Master rad - Prirodno - matematički fakultet u Nišu rad Niš, 2014. 2 UNIVERZITET U NIŠU...
Transcript of Master rad - Prirodno - matematički fakultet u Nišu rad Niš, 2014. 2 UNIVERZITET U NIŠU...
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATICKI FAKULTET NIŠ DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Tamara V. Stanković
Uticaj kumarina (1,2-benzopirona) na krvnu sliku i histološku građu jetre Wistar pacova
Master rad
Niš, 2014.
2
UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO-MATEMATICKI FAKULTET NIŠ DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Uticaj kumarina (1,2-benzopirona) na krvnu sliku i histološku građu jetre Wistar pacova
Master rad Kandidat Mentor
Tamara V. Stanković 76 Dr Perica Vasiljević
Niš,
Septembar, 2014
3
UNIVERSITY OF NIŠ FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Effect of coumarine (1,2-benzopyrone)on blood and histological structure of liver in Wistar rats
Master thesis Candidate Mentor
Tamara V. Stanković 76 Dr Perica Vasiljević
Niš,
September, 2014
4
Pre svega želim da izrazim zahvalnost i poštovanje svom mentoru prof. dr Perici Vasiljeviću
na ukazanom poverenju, pomoći, razumevanju i strpljenju.
Takođe zelim da se zahvalim asistentici Mileni Aleksić i stručnoj-saradnici Andrei Žabar,
koje su pomogle u realizaciji eksperimentalnog dela rada.
I naravno na kraju, najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici, na omogućenom
školovanju i pruženoj podršci tokom studiranja.
Hvala.
5
Sažetak
Cilj ovog rada bio je ispitivanje uticaja različitih koncentracijа kumarina (1,2-benzopirona)
na broj eritrocita, leukocitarnu formula, zatim količinu deponovanog glikogena i morfometrijske
karakteristike ćelije jetre Wistar pacova. Kumarin je hemijsko jedinjenje koje se može izolovati iz
velikog broja biljaka i široko je rasprostranjeno u prirodi. Po hemijskoj strukturi kumarin je
jedinjenje sa benzopironskom osnovom i zahvaljujući velikom broju reakcija supstitucije koje su
karakteristične za benzenov prsten u kumarinskoj osnovi ovo jedinjenje poseduje veliki broj
derivata i niz bioloških aktivnosti. Životinje su kumarinom tretirane intravenozno, u repnu venu, u
koncentracijama od 10 mg/kg, 20mg/kg i 30mg/kg, 5 dana u konstantnim eksperimentalnim
uslovima. Životinje su posle pet dana tretiranja kumarinom žrtvovane i određeni su hematološki
parametri a zatim i napravljeni histološki preparati tkiva jetre. Na osnovu ovih preparata određeni
su morfometrijski karakteri i količina deponovanog glikogena. Analizirani parametri su: area,
dijametar jedara i odnos između broja hepatocita i broja Kupferovih ćelija. Rezultati su pokazali
povećanje broja eritrocita,smanjenje broja neutrofila, povećanje broja bazofila, povećanu
koncentraciju deponovanog glikogena u jetri. Najveće promene su zabeležene kod jedinke koja je
tretirana najvećom dozom, 30 mg/kg. Area i dijametar jedra u ovim ćelijama zadržali su svoje
normalne vrednosti i kod ovih parametra nema značajnih promena. Broj Kupferovih ćelija u tkivu
jetre tretiranih životinja se povećao što se povezuje sa njihovom odbrambenom ulogom.
Ključne reči: kumarin, jetra, hepatociti, Kupferove ćelije, morfometrija, krvni elementi
6
Abstract
The aim of this work was inspecting the influence of coumarin (1,2-benzopyrone) in various
concentrations on the quantity of erythrocytes, leucocyte formula, the quantity of stored glycogen
and morphometric characteristics of the liver cells in Wistar rats. Coumarin is a chemical compound
which can be isolated from numerous plants and it is widespread in nature. Chemically, coumarin is
a compound with benzopyrene base and because of the great number of substitution reactions,which
are typical for the benzene ring in the coumarinbase, this chemical therefore has numerous
derivatives and various biological activities. The experimental animals were treated with coumarin
intravenous into the caudal vein, in concentrations of 10 mg/kg, 20mg/kg and 30mg/kg for five days
in constant experimental conditions. After the period of five days treatment with coumarin, animals
were killed and hematological parameters were assessed, also histological slides of the liver were
made. According to the histological slides, morphometric characters were assessed and the quantity
of the stored glycogen. The analyzed parameters were: area, nucleus diameter and the ratio between
the numbers of hepatocytes and Kupffer cells. The results showed a significant increase of the
erythrocyte number, decrease of neutrophils, increase of the basophiles and increased concentration
of the stored glycogen in liver. The greatest changes were detected in individuals which were
treated with the highest dose, 30 mg/kg. Area and nucleus diameter in this particular cells remained
the same, normal values and in this parameters there were no significant changes. The number of
Kupffer cells in the liver tissue of the treated animals was significantly increased which is
associated with their defensive role.
Keywords: coumarin, liver, hepatocytes, Kupffer cells, morphometrics, blood elemnts.
7
Sadržaj 1.Uvod .............................................................................................................................................. 8
1.1.Kumarin…………………………………………………………………………………............. 8
1.1.1. Struktura kumarina ....................................................................................................... 8
1.1.2. Dosadašnja istraživanja .............................................................................................. 11
1.2. Krvna slika ................................................................................................................................. 13
1.3. Jetra ............................................................................................................................................ 16
1.3.1. Anatomija jetre ........................................................................................................... 16
1.3.2. Histologija jetre .......................................................................................................... 17
1.3.2.1. Hepatocit.................................................................................................... 17
1.3.2.2. Kupferove ćelije ........................................................................................ 18
1.3.3. Funkcije jetre .............................................................................................................. 18
2. Cilj rada ................................................................................................................................... 20
3. Materijali i metode ............................................................................................................... 21
3.1. Materijal .................................................................................................................................... 21
3.2. Metode ...................................................................................................................................... 21
3.2.1. Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima ................................ 21
3.2.2. Postupak za dobijanje krvnih elemenata .................................................................... 22
3.2.3. Metoda određivanja broja eritrocita i leukocita u komori .......................................... 22
3.2.4. Izrada krvnog razmaza i određivanje leukocitarne formule ....................................... 24
3.2.5. Pravljenje trajnih mikroskopskih preparata ................................................................ 25
3.2.6. Bojenje preparata ........................................................................................................ 26
3.2.7. Merenje morfometrijskih karakteristika ćelija i jedara ............................................... 28
4. Rezultati i diskusija .............................................................................................................. 29
4.1.Ispitivanje uticaja razlicitih koncentracija kumarina na broj krvnih ćelija kod
pacova.................................................................................................................................... 29
4.2.Ispitivanje uticaja razlicitih koncentracija kumarina na deponovanja glikogena u jetri pacova
............................................................................................................................................... 31
4.3.Ispitivanje uticaja razlicitih koncentracija kumarina na morfomertrijske karaketristike ćelija jetre pacova
............................................................................................................................................................. 33
4.4.Ispitivanje uticaja razlicitih koncentracija kumarina na odnos između broja hepatocita i broja Kupferovih
ćelija u tkivu jetre pacova .................................................................................................................. 35
5. Zaključak ................................................................................................................................. 37
6. Literatura ................................................................................................................................ 38
8
1. Uvod
1.1. Kumarin
Kumarin je hemijsko jedinjenje koje je široko rasprostranjeno u prirodi, nalazi se najviše u
plodovima, zatim semenu, korenu, stablu i listovima mnogih biljaka, kao i u voću i povrću.
Kumarin i njegovi derivati su poznati jer pokazuju niz bioloških aktivnosti. Kumarinske droge,
ekstrakti i izolovana jedinjenja koriste se kao sredstva za aromatizaciju u kozmetičkoj,
prehrambenoj, duvanskoj i industriji alkoholnih pića. Međutim njihova upotreba je ograničena i
njihova dozvoljena koncentracija u namirnicama je propisana zakonom (Molnar i Čačić, 2011).
1.1.1. Struktura kumarina
Kumarin je prvi put izolovan 1820. godine iz plodova tropske biljke Coumarouna odorata
Aube (Dipteryx odorata), koja pripada porodici mahunarki (Fabaceae). Kumarin je poznat po
ugodnom mirisu na vanilu, koji neki autori karakterišu i kao miris na sveže pokošeno seno.
