MASTER RAD - Prirodno matematicki fakultet...hemikalija ili određenih sredinskih faktora na...
Transcript of MASTER RAD - Prirodno matematicki fakultet...hemikalija ili određenih sredinskih faktora na...
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Stefan G. Nikolić
Morfološke promene na usnom aparatu larvi hironomida (Ordo Diptera,
Familia Chironomidae) izloženih nanočesticama titanijum dioksida
(ТiO2) u sedimentu
MASTER RAD
Niš, 2018
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Stefan G. Nikolić
Morfološke promene na usnom aparatu larvi hironomida (Ordo Diptera,
Familia Chironomidae) izloženih nanočesticama titanijum dioksida
(ТiO2) u sedimentu
Master rad
Kandidat: Stefan Nikolić Mentor:
Broj indeksa: 252 Dr Đurađ Milošević Niš, 2018
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Morphological changes of mouth apparatus on chironomids larvae (Ordo
Diptera, Familia Chironomidae) exposed to TiO2 nanoparticules in the
sediment
Master thesis
Candidate: Stefan Nikolić Mentor:
Students Reg. No. 252 PhD Đurađ Milošević
Niš, 2018
Biografija
Stefan Nikolić rođen je u Zaječaru 05. novembra 1991. godine, od oca Gorana i majke
Biljane.
Osnovnu školu ´´Ljubica Radosavljević Nada´´ u Zaječaru završava 2006. godine kao
odličan đak, a paralelno i osnovnu muzičku školu ´´Stevan Mokranjac´´ takođe u Zaječaru iste
godine. Nakon završetka osnovnog obrazovanja, 2006. godine upisuje srednju medicinsku školu
u Zaječaru, smer medicinska sestra-tehničar koju uspešno završava 2010. godine.
Osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu upisuje 2010.
godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. 2016. godine završava osnovne akademske
studije i iste godine upisuje master akademske studije, smer Biologija.
Zahvalnica
Srdačno se zahvaljujem svom mentoru, dr Đurađu Miloševiću na pruženoj nesebičnoj pomoći prilikom realizaciji master rada. Želeo bih isto da iskažem ogromnu zahvalnost na svim datim savetima, pozitivnim kritikama, pomoći, lepim rečima i predavanjima, motivaciji i podršci tokom svih ovih godina mog studiranja. Hvala Vam !!! Takođe, zahvaljujem se kolegi Dušanu Đorđeviću za pomoć oko pisanja master rada, kao i doktorantima Dimitriji Savić i Aci Đurđeviću na dobronamernim sugestijama pri izradi master rada kao i za pomoć tokom eksperimentalne faze istraživanja i lepim trenutcima provedenim kako na terenu i u laboratoriji, tako i tokom studentskih dana. Želeo bih da se zahvalim kolegama: Milošu Krstiću, Vladici Jovanoviću, Petru Radojkoviću, Stefanu Petkoviću, Miroljubu Đurđanoviću, Nikoli Mladenoviću, Milanu Živkoviću, Milanu Stanisavljeviću, Petru Iliću, Aleksandru i Saši Cvetkoviću, Bogosavu Stojiljkoviću, Danilu Peniću kao i koleginicama: Hristini Zakić, Mileni Petrunović, Milici Žikić, Milici Stanković, Kristini Nikolić, Milici Stojičič, Andrijani Vukadinović, Dragani Anđelković, Evi Mitić, Tini Stojadinović, Nastasji Manić, Aleksandri Stojanović, Mariji Jovanović, Sandri Stanimirov, Jovani Stanković, Mileni Veličković, Mariji Nikić, Dariji Milenković, Bojani Bošković, Jeleni Kričak, Bojani Vidojković, na nezaboravnim studentskim danima. Takođe i mom društvu: Slobodanu Zlatkoviću, Dejanu Zlatkoviću, Milanu Ignjatoviću, Daliboru Pavloviću, Milici Đorđicović, Višeslavi Bocoković, Milanu Singuliroviću, Milošu Đorđeviću, Aleksandru Mitroviću, Aleksandru i Dušanu Đorđeviću, Darku Stanimirov, Milici Gocić, Nikoli Adamoviću, Tomici Kostić, Danijelu Petrunoviću, Milošu Najdanoviću, Ivani Stančić, Milanu Tomiću, Milanu Rašiću, Tijani i Tamari Peševski, Tamari Vukić kao i mnogim drugima na divnom prijateljstvu do sada, a nadam se da ćemo i u daljem životu biti tu jedni za druge kako u lošem, tako i u dobrom ! Onima kojima sam nenamerno zaboravio da se zahvalim, ovom prilikom se izvinjavam !
Ni manju zahvalnost ne dugujem čiki Dejanu i strini Danijeli, sestri Milici i bratu Aleksandru, deda Lazi i deda Bori, sestri Dragani Aleksić, , kao i pokojnim bakama Milici i Mirjani koji su uvek bili tu za mene !!! Ovaj završni master rad posvetio bih svojim divnim roditeljima
Biljani i Goranu i najdivnijoj sestri Ivani, kojima dugujem najveću
zahvalnost, ne samo tokom studiranja, nego i u dosadašnjem životu na
svemu !!! Hvala im na bezuslovnoj podršci, ne samo tokom svih ovih
godina školovanja, već najviše na pomoci da zajedno dodjemo do
ostvarenja mog sna, a to je da postanem profesor !!! HVALA VAM !!!
Sažetak
Larve vrste Chironomus tentans (Ordo Diptera, Familia Chironomidae) koriste se u
standardnim bioesejima po protokolima za testiranje toksičnosti supstanci u sedimentima
slatkovodnih ekosistema. Pokazalo se da izloženost toksinima tokom razvića larvi dovodi do
morfoloških promena na glavenoj čauri, a posebno mentumu, što je i bio predmet ovog
istraživanja.
Testirane su sredinski relevantne koncentracije nanočestica: 2.5; 25 i 250 mg/kg TiO2, a
ICP-MS analizom potvrđeno je da larve unose nanočestice u organizam. Metodom tradicionalne
morfometrije praćeno je osam morfoloških parametara na mentumu izloženih larvi i pokazalo se
da tri parametra statistički značajno variraju između tretmana.
Rezultati ukazuju na veliki potencijal vrste Chironomus tentans kao bioindikatora
zagađenja sedimenata nanočesticama.
Ključne reči: hironomide, bioesej, TiO2 nanočestice, ekotoksikologija, biomonitoring voda,
OECD protokol, tradicionalna morfometrija
Abstract
Chironomus tentans larvae (Ordo Diptera, Familia Chironomidae) are used in standard
bioessey researches for testing effects of toxic supstances in freshwater sediments. Many
researches indicates that exposure to toxic supstances have negative influence on larval
development stadium of chironomidae, specially, inducing morphological changes on mouth
apparatus of larvae, more precisely, deformities on larvae mentum.
Relevant concentrations of TiO2 nanoparticules were tested: 2.5, 25 i 250 mg/kg TiO2,
and ingestion of nanoparticules by larvae was confirmed by ICP-MS analysis. With traditional
morphometry method, eight morphological parameters were monitored on the mentum of
exposed larvae, out of which three showed statisticaly signifficant difference among treatments.
Results indicates that larvae of C. tentans have great potential as bioindicators of
sediment pollution level by toxic supstances.
Keywords: chironomidae, bioessey, TiO2 nanoparticles, ecotoxicology, water
biomonitoring, OECD protocol, traditional morphometry
Sadržaj
1. UVOD ......................................................................................................................................................... 1
1.1 Biomonitoring ..................................................................................................................................... 1
1.2 Testovi ekotoksičnosti ......................................................................................................................... 3
1.2.1 Morfometrijske analize u testovima toksičnosti .......................................................................... 6
1.3 Zagađenje akvatičnih ekosistema ....................................................................................................... 8
1.3.1 Nanotehnologija i nanоčestice u akvatičnom ekosistemu ........................................................ 10
1.3.2 Biološki efekti metala ................................................................................................................. 11
1.3.3 Titanijum dioksid - TiO2 .............................................................................................................. 12
1.4 Akvatični makroinvertebrati kao biondikatori .................................................................................. 13
1.4.1 Chironomidae u ekotoksikološkim istraživanjima ..................................................................... 15
1.4.2 Biološki testovi uticaja TiO2 na larve hironomida ...................................................................... 19
1.5 Chironomus tentans – opšte karakteristike ...................................................................................... 22
1.5.1 Životni ciklus familije Chironomidae .......................................................................................... 22
1.5.2 Građa larve Chironomidae ......................................................................................................... 23
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ............................................................................................................................. 26
3. MATERIJALI I METODE ............................................................................................................................ 27
3.1 Test organizam .................................................................................................................................. 27
3.2 Testirana supstanca .......................................................................................................................... 29
3.3 Bioesej – postavka eksperimenta ..................................................................................................... 30
3.3.1 Tradicionalna morfometrijska analiza ........................................................................................ 31
3.3.2 ICP-MS analiza ............................................................................................................................ 32
3.4. Statistička obrada podataka ............................................................................................................ 32
4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................................................ 33
5. ZAKLJUČAK .............................................................................................................................................. 41
Literatura .................................................................................................................................................... 42
1
1. UVOD
1.1 Biomonitoring
Životna sredina je sve ono što nas okružuje i svaka čovekova aktivnost je direktno ili
indirektno povezana sa njom. Kroz antropogenu aktivnost, čovekova sredina se suočila sa novim
i potencijalno opasnim supstancama koje do tada nisu bile prisutne u prirodi (Oehlmann i
Markert, 1999).
Okvirna procena je da u životnu sredinu dospeva oko 150.000 različitih supstanci
antropogenog porekla (Slobodnik, 2013). Neki od glavnih organskih zagađivača antropogenog
porekla su: herbicidi, insekticidi, policiklična aromatična jedinjenja, perhlorati i sl. Među
neorganskim jedinjenjima prisutni su zagađivači: metali, amonijak, fosfati, nitrati i nitriti (Wright
i Welbourn, 2002). Ovi zagađivači se drugačije nazivaju hazardne supstance, prema Okvirnoj
Direktivi o vodama (eng. Water Framework Directive–Directive 2000/60/EC) i među njima se
izdvajaju pojedine koje karakteriše visoka toksičnost, perzistentnost i visoka stopa
bioakumulacije. Sve ove zagađujuće supstance neophodno je uključiti u opšti monitoring, pri
čemu se formiraju liste prioritizacije na osnovu stepena štetnosti. Dozvoljene koncetracije ovih
supstanci u akvatičnim ekosistemima su određene zakonskim regulativama, a osnovni
regulatorni dokument je Direktiva o standardima u vodenim ekosistemima (eng. Environmental
Quality Standards Directive - EQS, 2008/105/EC).
Praćenje stanja životne sredine u cilju njenog očuvanja i sprečavanja štetnih efekata
ksenobiotika na celokupan živi svet podrazumeva skup metoda koje se mogu objediniti
terminom monitoring. Prema definiciji Programa za životnu sredinu Ujedinjenih nacija (eng.
United Nations Environmental Program - UNEP) monitoring predstavlja svako ponovljeno
merenje, sa definisanim ciljem, jednog ili više hemijskih ili bioloških parametara prema unapred
određenom rasporedu u prostoru i vremenu, koristeći metode koje su uporedive i
standardizovane. Monitoring omogućava kontinuiranu kontrolu i prepoznavanje neprirodnih
promena u spoljašnoj sredini. Dva osnovna tipa monitoring, kojima se može za proceniti rizik od
2
dejstva zagađujućih materija na organizme i pratiti kvalitet životne sredine, su hemijski i biološki
monitoring (De Zwart, 1995).
Hemijski monitoring daje informacije o pristustvu i nivoima kontaminanata, čime se
omogućava procena izloženosti organizama, međutim ovaj vid monitoringa ne govori ništa o
efektima koje kontaminanti imaju na biološke sisteme (Lam, 2009). Njime se dobija informacija
o nivou određene grupe zagađivača u životnoj sredini i podaci o izloženosti organizama
ksenobioticima.
Definisanje kvaliteta sredine ili procena ugroženosti može se utvrditi i analizom strukture
živih sistema, polazeći od pojedinačnih organizama pa sve do ekosistema (Lam, 2009). U
ovakvom biološkom monitoringu (biomonitoring) koriste se živi organizmi da bi se procenilo
stanje životne sredine (Despotović, 2013). Metode ovog monitoringa imaju niz prednosti:
praćenje dugoročne izloženosti ekosistema, merenje efekata biodostupnosti ispitivanih jedinjenja
u korelaciji sa njihovom koncetracijom i toksičnošću u organizmu, integrisanje rezultata na
velikom broju jedinki (De Zwart, 1995). Bioindikatorske vrste oslikavaju nivo zagađenja u
ekosistemu, kao i dugoročni uticaj zagađenja (Wayker i Deshmukh, 2012).
Van Gestel i Van Brummelen (1996) predložili su četiri različita nivoa biomonitoringa:
➢ suborganizmalni nivo – uključuje korišćenje biomarkera, pri čemu je na nivou
biohemijskih i fizioloških procesa moguće utvrditi odstupanje od zdravog stanja;
➢ organizmalni nivo – uključuje korišćenje organizama kod kojih se prati
preživljavanje, rast, reprodukcija i slični parametri u laboratorijskim testovima toksičnosti;
➢ populacioni nivo – korišćenjem biondikatora prate se efekti promene u genetičkoj
strukturi, starosnoj strukturi ili gustini populacije;
➢ ekosistemski nivo – promene u sastavu, gustini i diverzitetu vrsta mogu ukazati na
efekte zagađenja na biocenoze.
3
Biomarkeri predstavljaju merljive promene parametara bioloških sistema (koji mogu biti
hemijskog, fizičkog ili biološkog tipa) koje reflektuju interakciju između biološkog sistema i
određenog zagađivača (Who, 1993). Glavna prednost korišćenja biomarkera je mogućnost
detekcije subletalnih bioloških efekata, koji predstavljaju rani upozoravajući signal u vidu
odgovora koji se prvo dešava na fiziološkom ili molekularnom nivou za kojim slede promene na
višim nivoima biološke organizacije (Lam, 2009).
