101520253035

POBRE (4-9)

REGULAR(10-11)

BUENO (12-15)

ÓPTIMO (16-20)

HMB-45 GCP

Puntuación asesores

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tinción irregular y en un 8,5% tinción inadecuada de algunas células (Fig 6).

Estudio de los controles locales de cada centro: Los

resultados de la evaluación fueron los siguientes:

Considerando que una puntuación igual o superior a 12 se

considera aceptable, el 97% de las preparaciones remitidas se consideran aceptables. El 36,7 % % de los centros obtuvieron una puntuación óptima, y sólo el 2,9% no alcanza el nivel mínimo para considerar que la técnica puede aplicarse de manera rutinaria. Los principales problemas por los que las técnicas no alcanzaron el nivel óptimo fueron: el más frecuente (73,5 %) se debe a degradación del tejido por pretratamiento excesivo (Fig 7); en un 27,9% de los centros se observó tinción de fondo ligera o moderada; en 25% de los centros tinción ligera o muy ligera de las células diana; en 22% problemas con el contraste (con más frecuencia contraste escaso); en 14,7% se observó artefacto técnico (Fig 8)y en 10,2 %

Nº centros

Puntuación asesores

HMB-45 CONTROL LOCAL

05

1015202530354045

POBRE (4-9)

REGULAR(10-11)

BUENO (12-15)

ÓPTIMO (16-20)

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tinción irregular y tinción inadecuada de algunas células(Fig 9).

Los tejidos empleados como control local, en los laboratorios que lo especificaron (79,9%), han sido con mayor frecuencia (69,1%%) melanoma (Fig 10) (cutáneo primario en un 64,7% y melanoma metastático en un 4,1 % de los casos). Un 7,3 % de los centros utilizaron tumores benignos cutáneos (4,4% nevus melanocítico compuesto (Fig 11), 1,4%nevus de spitz, 1,4% nevus azul), y un 1,4% piel sin lesión melanocítica.

Un 22% de los laboratorios participantes no especifican el tejido empleado para control local.

Resultados de la autoevaluación: La autoevaluación es una

parte importante del programa de Garantía de calidad. El 92,8% de los técnicos y el 97,1% de los patólogos han remitido autoevaluación de los controles de GCP, y el 92,6 % de los técnicos y el 95,5%de los patólogos remitieron su valoración de control local. Estas cifras son superiores a los porcentajes de autoevaluación en otras rondas tanto por parte del técnico como del patólogo. Los resultados obtenidos son:

Nº centros

HMB-45 GCP

Puntuación técnico

010203040506070

POBRE (4-9)

REGULAR(10-11)

BUENO (12-15)

ÓPTIMO (16-20)

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Como se puede observar en los gráficos, la percepción local de los resultados de la técnica es superior a la valoración de los observadores externos. El 95,3% de los técnicos y el 94,1% de los patólogos participantes puntúan los controles de GCP como óptimos (igual o mayor de 16), mientras que sólo el 48,5% de los casos fueron puntuados como óptimos por los asesores de la evaluación externa.

Control local:

Nº centros

010203040506070

POBRE (4-9)

REGULAR(10-11)

BUENO (12-16)

ÓPTIMO (17-20)

HMB-45 GCP

Puntuación patólogo

010203040506070

POBRE (4-9)

REGULAR(10-11)

BUENO (12-15)

ÓPTIMO(16-20)

HMB-45 LOCAL

Nº centros

Puntuación técnico

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Los resultados indican que el 100% de los técnicos y un

96,9% de los patólogos evalúan de forma óptima (puntuación superior a 16) el control local, mientras sólo el 36,7 % de los centros han recibido una puntuación óptima en la evaluación externa.

La apreciación de los técnicos y patólogos sigue siendo superior a los asesores externos, tanto en control GCP como en control local. Esta tendencia a sobrevalorar los resultados de la técnica podría corregirse observando minuciosamente detalles como intensidad de la tinción, presencia de tinción inespecífica no deseada, fondo, degradación del tejido por pretamiento excesivo o irregularidad en la tinción en diferentes áreas de la preparación

Inmunotinción óptima: Los criterios consensuados usados en

la evaluación para considerar la tinción de HMB-45 como óptima fueron los siguientes:

-Melanoma: Tinción citoplasmática de moderada a fuerte en la mayoría de las células neoplásicas.

-Riñón: Ausencia de tinción en el tejido renal.

010203040506070

POBRE (4-9)

REGULAR(10-11)

BUENO (12-15)

ÓPTIMO(16-20)

HMB-45 LOCAL

Nº Centros

Puntuación patólogo

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La tinción en ambos tejidos se debe acompañar de una adecuada relación en la intensidad de la tinción respecto al contraste empleado y con mínimo o ausente artefacto tanto de técnica inmunohistoquímica (degradación del tejido por sobrecalentamiento, tinción de fondo,…etc.) como de técnica histológica (contraste adecuado, ausencia de hidratación,.. etc.).

