LAZIĆ Aleksandar_Ponašanje pješaka prilikom prelaska obilježenog pješačkog prelaza.docx
LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da...
Transcript of LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da...
![Page 1: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/1.jpg)
LUCIFERAZE
“THE SWISS ARMY KNIFE OF MOLECULAR BIOLOGY”
![Page 2: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/2.jpg)
Da se upoznamo sa glavnim terminima
LUMINESCENCIJA je hladno zračenje svetlosti, ali ne kao posledica pretvaranja toplotne E u svetlosnu nego drugih izvora
energije. U zavisnosti od izvora E razlikujemo različite tipove
luminescencije.
BIOLUMINESCENCIJA je proces u kome živi organizam
emituje svetlost kao posledica enzimske reakcije koju
katalizuje enzim LUCIFERAZA.
LUCIFERIN + O2
PEROKSIDNI INTERMEDIJER
[OXILUCIFERIN]*
OXILUCIFERIN + SVETLOST
![Page 3: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/3.jpg)
Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska u stabilno nepobuđeno stanje.
Fluorescencija ili fosforescencija je suprotan proces u kome je potrebno da dođe do apsorpcije energije koja
će kao rezultat dati emisiju svetlosti.
![Page 4: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/4.jpg)
SUPSTRAT
Luciferini - klasa malih molekula koji pri oksidaciji oslobađaju svetlost
Vibrio, Photobacterium Dinoflagellata Koelenterazin – Ctenophora,
Radiollaria , Cnidaria
Latia Vargulin – Ostracodes, Poricthys Lampyridae
![Page 5: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/5.jpg)
Widder, 2017, Science
![Page 6: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/6.jpg)
KOJI ORGANIZMI IMAJU SPOSOBNOST BIOLUMINESCENCIJE
• Više od 2500 vrsta, a od toga 80% su morski organizmi
• Bakterije – Gammaproteobacteria rodovi Vibrio, Aliivibrio, Photobacterium
• Kopneni zglavkari i insekti: Myriapoda, Geophila, Hexapoda, Collembola, Diptera, Colepotera
• Dva od tri najčešće korišćena reporter sistema koji se zasnivaju na mehanizmu bioluminescencije u molekularnoj biologiji su izolovana iz kopnenih organizama (Photinus pyralis – svitac, Photorhabdus luminescens – crevni patogen, nematoda), a najnovija okarakterisana koja je ušla u primenu je luciferaza izolovana i Gaussia princeps, morska kopepoda
• 2008. godine – Nobelova nagrada za hemiju Osamu Shimomura za otkriće i razvoj GFP sa još dva američka naučnika
![Page 7: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/7.jpg)
Widder, 2017, Science
![Page 8: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/8.jpg)
NEPOŽELJAN PLEN – PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI
![Page 9: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/9.jpg)
BAKTERIJSKE LUCIFERAZE
Heterodimeri, α -subjedinica (35 kDa) i β-subjedinica (40 kDa)
![Page 10: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/10.jpg)
MEHANIZAM DEJSTVA VIBRIO FISCHERI
FMNH2 + O2 + RCHO → FMN + RCOOH + H2O + SVETLOST
![Page 11: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/11.jpg)
LUX SISTEM
Organizacija LUX operona različitih bakterijskih vrsta.
Jezgro operona čine luxCDABE geni, dok se prisustvo ostalih gena
razlikuje od vrste do vrste.
![Page 12: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/12.jpg)
LUX SISTEM
luxA i luxB – heterodimer luciferaze, luxC, luxD i luxE – multienzimski
kompleks reduktaza masnih kiselina, luxF – flavoprotein homolog
subjedinici luciferaze, luxG – flavin reduktaza, luxH – protein
najverovatnije uključen u sintezu FMN.
![Page 13: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/13.jpg)
QUORUM SENSING...
• Komunikacija i koordinisano “ponašanje” populacije zavisno od koncetracije signalnog molekula (primer na slici kod Vibrio fischeri)
![Page 14: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/14.jpg)
INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA
Najbogatija i najraznovrnija grupa organizama
Do sada je opisano 2500 vrsta koje imaju ovu osobinu
Od identifikacije luciferina svica 60 i 70-tih godina prošlog
veka do danas je okarakterisano još šest luciferina iz različitih
grupa organizama
• Razlike u emisiji nastaju kao posledica različitih supstrata i
rekcije koju katalizuje luciferaza
![Page 15: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/15.jpg)
INSEKTI I BIOLUMINESCENCIJA
A.Photinus pyralis, Mg2+ za hirdrolizu ATP
B. Renilla reniformis, Ca2+
![Page 16: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/16.jpg)
PHOTINUS PYRALIS – SVITAC
Najbolje proučena luciferaza, izolovana i okarakterisana 1976. god.