Biondikator je pojedinačni organizam koji svojim prisustvom, odsustvom ili ponašanjem
daje informacije o uslovima u sredini u kojoj živi.
Idealni bioindikatorski organizmi bi trebalo da zadovolje naredne kriterijume: mogućnost
akumuliranja visokih koncetracija zagađivača bez visoke stope mortaliteta; sesilan način života
ili slaba pokretljivost; široka rasprostranjenost; kratak životni vek; visok fekunditet, visoka
abundanca; jednostavno uzorkovanje i gajenje u laboratorrji (Zhou et al, 2008).
Biomonitoring se sprovodi primenom dva različita pristupa:
➢ in situ (monitoring direktno u životnoj sredini na određenom lokalitetu),
➢ ex situ (proučavanje uticaja supstanci u laboratorijskim uslovima).
1.2 Testovi ekotoksičnosti
Testovi ekotoksičnosti su biološki eksperimenti (bioeseji) u kojima se testira uticaj
hemikalija ili određenih sredinskih faktora na odrećene test vrste, tj. bioindikatore. Testovi
ekotoksičnosti sastavni su deo ex situ bioloških monitoringa. Koriste se u proceni rizika novih i
postojećih hemikalija kao i za sprovođenje monitoringa stepena zagađenosti okoline tj. kvaliteta
životne sredine (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).
U svakom testu se meri efekat ispitivanog jedinjenja kroz praćenje jedne ili više varijabli,
koje se nazivaju krajnje tačke (eng. ´´endpoints´´). Efekti koji se prate mogu biti letalni ili
subletalni. Termin ´´endpoint´´ se odnosi na biološki parametar koji se meri, odnosno posmatra
(preživljavanje, broj jaja, veličina ili težina, nivo enzima …). Kod kvantitativnih varijabli (npr.
4
mortalitet) subletalni efekat je iskazan u vidu promena broja jedinki koje su pogođene, a kod
kontinuiranih varijabli (npr. stopa rasta) iskazan je procentom promene prosečnog nivoa
varijable tj. krajnje tačke. Kod oba tipa praćenih varijabli rezultati se upoređuju sa kontrolom
(Rate, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Kontrola je referentno stanje bez prisustva polutanta tj.
ksenobiotika.
Biološki testovi sprovode se na osnovu standardnih protokola, te se mogu međusobno
upoređivati i moguće je proveriti tačnost izvedenog testa ponovnim izvođenjem pod istim, tačno
defeinisanim uslovima (Rate, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).
Postoje dve vrste ekotoksikoloških testova (Markert et al., 2003):
➢ akutni testovi (kratkoročni testovi - posmatrani su parametri poput mortaliteta ili
imobilizacije jedinke; predmet istraživanja su direktno organizmi, tj. jedinke);
➢ hronični, tj. prolongirani testovi (dugoročni testovi - posmatrane promene parametra koje
se odigravaju u određenom vremenskom periodu i tiču se efekata toksikanata na stopu
reprodukcije, rasta ili neki drugi fiziološki proces; predmet istraživanja su viši nivoi
ekološke organizacije - populacije)
Obzirom da se ekotoksikološki testovi koriste u kontroli hemikalija i proceni kvaliteta
komponenti životne sredine, svaki standardizovani test mora da da približno iste rezultate u
različitim laboratorijama i u istoj laboratoriji u različitom vremenu. Da bi se dostigla visoka
ponovljivost i konzinstentnost uslovi testa moraju da budu striktno regulisani. Kako bi rezultati
ekotoksikoloških testova bili verodostojni, istraživanja se vrše prema standardizovanim načelima
Dobre Laboratorijske Prakse (eng. Good Laboratory Practice - GLP) (OECD, 1998b), kao i po
principima i standardima koje su definisale internacionalne organizacije: OECD (eng.
Organisation of Economics Cooperation and Development), CEN (eng. Comite of Europende
Normalisation) i ISO (eng. International Organization for Standardization) (Ratte, Hammers-
Wirtz i Cleuvers, 2003). Od 1980-ih različite organizacije (OECD, CEN, ISO, ASTM) razvijaju
pravilnike za ovakve testove.
5
Ukoliko se test ponavlja nekioliko puta ili se sprovodi u istom trenutku na različitim
mestima, rezultati neće biti potpuno isti usled biološke varijabilnosti test organizama koji su
uključeni, kao i zbog određenih varijabli koje je nemoguće potpuno kontrolisati u laboratorijskim
uslovima. Uzroci varariranja u ekotoksikološkim testovima mogu biti genetske i ekološke
prirode (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).
Prilikom postavljanja eksperimenta, pojedine ekološke faktore je lako kontrolisati, kao
što je temperatura, svetlost i tip podloge. Postoje faktori koje je teže kontrolisati (npr.
snabdevanje hranom približno istog kvaliteta), a koji imaju veliki uticaj na razvoj test
organizama i na efekte eksotoksikanata (Soares i Calow 1993; Ratte, Hammers-Writz i Cleuvers,
2003). Pored toga, postoji prirodna varijabilnost kod samih organizama, kaja je posledica
genetske varijabilnosti. Sve ove varijacije izazivaju “šum” u rezultatima, jer mogu zamaskirati
efekte ispitivane supstance, pa se tokom sprovođenja eksperimenata teži svodjenju ove
varijabilnosti na minimum.
Akvatična toksikologija bavi se proučavanjem jedinjenja koja se ispuštaju u akvatične
ekosisteme, a to mogu biti sintetičke i prirodne materije. Proučava se efekat i uticaj na akvatične
organizme na raznim nivoima organizacije: od subcelularnog, preko nivoa jedinke, do nivoa
zajednice i čitavog ekosistema (Rand i Petrocelli, 1985).
Tridesetih godina prošlog veka, krenuo je intenzivan razvoj ekotoksikologije voda, što je
započeto akutnim testovima na ribama. Naredne dve decenije razvili su se tzv. bioeseji u
“teglama za zimnicu”, gde se javila potreba za standardizacijom testiranja pa su tegle masovno
počele da se koriste za testiranje, a metodologija je usklađivana u različitim istraživačkim
institucijama (Rand i Petrocelli, 1985).
Biološki testovi su razvijani tokom decenija, a uobičajeni su: standardizovani test akutne
toksičnosti (obično trajanja od 24 do 29 sati) i test hronične toksičnosti (obično traje 7 i više
dana) (Moore, 2006). U ovim testovima mere se parametri, kao što su: stopa preživljavanja, rast,
reprodukcija i sl., pri različitim koncentracijama ispitivane supstance uz obavezan kontrolni test.
6
Za procenu rizika zagađenja vodene sredine od strane pojedinih polutanata u biološkim
testovima koriste se mnoge vrste algi, beskičmenjaka i riba, a najčešći standardni akvatični test
organizmi su: Pimephales promelas (vrsta klena), dafnije-račići iz reda Cladocera ( npr. Daphnia
magna), biljni komarci (Chironomus tentans, Chironomus riparius) i kalifornijska pastrmka
(Oncorhynchus mykiss) (Rand i Petrocelli, 1985).
Pojedine zelene alge (npr. Chlorella vulgaris), koriste se kao standardni test organizmi
predstavljajući primarne producente. U ulozi primarnih konzumenata koriste se Daphnidae, ali i
predstavnici zglavkara, među kojima je i grupa hironomida, čije se vrste ne koriste samo u
proceni stanja zagađenosti vodenih ekosistema određenim toksikantima, več se rade i studije u
kojima se proučava prirodna varijabilnost i prilagođenost larvi pojedinih vrsta hironimida na
promenu različitih sredinskih faktora (kiseonik, osvetljenost, ishrana i sl.) (Markert et al. 2003).
1.2.1 Morfometrijske analize u testovima toksičnosti
Morfometrija se odnosi na kvantitativnu analizu forme, odnosno koncepta koji obuhvata
veličinu i oblik (Breno, Leirs i Van Dongen, 2011). Metode morfometrije primenjuju se u
mnogim naučno istraživačkim radovima, u biologiji ove metode korišćene su za proučavanje
telesnih mera i oblika neke vrste. Jedinke određene vrste u populaciji imaju karakteristične
telesne mere uz manje ili veće varijacije. Različiti faktori utiču na promenljivost morfoloških
parametara kod jedinki, kao što su uslovi sredine, mutacije ili razvojne promene u obliku, prema
tome glavni cilj morfometrije je statistički ispitati uticaj različitih faktora na promenu oblika.
Morfometrijske analize mogu se podeliti na
1. tradicionalne
2. geometrijske
7
1.2.1.1 Tradicionalna morfometrija
Tradicionalna morfometrija se zasniva na jednostavom merenju distanci, uglova i
površina delova nekog organizma. Ona predstavlja spoj kvantitativne morfologije, koja daje
ulazne podatke i multivarijantnih statističkih metoda kojima se obrađuju ti podaci.
Metode tradicionalne morfometrije uključuju merenje vrednosti datih parametara bez
uzimanja u obzir geometrijske konfiguracije među datim parametrima (Holland, 2009).
Analiziraju se mere kao što su dužina, širina, masa i proporcije, prema tome tradicionalne
morfometrijske metode su uopšteno mere veličine. U slučajevima kada su relativne ili apsolutne
veličine od značaja, metode tradicionalne morfometrije pokazale su se izuzetno korisnim, kao što
je istraživanje rasta, te kada su mere veličine bitne u istraživanjima funkcionalne morfologije.
Metode tradicionalne morfometrije mogu biti izuzetno korisne u biomonitoringu i proučavaju u
kojoj meri pojedini zagađivači imaju uticaja na morfološke promene jedinki u ekotoksikološkim
testovima (Vidović, 2017).
1.2.1.2 Geometrijska morfometrija
Metode geometrijske morfometrije najčešće se koriste u istraživanjima evolucione i
razvojne biologije. Ove metode pružaju veliki izbor analitičkih alata koja se koriste u
proučavanju asimetrije, takođe nude fleksibilan pristup za kvantifikovanje morfoloških varijacija
koje se kasnije mogu koristiti za analizu asimetričnosti. Ova metoda omogućuje analizu celog
oblika jedinke, nezavisno od veličine, a rezultati daju jasna logička razdvajanja veličine i oblika
koji su konceptualno različiti jedni od drugih iako mogu biti u korelaciji bioloških podataka
(Klingenberg, 2015). Stoga se ove metode, kao sofisticiranije i preciznije preporučuju u
biomonitoringu u kome se prate vrlo suptilni efekti zagađujućih supstanci.
8
1.3 Zagađenje akvatičnih ekosistema
Slatkovodni ekosistemi su najveći rezervoari slatke vode za čovečanstvo! Ovi ekosistemi
su značajni transportni koridori, imaju veliki značaj u proizvodnji energije, a značajan su i izvor
hrane.
Ovi ekosistemi su u stalnoj biohemijskoj dinamici, čiji intenzitet zavisi od niza abiotičkih
i biotičkih faktora koji prostorno i vremenski neprekidno variraju. Na dinamiku procesa u
ekosistemu utiču prirodni faktori iz spoljašne sredine (npr. atmosferske padavine), ali i faktori
koji su rezultat ljudskih aktivnosti koje mogu imati negativne posledice na vodene ekosisteme.
Zagađenje vode je globalni ekološki problem (S. Simić i V. Simić, 2009). Zagađena
voda je element životne sredine koji je izmenjen i kvantitativno i kvalitativno odstupa od
prirodnih, fizičkih, hemijskih i bioloških osobina i izaziva nepoželjne posledice u vodenim
ekosistemima, pri čemu nanosi štetu biotičkoj komponenti, ljudskom zdravlju i ograničava
mogućnost njene upotrebe.
Čovekovim direktnim i indirektnim uticajem menja se struktura i funkcija vodenih
ekosistema (Lazarević et al. 2010). Delovanjem čoveka kroz urbanizaciju, industriju,
poljoprivredu i menjanje tokova reka, dolazi do promena u vodenim ekosistemima koje dovode
do destrukcije ekosistema, fizičkih promena staništa, promena u hemiji vode i promena u sastavu
vrsta (Li et al. 2010).
Vodeni ekosistemi u urbanoj i suburbanoj okolini su u velikoj meri pod uticajem čoveka i
u njih dospevaju velike količine zagađujućih materija. Bilo koja materija u velikim i neprirodnim
količinama, koja se nađe u vodi može da bude zagađujuća materija (Simić i Simić, 2009).
Trofičnost vodenih ekosistema, tj. nivo organske produkcije, zavisi od tipa i intenziteta prometa
materije, od protoka energije i visine organske produkcije. Antropogeni uticaj dovodi do
povećanja stepena zagađenja, pri čemu se povećava eutrofičnost vodenih ekosistema. Usled
različitih tipova zagađenja, trofički odnosi, tačnije odnosi u lancima ishrane, mogu biti
poremećeni što može imati posledice po populacije različitih vrsta u biocenozi. Izvori zagađenja
9
mogu biti prirodni (vulkanske erupcije, produkti požara…) ili antropogeni i u osnovi se mogu
podeliti u dve grupe (Simić i Simić, 2009):
➢ tačkasta zagađenja
➢ difuzna zagađenja
Komunalne otpadne vode, otpadne vode iz industrija i fabrika, kao i drugi izvori koji
direktno ispuštaju zagađujuće materije kroz cevi i kanale u vodene ekosisteme definisani su kao
tačkasti izvori zagađenja (eng. point source pollution). Uticaj ovakvih izvora zagađenja se u
veliko meri oseća u vodenim ekosistemim, međutim lako ih je uočiti, registrovati i moguće ih je
kontrolisati zakonodavno (Simić i Simić, 2009).
Difuzni izvori zagađenja (eng. non point source pollution) su prostorno široko
rasprotranjeni, tj. ne potiču iz jedne tačke. Javljaju se ređe i u kraćim vremenskim intervalima od
izvora tačkastog zagađenja (Simić i Simić, 2009). Nastaju kada se padavine kreću kroz i preko
zemljišta, noseći sa sobom zagađenja koja dospevaju do podzemnih voda ili do većih tokova
reka, jezera i močvara pri čemu ostavljaju veći stepen posledica u ovim ekosistemima. Glavni
izvori difuznog tipa zagađenja su: otpadna voda sa urbanih površina (ulice, travnate površine,
bašte…), veštačka đubriva i pesticidi koji se spiraju sa poljorpivrednih površina, otpadna voda
pri eksploataciji ruda (Simić i Simić, 2009).