Kumarini obuhvataju veliku klasu jedinjenja i u visokim koncentracijama se nalaze u nekim
eteričnim uljama biljaka, npr. ulje lavande, ulje od kore cimeta, ulje od lovorovog lista i drugim.
Takođe, nalaze se u voću (npr. borovnica, kupina), zatim u zelenom čaju i drugim namirnicama.
Najveći broj jednostavnih kumarina javlja se u višim biljkama, a najveće izvore predstavljaju biljke
iz familije Asteraceae i Fabaceae, ali ih ima i u familijama Rutaceae i Apiaceae. Kumarini iz biljke
roda Calophyllum koriste se u narodnoj medicini (Jain i Joshi, 2012). Smatra se da kumarini u
biljnom tkivu imaju zaštitnu ulogu (to su fitoaleksini), štite biljku od ultraljubičastog zračenja.
Kumarin je klasifikovan kao član porodice benzopirona, jedinjenja koje u osnovi ima
benzenov prsten za koji se vezuje pirolov presten. Benzopironi se dele u dve grupe,benzo-α- pironi,
gde spadaju kumarini i benzo-γ-pironi, grupa čiji su glavni predstavnici flavonoidi (Lacy i
O’Kennedy, 2004).
9
Postoje četiri glavne podgrupe kumarina:
1. Jednostavni kumarini – Međusobno se razlikuju po supstituentima; najčešće su to
hidroksilne i metoksi grupe, pa se i oni nazivaju hidroksi- ili metoksikumarini. Uglavnom
sva prirodna jedinjenja sadrže supstituent (hidroksi ili metoksi radikal) u položaju C7. To su
i najrasprostranjeniji kumarini umbeliferon i herniarin. Pored toga, do supstitucije može doći
i na drugim položajima; na C6 i C8 (Slika 1) (Lacy i O’Kennedy, 2004). Njihova
farmakološka delovanja su: upijaju UV zračenje; smanjuju permeabilnost zidova kapilara i
limfnih sudova, smanjuju eksudacije i nastanak edema (antiinflamatorno delovanje);
intenziviraju glomerularnu filtraciju i deluju kao diuretici. Kumarinske droge se koriste kao
blagi diuretici i kod tromboflebitisa. Izolovana jedinjenja i ekstrakti droga koriste se za
kombinovanu foto-hemo terapiju psorijaze i vitiliga.
Slika 1. Hemijska formula jednostavnih kumarina
2. Furanokumarini – sadrže petočlani furanov prsten koji je vezan za jezgro kumarina.
Podeljeni su na linearni i ugaoni tip sa supstituentima na jednoj ili obe preostale pozicije na
benzenovom prstenu (Slika 2) (Lacy i O’Kennedy, 2004). Kao farmakološke supstance oni
upijaju UV zračenje, povećavaju broj melanocita, utiču na sintezu melanina, pa se zbog toga
i koriste u kozmetičkim preparatima za sunčanje (tamnjenje i zaštita).
10
Slika 2.Hemijska formula linearnog i ugaonog tipa (gore) i formule predstavnika furanokumarina
(dole)
3. Piranokumarini – analogni su furanokumarinima ali sadrže šestočlani prsten (Slika 3) (Lacy i
O’Kennedy, 2004). Neki Piranokumarini se koriste kao koronarni vazodilatatori i za terapiju
staračke insuficijencije centralnog nervnog sistema.
Slika 3. Hemijska formula piranokumarina, seselina (levo) i ksantiletina (desno)
4. Piron supstituisani kumarini – uključuju 4-hidroksikumarin (Slika 4) (Lacy i O’Kennedy,
2004).
Slika 4. Hemijska formula 4-hidroksikumarina
Sama strukturna raznolikost uzrok je velikog broja različitih bioloških aktivnosti. (Molnar i
Čačić, 2011).
11
1.1.3. Dosadašnja istraživanja
Kumarini, takođe poznati kao benzopironi, prisutni u izuzetnim količinama u biljkama,
mogu se naći i u mikroorganizmima. Neki važni predstavnici ove klase jedinjenja izolovani su iz
vrsta rodova Streptomyces i Aspergillus (Jain i Joshi, 2012). Pedstavljaju veliku klasu jedinjenja
koja od davnina privlači velika interesovanja zbog svojih bioloških aktivnosti. Pokazalo se da su
korisni kao antikancerogena, anti HIV jedinjenja i kao CNS aktivne supstance. Pored toga, njihova
sposobnost inhibicije enzima, antimikrobna i antioksidativna aktivnost privukle su pažnju ovoj
oblasti istraživanja (Borges i sar. , 2005).
Još 1979. godine rađene su studije kojima je dokazano da kumarini izazivaju oštećenje jetre
kod pacova i psa posle uzimanja doze od 65 mg/kg svakog dana tokom 2 godine, ali ne i kod
babuna. Ozbiljne sumnje su se pojavile u prihvatanju dijagnoze kancera žučnih puteva kod pacova
hranjenih dnevno sa 5000 ili 6000 ppm kumarina u ishrani tokom 2 godine, najviše zbog odsustva
značajne metastaze u ovim životinjama i negativnog nalaza na kancer u ranijim studijama sa
pacovima. Kumarin ne deluje kao ko-kancerogen ni u koži miša, što je dokazano subkutanom
primenom kumarina na pacova u ograničenim eksperimentima (Cohen, 1979).
Najintezivnije se ispituju citotoksični efekti kumarina i raspravlja se dosta o njihovom
širokom spektru efekata na tumore što je i prikazano različitim in vitro i in vivo eksperimentima
(Kostova, 2005). Suspenzije hepatocita pacova su korišćene kao model sistemi u nekim studijama o
mehanizmu kumarinom indukovane hepatotoksičnosti. Dokazano je da kumarin proizvodi
vremenski i koncentracijski zavisan citotoksični efekat na hepatocitima pacova, najpre dovodi do
gubitka vitalnosti ćelija a zatim i gubljenja glutationa u ćelijama (Den Besten, 1990). Kumarin u
određenoj dozi izaziva nekrozu jetre i značajno povećava aktivnost alanin aminotransferaze i
aspartat aminotransferaze (Lake, 1999). Takođe je dokazana i sposobnost kumarina da poveća
aktivnost hidrolaza čak 13 do 14 puta (Feuer, 1970). Kumarin može da utiče i na formiranje i
sakupljanje otpadaka reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), a ima i sposobnost da inhibira biosintezu
prostaglandina (Fylaktakidou i sar. , 2004). Sprovedena je i studija da se proceni antidijabetički
efekat kumarina na ključne enzime u metabolizmu ugljenih hidrata kod pacova sa dijabetesom.
Ovom studijom je dokazano da kumarin izaziva povećanje količine glikolitičkih enzima
(heksokinaza) kao i glukozo-6-fosfataze i fruktoza-1,6-bifosfataze. Osim toga, primećena je i zaštita
od gubitka telesne težine kod ovih pacova, što znači da primena kumarina rezultira promenom u
metabolizmu glukoze sa naknadnim smanjenjem nivoa glukoze u plazmi (Pary i Rajarajeswori,
2009).
12
Pacov kod koga se javlja znatna hepatotoksičnost prvenstveno metaboliše kumarin preko 3-
hidroksilacije i cepanja heterocikličnog prstena. Kumarin je manje toksičan kod pavijana, zamorca i
određenih sojeva miševa, koji podsećaju na čoveka po obimnom formiranju 7-hidroksi metabolita.
Toksičnost jetre kod pacijenta koji primaju relativno visoke doze kumarina svakodnevno je veoma
retka. Nedavne studije su pokazale da je za hepatotoksičnost kod pacova odgovoran metabolički
intermedijer 3,4-epoksid (Fentem i Fry, 1993). Posle tog otkrića da pacov metaboliše kumarin
drugačije nego čovek, postavljalo se pitanje o prikladnosti pacova kao model vrste za određivanje
hepatotoksičnog rizika za čoveka (Cohen, 1979). Upoređivani su i hepatotoksični efekti kumarina i
njihovih metal-analoga (3-, 4-metil kumarin i 3-, 4-dimetilkumarin). Ustanovljeno je da su metil
analozi kumarina manje toksični, ali da se njihova toksičnost kod hepatocita koje su osiromašene
glutationom znatno povećava (Fernyhough i sar. , 1994).