Anticuerpos empleados: EL 10% de los centros no

especificaron el clon utilizado. El 100% de los centros que lo especificaron emplearon el

clon HMB-45. Casa comercial Laboratorios DAKO 31 ROCHE 20 VITRO 10 NOVOCASTRA 3 BIO CARE

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LEICA BIOSYSTEMS

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Mejores métodos: -Puntuación 20/20 de GCCP:

Método: ENVISION Bloqueo: Agua oxigenada Automatización: DAKO autostainer Digestión enzimática: No Recuperación antigénica con calor. Si Tampón y PH: citrato ph6 Anticuerpo primario: DAKO Cromógeno: DAB –Puntuación 19/20:

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Automatización: VENTANA Anticuerpo primario: ROCHE Cromógeno: DAB No constan otras especificaciones sobre el método empleado Comentarios: El HMB-45 ((Human Melanoma, Black) detecta

el antígeno específico de melanosomas (MSA) que se encuentra presente en melanocitos inmaduros y activados (por inflamación, aumento de celularidad o tumor subyacente…), pero no en el resto de melanocitos maduros.

La mayor parte de los melanomas son HMB45 positivos (60-90%), sin embargo, los melanomas fusocelulares y los desmoplásicos pueden ser en la mayor parte negativos o sólo focalmente positivos. También se observa positividad variable en tumores melanocíticos benignos como en nevus junturales o compuestos; en estos últimos, el componente epidérmico puede presentar inmunotinción intensa en el componente epidérmico, mientras que el componente dérmico sólo muestra tinción débil o ausencia de inmunotinción (Fig 12)

HMB45 también se detecta en la mayor parte de los nevus azules, nevus displásicos y nevus de Spitz. En otros tumores en los que se demuestra origen o diferenciación melanocítica, también se demuestra expresión de HMB45 (sarcoma de células claras, sarcoma epiteliode, blastoma pulmonar, hepatoblastoma, feocromocitoma, neurofibroma y schwannoma melanóticos y PEcomas)

Del análisis de los resultados se destacan los siguientes

datos: - Se ha observado un elevado porcentaje de tinciones

aceptables (puntuación igual o superior a 12) del 92,8% y

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97% respectivamente según se evalúen los controles GCP o locales, con un porcentaje de tinciones óptimas del 48,5% y 36,7 % respectivamente. Según estos datos, la mayor parte de los centros poseen resultados adecuados para la utilización rutinaria de la técnica. Comparando con rondas anteriores (ronda 12), se han observado resultados similares con un 93,8 y 91,3 % de resultados aceptables para controles GCP y local respectivamente. Es llamativo el descenso respecto a la ronda anterior del porcentaje de inmunotinciones óptimas o muy buenas, pues en la ronda previa se obtuvo un porcentaje del 71,8% y 76,3 % de resultados óptimos respectivamente para controles GCP y local.

- Se ha observado un incremento en la participación en la

valoración de los resultados de la propia técnica por parte de los técnicos de cada laboratorio respecto a la ronda anterior. En esta ronda, el 92,8% de los técnicos y el 97,1% de los patólogos han remitido autoevaluación de los controles de GCP, y el 92,6 % de los técnicos y el 95,5%de los patólogos remitieron su valoración de control local. En la ronda anterior (ronda 12) sólo el 85,4 % de los técnicos y el 94,8 % de los patólogos participantes remitieron su valoración de las preparaciones del GCP. En el caso de los controles locales este porcentaje fue del 83,9 % y el 93,5 % respectivamente.

-El número de centros participantes que no alcanza el nivel mínimo para considerar que la técnica pueda aplicarse de manera rutinaria es del 7,1% y 2,9% según se evalúen los controles GCP o controles locales respectivamente. Estas cifras son similares a las obtenidas en rondas anteriores, donde se observó un 6,2% y 8,7 % para controles GCP y local respectivamente. Las principales causas responsables de estos datos en la ronda actual para

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los controles GCP observados en orden decreciente de frecuencia son: en un 62% de los centros participantes se observó tinción de fondo (con mayor frecuencia tinción de fondo ligera), en un 34,2% pretratamiento excesivo con degradación de los tejidos, en un 24,2% problemas con el contraste (con mucha mayor frecuencia contraste escaso), en un 22,8% tinción ligera o muy ligera, en un 15,7% tinción irregular y en un 8,5% tinción inadecuada de algunas células. En la ronda anterior, los problemas detectados fueron diferentes en cuanto a la frecuencia de los mismos con una alta frecuencia de tinción inadecuada o inespecífica de algunas células, seguida por la excesiva tinción de fondo. Para los controles locales el principal problema detectado por su frecuencia ha sido la degradación del tejido por pretratamiento excesivo (73,5 %) seguido por tinción de fondo ligera o moderada (27,9%). En la evaluación de los controles locales de la ronda previa los principales problemas detectados fueron una alta frecuencia de tinción inadecuada o inespecífica de algunas células seguida por una excesiva tinción de fondo o tinciones irregulares.

