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Mammalian expression vector

speaker : Yen-chin Liu

劉 燕 琹

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Mammalian expression vector ( 哺乳類動物細胞表現載體 )

定義：當 DNA 接入此種載體，經送入哺乳類動物細胞內， 而使此段 DNA 序列能夠表現出蛋白質條件： 含有複製起始點 Ori → 能在寄主細胞內自行複製

有限制酶 (restriction enzyme) 切點 → 用於 DNA

切接

含有耐抗生素基因 → 以利篩選

安全無毒性 → 對寄主細胞無害

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promoter RBS ATG MCS TAA

含有起動子 (promoter) → 為 RNA polymerase 結合的地方， 是 DNA 轉錄為 RNA 之起始部位

含有核醣體結合區 (ribosome binding site, RBS) → mRNA

與 ribosome 結合後，由 mRNA 的 5´→3´端逐一合成蛋白質

含有轉譯起始部位 ATG ；終止部位 TAA 、 TAG or TGA

含有多重選殖位 (multiple cloning sites, MCS) → 插入欲表 現基因

expression vector

gene

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在哺乳動物細胞上發展轉殖的目的：

為了 knockout 基因表現，將細胞內某一基因失去作用，

以瞭解某一基因在細胞內的功能

利用動物生產重要蛋白質，伴隨乳汁分泌出來，通常是 醫藥上的蛋白質

基因治療 (gene therapy) ，將健康的基因取代患者的遺 傳致病基因，使其遺傳病消失

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依據外源基因 ( exogenous gene) 進入哺乳動物細胞的方式

分類：

( 一 ) Calcium phosphate-mediated transfection

DNA 溶液 ( plasmid DNA ) 與 0.125 M CaCl2 及 1.5 mM Na2H

PO4

混合形成 CaPO4 / DNA 沈澱，用以感染哺乳動物細胞

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( 二 ) DEAE dextran-mediated transfection

DNA 溶於分子量為 500 kD 的 diethylaminoethyl dextran 培養液 中， DNA 負電荷與 DEAE-dextran 結合被細胞吞入，

因此容易 送入寄主細胞內

( 三 ) Electroporation

將 plasmid DNA 混合於細胞懸浮液並置於一容器中，容器接

上 (+) 及 (-) 電以 2 ~ 4 kV 電壓在 4℃溫度之下通電 10

min ，約有 60 ~ 90 % 細胞經此通電處理可以存活，高電壓通電可以使 細胞膜有孔洞，因而 DNA 進入細胞內

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( 四 ) Liposome-mediated transfection

磷脂質溶於有機溶劑中經揮發形成一薄層，加入DNA 溶液

並經超音波震盪可做成各種大小的脂球體 ( liposome

) ，內部 是 DNA 溶液而其外是磷脂雙層膜，此 liposome 攜

帶 DNA 能經 由與細胞膜的融合，而將 DNA 送入哺乳動物細胞內Liposome

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以上方法均是以化學及物理方式，將帶有轉殖基因的

載體轉染哺乳動物細胞 優點： 能控制毒性 ( controlled toxicity )

DNA 大小沒有限制 ( unlimited DNA size )

缺點：

獲得穩定的轉染細胞則需幾週至幾個月的時間

插入寄主染色體機率低 ( very low integration )

基因傳遞效率低 ( very low transfected efficient )

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( 五 ) Viral vector-mediated transfection

利用 virus 可以感染哺乳動物細胞且快速的特性，將病毒

DNA 適當的剪接去除有害的片段，將外來 DNA 接入病毒 DNA 內，經感染而送入細胞內

http://www.nettally.com/prusty/gene.htm

capsid

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Viral vector

猿猴病毒 40 ( simian virus, SV40 )

腺病毒 ( adenovirus )

牛乳狀突病毒 ( bovine papilloma virus, BPV )

反轉錄病毒 ( retrovirus )

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猿猴病毒 40 ( simian virus, SV40 )

又名猿猴空泡病毒 40 ( simian vacuolating virus 40)

源自恆河猴腎臟細胞內，但不影響本身細胞病變

直徑 45 nm 、 20面體立體對稱

含 5243 個鹼基對組成的環狀雙股 DNA

為多瘤病毒 ( polyoma virus ) ，可誘發 多個部位或器官產生肉瘤或癌症

感染對象為倉鼠、大鼠、猴、人類等

第一個選殖病毒載體用於感染哺乳類動物

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SV40 病毒基因體 ( SV40 genome )

分為早基因及晚基因區域早基因在病毒感染寄主早期便能表現，早基因產物為大 T抗原 ( large T antigen ) 是促使病毒DNA 在容許性細胞 (permissive cell)中複製的因子。晚基因僅於病毒

的 DNA開始複製後才表現。晚基因會製造病毒的被囊體 ( capsid )蛋白質，或稱病毒的外殼。

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SV40 病毒選殖載體實例

以 HindIII 與 BamHI 切割載體，插入兔子球蛋白基因 (β-globin gene )。原本在 HindIII 與 BamHI

切位間之片段因此被移除，換上兔子之基因，此 viral

vector稱為 SVGT-5。

重組的 SV40 病毒顆粒再去

感染猿猴腎細胞，使兔子

的 β-globin 得到高效表現。 SVGT-5

HindIII

BamHI

Late genes

Early genes

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腺病毒 ( adenovirus, Ad )