Procenjuje se da prosečna zapadna ishrana sadrži oko 1 g na dan mešovitih benzopirona jer
se oni nalaze u povrću, voću, semenkama, orasima, kafi, čaju i vinu (Hoult i Paya, 1996). Na kraju,
ipak većina testova sugeriše da kumarin nije genotoksični agens i može se slobodno zaključiti da
izloženost kumarinima iz hrane i/ili kozmetičkih proizvoda ne predstavlja zdravstveni rizik za ljude
(Lake, 1999). Značajna su i istraživanja o njihovim farmakološkim i terapeutskim svojstvima tokom
mnogo godina. Kumarin je prirodna supastanca koja je pokazala anti-tumorsku aktivnost u in vivo
eksperimentima. Njima je dokazano da takav efekat imaju zahvaljujući svojim metabolitima (npr. 7-
hidroksikumarin). Nedavna studija je pokazala da 7-hidroksikumarin inhibira oslobađanje ciklina
D1, koji je prekomerno eksprimiran u mnogim tkivima kancera. Eskuletin, derivat kumarina,
inhibira rast i progresiju ćelijskog ciklusa indukcijom zaustavljanja ciklusa u fazi G1 kod HL-60
leukemičnih ćelija (Lacy i O’Kennedy, 2004). 1,2-benzopiron ima odavno ustanovljenu efikasnost u
dugoročnom smanjenju limfoedema kod čoveka, pa se koristi u lečenju elefantijaze i
postmastektomičnog oticanja ruku. Mehanizam njegovog delovanja je neizvestan ali može da
uključi makrofagom indukovanu proteolizu proteina edema (Hoult i Paya, 1996).
Kako mnogi kumarini i njihovi derivati ispoljavaju antikoagulansna,antikancerogena,
antivirusna, antiinflamatorna i antioksidativna delovanja, kao i antimikrobnu (Smyth i sar. , 2009) i
aktivnost enzimske inhibicije, poznavanje ključnih strukturnh karakteristika je od ključnog značaja
za razvoj novih analoga sa poboljšanom aktivnošću. Glavni izazov mnogim istraživačima je u pravo
dizajn i sinteza novih derivata kumarina sa visoko specifičnom aktivnošću u neke druge
farmakološke ciljeve (Riveiro i sar. 2010).
13
1.2. Krvna slika
Krvna slika daje vredne informacije o opštem zdravstvenom stanju. Kompletna krvna slika
je osnova za tumačenje laboratorijske analize krvi koja se radi zbog procene opšteg zdravstvenog
stanja i otkrivanja različitih poremećaja poput anemija, infekcija, virusnih oboljenja, stanja
uhranjenosti organizma i izloženosti otrovnim materijama. Ovom analizom krvi dobija se uvid u to
kakav broj i kvalitet imaju krvne ćelije - eritrociti, trombociti i leukociti (Slika 5). Važno je obratiti
pažnju na granične vrednosti i s time uporediti rezultate koji su dobijeni. Krvna slika je ubedljivo
najčešće korišćena laboratorijska analiza.
Slika 5. Izgled krvnih ćelija
Eritrociti (crvena krvna zrnca) su bezjedarne, bikonkavne ćelije diskoidnog oblika,
prečnika 7-8 µ. Nastaju procesom eritrocitopoeze koji se posle rođenja odigrava samo u koštanoj
srži. Sastoje se iz membrane i citoplazme. Membrana eritrocita je sačinjena od proteina, lipida i
steroida (lecitin, holesterol). Citoplazmu sačinjava mrežasta struktura u čijim se okcima nalazi
“krvni pigment disanja”, hemoglobin, koji joj daje crvenu boju i čini 95 % suve supstance eritrocita
(Slika 6). Ove ćelije krvi služe za transport gasova. Kiseonik prenose iz pluća do perifernih tkiva i
na taj način eritrocit snabdeva organizam kiseonikom koji je neophodan za stvaranje energije, a
takođe učestvuje i u eliminaciji ugljen dioksida iz tkiva (Slika 7) (Petrović, 2009). Energiju za
obavljanje svoje fiziološke funkcije eritrocit stvara procesom glikolize. Prosečan životni vek
eritrocita kod čoveka je 120 dana. U normalnim uslovima, dnevno se stvara oko 3 milijarde
eritrocita na kg telesne mase, a približno toliko u jednom danu i završi svoj životni vek (Anđelković
i sar. , 2002).
14
Slika 6. Izgled eritrocita i građa hemoglobina
Slika 7. Razmena gasova na nivou ćelije
Normalna vrednost broja eritrocita kod pacova je 7,8 x 1012/L, a referentne vrednosti se
kreću od 4,7 do 8,5 x 1012/L. Stanja kod kojih postoji smanjenje mase eritrocita u krvi, tj. smanjen
je njihov broj ispod normalnih vrednosti, nazivaju se anemije. Povećan broj eritrocita u krvi se
naziva policitemija, eritrocitoza ili poliglobulija (Rusov, 1984).
Leukociti (bela krvna zrnca) su ćelije koje za razliku od eritrocita imaju jedro, ćelijske
organele i granule. Pri bojenju krvnog razmaza njihove granule ispoljavaju različita tinktorijalna
svojstva, usled čega se leukociti tradicionalno dele na granulocite i agranulocite (Slika 8). Leukociti
su ćelije krvi koje su uključene u humoralnu i celularnu odbranu organizma. Odbrambena uloga se
zasniva na njihovoj sposobnosti fagocitoze i ameboidnog kretanja.
15
Granulociti imaju segmentovano jedro i u njihovoj citoplazmi su prisutne granule. Ove
granule mogu biti prijemčive za kisele ili bazne boje, ili i za jedne i za druge, na osnovu čega je
granulocite moguće razvrstati na eozinofilne, bazofilne i neutrofilne. Neutrofilni granulociti su
najbrojniji i čine 50-70% ukupnog broja leukocita. Jedro neutrofila ima najčešće tri segmenata i
njihove granule se boje ljubičasto jer imaju podjednaki afinitet prema bazama i kiselinama.
Neutrofili čine prvu liniju odbrane organizma od bakterijskih infekcija i u aktivnom stanju
označavaju se mikrofagima. Eozinofilni granulociti imaju isti oblik i neznatno veći dijametar od
neutrofila, jedro ima dva režnja povezana hromatinskim mostom. U njihovoj citoplazmi dominiraju
granule koje pokazuju visok afinitet za kisele boje (eozin). Kod alergijskih i parazitarnih bolesti
značajno se povećava broj eozinofila u krvi (eozinofilija). Bazofilni granulociti su najsitniji i
najmanje brojni granulociti. Njihovo jedro je potkovičasto a granule ispoljavaju bazofiliju.
Agranulociti imaju nesegmentovano jedro i azurofilne granule koje se boje isključivo
ljubičasto. U agranulocite spadaju limfociti i monociti (Slika 7). Monociti su najkrupnije ćelije krvi,
ovalnog oblika sa ovalnim jedrom. Predstavljaju pokretnu rezervu tkivnih makrofaga koji učestvuju
u čišćenju tkiva od raspadnih produkata i u odbrani od mikroorganizama (Anđelković i sar. , 2002).
Slika 8. Izgled granulocita i agranulocita na mikroskopskom preparatu
Trombociti (krvne pločice) su bezjedarni fragmenti dzinovskih poliploidnih ćelija
megakariocita koji nastaju tokom trombocitopoeze u koštanoj srži. Imaju oblik bikonveksnog diska
prečnika 2-4 µm. Njihova izrazita sklonost ka aglutinaciji omogućava im da učestvuju u procesu
stvaranja krvnog ugruška na mestu oštećenog krvnog suda. Njihov životni vek je od 8 do 14 dana,
posle čega se razgrađuju u slezini (Anđelković i sar. , 2002).
16
1.3.Jetra
Jetra kao najveća žlezda,a posle kože i najveći organ ljudskog tela, zauzima specifičan
položaj u cirkulatornom sistemu, pogodan za preuzimanje i deponovanje hranljivih materija koje su
prispele iz creva, kao i za transformaciju, neutralizaciju i uklanjanje otrovnih supstanci iz krvi
(Anđelković i sar. , 2001).
Sve funkcije jetre su u međusobnom odnosu što postaje jasno prilikom pojave abnormalnosti
jetre, jer su tada mnoge od njenih funkcija oštećene istovremeno (Guyton i Hall, 2003).