Zagađujuće materije su: različita organska i neorganska jedinjenja, sedimenti, joni teških
metala, neorganski nutrijenti, agensi koji izazivaju bolesti, radioaktivne supstance i topla voda, a
prepoznavanje tipa zagađivača je bitno za prevenciju i prečišćavanje voda kao i za konzervaciju
životne zajednice tog ekosistema (Simić i Simić, 2009).
10
1.3.1 Nanotehnologija i nanоčestice u akvatičnom ekosistemu
Nanotehnologija je interdisciplinarna nauka koja se bavi proučavanjem materija na
nanoskali, pokušavajući da otkrije mogućnosti sinteze, modifikacije i manipulacije materija ovih
dimenzija, dimenzija manjih od milijarditog dela metra. Američka nacionalna nanotehnološka
inicijativa (eng. US National Nanotechnology Initiative) definiše nanotehnologiju kao polje koje
se bavi sistemima i strukturama koje ispoljavaju nove, veoma unapređene fizičke, hemijske i
biološke osobine, i mogu da ulaze u specifične procese koji su posledica njihove nano-veličine
(http://www.nano.gov/nanotech-101/what).
Vizija budućnosti je da se nanotehnološka i biotehnološka otkrića ujedine kako bi nastali
novi nanosistemi i uređaji koji će funkcionisati po biološkim principima (Moore, 2002; Perkel,
2004).
Zabrinutost u protekloj deceniji raste među ekotoksikolozima i patolozima zbog
posledica koje fabrički proizvedeni materijali mogu da izazovu u životnoj sredini. Osim
organskih ksenobiotika, metala i vulkanskog pepela, organizmi nisu bili u dodiru sa
nanomaterijalima u meri u kojoj se susreću danas, pa su njihovi mehanizmi odbrane od
potencijalanih negativnih dejstava ovih nanomaterijala nerazvijeni.
Biološka aktivnost ovih materija zavisi od njihovog naelektrisanja i hemijske
reaktivnosti. Priroda i protok nanočestica kroz ekosisteme nije poznata, jer su one dospele
veštački u prirodu tek pre nekoliko decenija nakon industrijske revolucije. Nekada su jedine
nanočestice u prirodi bile produkt prirodnih procesa: vulkanske prašine, morske soli i produkata
prirodnog sagorevanja (šumski požari) (Moore, 2006). Sama veličina nanočestica utiče na nivo
njihove toksičnosti i patogenost, a treba posvetiti pažnju njihovoj biorazgradnji, jer je to možda
jedan od najsigurnijih načina za kontrolu toksičnosti ovih supstanci u životnoj sredini (Crane i
Handy, 2007).
11
Kod terestričnih organizama, najčešći put unosa nanočestica je putem inhalacije ili
ingestije (Moore, 2002; Brigger et al., 2002; Colvin, 2003; Colvin,2004; Dowling, 2004;
Howard, 2004; Warheit, 2004). Postoje dokazi da sitne čestice nastale sagorevanjem izazivaju
posledice po ljudsko zdravlje (Dowling, 2004; Colvin, 2003, Colvin, 2004; Warheit, 2004;
Howard, 2004; Moore, 2002).
Moore (2006) i Crane i Handy (2007) su izučavali potencijalne biološke efekte
nanočestica i nanomaterijala na organizme u vodenoj sredini. Akvatični organizmi su u dodiru sa
vodom celom površinom tela i mogući su dodatni mehanizmi unosa od onih koji su mogući u
terestričnoj sredini, kao što je prenos preko škrga i površinskih epitela. Na ćelijskom nivou,
putevi ulaska su obično endocitoza ili kaveolarna endocitoza (Moore, 2006).
1.3.2 Biološki efekti metala
Metali predstavljaju poseban tip polutanata koji se u rekama mogu naći putem različitih
aktivnosti, ali najčešće spiranjem podloge rečnog korita ili aktivnostima čoveka (Waykar i
Deshmukh, 2012; Sakan i sar., 2011). Poljorpivreda, industrija i rudarstvo su glavni izvori
zagađenja metalima (Kumar Singh i sar., 2007). Značaj metala kao zagađivača akvatičnih
sistema ogleda se u njihovoj sposobnosti da prodru u organizme i akumuliraju se duž lanaca
ishrane. Najznačajniji metali sa aspekta zagađenja vode su: Zn, Cu, Pb, Cd, Hg, Ni i Cr. Teški
metali kao što su živa, kadmijum, olovo i nikl, kao i policiklična aromatična jedinjenja, odlikuju
se visokim stepenom genotoksičnosti (Johns i Luoma, 1990).
Teški metali u obliku finih čestica prašine dospevaju u atmosferu, odakle se talože u
vodama i tlu. U vodama se brzo razređuju i talože se kao teško rastvorljivi karbonati, sulfati i
sulfidi na dnu vodenih ekosistema. Kada se adsorpcijski kapacitet sedimenta iscrpi, raste
koncetracija jona metala u vodi. Kruženje teških metala u prirodi zavisi od promena kojima
metali podležu. Smatra se da bentosne vrste u velikoj meri akumuliraju metale jer su izloženije
njihovom delovanju od vrsta koje naseljavaju više slojeve vode (Jarić i sar., 2011). Ove vrste su
stoga pogodne kao bioindikatori zagađenja akvatičnih sredina metalima. Zbog toga što sa
12
lakoćom mogu da prodru u telo i izazovu negativne efekte, pre svega oksidativni stres, značajno
je proučiti mehanizme toksičnosti ovih elemenata i bolje razumeti načine delovanja na
organizme.
1.3.3 Titanijum dioksid - TiO2
Titanijum je otkriven u Cornwall-u, Velika Britanija, od strane William Gregor-a još
1791. Naziv je dobio po uzoru na Titane iz grčke mitologije. Široko je rasprostranjen i sačinjava
čak 0.44% Zemljine kore. Ima ga u skoro svim stenama, pesku, glini i zemljištu. Prisutan je i u
biljkama i životinjama, vodenim ekosistemima, dubinskim iskopinama, pa čak i na meteorima i
zvezdama. Dva osnovna minerala koji se koriste za izolovanje titanijuma su ilmenit i rutil. Ovaj
metal je prvi put izolovan kao čist 1910. od strane metalurga Matthew A. Hunter-a redukcijom
titanijum tetrahlorida (TiCl4) sa natrijumom u čeličnom cilindru. Najčešća forma je rutil, koji je
ujedno i najstabilnija forma. Anatas i brukit prelaze u rutil putem zagrevanja (Kazuhito i sar,
2005).
Titanijum dioksid (TiO2), je prirodni oksid titanijuma, ako se upotrebljava kao pigment
naziva se titanijumsko belo ili beli pigment. Titanijum dioksid ima široku primenu kao sastojak
boja, kozmetičkih proizvoda ali i u proizvodnji i bojenju hrane, gde ima oznaku E171
(Dubrovinskaia, 2011).
Slika 1. Strukturna formula titanijum dioksida
(https://sr.wikipedia.org/wiki)
13
U prirodi se nalazi u obliku minerala rutila, dok se za potrebe industrije može sintetisati
putem hloridnog procesa, kada se ruda redukuje ugljenikom, zatim oksiduje hlorom, pri čemu
nastaje titanijum tetrahlorid. Nastali proizvod se destilira i oksidira kiseonikom, pri čemu nastaje
čisti titanijum dioksid, uz regeneraciju hlora. U periodu između 1916. i 2011. godine
pretpostavlja se da je sintetisano oko 165.050. 000 metričkih tona titanijum dioksida širom sveta,
u nano, mikro ili krupnom obliku (Jovanović, 2015).
Ako se upotrebljava kao pigment, naziva se titanijumsko belo, beli pigment 6 ili CI
77891. Prirodno pronađeni oksidi se kopaju u rudnicima, a služe i kao komercijalni izvor
titanijuma. (Fernández-García i Rodriguez, 2007). Ima široku upotrebu: kao sastojak boja, za
bojenje hrane (ima oznaku E171), pri proizvodnji plastike i sličnim proizvodima zbog svoje
otpornosti na ultraljubičasto zračenje (apsorbuje UV zračenje efikasno pretvarajući UV svetlost u
toplotu). Zbog takvih osobina, TiO2 se koristi i u većini krema za sunčanje. Takođe uz UV
zračenje nano čestice titanijum dioksida mogu izazvati nastanak radikala sa antimikrobnim
dejstvom, zahvaljujući ovome koristi se u medicini, u prehrambenoj industriji i kontroli kvaliteta
vode (Ravishankar Rai i Jamuna Bai, 2011). Međutim usled prevelikog izlaganja UV zracima,
TiO2 (E171) može stvoriti i grupu slobodnih radikala koje mogu izazvati oksidativni stres i
oštetiti pojedine organele u ćeliji (Haynes et al., 2017). Fotokatalitičke osobine titanijum
dioksida je otkrio Akira Fudžišima 1967. godine, a otkriće je objavio 1972. U njegovu čast,
proces koji se odvija na površini kristala titanijum dioksida se naziva "Honda-Fudžišima efekt".
1.4 Akvatični makroinvertebrati kao biondikatori
Akvatične makroinvertebrate su organizmi koji velikim delom životnog ciklusa
naseljavaju vodene ekosisteme (Rosenberg i Resh, 1993). Pojedine vrste mogu živeti pri površini
vode (neuston), druge naseljavaju dno (bentos), ali mogu živeti i među submerznom vegetacijom
(epifiton). Obzirom na veliki potencijal, makroinvertebrati su temeljno istraživana grupa, pa je za
većinu vrsta poznat način života, životni ciklus, preferencije za ishranu, stanište. Mnoge vrste su
slabo pokretne, žive sesilnim načinom života, imaju široku rasprostranjenost i u životnoj sredini
14
su osetljive na promene (Paunović, 2007; Marković, 2014) te su se pokazale kao izuzetno
zahvalne za korišćenje u biomonitoringu.
U grupi akvatičnih makroinvertebrata, familija Chironomidae je najširije rasprostranjena,
česta i najbrojnija grupa insekata (makroinvertebrata) u slatkovodnim ekosistemima (Armitage i
sar, 1995).
Chironomini su hironomide čije larve su poznate kao ´´krvavi crvi´´ (eng. bloodworm),
zbog svoje izrazito crvene boje usled prisustva hemoglobina. Ovo je najznačajnija grupa u
familiji hironomida u stajaćim vodama i mogu biti brojne u jako zagađenim sredinama. Značajne
su sa ekološkog, ekotoksikološkog i medicinskog aspekta, pa se sve veći značaj daje njihovoj
biologiji i ekologiji. Detaljna ekologija i životni ciklusi mnogih vrsta još uvek su nepoznati i
mnoge studije se još površno bave njima, a razlog je teška determinacija velikog broja vrsta, kao
i mali broj stručnjaka koji su iz ove oblasti (Pinder, 1986). Prvi pokušaj da se sumira ekologija
hironomida bio je načinjen od strane Thienemann-a (1954).
U ovoj grupi, rod Chironomus najčešći je u laboratorijskim eksperimentima, dok se vrsta
Chironomus tentans najčešće koristi u ekotoksikološkim ispitivanjima i proceni uticaja hemijskih
supstanci na životnu sredinu. To je vrsta čija je populacija trenutno uspešno uspostavljena u
laboratoriji na Prirodnom-matematičkom fakultetu u Nišu (slika 2).
Slika 2. Imago Chironomus tentans u laboratoriji
Foto: Dimitrija Savić (pmf u Nišu)
15
1.4.1 Chironomidae u ekotoksikološkim istraživanjima
Kao posledica zagađenja vodene sredine specijski diverzitet faune u ovim staništima se
postepeno smanjuje, ali se favorizuju organizmi koji su tolerantni na određeni stepen zagađenja,
poput larvi pojedinih vrsta hironomida, koje postaju glavna komponenta zajednice
makroinvertebrata u ovim staništima. Larve hironomida igraju veoma važnu ulogu u lancima
ishrane vodenih ekosistema. Njima se hrane mnoge insektivorne vrste riba kao i pojedine vrste
beskičmenjaka. Larve održavaju i vodeno stanište čistim, konzumirajući i reciklirajući organsku
materiju (Ali, 1991).
Larve familije Chironomida (Diptera) su pogodne za biološka istraživanja sedimenata
slatkovodnih ekosistema iz nekoliko razloga:
➢ većinu svog života larve provode u površinskim sedimentimma, pa su izložene su
uticaju toksikanata direktnim fizičkim kontaktom ili putem ingestije;
➢ imaju kratak životni ciklus, pa je u laboratoriji moguće proizvesti deset ili više
generacija godišnje;
➢ izuzetno brojne u bentosu;
➢ relativno osetljive na polutante.
Iz navedenih razloga, larve hironomida se sve više koriste kao test organizmi u biološkim
istraživanjima (Giesy et al., 1988; Pascoe et al., 1990; Timmermans et al., 1992)
Monitoringom populacije ovih organizama možemo steći saznanja o kvalitetu vode, kao i
efektima prirodnih i antropogenih delovanja. Stresori koji utiču na acidifikaciju, degradaciju
staništa i organsko zagađenje mogu se pratiti i kontrolisati uključuvanjem hironomida u
programe bioprocene (Coffman, 1995). Larve mogu preživeti variranja temperature, pH
vrednosti, koncentracije kiseonika i nivo zagađenja. Jedinke iz familije Chironomidae su odlični
indikatori u detekciji različitih opterećenja staništa i za procenu kvaliteta vode (Lenat, 1983).