大小為 36 kb 的線型雙股 DNA 病毒

直徑約 80 nm 、 20面體立體對稱

可插入較大的外源 DNA片段，還 可以在寄主细胞中大量表現

能感染不分裂或具分裂能力的細胞

可以感染不同種類的細胞

感染對象為倉鼠、大鼠、人類等

serotype 有 Ad5 及 Ad2 ，安全性高，少致癌性

http://www.medgadget.com/archives/img

http://www.brackeler.com/products/fid/2862

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adenvirus genome

adenovirus transfect

host cell

‧‧‧GCTAATCG‧‧‧

5´ 3´

protein

5.5 kD

約 100bp 的 ITR( inverted terminal repeats)

← E1 →← E2 →← E3→ ← E4 →

ITR ITR

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adenovirus 病毒選殖載體實例 Recombinant Human Adenovirus Type 5 Injection

商品名：安柯瑞 在刪除了 E1B和 E3 區基因片段之後，能夠特異性地在腫瘤

細胞中複製、包裝及釋放，最終導致癌細胞裂解 在正常組織細胞中不能有效複製，因而無損傷作用 透過免疫系統，殺滅

癌細胞 用於治療鼻咽癌

http://big5.cancerotc.com.cn/news/20070522145625125.htm

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牛乳狀突病毒 ( bovine papilloma virus, BPV )

大小為 7.9kb 的雙股環狀 DNA 病毒

直徑約 55 nm 、 20面體立體對稱

造成牛的皮膚病，卻可在老鼠細胞內形成多個病毒，而不殺死老鼠細胞

帶有 exogenous gene 的 BVP DNA ，可獨立存在，不與老鼠細胞的染色體合併

可插入較大的外源 DNA片段，且載體基因不大，容易操作

感染對象為小鼠

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BVP 病毒基因體 ( BVP genome )

分為早基因 ( E 區 ) 及晚基因 ( L 區 ) 區域。早基因，即長度為 5.5kb 的 BamHI-Hind III片段，佔基因组總長的 69 %，故叫做 BPV-69T

BPV 病毒 DNA 上如果插有 pBR322 質體的序列，則能往返大腸菌及老鼠細胞間，作為能夠傳遞外來基因於這兩種生物細胞的載體，也稱往返載體 ( shuttle vector )

Late genes

Early genes

Late genes

Early genes

http://sky.scnu.edu.cn/life/class/genetics/gene%20engineering/chaper8/5.htm

BVP-pBR322

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BVP 病毒選殖載體實例

若 HindIII 與 BamHI 切割載體，插入人 β-globin gene

到 BVP-pBR322 重組結構上。形成既能在 E. coli 及 ma

mmalian cell 中複製的穿梭載體 BVP-BV1。

刺激轉化效率提高約 500倍 在每個細胞中的 copy number 可

保持在 10~30份之間 轉化到 E. coli 後，可迅速回收

載體 DNA

Human

βglobin gene

BVP-BV1

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反轉錄病毒 ( retrovirus )

線型正性單股 RNA( + ssRNA ) 病毒

內含兩條 8~11kb 的 + ssRNA構成

直徑約 25 nm 、 20面體立體對稱

可反轉錄為 (-)DNA ，再產生雙股 DNA

dsDNA會插入整合 ( integrated )到寄主細胞的染色體中鳥類的脾壞死病毒 ( SNV )

人類免疫缺失病毒 ( HIV )

莫洛尼氏小鼠白血病病毒 ( Moloney murine leukemia viru

s, Mo-MLV )

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retrovirus structure

( a ) 反轉錄酶、pol基因產物 ( b ) 2個RNA分子 ( c ) 脂質雙層膜 ( d ) 病毒外殼蛋白質 ( gag基因產物 )

( e ) 病毒外膜醣蛋白

( env基因產物 )

( a )

( b )

( c )

( d )

( e )

lhttp://sky.scnu.edu.cn/life/class/genetics/gene%20engineering/pictures/chap%208/8-19.jpg

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retrovirus transfection

http://www.supermt.com.tw/edu/about%20biotech/viruse.pdf

( + )( — )

( — )

( + )

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retrovirus 病毒基因體 ( retrovirus genome )

5´端有 Cap ； 3´端有 poly (A)

gene order ： 5´- gag – pol – env -3´ R region ： a short ( 18-250nt ) is terminally redundant

U5 ： a unique, non-coding region of 75-250nt

Primer Binding Site ： used to begin reverse transcription

Leader ： a relatively long ( 90-500nt ) non-translated region

Polypurine Tract ： responsible for initiating

U3 ： a unique non-coding region

5´ 3´

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retrovirus 病毒選殖載體實例

http://adm.ncyu.edu.tw/~apmicro/academic/2005%20microbial%205.pdf

A.輔助型反轉病毒 RNA

B.反轉病毒 RNA 表現載體

包裝細胞株

釋放包裏外源基因的病毒包裝載體

細胞受器

標的細胞

病毒 RNA 分子

反轉錄反應

病毒 DNA 分子

( + )

( + )

標的外源基因組表達產物

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Vectors used in gene therapy clinical trials

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常見病毒基因轉殖載體的優、缺點

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