1.3.1. Anatomija jetre
Jetra je mekan, smeđe-crveni organ klinastog oblika, i kao naјveći organ u trbušnoj šupljini
nalazi se u desnom gornjem kvadrantu abdominalne duplje (Slika 9). Ona ima tri strane: gornju,
koja je ispupčena, donju koja leži na debelom crevu i želucu i zadnju kojom je jetra srasla za
dijafragmu. Na gornjoj strani jetre nalazi se veza koja vezuje jetru za dijafragmu i upravo ta veza
deli jetru na dva velika režnja: desni koji je veći i levi koji je manji. Kroz donju stranu jetre u nju
ulaze grane hepatične arterije i vene porte. Kroz hilus jetre (vrata jetre) izlaze dva glavna žučna
kanala jetre koji se izvan jetre spajaju u glavni jetrin kanal - ductus hepaticus, a kada se on spoji sa
kanalom koji izvodi žuč iz žučne kesice - ductus cysticus, nastaje sabirni žučni kanal ductus
holedochus koji dovodi žuč u dvanaestopalačno crevo.
Slika 9. Građa jetre
Oba režnja se dalje dele na veliki broj režnjića (lobulusa), koji se tredicionalno smatraju
osnovnom morfološkom i funkcionalnom jedinicom jetre (Guyton i Hall, 2003).
17
Jetra je omotana Glisonovom kapsulom, tačnije vezivnom kapsulom koja je obložena
visceralnim listom peritoneuma, osim na delu gde je direktno vezana za abdominalni zid i okolne
organe (Anđelković i sar. , 2001).
1.3.2. Histologija jetre Strukturne komponente jetre su:
a) Hepatociti
b) Vezivno-tkivna stroma u kojoj su smešteni krvni sudovi, nervi, limfni sudovi i žučni kanali
c) Sinusoidni kapilari
d) Kupferove i perisinusoidne (Ito) ćelije.
1.3.2.1. Hepatocit
Hepatocite su parenhimske ćelije , koje su krupne i mnogougaone veličine oko 20-30 μm.
One formiraju skelet lobulusa na taj način što su poređane u obliku ploča, tzv. Remakove gredice.
Sama ploča izgrađena je od jednog ili dva sloja hepatocita koje se od centralne vene pružaju u vidu
zraka ka periferiji lobulusa.
Hepatociti ćine oko 80% ćelijske populacije jetre. Životni vek hepatocita je 5 meseci i
poseduju značajnu moć proliferacije ukoliko dođe do gubitka jetrinog parenhima.
Hepatociti poseduju obilje mitohondrija i dobro razvijen endoplazmatični retikulum, što
obezbeđuje hepatocitima da predstavljaju najsvestranije ćelije čovekovog organizma. To je
dokazano posedovanjem i egzokrine i endokrine funkcije, pojedine supstance sintetišu, druge
deponuju, treće neutrališu a neke samo prenose. Svaki pojedinačni hepatocit je u stanju da ostvari
većinu funkcija koje obavlja jetra (Anđelković i sar. , 2001).
18
1.3.2.2. Kupferove ćelije
Kupferove ćelije su ćelije zvezdastog oblika koje vode poreklo od monocita (Anđelkovići
sar., 2001).
Kupferove ćelije su tkivni makrofagi, specijalizovane da fagocituju bakterije i druga strana
tela u krvi hepatičkih sinusa. Krv koja je pristigla iz intestinalnih kapilara je prikupila brojne
bakterije iz creva i takva krv, uzeta iz portalnih vena, će skoro uvek, ako se zasadi u kulturi, dati
kolonije bakterija iz kolona. Međutim pojava tih bakterija u uzorku krvi iz sistemske cirkulacije je
izrazito retka što nam ukazuje na to da Kupferove ćelije, veliki fagocitni makrofagi, vrlo efikasno
očiste krv dok ona prolazi kroz sinuse. Kada bakterija dođe u kontakt sa ovom ćelijom za manje od
0,001 s prolazi kroz njen zid i ulazi unutra gde biva svarena i na taj način uklonjena iz krvi (Guyton
i Hall, 2003).
Pored fagocitoze učestvuju i u odbrani organizma na taj način što produkuju biološki
aktivne supstance, kao što su citokini i prostaglandini. Takođe se smatra da Kupferove ćelije
učestvuju u sprečavanju pojave i rasta mnogih tumora koji metastaziraju u jetri (Anđelković i sar. ,
2001).
1.3.3. Funkcije jetre
Metabolizam Jetra je hemijski vrlo reaktivan bazen, sa visokim stepenom metabolizma koji ima ulogu da
raspoređuje supstrate i energiju iz jednog u drugi metabolički sistem, obrađuje i sintetiše različite
supstance koje se transportuju u druge delove tela, kao i mnoge druge metaboličke funkcije. Njene
uloge u metabolizmu ugljenih hidrata, masti i proteina su sledeće.
Metabolizam ugljenih hidrata: deponovanje velikih količina glikogena (glukozni pufer);
pretvaranje galaktoze i fruktoze u glukozu; glukoneogeneza; formiranje mnogih važnih hemijskih
jedinjenja iz intermedijarnih proizvoda metabolizma ugljenih hidrata. Iz ovoga se može zaključiti
da je jetra veoma važna u održavanju normalne koncentracije glukoze u krvi.
Posebne uloge jetre u metabolizmu masti su: oksidacija masnih kiselina za dostavljanje
energije drugim telesnim funkcijama; sinteza velikih količina holesterola, fosfolipida i većine
lipoproteina; sinteza masti iz proteina i ugljenih hidrata.
Metabolizam proteina: deaminacija aminokiselina; uklanjanje amonijaka iz telesnih tečnosti
putem formiranja uree; formiranje protein plazme; interkonverzije među različitim aminokiselinama
i sinteza drugih jedinjenja iz aminokiselina. Ukoliko se telo odrekne usluga jetre u metabolizmu
proteina zasigurno nastupa smrt organizma (Guyton i Hall,2003).
19
Sinteza Jetra sintetiše i izlučuje u krv albumin, lipoproteine i supstance koje se koriste u procesu
koagulacije, kao što su fibrinogen, protrombin i drugi. (Anđelković et al,2001).
Depo Sklonost jetre ka deponovanju vitamina je već dugo poznata kao odličan izvor određenih
vitamina u lečenju pacijenata. Najzastupljeniji su vitamin A, D i B12.
Pored vitamina, jetra je pored hemoglobina u krvi, važan rezervoar gvožđa. Gvožđe se u
jetri deponuje u obliku feritina koji se oslobađa kada je nivo gvožđa u organizmu snižen.
Depo krvi Jetra je veoma rastegljiv venski organ koji je sposoban da deluje kao značajan rezervoar krvi
u periodima prekomerne zapremine krvi, kao i snabdevač dodatnih količina krvi u momentima
smanjenog volumena krvi.
Odbrambena uloga Sposobnost Kupferovih ćelija da fagocituju bakterije i druga strana tela u krvi hepatičkih
sinusa, i produkcija biološki aktivnih supstanci, kao što su citokini i prostaglandini, obezbeđuje
odbranu organizma.
Detoksikacija Aktivna hemijska sredina u jetri ima sposobnost da detoksikuje različite lekove kao što su
sulfonamidi, penicillin i drugi.
Sekrecija Hepatocite izlučuju različite transformisane sastojke krvi u žučne puteve. Pored vode i
elektrolita, izlučuju se žučne kiseline, žučni pigment bilirubin, holesterol i fosfolipidi (Guyton i
Hall,2003).
20
2.Cilj rada
Cilj ovog rada bio je:
Ispitati uticaj različitih koncentracija kumarina, 10mg/kg, 20mg/kg, 30mg/kg na:
− broj krvnih ćelija kod pacova;
− deponovanje glikogena u jetri pacova;
− morfometrijske karakteristike ćelije jetre pacova; − na odnos između broja Kupferovih ćelija i broja hepatocita.