16
Deformacije i fluktuiranje asimetričnosti morfoloških karakteristika kod larvi hironomida
prepoznati su kao osetljivi indikatori biološkog stresa i često se koriste u studijama koje se bave
procenama negativnog uticaja čoveka na životnu sredinu. Najčešće korišćene vrste su
Chironomus riparius i Chironomus tentans, na kojima su u jednom takvom istraživanju
posmatrani efekti polutanata iz reke u kojoj je ova populacija živela. Različite koncentracije
olova i 4-nonilfenola pronađene su u jedinkama ove populacije, među kojima je uočena pojava
deformacije usnog aparata (Aramborou et al. 2012).
Kod kasnijih stupnjeva larvenog stadijuma Chironomidae takođe je moguće uočiti
oštećenja usnog aparata, posebno mentuma, kada su se javljala oštećenja zuba kao rezultat
reakcija na prisustvo polutanata u životnoj okolini. Ovo istraživanje sprovedeno je među 25
rodova Chironominae, Orthocladinae i Diamesinae u oblasti Nova Škotska u Severnoj Americi.
Stepen oštećenja kao i tip deformacije poslužili su kao indikatorske karakteristike pomoću kojih
je bilo moguće proceniti subletalnu dozu toksikanata (testirane su različite koncetracije teških
metala, radioaktivnosti, organofosfata, organohlorida i sličnih ksenobiotika) (Bird, 1994).
Prvi larveni stupanj kod Chironomus riparius koristi se kao najpogodniji za početak
ekotoksikoloških studija koje prate hroničnu toksičnost sedimenta, gde se prati njihov razvoj do
pojave adulta. U većini slučaja vodenih ekosistema koncentracija polutanata i dalje je ispod
letalne doze i može se odrediti tokom vremena pomoću ekotoksikoloških studija. Chironomus
riparius poznat je kao pouzdan indikator stresa usled zagađenja okoline, a otpornost larvi raste
kako i same larve napreduju ka višem stupnju (Watts i Pascoe, 1998).
U poslednje vreme, više pažnje se poklanja larvama hironomide kao i njihovoj
osetljivosti na promene životne sredine. Deformacije koje se razvijaju u odgovoru na prisustvo
toksikanata, označene su kao jako pogodni biomarkeri za određivanje toksičnosti sedimenta i
prisutnost mikropolutanata (Hamilton i Saether, 1971).
U studiji u kojoj je proučavano dejstvo metala na razvoj larvi Chironomidae, različite
koncetracije teških metala u sedimentu, poput bakra i olova, pokazale su štetno dejstvo
izazivajući deformitete delova usnog aparata kod hironomida. Larve trećeg i četvrtog stupnja
17
pokazale su najveći stepen deformacija zuba mentuma. Podloga na kojoj su larve bile uzgajane u
eksperimentalnim uslovima, bila je dijatomejska zemlja, koja se nije pokazala kao najbolji izbor
zbog toga što je izazivala visok stepen mortaliteta larvi (>60%) nezavisno od dejstva teških
metala (Bisthoven i Ollevier, 1998).
Povećanje koncetracije organske materije koje dospevaju u vodene ekosisteme putem
otpadnih voda često mogu dovesti do promena strukture životne zajednice tog ekosistema.
Kombinacije različitih polutanata i komponenti organske materije u potocima Severne Karoline
podstiču pojavu hironomida kao dominantne vrste u zajednici. Na ovaj način larve Chironomidae
možemo smatrati odličnim indikatorskim vrstama i daljom analizom zajednice bentosa možemo
utvrditi u kojoj meri je prisutnost organskog zagađenja uticala na promenu strukture zajednice.
Sa druge strane, uticaj toksičnih jedinjenja, poput teških metala ili drugih polutanata, najbolje je
posmatrati kroz stepen deformacija koje izazivaju na posmatranoj vrsti (Lenat, 1993).
Prema Warwick-u i Tisdale-u (1998), koncentracija jona teških metala, pesticida,
radioaktivnih komponenti i pojedinih kancerogena kod zajednice hironomide u larvenom
stadijumu izazvale su veliki broj poremećaja kod mandibula, premandibula, labralnih lamela i
antena.
Deformiteti mentuma uzimaju se kao najčešći parametri koji se prate tokom sprovođenja
ekotoksikoloških studija. Pored toga se u standardnom testu toksičnosti prate i tradicionalni
subletalni efekti agenasa kao što su: rast, vreme razvića ili stopa izleganja adulta. U oba slučaja
posmatrane karakteristike test organizma mogu pokazati određeni stepen varijabilnosti u odnosu
na specifičnosti postavljenog testa toksičnosti. Subletalni, efekti kod model organizama mogu
zavisiti od tipa supstrata čije fizičke osobine mogu uticati na rast i razviće larvi, kao i na akutne
promene koje se tiču deformiteta delova usnog aparata larvi (Wentsel et al. 1978).
18
Slika 3. Elektronska mikroskopija usnog aparata kod Polypedilum (levo-normalna građa, desno-oštećenje zuba)
(https://www.pmf.ni.ac.rs/download)
U nekim istraživanjima naučnisi su koristili supstrate bazirane na organskoj materiji
(treset) (Batac-Catalan i White, 1982), dok su pojedini koristile podloge na mineralnoj bazi
(kvarcni pesak) (Giesy et al. 1988). Korišćenjem supstrata na bazi minerala, istraživanjem se
pokazalo da dovodi do smanjenja oštećenja zuba mentuma kod larvi Chironomidae. Kasnije je
dokazano da uzgajanjem larvi hironomide na ovakvim podlogama može dati nejasne ili lažno
pozitivne rezultate (Warwick, 1988).
Efekti četiri različita supstrata na rast, razviće, preživljavanje i istrošenost zuba mentuma
kod larvi Chironomus tentans, ispitivani su u laboratoriji od strane Bird-a, 1995. Podloge na
kojima su larve Chironomidae bile uzgajane sastavljene su celuloznog papira u komadićima,
grubog peska, šljunka i sitnog peska. Stepen deformiteta mentuma definisan je u odnosu na tip
podloge i to u jednu od tri kategorije: minimalna oštećenja mentuma, umerena oštećenja
mentuma i znatna oštećenja mentuma. Iako su rezultati pokazali da je celulozna podloga
najpogodnija za uzgajanje kultura Chironomidae, ovo istraživanje nije u potpunosti dalo
statistički značajne podatke na osnovu kojih bi mogli tvrditi da je stepen deformiteta mentuma
direktno povezan sa tipom podloge na kojoj su larve živele. Stepen prirodne varijabilnosti u
okviru ove grupe je izrazito veliki, ujedno su visoke i stope prirodnih i naslednih deformacija
koje larve poseduju, pogotovo je to bitno kada se radi sa kulturama starijih jedinki u
istraživanjima koja se tiču odnosa deformiteta i tipa podloge (Bird, 1995).
19
Ukoliko se kao posmatrani parametar u testovima prati frekvencija deformiteta, izbor
supstrata ne mora biti od kritične važnosti, ukoliko podloga ne uzrokuje preveliko oštećenje zuba
mentuma do te mere da daje nejasne rezultate, koje je teško protumačiti ili pak izaziva visoku
stopu mortaliteta jedinki. Ako pratimo rast i razviće kao ciljne parametre istraživanja, izbor
podloge je od veće važnosti i treba što bolje uskladiti fizičke odlike podloge na kojoj se kultura
testira sa izvornim supstratom (Bird, 1995).
Dimenzije tela mogu biti parametri koji se prate u testovima toksičnosti u zavisnosti
od tipa ishrane larvi. Kvalitet hrane zavisi od prisustva organske materije, mikro-detritusa i
komponenti koje čine nutrijente za larve Chironomidae te utiču na njihov rast i razviće. U
istraživanjima u kojima je ispitivan nutrijent koji najviše doprinosu rastu i razviću jedinki
ustanovljeno je da ishrana na bazi TetraMin® hrane (komercijalna hrana za ribe), daje jedinke sa
najvećim dimenzijama tela, u odnosu na ishranu sa algama i kvascima (Habashy, 2005).
1.4.2 Biološki testovi uticaja TiO2 na larve hironomida
Akutni i hronični testovi sa biljnim komarcima (ordo: Diptera, famillia: Chironomidae)
predstavljaju deo standardne procedure analize supstanici za registraciju agrohemikalija (pod
evropskom direktivom zaštite biljnih produkata 91/414/EEC), kao i biocide. Biocidi su u
evropskom zakonodavstvu definisani kao hemijske supstance ili mikroorganizmi koji imaju za
cilj da unište, odvrate, učine bezopasnim ili vrše kontrolni uticaj na bilo koji štetni organizam
(Paulus, 2006). Rezultati ovih testova koriste se pri proceni rizika i uticaja na životnu sredinu.
OECD protokoli koji se najviše koriste jesu 218: test sa supstancom u sedimentu- OECD, 2004a
(”Sediment water chironomid toxicity test using spiked sediment“) i 219: test sa supstancom u
vodi- OECD, 2004b (”Sediment water chironomid toxicity test using spiked water“). Od 2011.
prihvaćen je i test koji se radi u test sistemu samo sa vodom: akutni imobilizacioni test
(“Chironomus sp. acute immobilization test”). Osmišljen je i test punog životnog ciklusa (prsten
test), koji predstavlja proširenje prethodnih testova. Test se ne završava sa izletanjem adulta, već
20
se imago prebacuju u akvarijum za razmnožavanje, jaja polažu u isti sistem sa test supstancom,
kao onaj iz koga su se izlegli, prati se izleganje larvi (F1 generacija), pa se one prebacuju ponovo
u posude sa supstancom i prate do izletanja. Prate se, dakle, 2 generacije (P i F1), pa se može
pratiti uticaj na reprodukciju, fekuditet i fertilitet, akumulaciju, nasledne efekte i ostale parametre
(Bruns i Weltje, 2009).
Nekoliko studija pokazalo je pojavu deformiteta delova usnog aparata kod hironomida
kao odgovor na prisustvo agenasa, a mnoge od njih bave se korišćenjem tih deformiteta kao
“endpoint”, krajnjih tačaka inidkacije populacije u biološkim testovima (Warwick, 1980a;
Warwick, 1980b; Warwick i sar., 1987; Warwick, 1991; Dermott, 1991; Janssens de Bistoven i
sar., 1992; Lenat, 1993; Bird, 1994; Hamilton i Saether, 1971).
Najskorija ispitivanja uticaja TiO2 na hironomidama (na vrsti Chironomus riparius)
vršili su Tomilinaa i sar. (2015). Praćena je promena bioloških parametara pod uticajem dve
polimorfne modifikacije TiO2- anatasa i rutila. Kao kriterijum za toksičnost su korišćeni sledeći
parametri: mortalitet, promena u linearnoj veličini i pojava morfoloških abnormalnosti u strukturi
usnog aparata nakon 20 dana izlaganja; kao i relativni broj larvi sa deformitetima, procenat
određenih deformisanih struktura i indeks stepena deformacije antena (slika 4). Koncentracije
kojima su izlagane larve su od 0.002 do 20 mg/L TiO2. Stopa preživljavanja u svim
koncentracijama bila je od 50 do 100 %, ne razlikujući se mnogo od kontrole. Linearna veličina
larvi je bila značajno manja nego u kontroli; deformiteti su bili statistički značajni na svim
koncentracijama i na mentumu i na antenama (slika 4); primećena je retardacija metamorfoze
kod larvi, najviše kod larvi III stupnja (anats-65.8% ukupnog broja larvi, rutil-37.9%).
Deformiteti mentuma su primećeni na srednjem i lateralnim zubima: bifurkacija srednjeg zuba,
dodatni zubi u nizu, manjak broja lateralnih zuba i devijacije mandibula; čak se javlja i
depigmentacija mentuma i malformacija na hetama. Na antenama su najveće promene uočene na
segmentima II i IV (savijanje ili iščezavanje segmenata, pojava novih struktura) (slika 4). Pri
ekspoziciji najvećoj koncentraciji TiO2 sve pomenute malformacije su bile izražene. Mehanizam
nastanka deformiteta nije najjasniji, predpostavlja se da deformiteti nastaju usled oštećenja DNK.
(Tomilina i sar, 2015).
21
Slika 4. Deformiteti na mandibulama i antenama Chironomus riparius (Tomilina, 2015)
Međutim, potencijalni biomarkeri zagađenja slatkovodnih ekostema nanočesticama je
nedovoljno istražen i neophodno je usavršiti postojeće i unaprediti nove metode testiranja kako
bi se taj potencijal u potpunosti iskoristio.
22
1.5 Chironomus tentans – opšte karakteristike
1.5.1 Životni ciklus familije Chironomidae
Životni ciklus hironomida (slika 6), kao i kod drugih insekata sa holometabolnim tipom
razvića, sastoji se od 4 faze:
➢ jaje
➢ larva
➢ pupa (lutka)
➢ adult (imago)
Slika 5. Životni ciklus larve familije Chironomidae (Walker, 1987)
Ženke polažu jaja u želatinozni matriks (slika 7), na neku čvrstu i stabilnu podlogu
(kamenje, granje ili žive biljke) (Nolte, 1993). Kod nekih vrsta adulti ženke legu jaja direktno na
površinu vode, nakon čega potonu na dno i iz njih se izlegu larve (familija Telmatogetoninae)
(Armitage et al., 1994).
Broj jaja u paketiću varira, uglavnom se kreće između 20 i 30. Dužina razvića jajeta traje
nekoliko dana i najviše je uslovljena temperaturom (2 do 8 dana). Morfološke karakteristike jaja
takođe mogu poslužiti prilikom determinacije (Nolte, 1993; Vallenduuk i Moller Pillot, 2007).
23
Slika 6. Jaja u želatinoznoj masi (tribus Chironominni) (Nolte, 1993)
Larve provode veći deo života zakopane u sedimentu gde žive, hrane se i razvijaju.
Nakon larvene faze, sledi period pupacije, gde pupe, tj. lutke aktivno plivaju ka površini vode.
Adulti se izležu iz lutki, ostavljajući egzoskelet (exuviae) na površini vode (Kranzfelder et al.
2015).