Gen je u jednoj kopiji, ima 7 egzona i 6 introna; protein 62 kDa
![Page 17: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/17.jpg)
MEHANIZAM KOD PHOTINUS PYRALIS
Luciferin+ ATP → Luciferin adenilat + PPi
Luciferin adenilat + O2 → Oksiluciferin + AMP + SVETLOST + H2O + CO2
![Page 18: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/18.jpg)
EVOLUCIJA LUCIFERAZA
• Na osnovu raznovrsnosti enzima, supstrata i mehaniama uključenih u bioluminescenciju pretpostavka je da je bioluminiscencija evoluirala nezavisno bar 40 puta u različitim organizmima.
• Većina napora da se objasni evolucija se svodi na dva osnovna koji su usemreni na selektivni pritisak na supstrat ili enzim.
• U prvom slučaju selektivni pritisak je mogao da bude zaštiti organizme od rastuće koncentracije toksičnog kiseonika. Dok je moguća i hipoteza da su nastale od oksigenaza sa mešovitom funkcijom koje su uključene u oksidaciju rastuće koncentarcije organiskih jedinjenja.
• Sve ovo može da se odnosi samo na bakterijske luciferaze.
• Trenutno stanovište je da je većina luciferaza nastala de novo.
• Nastale od predačkog kalmodulin vezujućeg proteina, acil-CoA sintetaze, aminoacil-tRNK sintetaze, itd.
![Page 19: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/19.jpg)
EVOLUCIJA LUCIFERAZA INSEKATA
-Polipeptidi 545-550 AK - ~60 kDa - na C-kraju SKL tripeptid (SerLysLeu) - 66-99% identičnosti - od slabo luminescentnih ligaza, formiranje aktivnog mesta luciferaze, koevolucija sa fotocitama do današnjih luciferaza
![Page 20: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/20.jpg)
• Različita zastupljenost i kod bakterija iste vrste.
• Sekvenca Lux operona konzervirana kod svih luminescentnih bakterijskih vrsta.
• Prvo je povezana sa reparacijom DNK, a zatim sa quorum sensing (QS) sistemom. Međutim, QS nije karakterističan samo za bioluminescenciju (BL) – Šta je nastalo prvo BL ili QS?
• Bakterijske luciferaze kod bakterija koje žive u simbiozi su koevoluirale sa domaćinom i/ili njegovim organom za proizvodnju svetlosti.
• Najnoviji okarakterisani luciferazni sistemi kod dinoflagelata govore o mogućem gubitku odnosno redukciji luminescentnog potencijala i konvergentnoj evoluciji.
EVOLUCIJA LUCIFERAZA BAKTERIJA
![Page 21: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/21.jpg)
PRIMENA I ZNAČAJ
Reporter geni u bakterijskim i eukariotskim ćelijskim linijama
identifikacija promotora
detekcija bakterija u uzorku
in vivo praćenje bakterijske i virusne infekcije
in vivo praćenje ekpresije gena u eksperimentalnim životinjama
in vivo praćenje tumora
GFP vs. Luciferazni reporter geni
- drastično kraći poluživot luciferze
- nema posttranslacionih modifikacija
- ne zavise od egzogenih supstrata ili ekscitatora - više puta ponovljeno merenje
- talasna dužina emitovane svetlost je duža, a E veća
- brži, manje zahtevni i jeftiniji
![Page 22: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/22.jpg)
• Autoindukujući reporter sistem – V. harveyi za praćenje interspecijske komunikacije kod bakterija
• Ekspresija bakterijskih gena
• Vizualizacija kontaminacije u uzorcima hrane i okolini
• Detekcija bakterija u ciljnim tumorima, a u sklopu antitumorskog tretmana
• Praćenje ekspresije eukariotskih gena primenom eukariotskih luc i ruc luciferaznih reporter gena
• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin
PRIMENA I ZNAČAJ
![Page 23: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/23.jpg)
• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin
PRIMENA I ZNAČAJ
Guo et al., 2013, Anti. Agents Chem.
![Page 24: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/24.jpg)
PRIMENA I ZNAČAJ
• in vivo praćenje interakcije mikroorganizam – domaćin
van Zyl et al., 2015, Gut Microbes
![Page 25: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/25.jpg)
• Kontrolisani koncentracijom arsena u podlozi
...I BIOSENZORI
![Page 26: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/26.jpg)
• "sequencing by synthesis "
• Ronaghi i Nyrén 1996.
PIROSEKVENCIRANJE
![Page 27: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/27.jpg)
• Sve zavise od O2
• Veoma je važno kako se ovi reporter geni ubace u organizam koji se analiziran, ali i jedna hromozomska kopija je bolja od plazmidno lociranih gena
• Nezamenljive u molekularnoj biologiji
• Kombinuju sposobnost da mere aktivnost promotora i u isto vreme određuju lokaciju bakterija i kvantifikaciju bakterija u kulturi, u kulturi eukariotskih ćelija, tkivima ex vivo i in vivo
ZAKLJUČAK
![Page 28: LUCIFERAZE - bio.bg.ac.rs · Bioluminescencija – hemijska reakcija mora da bude egzotermna da sintetiše energijom bogato jedinjenje koje će osloboditi foton prilikom prelaska](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022020114/5b149a507f8b9a347c8dee82/html5/thumbnails/28.jpg)