21
3.Materijali i metode
3.1. Materijal Tokom eksperimenta korišćen je sledeći materijal:
− Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, težine od 200g
− Krvno tkivo i tkivo jetre pacova
− Kumarin (1,2-benzopiron)
3.2. Metode − Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima
− Postupak za dobijanje krvnih elemenata
− Metoda određivanja broja eritrocita u komori
− Izrada krvnog razmaza i određivanje leukocitarne formule
− Pravljenje trajnih mikroskopskih preparata
− Bojenje preparata
− Merenje morfometrijskih karakteristika ćelija i jedara
3.2.1. Tretiranje životinja u konstantnim eksperimentalnim uslovima
Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, težine od 200g, tretirani su 5 dana
kumarinom u koncentracijama 10, 20 i 30 mg/kg telesne tezine. Ukupno je bilo 5 životinja od kojih
su 4 tretirane i jedna netretirana koja je služila kao kontrola u eksperimentu. Lek je apliciran
intravenozno, u repnu venu. Životinje su dozirane sa po 0.5 ml rastvora kumarina određene
koncentracije svakog dana u istovreme u prepodnevnim časovima. Kumarini se rastvaraju u
rastvoru koji sadrži 80% fiziološkog rastvora i 20% propilen glikol. U 0.5 ml je dakle u životinje
unešeno: životinja tretirana sa 10 mg/kg unela je 4 mg kumarina, životinja tretirana sa 20 mg/kg
unela je 8 mg, sa 30 mg/kg unela je 12 mg, što je odgovaralo njihovim težinama od 200g.
Eksperimentalne životinje čuvane su na temperaturi od 22-23º C, sa slobodnim režimom ishrane i
režimom dana od 12:12h svetlost/tama.
22
3.2.2. Postupak za dobijanje krvnih elemenata
Pribor za uzimanje i čuvanje uzoraka krvi mora biti hemijski čist, sterilan i suv. Za upotrebu
se mora pripremiti dovoljna količina injekcionih igla, špriceva i drugog pribora. Zavisno od vrste
životinje koriste se igle različite dužine i promera, a moraju biti od čelika. Veće količine krvi mogu
se dobiti punkcijom srca (Rusov, 1984).
Petog dana od početka aplikacije kumarina životinje su žrtvovane i uzeta je krv iz srca na
sledeći način. Životinja se prvo anestezira sa 0,4 ml 10 % ketamidorom, a onda se heparinizovanom
iglom i špricem izvrši punktacija leve komore srca. Tokom vađenja krvi vodi se računa da se ne
ošteti komora i da se povremeno zaustavi uvlačenje kako bi se ona napunila krvlju. Nakon
dobijenog uzorka igla se adekvatno odlaže i baca a iz šprica se laganim pokretom istisne kap krvi na
sahatno staklo za dalju analizu. Poželjno je u što kraćem vremenskom interval početi sa analizom
kako krv ne bi koagulisala.
3.2.3. Metoda određivanja broja eritrocita i leukocita u komori
Za određivanje broja krvnih ćelija u perifernoj krvi i drugim tkivnim tečnostima i
suspenzijama upotrebljavaju se razne komore koje se nazivaju hemocitometri. Neubauer-ova
komora se sastoji od debele staklene ploče na kojoj se razlikuju tri polja, od kojih se središnje koje
je niže za 0,1 mm koristi za brojanje (Slika 10). Na njemu su ucrtane dve mrežice koje su odvojene
žlebom. Sama mrežica je oblika kvadrata i izdeljena je na 9 velikih kvadrata, čije stranice iznose 1
mm. Četiri ugaona velika kvadrata su podeljena na 16 srednjih kvadrata i oni uglavnom služe za
brojanje leukocita. Centralni kvadrat je podeljen na 16 srednjih, a ovi su dalje podeljeni na 16 malih
kvadrata, koji služe za brojanje eritrocita. Melanžeri kojima se krv uzima imaju uzan kapilarni deo
koji je graduisan i na koji se nastavlja prošireni deo sa staklenom kuglicom za bolje mešanje krvi sa
rastvorom za razblaživanje (Rusov, 1984).
23
Slika 10. Neubauer-ova komora (gore) i mrežica za brojanje ćelija na komori (dole)
Postupak punjenja komore započinjemo tako što se prvo krv uvlači sa sahatnog stakla u
kapilarni deo melanžera do oznake 0,5 ili 1,0 u zavisnosti od razblaženja koje želimo. Ukoliko
želimo da krv razblazimo 100 puta, krv se uvlači do oznake 1,0, a za razblaženje od 200 puta
uvlačimo krv do oznake 0,5. Vrh melanžera prebrišemo vatom i uranjamo u rastvor za razblaženje
(Hayem-ov rastvor za eritrocite; Turck-ov rastvor za leukocite) koji pažljivo uvlačimo do oznake
101 na kraćem kapilarnom delu melanžera. Nakon mućkanja melanžera napunimo prostor između
komore i pokrovne ljuspice u predelu mrežica i ostavimo da stoji 2-3 minuta. Tako pripremljenu
komoru posmatramo pod mikroskopom i sa objektivom srednjeg uveličanja vršimo brojanje krvnih
ćelija.
Izračunavanje: Za brojanje eritrocita na komori se pronalazi centralni veliki kvadrat.
Brojanje se vrši u malim kvadratima površine 1/400 mm2 i to najmanje u 80 takvih kvadratića.
Formula za izračunavanje je
n / 80 * 400 * 10 * 100 (ili200)
Za brojanje leukocita na komori se pronalaze četiri velika ugaona kvadtrata površine 1mm2 i
u njima se vrši brojanje. Formula za izračunavanje je
n * 10 * 10 (ili20) / 4
Oznaka n u formuli je broj izbrojanih eritrocita, a dobijeni broj izračunavanjem prema
navedenim formulama predstavlja broj eritrocita ili leukocita u μl krvi. (Rusov,1984).
24
3.2.4. Izrada krvnog razmaza i određivanje leukocitarne formule
Potreban pribor: pribor za uzimanje krvi, brušeno staklo za pravljenje razmaza i staklena
mikroskopska pločica.
Pipetom nanesemo kap krvi (prečnika 1-2 mm) na početak predmetnog stakla. Drugo
brušeno staklo prislonimo pod uglom od 35 do 45º uz kap kako bi se krv razlila duž ivice
prislonjenog stakla. Zatim se pod određenim pritiskom to staklo bez zadržavanja prevuče preko
predmetnog stakla (Rusov, 1984).
Razmaz se osuši na vazduhu a zatim boji po Pappenheim-u. Prvo se razmaz fiksira
rastvorom May-Grunvald 3-5 min, ispere mlazom destilovane, pa se prelije razblaženim rastvorom
Giemsa i ostavi da stoji 15-30 minuta. Na kraju boja se ispira destilovanom vodom dok razmaz ne
dobije crvenkastu boju.
Uz upotrebu imerzionog ulja i objektiva razmaz se pregleda i na njemu se broje 100 do 200
leukocita pri čemu se beleži svaka vrsta ponaosob (Slika 11). Na osnovu toga izračunava se
procentualna zastupljenost svake vrste leukocita - diferencijalni odnos (Petrović, 2009).
Slika 11. Morfologija agranulocita i granulocita
25
3.2.5. Pravljenje trajnih mikroskopskih preparata
Petog dana od početka aplikacije kumarina, kada se vrši žrtvovanje životinja, uzima se svež
uzorak tkiva jetre svakog pacova. Uzeti uzorak se čuva u 4 % formalinu najmanje 3 dana čime se
vrši fiksacija tkiva i na taj način održava stanje ćelija slično prirodnom. Tkivo se zatim dehidratiše
postepeno serijom etil alkohola rastuće koncentracije (75%-80%-96%-100%) pri čemu alkohol
istiskuje vodu iz tkiva. Sledeća etapa je zamena alkohola ksilolom, koji tkiva čini prozirnim, posle
koje sledi impregnacija tkiva. Bočice sa tkivima i ksilolom se stavljaju u termostat gde im se dodaje
otopljeni parafin, s tim da odnos ksilola i parafina bude 1:1 (Slika 12). Kada je parafin infiltrirao
tkivo, prožeo sve njegove pore, tkivo se zajedno sa parafinom uobliči u blok pogodan za rezanje i
taj proces se naziva kalupljenje tkiva. Koriste se posebni kalupi sa metalnim delom i plastičnom
mrežicom. Kalupljenje se vrši u termostatu tako što se tkivo u metalnom delu pravilno orijentiše,
prelije se parafinom, prekrije mrežicom pa opet nalije parafin (Slika 13). Ceo proces kalupljenja
odvija se u termostatu jer je veoma važno da parafin sve vreme ostane tečan kako se ne bi formirali
mehurići vazduha i da ne bi došlo do pucanja parafina prilikom sečenja na mikrotomu. Određena
brzina pri radu potrebna je zato što se parafin brzo steže na sobnoj temperaturi. Tako spremljen
kalup odnosi se u zamrzivač na 10 minuta kako bi se mrežica sa tkivom odvojila od metalne
posudice za kalupljenje. Sledeći korak je sečenje tj. pravljenje preseka ukalupljenog tkiva uz pomoć
mikrotoma. Mikrotom je aparat koji se koristi za sečenje ekstremno malih preseka tkiva (najčešće
4-5 mikrona) (Slika 14). Isečeni parafinski rezovi se ispravljaju u vodenom kupatilu na 50ºC i na
kraju fiksiraju za čistu predmetnu pločicu uz pomoć adhezionog sredstva. Najčešće se koristi
Majerov lepak koji se dobija filtriranjem mešavine belanca i glicerola (1:1) i dodavanjem kristala
timola filtratu. Na ovaj način dobija se trajni mikroskopski preparat koji je, kada se pločica osuši,
spreman za histološka bojenja.