1.5.2 Građa larve Chironomidae
Larve imaju čvrstu glavu sa antenama, koja nema mogućnost uvlačenja u telo, sa snažnim
mandibulama, mentumom i ostalim delovima usnog aparata u prednjem delu glave. Telo je usko,
mekano i cilindrično. Uglavnom poseduju jedan par lažnih prednjih nogu na prvom segmentu
grudnog dela tela i jedan par lažnih zadnjih nogu na poslednjem telesnom segmentu (´´noge´´
larvi hironimida nemaju tipičnu građu noge insekata, već više liče na pijavke sa sitnim kukicama,
zbog čega se nazivaju lažne noge), gde su smešteni i procerci, sete i jedan do tri (najčešće dva)
para analnih tubula. Neke terestrične hironomide su izgubile jedan ili oba para ´´nogu´´, zbog
specifičnog načina života i biotopa u kome se razvijaju (Epler, 2001).
Glavni karakteri koji se koriste kod identifikacije larvi hironomida, nalaze se na glavenoj
kapsuli, u najvećoj meri oni na ventralnoj strani glave, a to su uglavnom: premandibule,
mandibule, mentum, ventromentalne ploče, sete (slika 11). Neke potfamilije poseduju
specijalizovane strukture, kao što su ligula i paraligula (Vallenduuk & Moller Pillot, 2007).
24
Slika 7. Terminologija i izgled najbitnijih karaktera za identifikaciju larvi hironomida (Sæther, 1980)
Među najistaknutijim karakterističnim delovima usnog aprata su parne, zglobne
mandibule (slika 12). One funkcionišu u kosoj ravni između labruma i maxilla. Mandibula je
nazubljena struktura, uglavnom sa spoljnim dorzalnim zubom, dominantnim apikalnim zubom i
2 ili 3 unutrašnja zuba, s tim što dorzalni zub nedostaje kod mnogih taksona. Struktura i veličina
mandibula kod hironomida se najviše koriste za njihovo razvrstavanje po funkcionalnim
grupama ishrane ( Harnisch, 1923; Chernovski, 1949; Thienemann, 1954).
Na mandibulama se mogu uočiti tri vrste seta ili grupa seta:
➢ češljasta seta ili seta mandibularis na mezalnoj subapikalnoj površini;
➢ četkasta seta ili seta subdentalis blizu unutrašnjih zuba;
➢ razgranata seta ili seta interna bazalno na unutrašnjoj strani mandibule.
Ove sete, sa setama na epipharyngis-u služe za prinošenje hrane (Artimage et al., 1995).
25
Slika 8. Različiti oblici mandibula larvi Chironomidae
Foto: Aca Đurđević (pmf u Nišu)
Larve vrsta subfamilije Chironomini su specifično crvene boje zbog prisustva
hemoglobin u krvi. Larve četvrtog stupnja se koriste u identifikaciji, jer se na njima najbolje
uočavaju karakteri. Vrlo su specifične po strukturi glavene čaure i usnog aparata, kao i nastavka
na kraju abdomena. Glava je sklerotizovana sa karakterističnim izgledom delova usnog aparata
koji predstavljaju taksonomski karakter. Oči, kao i kod ostalih jedinki ove subfamilije, su
predstavljene duplim očnim mrljama postavljenim vertikalno. Parapodije tj. lažne noge se nalaze
na prvom torakalnom i poslednjem abdominalnom segmentu. Na terminalnom abdominalnom
segmentu nalaze se parni procerci sa setama. Odrasle ženke je lako razlikovati od mužjaka:
ženke imaju kratke nitaste antene i zdepastiji abdomen, mužjaci imaju duge peraste antene i
izražene genitalne segmente na poslednjem segmentu abdomena. Pupa može biti korišćena pri
identifikaciji, kao i egzuvije, ali je ovakva determinacija vrlo teška i koriste se potpuno drugačiji
ključevi (slika 15) (Hein i Mahadeva, 1992).
26
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
Osnovni cilj ovog istraživanja je utvrditi efekat sredinski relevantnih koncentracija
nanočestica industrijski proizvedenog titanijum dioksida (TiO2, proizveden za potrebe bojenja
hrane, kao aditiv E171) na larve vrste hironomide Chironomus tentans, kroz praćenje
variranjamorfometrijskih parametara delova usnog aparata
Za realizaciju ovog cilja larve su izlagane nanočesticama u sedimentu u koncentracijama
2.5, 25 i 250 mg/kg TiO2, prateći standardni OECD protokol broj 218 dizajniran da proceni
efekte prolongiranog izlaganja larvi toksikantima u sedimentu (eng. OECD – Organization for
Economic Cooperation and Development, test 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Using
Spiked Sediment). Efekat je ispitivan praćenjem morfoloških promena na mentumu larvi
metodom klasične morfometrije.
Podaci korišćeni za obradu rezultata ovog master rada preuzeti su iz istraživanja
doktoranda Dimitrije Savić-Zdravković i rada: An environmentally relevant concentration of
titanium dioxide (TiO2) nanoparticles induces morphological changes in the mouthparts of
Chironomus tentans. Chemosphere, 211, pp.489-499. (Savić-Zdravković, D., Jovanović, B.,
Đurđević, A., Stojković-Piperac, M., Savić, A., Vidmar, J. and Milošević, D., 2018.)
27
3. MATERIJALI I METODE
3.1 Test organizam
Kako bi se formirala laboratorijska populacija, larve hironomida prikupljene su na
lokalitetu starog korita reke Nišave (slika 19). Pre nego što je eksperiment nastavljen u
kontrolisanim uslovima u laboratoriji, larve su podvrgnute identifikaciji. Nakon identifikacije,
uzgajane su u akvarijumima sa regulisanom temperaturom, svetlosnim režimom i dotokom
kiseonika. Larve su uzgajane u laboratoriji do eklozije pupe u adulte. U svrhu praćenja svih faza
životnog ciklusa hironomida, kao i stvaranja čiste kulture vrste Chironomus tentans, prva
generacija potomaka nakon polaganja jaja izolovana je u posebne akvarijume.
Slika 9. Lokalitet uzorkovanja staro korito Nišave kod Ledene Stene.
(http://i47.tinypic.com/5af140.jpg)
Akvarijumi za uzgoj u laboratoriji su konstruisani od komercijalno dostupnog stakla.
Iznad svakog akvarijuma nalazila se rojilica napravljena od drvenog okvira i mrežice koja je
prekrivala otvore kako bi se sprečilo bekstvo adulta. Zapremina akvarijuma iznosila je 80l,
dubina vode u akvarijumu bila je približno 15cm (slika 19). Akvarijum je bio opremljen
28
pumpicom za aeraciju, kako bi se populacija snabdevala kiseonikom. Voda u akvarijumu sastoji
se od česmenske i destilovane vode u odnosu 1:1, dok je temperatura održavana 21 ± 0,5ºC.
Slika 10. Akvarijum za uzgoj hironomida u laboratoriji
Foto: Dimitrija Savić (pmf u Nišu)
Bitan faktor koji utiče na razviće larvi hironomida jeste fotoperiod kao i temperatura na
kojoj je kultura uzgajana, promena malih vrednosti u okviru ovih faktora može dovesti do
odlaganja izleganja adulta (Maier, Kosalwat i Knight, 1990). Prema tome odnos svetlosti i mraka
u eksperimentu imitirao je smenu svetlosnih perioda u prirodnim uslovima (16 sati svetlosti i 8
sati mraka). Fizičko-hemijski parametri vode konstantno su praćeni, poput tvrdoće 7,3 ± 0,25
°dH i provodljivosti 325 μS/cm3, kao i pH 7,2.
Za ishranu je korišćen TetraMin® (mešavina riblje hrane u čiji sastav ulaze: riba i riblji
proizvodi, belančevine, ulja, masti, biljni proizvodi, školjke, žitarice, kvasac, lecitin, minerali,
šećeri, alge). 1g mešavine riblje hrane rastvaran je u 10ml destilovane vode, pre dodavanja u
akvarijum (slika 20).
29
Slika 11. Priprema mešavine TetraMin® riblje hrane
Foto: Dimitrija Savić (pmf u Nišu)
Materijal koji se pokazao kao najbolja podloga za uzgoj hironomida u laboratoriji jeste
celulozni papir. Ubrus papiri su natopljeni acetonom u svrhu dezinfekcije, nakon toga tretirani su
destilovanom vodom, tačnije ispirani su dok se ne ukloni miris acetona, potom je papir kuvan u
destilovanoj vodi 1h na 100°C i time je dobijena smesa za formiranje substrata.
3.2 Testirana supstanca
Za potrebe eksperimenta obezbeđen je komercijalno dostupni titanijum dioksid, sastojak
hrane E171, proizveden od strane italijanske kompanije Fiorio Colori Spa. Prema Brunauer-
Emmett-Teller površinskoj analizi supstance, TiO2 poseduje specifičnu površinu od 6.14 m2 g/1,
volumen pora je 0.12 cc g/1, dok dijametar pora iznosi 2.97 nm. Čestice belog praha titanijum
dioksida odlikuju se amorfno sferičnim oblikom sa jasno izraženim ivicama prema transmisionoj
elektronskoj mikroskopiji. Titanijum dioksid u eksperimentu korišćen je u vidu rastvora sa
koncentracijama 2.5; 25 i 250 mg E171 TiO2 po 1 kg sedimenta. Pripremljene koncentracije
suspenzije titanijum dioksida, izložene su sunčevoj svetlosti, da se inkubiraju u toku perioda
jednog dana. Tokom vremena za koje su suspenzije bile izložene, zabeležena je solarna radijacija
od 477.81 W/m2 (merenje je vršeno uz pomoć Davis Vantage Pro2TM aparata, instaliranog na
krovu zgrade). Suspenzije nano-TiO2 su potom pomešane sa kvarcnim peskom i dodate u test
posude koje su bile napunjene mešavinom obične i dejonizovane vode. Test posude su ostavljene
u laboratoriji par dana kako bi se rastvorene supstance u njima staložile.
30
3.3 Bioesej – postavka eksperimenta
Dizajn eksperimenta formiran je prema OECD protokolima, tačnije sproveden je test br.
218 dizajniran da proceni efekte prolongiranog izlaganja larvi toksikantima u sedimentu (OECD,
2016). Larve su izložene rastućim koncentracijama TiO2 u sedimentu koji se sastojao od
mešavine kvarcnog peska sa sledećim koncentracijama titanijum dioksida: 2.5, 25 i 250 mg E171
TiO2 po 1 kg sedimenta. Izabrane koncentracije predstavljaju količinu TiO2 koja ne izaziva
značajne promene u stopi mortaliteta kod larvi, kako je procenjeno prema Švajcarskom modelu
sedimenta Evropskih voda (≈2.5 mg kg/1; Gottschalk et al., 2009).
Test posude bile su staklene tegle (zapremine 600ml, dijametra 8 cm) u koje je dodat
sediment u sloju od 2 cm, pomešan sa dejonizovanom i česmenskom vodom (pH 6.52±0.4;
tvrdoća vode 7.3 °dH; provodljivost vode 325 μS/cm3). Po 20 larvi prvog stupnja stavljene su u
svaku test posudu, sa temperaturom vode od 21 ± 1 ºC, konstantnom aeracijom i dnevno-noćnim
ritmom 16:8h (svetlost:mrak). Rastvor odgovarajuće koncentracije TiO2 dodat je mokrom
sedimentu i blago i podjednako pomešan sa njim. Kao sediment u bioeseju korišćen je kvarcni
pesak pomešan sa dejonizovanom vodom. Kontrolna grupa postavljena je na isti način, samo bez
koncentracije TiO2 u podlozi. Eksperiment je rađen u triplikatu (po tri ponovaka svake
koncentracije i tri ponovka kontrole).
Kako bi larve hironomida bile praćene kroz kompletni larveni ciklus, obuhvatajući faze
od prvog do četvrtog stupnja razvića, po dvadeset larvi prvog stupnja prebačeno je u test posude
četiri dana nakon izleganja. Posle osam dana larve su dostigle četvrti stupanj razvića. Kako bi
bilo sigurno da su larve dostigle poslednji stupanj razvića, eksperiment je nastavljen do
jedanaestog dana, nakon čega je testiranje okončano i larve su pokupljene iz svih posuda. Larve
su sačuvane u 70% etanolu.
31
3.3.1 Tradicionalna morfometrijska analiza
U svrhu morfometrijskih merenja glavene kapsule hironomida su uklonjene i kuvane na
100°C u 15% KOH tokom 15 minuta, kako bi se omekšala gula i glave pripremile za izradu
mikroskopskih preparata. Ukupno 206 glavenih kapsula postavljeno je na mikroskopske pločice
koristeći Berlezov medijum, u ventralnoj poziciji kako bi se posmatrali mentumi. Preparati su
ostavljeni da se suše 20 dana. Glavene kapsule posmatrane su pod mikroskopom na 100x i 200x
uvećanju i fotografisane uz pomoć Leica MZ16A stereomikroskopa sa 10x/21B okularnim i 10x
i 20x uvećanjem objektiva. Fotografije su dobijene uz pomoć Leica DFC320 Digital Camera
system kamere. Merenja su vršena pomoću ImageJ softvera.
Radi analize morfoloških promena, definisano je i mereno osam distanci na mentumu.
Odabrane su distance koje se koriste u identifikaciji vrsta i predstavljaju taksonomski karakter za
datu vrstu. Merene su sledeće distance u mikormetrima (µ) (Slika 21):
M1 = distanca između Setae submenti;
M2 = distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba;
M3 = širina baze centralnog, tj. medijalnog zuba;
M4 = širina baze unutrašnjeg, tj. prvog
lateralnog zuba (levo);
M5 = širina baze unutrašnjeg, tj. prvog
lateralnog zuba (desno);
M6 = distanca između vrha centralnog i vrha
poslednjeg lateralnog zuba (levo);
M7 = distanca između vrha centralnog i vrha
poslednjeg lateralnog zuba (desno);
M8 = visina mentuma (distanca između vrha
centralnog zuba i linije koja spaja Setae
submenti);
Slika 12. Šema merenih rastojanja na mentumu Chironomus
tentans za tradicionalne morfometrijske analize.