-No se ha observado discrepancia en los resultados de la

evaluación de control GCP y control local relacionado con el factor “tejido”, pues los empleados en la ronda actual ha sido con mayor frecuencia (69,1%) melanoma (cutáneo primario en un 64,7% y melanoma metastático en un 4,1 % de los casos). Un 7,3 % de los centros utilizaron tumores benignos cutáneos (4,4% nevus melanocítico, 1,4%nevus de spitz, 1,4% nevus azul), y un 1,4% piel sin lesión melanocítica.

Normalmente se recomienda el uso de tejidos no tumorales como controles, pero en el caso de HMB-45 es difícil identificar un tejido normal que exprese niveles consistentes de HMB-45 para ser usados como control

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positivo recomendable. Los melanocitos no suelen ser positivos en la piel normal.

-En aquellos melanomas con gran cantidad de pigmento

melánico que pueda interferir en la interpretación de la positividad de la tinción inmunohistoquímica, seria recomendable la utilización de contratinción con Giemsa en lugar de hematoxilina, ya que permite diferenciar las células tumorales que muestran el pigmento marrón del cromógeno respecto a los histiocitos que han fagocitado pigmento que muestran un color verdoso. Otra opción utilizada por varios laboratorios es la Fosfatasa Alcalina o Fast Red que (Fig 13) genera un pigmento rojizo, permitiendo así su diferenciación del pigmento melánico marrón. Sólo un pequeño porcentaje de centros utilizan este método

Fig 1: Panorámica del control GCCP. A la izquierda

melanoma (control positivo) y a la derecha cortical renal (control negativo). HMB-45 x 0,6.

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Fig 2. Inmunotinción óptima en control GCP. Tinción

citoplasmática de moderada a fuerte en la mayoría de las células neoplásicas. HMB45 x13, 2

Fig 3: Inmunotinción óptima en control GCP. Cortical renal con ausencia de tinción. HMB45 x16.

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Fig 4: Tinción de fondo ligera en control GCP.

HMB45.x14, 2

Fig 5: Degradación del tejido por pretratamiento excesivo en control GCP. EL tejido comienza a levantarse (flechas).HMB45 x8

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Fig 6: Tinción inadecuada del epitelio tubular en el

control GCP. HMB45 x20.

Fig 7: Degradación del tejido por calentamiento excesivo

en el pretratamiento en control local. HMB45 x10, 8.

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Fig 8: Artefacto técnico en control local. HBM45 x 2

Fig 9: Tinción inadecuada de algunas glándulas en la piel

de un control local. HMB45 x20

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Fig 10: Panorámica de melanoma de control local. HMB45

Fig 11: Panorámica de nevus melanocítico intradérmico

empleado en control local

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Fig 12: Nevus melanocítico intradérmico empleado como

control local. Obsérvese tinción en aislados melanocíticos epidérmicos y ausencia de tinción en el componente intradérmico. HMB45 x20

Fig 13: Pigmento rojizo que permite la diferenciación del

pigmento melánico marrón.

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Referencias seleccionadas - http://www.nordiqc.org/Epitopes/msa/msa.htm - Gown AM et al. Monoclonal antibodies specific for

melanocytic tumors distinguish subpopulations of melanocytes. Am J Pathol 1986, 123:195.

- Jungbluth AA. Serological reagents for the immunohistochemical analysis of melanoma metastases in sentinel lymph nodes. Semin Diagn Pathol. 2008 May;25(2):120-5

- Folpe AL, Mentzel T, Lehr HA, Fisher C, Balzer BL, Weiss SW. Perivascular epithelioid cell neoplasms of soft tissue and gynecologic origin: a clinicopathologic study of 26 cases and review of the literature. Am J Surg Pathol. 2005 Dec;29(12):1558-75.

-Xu, X., Chu, A. Y., Pasha, T. L., Elder, D. E., Zhang, P. J. Immunoprofile of MITF, tyrosinase, melan-A, and MAGE-1 in HMB45- negative melanomas. Am J Surg Pathol 2002;26:82-87.

-Zembowicz A, Granter SR, McKee PH, Mihm MC. Amelanotic cellular blue nevus: a hypopigmented variant of the cellular blue nevus: clinicopathologic analysis of 20 cases. Am J Surg Pathol. 2002 Nov;26(11):1493-500.