Slika 12. Etape procesa pravljenja trajnih histoloških preparata
26
Slika 13. Kalupljenje tkiva Slika 14. Sečenje tkiva na mikrotonu 3.2.6. Bojenje preparata
Pre svakog bojenja neophodno je izvršiti pripremu preparata za bojenje na sledeći način.
Preparati tkiva stoje u termostatu određeno vreme kako bi se izvršila deparafinizacija preparata i
kako bi na mikroskopskoj pločici ostao samo presek tkiva. Nakon toga preparati se stavljaju najpre
u ksilol 15 minuta a zatim se ispiraju serijom etil alkohola, prvo apsolutnim, onda 96%nim i na
kraju destilovanom vodom. Ovako pripremljeni preparati su spremni za bojenje (Švob,1974).
H-E bojenje (Hematoksilin-Eozin)
1. Bojenje Hematoksilinom 10 minuta.
2. Ispiranje tekućom vodom 5 minuta.
3. Bojenje eozinom 2 minuta
4. Ispiranje destilovanom vodom i serijom alkohola rastuće koncentracije,do apsolutnog
alkohola.
5. Stajanje u ksilolu 10 minuta
6. Prekrivanje pokrovnim ljuspicama
Kao rezultat ovog bojenja na mikroskopu posmatramo ćelije jetre kojima su jedra obojena
plavo a citoplazma različitim nijansama ružičaste boje. (Švob, 1974).
27
PAS bojenje (Perjodna kiselina-Schiff)
PAS bojenje je metoda koja se koristi za dokazivanje prisustva polisaharida, kao što je glikogen, u
tkivnim komponentama.
1. Stajanje u perjodnoj kiselini 30 minuta u frižideru.
2. Ispiranje tekućom vodom 5 minuta, pa zatim destilovanom vodom još 5 minuta.
3. Bojenje Šifovim reagensom 30 minuta u frižideru.
4. Ispiranje tekućom vodom 15 minuta.
5. Bojenje Harisovim hematoksilinom 8 minuta.
6. Ispiranje tekućom vodom 10 minuta.
7. Potapanje u kiselom alkoholu (samo ukoliko je potrebno,jer može dovesti do obezbojavanja
pločica)
8. Ispiranje tekućom vodom 10 minuta.
9. Ispiranje serijom alkohola rastuće koncentracije.
10. Stajanje u ksilolu 10 minuta.
11. Sušenje na vazduhu.
12. Pokrivanje pokrovnim ljuspicama.
Kao rezultat ovog bojenja dobijamo obojena PAS pozitivna mesta, tj. deo ćelije u kome se
nalazi glikogen je obojen ružičasto do purpurno crveno (Švob,1974).
Sudan-Black B bojenje
Ova metoda se koristi za bojenje lipida na tkivnim preparatima.
1. Preparati stoje u 70% alkoholu.
2. Bojenje u dobro zatvorenoj posudi rastvorom Sudan-Black. Dužina bojenja varira u
zavisnosti od količine lipida u tkivu koje se boji. Za organe bogate lipidima dovoljno je
nekoliko minuta, a za druge organe i 30 minuta.
3. Ispiranje 70% alkoholom 30 sekundi.
4. Ispiranje tekućom vodom.
5. Kontrastno bojenje jedra crvenim nuklearnim bojama kao što su neutral red (neutralno
crvenilo), safranin (šafran), nuclear red u trajanju od svega par minuta.
6. Ispiranje destilovanom vodom.
7. Sušenje na vazduhu.
8. Pokrivanje pokrovnim ljuspicama.
Kao rezultat ovog bojenja dobijamo obojene lipide u ćeliji crno ili smeđe crno, dok su jedra
obojena crveno (Švob, 1974).
28
3.2.7. Merenje morfometrijskih karakteristika ćelija i jedara
Da bi se utvrdio uticaj kumarina na broj, morfologiju ćelija i jedara jetre izbrojan je broj
hepatocita po jedinici površine (µm2) i izmerena je area i dijametar jedra. Za utvrđivanje promena
morfologije ćelija jetre korišćen je program ImageJ, čiji je autor Vejn Resband (Wayne Rasband) sa
Nacionalnog Instituta zdravlja Sjedinjenih Američkih Država iz Betesde, država Merilend
(Bethesda, Maryland). "ImageJ" je slobodno dostupan softver za analizu slika napisan u
programskom jeziku "Java". Program ImageJ radi, bilo kao online aplikacija ili kao download
aplikacija, na svakom računaru koji ima instaliranu Java 1.4 ili noviju verziju (Slika 15). Program
može prikazati, uređivati, analizirati, obraditi, memorisati i štampati 8-bitne, 16-bitne i 32-bitne
slike. Može da radi sa mnogim formatima slika uključujući TIFF, GIF, JPEG, BMP i DICOM.
Tokom analize najpre smo preveli slike u TIFF format i tek onda određivali potrebne parameter. U
ovom program čitanje slika se može obavljati paralelno s drugim operacijama. Program ImageJ
podržava standardne funkcije obrade slike, ali obezbeđuje i određivanje raznih morfometrijskih
pokazatelja objekta, kao što su površina (area), obim, faktor oblika, i slično. Može meriti
udaljenosti i uglove, dakle daje topološke odnose između označenih objekata, pa smo ovaj program
i upotrebili za određivanje dijametra jedara hepatocita. Programom ImageJ mogu se obavljati
transformacije slika kao što su rotacije i skaliranja. Slika se može povećati do 32:1, a smanjiti do
1:32. Sve analize i funkcije obrade su dostupne na bilo kojem faktoru uvećanja (Vasiljević, 2012).
Nakon izvršene kalibracije, podešenog parametra koji želimo da analiziramo i jedinice kojom
želimo da parametar bude izražen pristupili smo analizi i dobili potrebne rezultate.
Slika 15. Glavni prozor programa ImageJ
29
4. Rezultati i diskusija
4.1.Ispitivanje uticaja različitih koncentracija kumarina na broj krvnih ćelija kod pacova
Rezultati do kojih se došlo prilikom ispitivanja uticaja kumarina na broj krvnih ćelija su
sledeći.
Eritrociti su brojani poslednjeg, petog dana eksperimenta, posle žrtvovanja životinja.
Jedinka koja je predstavljala kontrolu nije tretirana tokom eksperimenta i njen broj eritrocita u krvi
je bio jednak onome koji se smatra normalnim za vrstu a to je oko 7,8 x 1012/l (Rusov, 1984). Kod
jedinki koje su tretirane kumarinom došlo je do promene u broju eritrocita. Jedinka koja je primala
dozu od 10mg/kg, imala je neznatnu promenu u broju eritrocita, njihov broj se smanjio na 7,17 x
1012/l ali je i dalje ta vrednost bila u okviru normalnog opsega. Međutim, kod jedinki koje su primale
veću dozu kumarina došlo je i do većih promena. Tretirana životinja dozom od 20 mg/kg imala je
povećan broj eritrocita u krvi na 10,44 x 1012/l, dok je najveći broj eritrocita, čak 12,7 x 1012/l,
zabeležen kod jedinke koja je tretirana najvećom dozom, 30mg/kg. Na grafiku 1. prikazana je
razlika u broju eritrocita kod jedinki tretiranih različitim dozama kumarina.