Foto: Dimitirja Savić (PMF Niš)
32
3.3.2 ICP-MS analiza
Da bi dokazali da su larve hironomida u ovom israživanju unosile nanočestice u
organizam, nakon završenog eksperimenta izvršena je ICP-MS analiza tela larvi. Nakon
dekapitacije, tela larvi hironomida oprana su destilovanom vodom kako bi se uklonile moguće
nano čestice TiO2 sa površine, izmerena im je masa i potom su sačuvane u 70% etanolu radi
dalje ICP-MS analize.
Koncentracija titanijum dioksida u uzorcima larvi izmerena je pomoću ICP- MS metode
masene spektrofotometrije (eng. inductively coupled plasma mass spectrometry). U cilju
određivanja koncentracija titanijum dioksida E 171 korišćenja je jednačina:
TiO2 konc. = (konc. Ti u uzorcima larvi – konc. Ti u kontroli) * masena vrednost
TiO2/Ti. Pri čemu je masena vrednost TiO2/Ti = 1.6684
3.4. Statistička obrada podataka
Tradicionalna morfometrija
Jednofaktorska analiza varijansi (ANOVA) i Post Hoc LSD procedura je korišćena za
testiranje varijabilnosti osam morfometrijskih parametara, izmerenih na larvama hironomida
uzgajanih u kontrolnim uslovima i tretmanima sa tri različite koncentracije TiO2 u podlozi.
Mereni parametri predstavljaju distance između definisanih tačaka na mentumu i opisani su u
prethodnom tekstu (3.3.1 Tradicionalna morfometrijska analiza).
ICP-MS analiza
Rezultati analize statistički su testirani jednosmernom ANOVA metodom, praćena Post
hoc Tukey HSD procedura. Pre ANOVA analize, podaci su obrađeni kako bi se utvrdila
normalnost i homogenost vrednosti rezultata, koristeći Kolmogorov-Smirnov (sa Lilliefors
stepenom značajnosti ispravki), Shapiro- Wilk i Levene statističkim metodama.
33
Kako bi utvrdili da li postoji statistički značajna povezanost između koncentracije TiO2 u
telima hironomida i koncentracija TiO2 u podlozi, sproveden je neparametrijski korelacioni test,
tačnije Spearmanov korelacioni test - Spearmen rho.
4. REZULTATI I DISKUSIJA
ICP-MS analizom dokazano je da se sa povećanjem količine nanočestica TiO2 u
sedimentu povećava i njihova količina u telima larvi hironomida. Ovo predstavlja dokaz da su
larve unosile nanočestice u organizam, a možemo i predpostaviti da su ih unosile zajedno sa
hranom iz podloge. Rezultati analize prikazani su u tabeli 1:
Tabela 1- rezultati ICP-MS analize količine TiO2 u telima larvi hironomida nakon završenog eksperimenta
Koncentracija TiO2 u sediment
(mg TiO2 po kg sedimenta) 2.5 25 250
Ti02 koncentracija u C.tentans larvama
Srednja vrednost ± SD
(mg TiO2 po kg mokre mase jedinki)
67.30 ±
38.45a
493.63 ±
173.20b
6850.77 ±
4244.60c
*tretmani a i b su statistički različiti od tretmana c (p<0.05)
Osnova praćenja stanja životne sredine (monitoringa) je dobijanje dovoljnog broja
pouzdanih informacija na osnovu kojih se može vršiti ekološka procena rizika (eng. Ecoligical
risk assessment - ERA) (Despotović, 2013). Određivanje stepena rizika od zagađenja predstavlja
proces praćenja intenziteta i mogućnost uticaja određene toksične materije na spoljašnu sredinu
(Suter, 1993; Despotović, 2013). ERA je razvijena da bi se utvrdio štetan uticaj različitih
hemikalija na spoljašnu sredinu i obezbedila kvantitativna osnova za kategorizaciju i poređenje
različitih oblika rizika, kao i razumevanje rizika (Despotović, 2013). Da bi se monitoring vršio
na adekvatan način neophodno je odrediti i adekvatne biomarkere i praktične metode testiranja
za svaku toksičnu materiju.
34
Stoga je u ovom radu testirana metoda koja je izuzetno praktična, često korišćena kao
standardna laboratorijska procedura i jednostavna za primenu, a za organizam na kome se
supstanca testira odabran je standardni organizam po OECD protokolima koji naseljava
slatkovodne ekosisteme Srbije: Chironomus tentans.
Osetljivost na promene u životnoj sredini, dostupnost vrsta kao i brojnost jedinki,
ekološki značaj, neki su od glavnih kriterijuma koji test organizmi moraju imati kako bi bili
odabrani za procenu rizika zagađenja životne okoline. Zbog različite osetljovisti vrsta na različite
toksikante, ne postoji idealan test organizam za određeni tip hemikalije, jer svaki organizam
drugačije reaguje na određenu koncetraciju pojedinih polutanata, iako se prate isti parametri.
Ustanovljeno je da se prema organizaciji trofičkih nivoa, u ekotoksikološkim testovima koriste
organizmi koji su za dati nivo najbolji (Ratte et al. 2003).
Hironomide su holometabolni insekti, pa prolaze kroz potpunu metamorfozu tokom
hroničnih testova, a nakon izletanja, vrlo je lako razlikovati muške i ženske jedinke. Kompletan
životni ciklus Chironomus riparius na 20ºC u laboratoriji se završava za 25 dana, što je period
dovoljan za proučavanje hronične izloženosti (Bruns i Weltje, 2009). Sve ove karakteristike čine
C.tentans dobrim i kvalitetnim bioindikatorom, pritom je moguće naći jedinke u slatkovodnim
staništima Srbije, te je stoga ovo idealan test organizam koji je i korišćen u datom istraživanju.
U nastavku prikazani su rezultati dobijeni obradjenih podataka putem metode
tradicionalne morfometrije. U ovom istraživanju mereno je ukupno osam parametara – rastojanja
između tačno definisanih tačaka na mentumu. Sumirane vrednosti merenih parametara prikazane
su u tabeli 2:
35
Tabela 2 – Prikaz dobijenih vrednosti merenih rastojanja na mentumu. Pri čemu je: M1 = distanca između Setae
submenti, M2 = distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba, M3 = širina baze centralnog, tj. medijalnog
zuba, M4 = širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (levo), M5 = širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (desno), M6
= distanca između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba (levo), M7 = distanca između vrha centralnog i
vrha poslednjeg lateralnog zuba (desno), M8 = visina mentuma (distanca između vrha centralnog zuba i linije koja
spaja setae submenti).
TRETMAN replikat broj
jedinki
merena rastojanja u µ (srednja vrednost)
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8
kontrola pesak
I 19 204.8536 196.6981 52.13911 29.06679 29.23458 105.3739 105.6901 136.2619
II 14 219.6943 209.4681 56.63714 31.36443 31.16186 111.5099 111.7817 144.8207
III 13 213.9879 208.8863 52.41992 32.43192 31.75554 110.1515 110.1201 138.6181
prosečno 15.33 212.8453 205.0175 53.73206 30.95438 30.71732 109.0118 109.1973 139.9002
Kontrola papir
I 14 192.9714 180.5211 47.0925 27.62357 26.38671 97.755 99.33643 128.9261
II 15 218.7176 211.8719 55.89967 32.34713 31.83593 113.1329 114.9408 146.5255
III 13 200.0339 200.1056 49.26277 30.82877 31.27108 109.3628 106.4631 133.3182
prosečno 14 203.9077 197.4995 50.75165 30.26649 29.83124 106.7502 106.9134 136.2566
2,5 TiO2
I 17 212.4075 208.4861 54.36253 32.31947 31.43294 108.6595 111.3244 140.9377
II 14 212.8329 207.0442 53.31643 31.39136 30.31079 109.5432 109.8721 140.7799
III 7 223.3213 224.767 53.06657 35.09543 32.28757 120.3061 121.3947 152.0707
prosečno 12.6 216.1872 213.4324 53.58184 32.93542 31.34377 112.8363 114.1971 144.5961
25 TiO2
I 15 211.2909 209.531 53.42027 30.14893 30.26673 112.5583 113.2299 142.366
II 14 207.793 206.8591 54.1525 31.30557 30.41714 110.8274 109.3828 139.8286
III 12 223.3989 215.919 54.33508 33.90283 32.55092 113.203 114.6533 141.0624
prosečno 13.6 214.161 210.7697 53.96928 31.78578 31.07826 112.1962 112.422 141.0857
250 TiO2
I 14 209.4187 205.1519 55.06336 30.41743 30.37336 109.2335 109.7809 138.9182
II 11 212.2503 209.0514 53.20748 31.85432 31.01489 111.407 111.7849 141.02
III 13 212.7478 209.2684 53.41457 31.89223 31.07805 111.5397 112.0276 141.4435
prosečno 12.6 211.4722 207.8239 53.89514 31.38799 30.8221 110.7267 111.1978 140.4606
36
Uporedni prikaz dužina merenih distanci na mentumu vizuelno je prikazan na grafiku 1:
Analizom grafika 1 možemo primetiti da parametri M1 i M2 pokazuju veliku
varijabilnost medju tretmanima, dok su parametri M3, M4 i M5 skoro potpuno identičnih dužina.
Jednofaktorska analiza varijansi (one-way ANOVA) je pokazala da tri (M2, M4 i M7) od
osam parametara, koliko ih je ukupno uključeno u studiju, statistički značajno variraju (p<0.05)
između kontrole i tretmana (Tabela 3 i 4):
- M2 - distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba:
- M4 - širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (na levoj strani mentuma);
- M7 - distanca između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba (na desnoj strani
mentuma).
Grafik 1 - Rezultati merenja distanci na mentumu tretiranih larvi – uporedna analiza srednjih vrednosti
merenih parametara na različitim tretmanima.
37
Tabela 3- Deskriptivna statistika vrednosti merenih parametara koji statistički značajno variraju među tretmanima
(distanca između vrhova poslednjih lateralnih zuba - M2, širina baze unutrašnjeg lateralnog zuba (na levoj strani
mentuma)-M4 i distanca između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba (na desnoj strani mentuma)-M7.
Deskriptivna Statistika
TRETMANI N
Jedinki
Srednja
vrednost
rastojanja
u µ
Std.
Deviation
Std.
Error
95% Confidence
Interval for Mean Minimum
u µ
Maximum
u µ Lower
Bound
Upper
Bound
M2
Kontrola 46 204.02 13.015 1.919 200.16 207.89
183.49 235.68
2.5 TiO2 38 210.95 15.05 2.44 206.00 215.90
185.27 238.23
25 TiO2 41 210.48 11.17 1.74 206.95 214.01
193.94 230.76
250 TiO2 38 208.98 12.16 1.97 204.98 212.98
190.09 232.55
Total 163 208.42 13.10 1.02 206.39 210.45
183.49 238.23
M4
Kontrola 46 30.71 2.62 .38 29.93 31.49
25.48 36.46
2.5 TiO2 38 32.48 3.049 .49 31.48 33.49
25.10 37.64
25 TiO2 41 31.64 2.59 .40 30.82 32.46
25.14 37.23
250 TiO2 38 31.63 2.84 .46 30.70 32.57
26.96 43.38
Total 163 31.57 2.82 .22 31.14 32.01
25.10 43.38
M7
Kontrola 46 108.79 6.91 1.01 106.74 110.84
96.94 122.40
2.5 TiO2 38 112.64 8.29 1.34 109.91 115.37
99.15 131.05
25 TiO2 41 112.33 6.79 1.06 110.18 114.47
99.86 127.10
250
TiO2 38 112.32 7.03 1.14
110.01 114.64 98.39 125.72
Total 163 111.40 7.37 .57 110.26 112.54 96.94 131.05
38
Tabela 4 - Jednofaktorska analiza varijansi (one-way ANOVA).
Vrednosti označene * pokazuju statističku zančajnost
ANOVA Analiza Sum of Squares df Mean Square F Sig.
M2 Between Groups 1318.46 3 439.48 2.638 .049* Within Groups 26489.63 159 166.60
Total 27808.09 162
M4 Between Groups 65.92 3 21.97 2.853 .039* Within Groups 1224.46 159 7.70
Total 1290.3 162
M7 Between Groups 439.22 3 146.40 2.778 .043* Within Groups 8378.27 159 52.69
Total 8817.49 162
Parametar M2 (rastojanje među vrhovima poslednjih zuba) je statistički značajno (M2,
ANOVA F=2.638, p<0.05) varirao između testiranih tretmana gde je kontrola imala značajno
(Post hoc LSD) uže mentume od hironomida gajenih u tretmanima sa 2.5 i 25 TiO2 (Grafik 2):
Grafik 2 - Variranje parametra M2 medju tretmanima.
a<b Tretman obeležen oznakom a je statistički značajno različit od tretmana b ( p<0.05).
39
Identičan obrazac variranja su pokazali parametri širina osnove prvog levog lateralnog
zuba (M4, ANOVA F=2.853, p=0.039) i distanca između vrha medijalnog zuba i poslednjeg
lateralnog sa desne strane (M7, ANOVA F=2.778, p=0.0430). Ovi parametri su pokazivali
najmanje vrednosti u kontroli, a najveće u tretmanu sa 2.5 TiO2 (Grafici 3 i 4):
Grafik 3- Variranje parametra M4 medju tretmanima.
a<b Tretman obeležen oznakom a je statistički značajno različit od tretmana b (p=0.039).
Grafik 4 - Variranje parametra M4 medju tretmanima.
a<b Tretman obeležen oznakom a je statistički značajno različit od tretmana b (p=0.0430)
40
Na osnovu grafika se može zaključiti da je rastojanje medju vrhovima poslednjih zuba na
mentumu najmanje u kontroli, te da se drastično povećava pri izloženosti TiO2. Ovaj obrazac se
ponavlja i kod ostalih merenih rastojanja koja pokazuju statistički značajno variranje između
tretmana. Baza prvog lateralnog zuba (na levoj strani mentuma) je uža u kontroli u odnosu na
tretmane, i to statistički značajno manja u odnostu na 2.5 tretman. Desna strana mentuma, tj.
rastojanje izmedju vrha medijalnog i vrha poslednjeg lateralnog zuba je kraća u kontroli u
odnosu na tretmane. Rezultati pokazuju tendenciju proširenja određenih delova usnog aparata pri
izloženosti nanočesticama TiO2
Ovo je suprotno od vrednosti rezultata analize geometrijske morfometrije koje je radjena
na istom uzorku od strane Savić-Zdravković i saradnika (Savić-Zdravković et al. 2018). Rezultati
geometrijske morfometrije pokazuju tendenciju sužavanja mentuma. Ovakvi rezultati ukazuju na
neophodnost daljih detaljnijih analiza.