Grafik 1 - Prikaz broja eritrocita kod životinja na kraju eksperimenta, petog dana, nakon
završetka tretiranja različitim koncentracijama kumarina.
0
2
4
6
8
10
12
14
Kontrola Doza 10mg/kg Doza 20mg/kg Doza 30mg/kg
x1012/L
30
Nakon zavšetka tretiranja životinja, petog dana, napravljen je razmaz periferne krvi,obojen i
određena je leukocitarna formula koja predstavlja diferencijalni odnos pojedinačnih vrsta leukocita,
i to je relativna vrednost izražena uprocentima (%).
Taj odnos kod zdravog pacova,što bi u ovom eksperimentu bila netretirana kontrola, iznosi
9-47% neutrofila, 0-3% eozinofila, retko bazofila, 51-90% limfocita i 0-3 % monocita (Rusov,
1984).
Tabela 1 - Procentualna zastupljenost pojedinih vrsta leukocita u krvnom razmazu kod
životinja
Doze mg/kg
granulociti (%) agranulociti (%) neutrofilni granulociti
eozinofilni granulociti
bazofilni granulociti
Limfociti Monociti
10 22% 0% 1% 77% 0% 20 45% 3% 6% 46% 0% 30 3% 0% 3% 94% 0%
Upoređivanjem normalnih vrednosti sa rezultatima iz tabele primećuje se smanjen broj
neutrofila kod jedinke koja je tretirana najvećom dozom. Neutrofilni granulociti kod ove jedinke
činili su 3% od ukupnog broja leukocita, što je ispod normalnih vrednosti za zdrave pacove. Kao
posledica neutropenije (smanjen broj neutrofilnih granulocita) javlja se smanjena sposobnost
odbrane organizma od bakterija što povlači za sobom i pojavu čestih infekcija. Prisustvo bazofilnih
granulocita kod svih tretiranih jedinki može da se protumači kao reakcija, tj. osetljivost na hemijsku
supstancu kojom su tretirane, jer je njihovo prisustvo kod zdravih pacova, u ovom slučaju kod
kontrole, veoma retko (Petrović,2009). Vrednosti procentualne zastupljenosti eozinofilnih
granulocita, limfocita i monocita pod dejstvom kumarina nisu bitno promenjene u odnosu na
normalne vrednosti.
31
4.2.Ispitivanje uticaja različitih koncentracija kumarina na deponovanja glikogena u jetri pacova
Kao što je već pomenuto, jedna od funkcija jetre u metabolizmu ugljenih hidarata jeste
deponovanje glikogena u njenim ćelijama (Guyton i Hall, 2003). Histološkim i histohemijskim
metodama je dokazano da kumarin utiče na količinu deponovanog glikogena, što se može povezati
sa koncentracijom glukoze u krvi. Rezultati koji su prikazani u Tabeli 2 nam pokazuju na promene
u količini deponovanog glikogena u ćelijama tretiranih jedinki u odnosu na kontrolu.
Tabela 2–Broj ćelija i procentualna zastupljenost ćelija sa glikogenom u jetri kod životinja tretiranih kumarinom
Doza mg/kg
Ukupan br ćelija po mm2
Br. Ćelija sa glikogenom po
mm2
% ćelija sa glikogenom
p-vrednost
10 1009,333±84,560
476,667±99,289
47,23 0,092
20 1426,667±69,284
415,667±136,442
29,14 0,204
30 1257,000±133,045
493,000±170,273
39,22 0,125
kontrola 1195,333±149,403
238,333±149,547
19,94 /
Analizom rezultata zaključujemo da je pod dejstvom kumarina došlo do povećanja količine
glikogena u ćelijama jetre onih jedinki koje su bile tretirane u odnosu na kontrolu. U poređenju sa
kontrolnom jedinkom, kod koje broj ćelija sa glikogenom po mm2 iznosi 238,333±149,547,
primećen je porast njihovog broja kod tretiranih jedinki (Slika 16). Najveći broj ćelija se
glikogenom je zabeležen kod životinje koja je tretirana dozom od 30 mg/kg, čak 493,000±149,547.
Međitim, najveća relativna procentualna zastuljenost ćelija sa glikogenom najveća je kod jedinke
tretirane dozom od 10 mg/kg, 47,23 %, dok je njena vrednost kod kontrole svega 19,94 %.
Rezultati su podvrgnuti statističkoj analizi, Studentovom t-testu kojim je vršeno poređenje
između dobijenih vrednosti za životinje koje su tretirane kumarinom i dobijenih vrednosti za
kontrolnu životinju. Vrednosti p>0,05 ne smatraju se statistički značajnim.
32
Slika 16. Uporedni prikaz.Histološki presek jetre. А- kontrolne životinje, B- jedinka tretirana
dozom od 10 mg/kg; C- jedinka tretirana dozom od20 mg/kg; D- jedinka tretirana dozom od
30mg/kg. Žuta zvezdica – ćelija sa glikogenom, zelena zvezdica – ćelija bez glikogena. PAS
bojenje. UV 40x.
Ovi rezultati su u skladu sa studijama koje su vršene sa kumarinom na koncentraciju enzima
glukozo-6-fosfataze (Feuer i sar. , 1965). Ovaj enzim se troši u ćeliji prilikom procesa glikogeneze,
tačnije učestvuje u konverziji glukoze u glikogen (Koraćević i sar, , 2003). Rezultati ovih studija
pokazuju da je kod tretiranih životinja kumarinom došlo do smanjene koncentracije ovog enzima u
ćelijama, što ukazuje na to da se enzim troši u procesu stvaranja glikogena.
A B
C D
33
4.3.Ispitivanje uticaja razlicitih koncentracija kumarina na morfomertrijske karaketristike ćelija jetre pacova
Na histološkim preparatima jetre pacova jasno se uočava morfološka građa jetre. Uz pomoć
programa Image J analizirane su morfometrijske karaketristike ćelija jetre pacova. Parametri koji su
obrađivani su area i dijametar jedara. Na Grafiku 2 i 3 prikazani su rezultati, odnosno promene ovih
parametara kod tretiranih životinja kumarinom u odnosu na kontrolnu jedniku.
Grafik 2 – Prikaz promene aree jedara hepatocita kod kontrole i tretiranih jedinki
Analizom rezultata koji su prikazani na Grafiku 2 došlo se do zaključka da se površina
jedara kod životinja koje su tretirane kumarinom povećala. Njene vrednosti su veće u odnosu na
kontrolnu životinju, kod koje je prosečna površina jedara ćelija jetre 37,78 μm. Najveća prosečna
površina jedara je zabeležena kod jedinke koja je tretirana najvećom dozom, 30 mg/kg, i ona iznosi
57,24μm. Do povećanja je došlo i kod jedinke tretirane dozom od 20 mg/kg i to na 48,28 μm i kod
one koja je tretirana dozom od 10 mg/kg, na 54,50μm.
0
10
20
30
40
50
60
70
Kontrola Doza 10mg/kg Doza 20mg/kg Doza 30mg/kg
μm
34
Grafik 3 – Prikaz promene dijametra jedara hepatocita kod kontrole i tretiranih jedinki
Dijametar jedra se obično kreće u interval od 5-10μm i varira u skladu sa stepenom
aktivnosti ćelije (Anđelković i sar. ,2002).
Analizom rezultata koji su prikazani na Grafiku 3 došlo se do zaključka da se dijametar
jedara i tretiranih životinja i kontrolne jedinke kreće u okviru normalnih vrednosti. Rezultati takođe
pokazuju i da tretirane jedinke imaju promene dijametra jedara u odnosu na kontrolnu životinju,
kod koje je prosečan dijametar jedra oko 6,85 µm. Najveći dijametar jedara izmeren je kod jedinke
tretirane najvećom dozom, 30 mg/kg, oko 8,37 µm, što bi značilo da je aktivnost ćelija jetre kod ove
jedinke najveća. Jedinka tretirana dozom od 10 mg/kg imala je prosečnu vrednost dijametra od 8,09
µm, a ona tretirana dozom od 20 mg/kg 7,62µm.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Kontrola Doza 10mg/kg Doza 20mg/kg Doza 30mg/kg
μm
35
4.4.Ispitivanje uticaja razlicitih koncentracija kumarina na odnos između broja
Kupfer-ovih ćelija i broja hepatocita u tkivu jetre pacova
Na histološkim preparatima tkiva jetre vršena je analiza procentualne zastupljenosti Kupfer-
ovih ćelija u odnosu na hepatocite. Rezultati analize prikazani su na Grafiku 4.