Hironomide su vrlo specifične po strukturi glavene čaure i usnog aparata, te se ove
strukture koriste u samoj identifikaciji vrsta. Međutim, u ekotoksikološkim ispitivanjima, kao što
je i navedeno u uvodu, ove strukture reaguju na zagađujuće supstance u sredini i menjaju svoju
morfologiju. Shodno ovome, nekoliko decenija unazad, deformiteti usnog aparata larvi
hironomida posmatraju se kao potencijalni indikatori prisutnosti zagađenja u prirodnim vodenim
ekosistemima (Warwick, 1990; Bird, 1994; Groenendijk et al., 1998; Janssens De Bisthoven et
al., 1998; Meregalli et al., 2000; Gerhardt et al., 2006). Međutim, ova metoda se pokazala kao
nedovoljno efikasna i neophodno je razviti nove metode i “endpoint” parameter koji se trebaju
pratiti u standardnim testovima. Stoga, zbog neobjektivnosti i nekonzistentnosti u proceni
prisustva deformiteta, u datom istraživanju praćeni su klasični morfometrijski parametri sa
precizno definisanim tačkama na mentumu larvi.
41
5. ZAKLJUČAK
Rezultati tradicionalne morfometrijske analize ukazuju da razlike među mentumima larvi
gajenih na podlogama sa različitim koncentracijama nanočestica TiO2 postoje. Pokazalo se da su
mentumi u kontrolama uži od mentuma u tretmanima, tj. merena rastojanja su statistički
značajno veća u tretmanima u odnosu na kontrolu. Merena rastojanja predstavljaju standardne
dužine koje se koriste u identifikaciji vrsta i predstavljaju taksonomski karakter za datu vrstu.
Rezultati ove analize izuzetno su značajni, jer ukazuju na to da i strogo definisani taksonomski
karakteri mogu varirati u stanju stresa, tj. pod uticajem izloženosti kontaminantima.
Od ukupno osam merenih parametara, samo tri se pokazalo osetljivo na tretiranje
nanočesticama. Ovakvi rezultati ukazuju na mogućnost korišćenja datih parametara u budućim
ekotoksikološkim ispitivanjima. Činjenica da ostali parametri, tj. rastojanja na mentumu, ne
variraju značajno među tretmanima, ukazuje na to da ih potencijalno treba isključiti iz budućih
istraživanja i time skratiti vreme analize.
Rezultati celokupnog istraživanja ukazuju na to da je Chironomus tentans dobar indikator
prisustva nanočestica u sedimentu akvatičnih ekosistema. Pre svega, pokazalo se da larve unose
TiO2 iz podloge u svoj organizam pomoću ICP-MS analize. Takođe, merenje rastojanja izmedju
definisanih tačaka na mentumu larvi, koristeći se tradicionalnim morfometrijskim metodama,
može pokazati efekat delovanja nanočestica na larve. Međutim, nije neophodno meriti više od tri
rastojanja na mentumu, tj: distancu između vrhova poslednjih lateralnih zuba; širinu baze prvog
levog unutrašnjeg lateralnog zuba i distancu između vrha centralnog i vrha poslednjeg lateralnog
zuba sa desne strane. Naravno, ovo istraživanje je neophodno sprovesti na većem broju
ponovaka i većem broju jedinki kako bi se ovaj trend proverio i potvrdila osetljivost datih
prametara na uticaj nanočestica TiO2. Neophodno je razmotriti i nove, sofisticiranije metode
analize morfoloških promena, kao što je metoda geometrijske morfometrije.
Ovakva istraživanja neophodno je sprovesti u većem obimu kako bi se uspostavila
standardna, ponovljiva metoda detekcije efekata TiO2 nanočestica, koja bi se mogla koristiti u
standardnim testovima toksičnosti.
Literatura
Ali, A., 1991: Perspectives on management of pestiferous Chironomidae (Diptera), an emerging
global problem. Journal of the American Mosquito Control Association 7: 260- 281.
Arambourou H, Beisel J-N, Branchu P, Debat V., 2012: Patterns of Fluctuating Asymmetry and
Shape Variation in Chironomus riparius (Diptera,Chironomidae) Exposed to
Nonylphenol or Lead. Plos one. Vol. 7. pp. 11.
Armitage, D., P., Pinder, L., C., V., P., Cranston, S., 1995: The Chironomidae. Biology and
ecology of non-biting midges. Chapman and Hall, UK.
Armitage, P., Cranston, P.S., Pinder, L.C.V. 1994: The Chironomidae: Biology and
Ecology of Non-biting Midges. Chapman and Hall, London. pp. 572.
Batac-Catalan, Z., White, S., 1982: Creating and Maintaining Cultures of Chironomus
tentans(Diptera: Chironomidae).Entomology News. Vol.93. pp. 54–58.
Bell, H. L., 1970: Effect of pH on the life cycle of the midge Tanytarsus dissimilis. – Canadian
Entomology. pp.102: 636-639.
Bird, G. A., 1994: Use of chironomids deformities to asses environmental degradation in the
Yamaska river, Quebac. Environmental Monitoring and Assesment. Vol. 30. pp. 163-
175.
Bird, G. A., 1995: Deformities in Cultured Chironomus tentans larvae and the influence of
substrate on growth, survival and mentum wear. Environmental Science Branch.
Bisthoven L., Ollevier, F, 1998: Experimental Induction of Morphological Deformities in
Chironomus riparius Larvae by Chronic Exposure to Copper and Lead. Environmental
contamination and toxicology. Vol. 35. pp. 249-256.
Breno, M., Leirs, H., Van Dongen, S., 2011: Traditional and geometric morphometrics for
studying skull morphology during growth in Mastomys natalensis (Rodentia Muridae).
Journal of Mammalogy. pp. 92(6): 1395-1406.
Brigger I., Dubernet, C., Couvreur, P., 2002: Nanoparticles in cancer therapy anti diagnosis.
Advance Drug Delivery Review. pp. 2002(54):631–51.
Brundin, L., 1966: Transantarctic relationships and their significance, as evidenced by
chironomid midges with a monograph of the subfamilies Podonomidae and
Aphoroteniinae and the austral Hetagyae. Kunglica Svenska Vetenskapakademiens
Handlingar. Pp.11, 1-471.
Bruns, E., Weltje, L., 2009: The chironomid full life-cycle test Validation report. First draft.
Chernovski, A. A. 1949: Indetification of larvae of the midge family Tendipedidae. Izdatestvo
Akademii nauk SSSR. National Lending Library for science and Tehnology. Boston spa.
Coffman, W. P., 1995: The chironomidae: biology and ecology of non-biting midges. Chapman
and Hall, London, pp. 436–447.
Colvin, V. L., 2003: The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature
biotechnology. pp. 21(10), 1166.
Colvin, V. L., 2004: Sustainability for nanotechnology: making smaller safer and changing the
way industry thinks in the process. The Scientist. pp.18(16), 26-28.
Crane, M., Handy, R., D., 2007: An assessment of regulatory testing strategies and methods for
characterizing the ecotoxicological hazards of nanomaterials. Report for Defra,
London,UK.
De Zwart, D., 1995: Monitoring water quality in the future. Biomonitoring. National Institute for
Public Healt and Environmental Protection. Bilthoven. The Netherlands. pp. 1-81.
Dermott, R. M., 1991: Deformities in Larval Procladius spp. and Dominant Chironomini from
the St. Clair River. Hydrobiology. pp. 219, 171–185.
Despotović, S., 2013: Parametri antioksidacionog zaštitnog sistema i koncentracija teških metala
u visceralnoj masi odabranih vrsta puževa i školjki Dunava, Tise i Velike Morave.
Doktorska disertacija. Biološki fakultet. Univerzitet u Beogradu.
Dubrovinskaia N. A., Dubrovinsky L. S., Ahuja R., 2001: Experimental and Theoretical
Identification of a New High-Pressure TiO2 Polymorph. Physics Review Letter. pp. 87:
27-550.
Dowling, A., 2004: Development of nanotechnologies. Mater Today. pp.30–51.
Epler, J. H., 2001: Identification manual for the larval Chironomidae (Diptera) of North and
South Carolina. North Carolina Department of Environment and Natural Resources.
Fabricius, 1805: Hemilucilia segmentaria (Fabricius, 1805) (Diptera: Calliphoridae) as new
biological vector of eggs of Dermatobia hominis (Linnaeus Jr., 1781) (Diptera:
Oestridae) in Reserva Biológica do Tinguá, Rio de Janeiro, Brazil.
Fernández-García, M., Rodriguez, A., J., 2007: Metal oxide nanoparticules. Nanomaterials:
Inorganic and Bioinorganic Perspectives. Brookhaven National Laboratory.
Ferrington, L.C., 2008: Global diversity of non-biting midges (Chironomidae; Insect-Diptera) in
freshvater. Hydrobiologia. pp.595(1):447-455.
Gerhardt, A., Orendt, C., Dettinger-Klemm, A., Janssens de Bisthoven, L., Michiels, S., Otto C.
J., Vogt, C., 2006: Chironomiden: potential und Einsatzmöglichkeiten im Biomonitoring
von Gewässern-ein Überblick. DGL-Mitteilungen. pp. 49–57.
Giesy, J. P.,Graney, R. L.,Newsted, J. L., Rosiu, C. J.,Benda, A., Kreis, R. G., Horvath, F. J.,
1988: Comparison of Three Sediment Bioassay Methods Using Detroit River Sediments.
Environmental Toxicology Chemistry. pp. 483–498.
Gottschalk, F., Sonderer, T., Scholz, R. W., Nowack, B., 2009: Modeled environmental
concentrations of engineered nanomaterials (TiO2, ZnO, Ag, CNT, fullerenes) for
different regions. Environmental science and technology. pp.43(24), 9216-9222.
Groenendijk, D., Postma, J., Kraak, M., & Admiraal, W., 1998: Seasonal dynamics and larval
drift of Chironomus riparius (Diptera) in a metal contaminated lowland river. Aquatic
Ecology. pp. 32(4):341–351.
Habashy, M. M., 2005: Culture of Chironomid larvae (Insecta-Diptera-Chironomidae) unde
different feeding systems. Egyptian Journal of Aquatic research. pp. 403-418.
Hamilton, A.L., O.A. Sæther, 1971: The occurrence of characteristic deformities in the
chironomid larvae of several Canadian lakes. Canadian Entomologist . Vol.103. pp.363-
368.
Harnish, O., 1923: Metamorphosis und system der Gattung Cryptochironomus. Ein Beitrag zum
Problem der Differenzierung der Entwicklungstande der Chironomidaen. Zoology Abt.
Syst. Georg. Biol. Tiere. pp. 47: 271-308.
Haynes, V. N., Ward, J. E., Russell, B. J., Agrios, A. G., 2017: Photocatalytic effects of titanium
dioxide nanoparticles on aquatic organisms current knowledge and suggestions for future
research. Aquatic Toxicology.
Hein, J., Mahadeva, M., N., 1992: Rearing and Maintaining Midge Cultures (Chironomus
Tentans) for Laboratory Studies. The American Biology Teacher. pp. 236-240.
Holland, E., 2009: Limitations of traditional morphometrics in research on the attractiveness of
faces. Psychonomic Bulletin and Review. pp.16(3): 613-615.
Howard, T.M., Crosskey, R.W., 2004: A revised taxonomic and geographical inventory of world
blackflies (Diptera: Simuliidae). London: Natural History Museum.
Janssens de Bisthoven, L. G., Timmermans, K. R., Ollevier, F., 1992: The Concentration of
Cadmium, Lead, Copper and Zinc in Chironomus thummi Larvae (Diptera,
Chironomidae) with Deformed Versus Normal Mentum. Hydrobiology. pp.141-149.
Janssens de Bisthoven, L., Gerhardt, A., Soares, A. M. V. M., 2005: Chironomidae larvae as
bioindicators of an acid mine drainage in Portugal. Hydrobiologia. pp.532: 181–191.
Janssens De Bisthoven, L., Nuyts, P., Goddeeris, B., Ollevier, F., 1998: Sublethal parameters
in morphologically deformed Chironomus larvae: clues to understanding their
bioindicator value. Freshwater Biology. pp.39(1):179–191.
Jarić, I., Višnjić-Jeftić, Ž., Cvijanović, G., Gačić, Z., Jovanović, LJ., Skorić, S., Lenhard, M.,
2011: Determination of differential metal and trace element accumulation in liver, gills,
intestine and muscle of starlet (Acipenser ruthenus) from the Danube River in Serbia by
ICP-OES. Microchemistry Journal. pp. 98, 77-81.
Jovanović, B., 2015: Critical review of public health regulations of titanium dioxide, a human
food additive. Integrated environmental assessment and management. pp.11(1), 10-20.
Johns, C., Luoma, C.N., 1990: Arsenic in benthic bivalves of San Francisco Bay and the
Sacramento/San Joaquin River delta. Science Total Environment. pp. 673- 684.
Kazuhito, H., Hiroshi, I., Akira, F., 2005: TiO2 Photocatalysis: A Historical Overview and
Future Prospects. Japanese Journal of Applied Physics. pp. 8269–8285
Kranzfelder P., Anderson A., Egan A., Ferrignton L. C., 2015: Use of Chironomidae (Diptera)
Surface-Floating Pupal Exuviae as a Rapid Bioassessment Protocol for Water Bodies.
Journal of visualized experiments.
Klingenberg, C. P., 2015: Analyzing Fluctuating Asymmetry with Geometric Morphometrics:
Concepts, Methods, and Applications. Symmetry. pp. 7(2): 843-934.