Grafik 4 – Prikaz promene odnosa broja Kupferovih ćelija i hepatocita u tkivu jetre kod tretiranih životinja i kontrolne jedinke
Broj Kupferovih ćelija po mm2 kod jedinki koje su tretirane kumarinom, dozom od 10
mg/kg iznosi 579,666±19,857, dozom od 20 mg/kg je 597,333±124,797, dozom od 30 mg/kg
498,000±78,886. Ove vrednosti se razlikuju od vrednosti izračunate za kontrolnu jedinku, tačnije
broj Kupferovih ćelija po mm2 kod kontrole iznosi 346,666±71,598. Na grafiku je prikazana
relativna procentualna zastupljenost Kupferovih ćelija u odnosu na hepatocite i to kod kontrole su
zastupljene sa 16 %, kod jedinke tretirane dozom od 10 mg/kg sa 24 %, dozom od 20 mg/kg sa 26
% i dozom od 30 mg/kg sa 25 %. Analizom ovih rezultata zaključuje se da je pod dejstvom
kumarina odnos između Kupferovih ćelija i hepatocita izmenjen, tj. došlo je do povećane
procentualne zastupljenosti i broja Kupferovih ćelija.
0
5
10
15
20
25
30
Kontrola Doza 10mg/kg Doza 20mg/kg Doza 30mg/kg
%
36
Slika 17. Histološki presek jetre tretirane životinje kumarinom u koncentraciji 30mg/kg. H-E
bojenje. UV 40x
Slika 18. Histološki presek jetre kontrolne životinje. H-E bojenje. UV 40x
Kupfer-ove ćelije
Hepatocite
Kupferove ćelije
Hepatocite
37
5. Zaključak
Mnoge studije do sada pokazale su štetne hepatotoksične efekte kumarina kod pacova.
U ovom istraživanju dobijeni rezultati, in vivo ekpserimentom sa Wistar pacovima,pokazali su
sledece :
• Kod tretiranih životinja broj eritrocita se povećao, kao i prisustvo bazofilnih
granulocita, dok je prisustvo neutrofila smanjeno, ispod normalnih vrednosti.
• Koncentracija glikogena se povećala, što znači da je došlo do povećanja njegovog
deponovanja u ćelijama jetre.
• Prosečne vrednosti površine i dijametra jedara hepatocita ostale su u okviru
normalnih vrednosti.
• Procentualna zastupljenost Kupfer-ovih ćelija u odnosu na hepatocite se povećala.
• Ove promene su u direktnoj zavisnosti sa koncentracijom kumarina, najveće
promene izavala je koncentracija od 30 mg/kg.
38
6. Literatura Anđelković, Z., et al., 2001: Histološka građa organa – Bonafides.
Anđelković, Z., et al., 2002: Ćelija i tkiva – Bonafides.
Borges, F., Roleira, F., Milhazes, N., Santana, L., Uriarte, E., 2005: Simple coumarins and
analogues in medicinal chemistry: occurrence, synthesis and biological activity. - Current
medicinal chemistry vol. 12: 887-916.
Cohen, A. J., 1979: Critical review of the toxicology of coumarin with special reference to
interspecies differences in metabolism and hepatotoxic response and their significance to
man. - Food and cosmetics toxicology vol. 17: 277-289.
Den Besten, C., Körösi, S. A., Beamand, J. A., Walters, D. G., Lake, B. G., 1990: Studies on the
mechanism of coumarin-induced toxicity in rat hepatocytes. - Toxicology in Vitro vol. 4:
518-521.
Fentem, J. H., Fry, J. R., & Thomas, N. W., 1992: Species differences in the hepatotoxicity of
coumarin: a comparison of rat and Mongolian gerbil. – Toxicology vol. 71: 129-136.
Fernyhough, L., Kell, S.W., Hammond, A.H., Thomas, N.W., Fry, J.R., 1994: Comparison of in
vivo and in vitro rat hepatic toxicity of coumarin and methyl analogues, and application of
quantitative morphometry to toxicity in vivo. - Toxicologyvol.88: 113-125.
Feuer, G. 1970: Induction of drug-metabolizing enzymes of rat liver by derivatives of coumarin. -
Canadian Journal of Physiology and Pharmacology vol. 48: 232-240.
Feuer, G., Goldberg, L., & Le Pelley, J., 1965: Liver response tests. II. Effect of coumarin on
glucose 6-phosphate metabolism in rat liver. - Food and Chemical Toxicologyvol.3: 251-
262.
Fylaktakidou, K. C., Hadjipavlou-Litina, D. J., Litinas, K. E., Nicolaides, D. N., 2004: Natural and
synthetic coumarin derivatives with anti-inflammatory/antioxidant activities. - Current
pharmaceutical design vol. 10: 3813-3833.
Gauyton, AC., & Hall, E.J., 2003: Medicinska fiziologija - Savremena administracija, Beograd.
Hoult, J. R. S., & Paya, M., 1996: Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins:
natural products with therapeutic potential. - General Pharmacology: The Vascular
System vol. 27: 713-722.
http://www.biology.iastate.edu/Courses/Leon/212L%20Docs/Using%20ImageJ.pdf
Jain, P. K., & Joshi. H., 2012: Coumarin: Chemical and pharmacological profile.
Koraćević et al., 2003: Biohemija
Kostova, I. 2005: Synthetic and natural coumarins as cytotoxic agents. - Current Medicinal
Chemistry-Anti-Cancer Agents vol. 5: 29-46.
39
Lacy, A., & O'Kennedy, R., 2004: Studies on coumarins and coumarin-related compounds to
determine their therapeutic role in the treatment of cancer. - Current pharmaceutical
design vol. 10: 3797-3811.
Lake, B., 1999: Coumarin Metabolism, Toxicity and Carcinogenicity: Relevance for Human Risk
Assessment. - Food and Chemical Toxicologyvol. 37: 423-453.
Lake, B. G., Evans, J., Lewis, D., Price, R., 1994: Studies on the acute effects of coumarin and
some coumarin derivatives in the rat. - Food and Chemical Toxicologyvol.32: 357-363.
Molnar, M., & Čačić, M., 2011: Biological activity of coumarin derivatives–a review. Croatian
Journal of Food Science and Technology vol. 3: 55-64.
Pari, L., & Rajarajeswari, N., 2009: Efficacy of coumarin on hepatic key enzymes of glucose
metabolism in chemical induced type 2 diabetic rats. - Chemico-biological interactions vol.
181: 292-296.
Petrovic, M., Dopsaj, V., & Rajic, M., 2009: Laboratorijska hematologija. – Farmaceutski fakultet,
Drugo dopunjeno izdanje, Beograd.
Riveiro, M. E., De Kimpe, N., Moglioni, A., Vazquez, R., Monczor, F., Shayo, C., Davio, C., 2010:
Coumarins: old compounds with novel promising therapeutic perspectives. - Current
medicinal chemistry vol. 17: 1325-1338.
Rusov, C., 1984: Osnovi hematologije životinja. - Naucna knjiga, Beograd.
Smyth, T., Ramachandran, V. N., Smyth, W. F., 2009: A study of the antimicrobial activity of
selected naturally occurring and synthetic coumarins. - International journal of
antimicrobial agents vol. 33:421-426.
supa.pharmacy.bg.ac.rs/assets/2436
Švob, M., 1974 : Histološke i histokemijske metode - Svjetlost, Sarajevo.
Vasiljević, J., 2012: Primena multifraktalne analize mikroskopskih slika u klasifikaciji intraosealnih
metastatskih carcinoma. Doktorska disertacija. Beograd.
40
Biografija kandidata
Tamara Stanković je rođena 05. decembra 1990. godine u Knjaževcu. Osnovnu školu
,,Dimitrije Todorović Kaplar “ u Knjaževcu završava 2005. godine sa Vukovom diplomom i iste
godine upisuje srednju Medicisku školu ,,Dr Milenko Hadzić“,smer fizioterapeut. Nakon završetka
srednje škole, 2009. godine upisuje osnovne akademske studije Biologije na Departmanu za
biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu,. Osnovne akademske
studije završava 2012. godine sa zvanjem ,,biolog“ i prosekom 8,5. Iste godin eupisuje master
akademske studije studijaki program Biologija na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-
matematičkog fakulteta u Nišu.