Kumar Singh, R., Chavan, S. L., Sapkale, P. H., 2007: Heavy metal concentrations in water,
sediments and body tissues of red worm (Tubifex sp.) collected from natural habitats in
Mumbai, India. Environment Monitoring Assessment. pp.129, 471-481.
Lam, P. K. S., 2009: Use of biomarkers in environmental monitoring. Ocean Coast. Manage. pp.
348-354.
Lazarević, M., Milovanović, D., Simonović, P., Simić, V., Simić, S., Cakić, P., Paunović, M.
2010: The Danube in Serbia. Institut za biološka istraživanja ”Siniša Stanković”,
Beograd. pp. 15-30.
Lenat, D. R., 1993: Using mentum deformities of Chironomus larvae to evaluate the effects of
toxicity and organic loading in streams. The North American Benthological Society. pp.
265-269.
Lenat, D. R., 1983: Chironomid taxa richness: natural variationand use in pollution assessment.
Freshwater Invertebrate Biology. pp. 192–198.
Li, L., Zheng, B., Liu, L., 2010: Biomonitoring and bioindicators used for river ecosystems:
definitions, approaches and trends. Procedia Environment Science. pp. 1510-1524.
Linnaeus, C., 1758: Systema Naturae, ed. Tomus I.
Markert B. A., Breure A. M., Zechmeister H. G., 2003: Bioindicators and Biomonitors. Elsevier
Science Ltd. Kidlington, Oxford. pp. 240.
Marković, V., 2014: Morfološka varijabilnost i distribucija roda Theodoxus Montfort, 1819
(Neritomorpha, Gastropoda) u centralnom delu Balkanskog poluostrva i na južnom
obodu Panonske nizije. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Begradu.
Marziali, L., Armanini, D. G., Cazzola, M., Erba, S., Toppi, E., Buffagni, A., Rossaro, B., 2010:
Responses of Chironomid larvae (Insecta: Diptera) to ecological quality in Mediterranean
river mesohabitats (South Italy). River Research Applications. pp.26: 1036-1051.
Maier, K. J., P. Kosalwat, A. W. Knight, 1990: Culture of Chironomus decorus (Diptera:
Chironomidae) and the Effect of Temperature on its Life History. Environmental
Entomology. pp. 1681–1688.
Meregalli, G., Vermeulen, A. C., Ollevier, F., 2000: The use of chironomid deformation in an in
situ test for sediment toxicity. Ecotoxicology Environmental Safety. pp. 47(3):231–238.
Moller Pillot, H., 2009: Chironomidae Larvae, Biology and Ecology of the Chironomini. Zeist,
The Netherlands, KNNV Publishing.
Moller Pillot, H. K. M., 2009: Chironomidae larvae of the Netherlands and adjacent Lowlands.
Biology and ecology of the Chironomini. KNNV Publishing, Zeist, The Netherlands.
Moore, M. N., 2002: Biocomplexity: the post-genome challenge in ecotoxicology. Aquatic
toxicology. pp.59(1), 1-15.
Moore, M. N., 2006: Do nanoparticles present ecotoxicological risks for the health of the aquatic
environment? Environment international. pp. 32(8), 967-976.
Nolte, U., 1993: Egg masses Of Chironomidae (Diptera): a review, including new observations
and a preliminary kay. Scandinavian Entomology Limited. pp. 4:35-75.
OECD, 2016: Nanomaterials in Waste Streams Current Knowledge on Risks and Impacts.
OECD Publishing.
OECD, 2016: Nanomaterials in Waste Streams Current Knowledge on Risks and Impacts.
OECD Publishing.
OECD, 2016: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment.
Oehlmann, J., Markert, B. A., 1999: Okotoxikologie. Ecomed.
Orendt, C., Spies, M., 2012: Chironomini (Diptera: Chironomidae: Chironominae): Keys to
Central European Larvae Using Mainly Macroscopic Characters.
Pascoe, D., Brown, A. F., Evans, B. M. J., McKavanagh, C, 1990: Effects and Fate of Cadmium
during Toxicity Studies with Chironomus riparius – The Influence of Food and Artificial
Sediment. Environment Contamination Toxicology. pp.19, 872–877.
Paunović, M., 2007: Struktura zajednica makroinvertebrata kao indikator tipova tekućih voda
Srbije. Doktorska disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Begradu.
Paulus, W., 2006: Directory of Microbicides for the Protection of Materials and Processes.
Springer Netherland, Berlin 2006.
Perkel, J., M., 2004: Nanoscience is out of the bottle. The Scientist. pp.17(15):20–3.
Pinder, L.C.V., 1986: Biology of freshwater chironomidae. Annual Review Entomology. Pp.
31:1-23.
Rand, Gary, M., Petrocelli, Sam, R., 1985: Fundamentals of aquatic toxicology: Methods and
applications. Washington: Hemisphere Publishing. ISBN 0-89116-382-4.
Ratte, H. T., Hammers-Wirtz, M., Cleuvers, M., 2003: Ecotoxicity testing. In Trace Metals and
other Contaminants in the Environment. Elsevier. pp. 221-256.
Ravishankar Rai, V., Jamuna Bai, A., 2011: Nanoparticles and their potential application as
antimicrobials.Mysore: Formatex.
Reiss, F., 1968: Verbreiting lakustrischer Chironomiden (Diptera) des Alpengebietes. Annual
zoology fenn. pp. 5: 119-125.
Rosenberg, D.M., Resh, V. H., 1993: Freshwater biomonitoring and benthic macroinvertebrates.
Chapman & Hall, New York.
Savić-Zdravković, D., Jovanović, B., Đurđević, A., Stojković-Piperac, M., Savić, A., Vidmar, J.
and Milošević, D., 2018. An environmentally relevant concentration of titanium dioxide
(TiO2) nanoparticles induces morphological changes in the mouthparts of Chironomus
tentans. Chemosphere, 211, pp.489-499.
Simić S., Simić V. 2009. Ekologija kopnenih voda. (Hidrobiologija I). Biološki fakultet
Univerziteta u Beogradu. Prirodno-matematički fakultet Univerziteta u Kragujevacu.
Zemun. Alta Nova, 1-295.
Sæther, O.A., 1980: Glossary of chironomid morphology terminology (Diptera: Chironomidae).
Entomology Scandinavian Supplies. pp.14:1-51.
Sakan, S., Đorđević, D., Dević, G., Relić. D., Anđelković, I., Đuričić, J., 2011: A study of trace
element contamination in river sediments in Serbia using microwave-assisted aqua regia
digestion andmultivariate statistical analysis. Microchemistry Journal. pp.99, 492-502.
Slobodnik, J., 2013: Emerging Environmental Pollutants in the Context of Risk Assessment of
European River Basin. UNESCO Conference on Emerging Pollutants in Water, Belgrade,
Serbia. pp. 35-38.
Soares, A. M. V. M., Calow, P., 1993: Seeking standardization in ecotoxicology. Progress in
standardization of aquatic toxicity tests. pp.1-6.
Suter, G.W. H., 1993: Ecological Risk Assessment. Lewis Publishers, Boca Raton, Fl, USA
.
Thienemann, A., 1954: Chironomus.Leben, Verbreitung und wirtshaftsliche Bedeutung der
Chironomiden. Binnengewasser. pp. 20: 1-834.
Timmermans, K. R., Peeters, W. and Tonkes, M.: 1992: Cadmium, Zinc, Lead and Copper in
Chironomus riparius (Meigen) Larvae (Diptera, Chironomidae): Uptake and Effects.
Hydrobiology. pp. 241, 119–134.
Tomilina, I. I., Gremyachikh, V. A., Grebenyuk, L. P., Smirnov, E. A., Golovkina, E. I., 2015:
Changes in biological parameters of freshwater animals under the impact of various
crystal modifications of titanium dioxide nanoparticles. Inland water biology. pp. 8(3),
309-318.
Townsend, C., Hildrew, A., Francis, J., 1983: Communiti structure in some soutern English
stream: the influence of physicochemical factors. Freshwater Biology. pp.13(6):521-544.
Vallenduuk, H., Moller Pillot, H., 2007: Chironomidae Larvae, General ecology and
Tanypodinae, Zeist, The Netherlands, KNNV Publishing.
Van Gestel, C. A. M., Van Brummelen, T. C., 1996: Incorporation ofthe biomarker concept in
ecotoxicology calls for a redefinition of terms. Ecotoxicology. pp. 217-225.
Vidović, I., 2017: Povezanost fluktuirajuće asimetrije i fitnesa dagnje (Mytilus galloprovincialis
Lamarck, 1819) uvjetovanog okolišem. Sveučilište u Zagrebu. Doktorska disertacija.
Walker, I. R., 1987: Chironomidae (Diptera) in paleoecology. Quatery Science Review. pp.6:
29–40.
Warheit, D. B., 2004:Nanoparticles: health impacts? Materials today. pp. 7(2), 32-35.
Warwick W. F., 1990: Morphological deformities in chironomidae (Diptera) larvae from the Lac
St. Louis and Laprairie Basins of the St. Lawrence River. Journal Great Lakes Research.
pp. 16(2):185–208.
Warwick, W. F., Fitchko, J., McKee, P. M., Hart, D. R., Burt, A. J., 1987: The Incidence of
Deformities in Chironomus spp. from Port Hope Harbour, Lake Ontario. Journal Great
Lakes Research. pp.13, 88–92.
Warwick, W. F., Tisdale, A. N., 1988: Morphological deformities in Chironomus,
Cryptochironomus and Procladius larvae (Diptera:Chironomi-dae) from two
differentially stressed sites in Tobin Lake, Saskatchewan. Canadian Journal of Fish-eries
and Aquatic Sciences. pp. 1123-1144.
Warwick, W. F., 1980: Pasqua Lake, Southeastern Saskatchewan: A Preliminary Assessment of
Tropic Status and Contamination Based on the Chironomidae (Diptera). Pergamon Press,
Oxford. pp. 255– 267.
Warwick, W. F., 1980: Palaeolimnology of the Bay of Quinte, Lake Ontario: 2800 Years of
Culture Influence. Canadian Fish Aquatic Science. pp. 117.
Warwick, W. F., 1988: Morphological Deformities in Chironomidae (Diptera) Larvae as
Biological Indicators of Toxic Stress. Advances in Environmental Science and
Technology. John Wiley & Sons, New York. pp. 281–320.
Warwick, W. F., 1991: Indexing Deformities in Ligulae and Antennae of Procladius Larvae
(Diptera: Chironomidae): Application to Contaminant-stressed Environments. Canadian
Journal Fish Aquatic Science. pp. 48, 1151–1166.
Watts, M., Pascoe, D., 1998: Selection of an appropriate life-cycle stage of Chironomus riparius
Meigen for use in chronic sediment toxicity testing. Chemosphere. pp. 1405 1413.
Waykar, B., Desmukh, G., 2012: Evaluation of bivalves as bioindicators of metal pollution in
freshwater. Environment Contamination Toxicology. pp. 88, 48-53.
Wentsel, R., McIntosh, A., McCafferty,W. P., 1978: Emergence of the Midge Chironomus
tentans When Exposed to Heavy Metal Contaminated Sediment. Hydrobiology. pp 195–
196.
Who International Programme On Chemical Safety – IPCS, 1993: Biomarkers and risk
assessment: concepts and principles. Environmental Health Criteria 155. World Health
Organization. Geneva, Switzerland.
Wright, D., Welbourn, P., 2002: Environmental toxicology. The press syndicate of the
University of Cambridge, Cambrige UK.
Zhou, Q., Zhang, J., Fu, J., Shi, J., Jiang, G., 2008: Biomonitoring: an appealing tool for
assessment of metal pollution in the aquatic ecosystem. Analitical Chemistry Acta. pp
135-150.
www.ncbi.nlm.nih.gov
http://www.nano.gov/nanotech-101/what
http://www.oecd.org/
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Stefan Nikolić
Mentor, MN: Đurađ Milošević
Title, TI: Morphological changes of mouth apparatus on chironomids larvae
(Ordo Diptera, Familia Chironomidae) exposed to TiO2
nanoparticules in the sediment
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2018
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
51 p. ; graphic representations: 12pics; 4 graphs; 4 tabels;
Scientific field, SF: Biology
Scientific discipline, SD: Ecology
Subject/Key words, S/KW: chironomids, bioessey, ecotoxicology;
UC 591.1:595.
77+549.514.6+552.5 Holding data, HD: Library
Note, N: Abstract, AB: In this research effects od TiO2 nanoparticles (E171 food
color aditiv) are examined on mouthpart deformities of
chironomid larvae (Chironomus tentans), using methods of
tradional morphometry. Experiment was designed on OECD
protocol (OECD – Organization for Economic Cooperation
and Development), test number 218.
Accepted by the Scientific Board on, ASB:
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President:
Member:
Member, Mentor:
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Стефан Николић
Ментор, МН: Ђурађ Милошевић Наслов рада, НР:
Морфолошке промене на усном апарату ларви хирономида (Ordo
Diptera, Familia Chironomidae) изложених наночестицама титанијум
диоксида (ТiO2) у седименту
Језик публикације, ЈП: Cрпски Језик извода, ЈИ: Eнглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2018 Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
51 стр. ; граф. прикази: 12, табела: 4 графика: 4;
Научна област, НО: Биологија Научна дисциплина, НД: Екологија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: хирономиде, биоесеј, екотоксикологија...
УДК 591.1:595.
77+549.514.6+552.5 Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН: уколико је рад рађен ван факултета (у лабораторији)
Извод, ИЗ: У овом раду истраживан је ефекат наночестица индустријски
произведеног титанијум диоксида (TiO2, произведен за потребе
бојења хране, као адитив Е171). Праћене су морфолошке промене
ментума код ларви хирономиде Chironomus tentans методом
класичне морфометрије. Експеримент је дизајниран на основу ОЕЦД
протокола (енг. OECD – Organization for Economic Cooperation and
Development) број 218.
Датум прихватања теме, ДП:
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник:
Члан: Члан, ментор: