LỜI CẢM ƠN -...

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc

đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp

đỡ và hướng dẫn tận tình.

Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí

nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học,

Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học,

Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban

Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau

đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học

Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học

Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất

để chúng tôi hoàn thành luận án.

Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi

hoàn thành luận án.

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình

đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này.

Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014

Tác giả

Võ Châu Tuấn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả

trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai

công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn

trách nhiệm.

Tác giả

Võ Châu Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ..............................................................1

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ........................................................................3

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN.................................................3

4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ............................................................4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................5

1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ...................................................................5

1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật ...............................................5

1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật .....................................................6

1.1.2.1. Nuôi cấy callus..................................................................................6

1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào................................................................7

1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào ...............10

1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào ................12

1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn ............................................16

1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC

VẬT NUÔI CẤY IN VITRO...................................................................................19

1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật .........................................19

1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật ................................19

1.2.2.1. Nhóm terpene ..................................................................................20

1.2.2.2. Nhóm phenol ...................................................................................20

1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen............................................................20

1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực

vật..............................................................................................................................21

1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước........................................................21

1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước ........................................................25

1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN..............................................................28

1.3.2. Thành phần hóa học.............................................................................28

1.3.3. Công dụng .............................................................................................30

1.3.3.1. Công dụng cổ truyền.......................................................................30

1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học ....................................................................30

1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen ................35

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.........................................................................37

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................37

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................38

2.3.1. Nuôi cấy callus ......................................................................................39

2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào...................................................................39

2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác .............................39

2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men..................................40

2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào ........................................40

2.3.4. Định lượng tinh dầu .............................................................................41

2.3.5. Định lượng curcumin ...........................................................................41

2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước ................................42

2.3.7. Xác định sesquiterpene ........................................................................42

2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu ..................................43

2.3.9. Xử lý thống kê.......................................................................................43

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................................44

3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN ................................................................44

3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC..............47

3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy.........................................................47

3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ....................................................................49

3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST .................................................................51

3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA ..........................................................................51

3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D......................................................................52

3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA ...........................................................52

3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon.............................................................54

3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose...................................................................54

3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose...................................................................56

3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN.....................59

3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào .........................................................59

3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy......................................................61

3.3.2.1. Cỡ mẫu ............................................................................................61

3.3.2.2. Tốc độ khuấy ...................................................................................62

3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí .........................................................63

3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN.........................................................65

3.4.1. Hàm lượng tinh dầu .............................................................................65

3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số ...................67

3.4.3. Hàm lượng curcumin ...........................................................................68

3.4.4. Xác định sesquiterpene ........................................................................73

3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN ...77

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................80

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

.................................................................................................................................. 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83

PHỤ LỤC

BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT

BAP : 6-benzylaminopurine

BA : 6-benzyladenine

CIB : centrifugal impeller bioreator

cs : cộng sự

DMSO : dimethyl sulfoxide

ĐC : đối chứng

ĐHST : điều hòa sinh trưởng

HPLC : high performance liquid chromatography

(sắc ký hiệu năng cao áp)

IAA : indoleacetic acid

IBA : indolebutyric acid

Kin : kinetin

L : lít

L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine

LPS : lipopolysaccharide

MS : Murashige và Skoog (1962)

NAA : naphthaleneacetic acid

Nxb : nhà xuất bản

TNF-α : tumor necrosis factor-alpha

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

TT Tên bảng Trang

1 Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 44

2 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát

sinh hình thái của callus 46

3 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào

nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 48

4 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào


5 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi

cấy huyền phù trong bình tam giác 51

6 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi

cấy huyền phù trong bình tam giác 52

7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế

bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 53

8 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào


9 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào


10 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào


11 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào

nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 62

12 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế

bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 63

13 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế

bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 64

14 Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy

trong hệ lên men 10 L 66

15 Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi

cấy trong hệ lên men 10 L 67

16 Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy

trong hệ lên men 10 L 69

17

Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene

trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự

nhiên

74

18 Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78

DANH MỤC CÁC HÌNH

TT Tên hình Trang

1 Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37

2 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm 38

3 Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro

(A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước 45

4 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 47

5 Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy

trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose 55

6

Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình

tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và

1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút

58

7 Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml

đặt trên máy lắc 59

8 Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 60

9

Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5

mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu

100 g

60

10 Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào

nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 61

11

Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men

nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5

mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu

200 g

65

12 Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml) 71

13 Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi

ngoài tự nhiên 72

14 Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến

18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít 73

15

Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự

nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2

đến 18 ngày

76

16 Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77

1

MỞ ĐẦU

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trong nhiều thế kỷ qua, loài người đã dựa chủ yếu vào thực vật như là

nguồn cung cấp carbohydrate, protein và chất béo làm thực phẩm. Hơn nữa, thực

vật cũng là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất tự nhiên dùng làm dược

phẩm, hóa chất nông nghiệp, hương liệu, chất màu, thuốc trừ sâu sinh học hoặc

các chất phụ gia thực phẩm có giá trị [132]. Những sản phẩm này được biết như

là các chất trao đổi thứ cấp, được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây

(thường nhỏ hơn 1% khối lượng khô) và chức năng trao đổi chất chưa được biết

đầy đủ. Chúng được xem là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với

môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật [177].

Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển

từ cuối những năm 50 của thế kỷ XX và đến nay có khoảng hơn 80.000 hợp chất

thứ cấp khác nhau ở thực vật đã đuợc công bố [19], [23].

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có đến 80% dân số thế giới sử dụng

thảo dược làm thuốc để chữa bệnh và chăm sóc sức khỏe. Việc khai thác nguồn

dược liệu tự nhiên từ thực vật đang trở thành một vấn đề quan trọng mang tính

toàn cầu và chúng ngày càng được thương mại hóa nhiều hơn. Tuy nhiên, vấn đề

đặt ra hiện nay là nơi sống tự nhiên của các loài cây thuốc đang bị biến mất

nhanh chóng do sự biến đổi của khí hậu toàn cầu cũng như sự khai thác bừa bãi

của con người. Như vậy, sản xuất các hợp chất thứ cấp thực vật bằng con đường

canh tác truyền thống và tổng hợp hóa học sẽ có nhiều hạn chế, khó có thể đáp

ứng đủ nhu cầu dược liệu ngày càng tăng trong tương lai [188]. Điều này buộc

các nhà khoa học cần phải tính đến công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật như một

con đường tiềm năng để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp dược

phẩm [106].

2

Nuôi cấy tế bào thực vật đã được quan tâm nghiên cứu từ những năm

1950. Nhiều nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy tế bào thực vật là một phương thức

có hiệu quả trong sản xuất các hợp chất có hoạt chất sinh học hoặc các chất

chuyển hóa của chúng [132]. Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật là có thể

cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu dồi dào để tách chiết ở quy mô công nghiệp

các hoạt chất mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên [106]; có thể tạo ra các

hợp chất mới và chủ động nâng cao khả năng sản xuất chúng bằng cách thay đổi

các điều kiện nuôi cấy [128]; các hoạt chất thu được không bị nhiễm bẩn bởi

thuốc trừ sâu, diệt cỏ, kháng côn trùng cũng như tránh được sự không đồng nhất

về nguồn nguyên liệu và những biến động hàm lượng của các sản phẩm thực vật

ngoài tự nhiên. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu cũng cho thấy, hàm lượng các

chất có hoạt tính sinh học tích lũy trong tế bào thực vật nuôi cấy in vitro tương

đương hoặc cao hơn nhiều lần so với cơ quan tích lũy của chúng trong cây ngoài

tự nhiên [140], [167]. Đến nay, người ta đã thành công trong sản xuất rất

nhiều loại hợp chất có giá trị theo phương thức này trên qui mô lớn

như anthraquinone ở cây Rubia akane, vincristine ở cây dừa cạn (Catharanthus

roseus), berberin ở cây Coscinium fenustratum, diosgenin ở cây Dioscorea

doryophora, taxol ở các loài thuộc chi Taxus, ginsenoside ở các loài thuộc chi

Panax… [163].

Nghệ đen còn gọi là nga truật thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) có nguồn

gốc từ Đông Bắc Ấn Độ, được trồng ở khắp khu vực Nam Á, Đông Nam Á,

Trung Quốc, Đài Loan, và Madagasca [9], [115]. Củ của cây nghệ đen có chứa

các hoạt chất sinh học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Ngoài ra nó

còn có tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng như tannin và flavonoid [82].

Các nghiên cứu cho thấy, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u;

một số dạng ung thư ở chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và

ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; curcumin cũng có tác dụng chống đông

máu và hạ huyết áp; curcuminoid và sesquiterpene là những chất có khả năng ức

3

chế sự hình thành TNF-α của đại thực bào đã được hoạt hóa, do đó có tác dụng

chống viêm nhiễm [152]; curcumin còn là một chất chống oxy hóa có khả năng

bảo vệ tế bào. Nhiều công trình nghiên cứu cũng cho thấy, tinh dầu nghệ đen có

tác dụng kháng khuẩn và kháng đột biến rất cao [176]. Bên cạnh đó,

polysaccharide của nghệ đen ức chế hiệu quả sinh trưởng của các bướu thịt

(sarcoma 180) được cấy dưới da của chuột, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, có

hoạt tính kích thích đại thực bào [75], [105], [169]. Trong tự nhiên, nghệ đen là

loài nhân giống bằng thân rễ, phải mất một thời gian dài để tạo củ nên hệ số

nhân kém; năng suất thu hoạch thường thấp, đặc biệt là phụ thuộc rất lớn vào

điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ, chi phí nhân công và vật tư sản xuất. Mặt

khác, nghệ đen trong tự nhiên còn dễ mắc các bệnh như thối củ và đốm lá [29].

Vì vậy, rất khó có đủ nguồn nguyên liệu dồi dào và ổn định để sản xuất lượng

lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học quý của cây nghệ đen sử dụng trong bào

chế dược phẩm.

Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

nuôi cấy tế bào cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) và khảo sát khả

năng tích lũy một số hợp chất có hoạt tính sinh học của chúng”

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp để

sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được khả năng tích lũy và

hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen nuôi cấy huyền phù

trong hệ lên men 10 L.

3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

3.1. Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có

tính hệ thống về nuôi cấy in vitro tế bào cây nghệ đen và sự tích lũy một số hợp

chất có hoạt tính sinh học của chúng; đồng thời là nguồn tài liệu tham khảo hữu

4

ích trong nghiên cứu, giảng dạy về nuôi cấy tế bào và sản xuất các hoạt chất sinh

học có giá trị cao từ nuôi cấy tế bào thực vật.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của luận án là cơ sở khoa học để phát triển hệ thống nuôi cấy

huyền phù tế bào cây nghệ đen ở qui mô lớn nhằm sản xuất nhanh sinh khối,

cung cấp nguồn nguyên liệu liên tục và ổn định để thu hồi các hợp chất có giá trị

cao dùng làm thuốc, góp phần bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Đã tạo ra dòng tế bào callus (rắn và rời rạc) từ bẹ lá của cây nghệ đen in

vitro thích hợp để nuôi cấy huyền phù, đồng thời xác định một cách có hệ thống

các điều kiện và môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng nhanh và ổn

định của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml và trong hệ lên

men 10 L.

- Đã khảo sát sự tích lũy các chất có hoạt tính sinh học như: tinh dầu,

curcumin, sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy.

Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng và thời điểm tích lũy cao nhất của các

hợp chất này theo đường cong sinh trưởng và đồng thời cho thấy có sự chuyển

hóa sinh học các chất như curcumin và sesquiterpene xảy ra trong nuôi cấy

huyền phù tế bào cây nghệ đen.

- Đã khảo sát được khả năng kháng khuẩn của tinh dầu chiết rút từ tế bào

cây nghệ đen nuôi cấy in vitro và nhận thấy, tinh dầu của tế bào có khả năng ức

chế sinh trưởng một số loài vi sinh vật gây bệnh ở mức tương đương hoặc cao

hơn so với tinh dầu chiết rút từ củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên.

5

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là nuôi cấy vô trùng các tế bào, mô, cơ

quan và các bộ phận của chúng dưới các điều kiện về vật lý và hóa học in vitro

[93]. Thử nghiệm đầu tiên về nuôi cấy tế bào bên ngoài một cơ thể thực vật hoàn

chỉnh được công bố vào năm 1902 bởi Haberlandt - nhà Sinh lý thực vật người

Đức, người được biết đến như nhà sáng lập ra phương pháp nuôi cấy tế bào thực

vật. Trong bài viết nổi tiếng với tiêu đề “Những thử nghiệm nuôi cấy các tế bào

thực vật tách rời”, ông đã mô tả những nổ lực trong thiết lập có hệ thống nuôi

cấy các tế bào thịt lá, biểu bì và lông hút. Mặc dù không thành công trong nuôi

cấy phân chia tế bào, nhưng ông dự đoán sẽ có khả năng đạt được sự phân chia

tế bào trong nuôi cấy các tế bào riêng rẽ, điều này đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự

nghiệp của nhiều nhà nhà khoa học sau này. Tiếp sau đó là những nghiên cứu

rộng rãi theo hướng cải thiện các dung dịch dinh dưỡng và khám phá về các chất

ĐHST thực vật nhằm kiểm tra lại những dự đoán của Haberlandt [164]. Trong

những năm 1960, nhiều nổ lực hơn nữa để cải thiện dung dịch dinh dưỡng đã

đưa đến 2 công bố đáng chú ý của Skoog và cs, với hai môi trường nuôi cấy đã

được dùng và mô tả đó là môi trường Murashige và Skoog [107] và môi trường

Linsmaier và Skoog [85].

Nuôi cấy các tế bào đơn và các khối nhỏ tế bào thành công đầu tiên trong

nuôi cấy tế bào cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) và cây Tagetes erecta trên máy

lắc. Nuôi cấy tế bào thực vật trên qui mô lớn đầu tiên thành công ở tế bào của

các cây bạch quả, bắt ruồi, cỏ Lolium và hoa hồng trong hệ lên men kiểu ráy

nước dạng đơn giản với dung tích 20 L [164].

Những thử nghiệm đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn để sản xuất dược

6

phẩm đã được tiến hành trong những năm 1950 tại công ty Charles Pfizer [164].

Đến năm 1987, đã có 30 hệ thống nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật có khả

năng sản xuất các hợp chất thứ cấp cao hơn trong các thực vật tương ứng [177].

Đến nay, một thế kỷ sau những nghiên cứu của Haberlandt, nhiều hợp chất thứ

cấp đã được sản xuất thương mại bằng con đường nuôi cấy tế bào thực vật như

berberine, paclitaxel, ginseng saponin, polysaccharide [177].

1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật

Mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, chứa đầy đủ thông tin di truyền

của một cơ thể. Trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào có thể hình thành

lại được một cơ thể hoàn chỉnh. Hoàn toàn có thể tách riêng và nuôi cấy tế bào

độc lập để nghiên cứu mọi quá trình sống xảy ra trong đó [12].

1.1.2.1. Nuôi cấy callus

Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào

không phân hóa, được gọi là callus. Nuôi cấy callus đạt được bằng cách nuôi cấy

các mẫu mô tách từ thực vật trên môi trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn

là agar. Môi trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa

lượng, vi lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất ĐHST thực vật. Đánh giá chính

xác các ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất ĐHST lên

khả năng sinh trưởng của callus là yêu cầu quan trọng để xác định môi trường tối

ưu cho nuôi cấy. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá sinh trưởng

trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh

trưởng [93].

Trong nuôi cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dòng

soma trong quá trình cấy chuyển. Vì vậy, các dòng tế bào ổn định di truyền nên

được lựa chọn để tránh sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp trong

nuôi cấy. Thông thường, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là

dòng tế bào đồng nhất khi các thông số sinh trưởng của dòng tế bào được lặp lại

7

trong quá trình cấy chuyển trên cùng một loại môi trường nuôi cấy [35]. Bouque

và cs (1998) đã nghiên cứu nuôi cấy 217 dòng callus khác nhau từ các loài của

chi Psoralea nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số

dòng callus sinh trưởng ổn định [22]. Fett-Neto và cs (1994) nuôi cấy tế bào cây

Taxus cuspidate và thu được dòng tế bào ổn định sinh trưởng sau 2 năm cấy

chuyển [42].

1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy huyền phù tế bào thường được khởi đầu bằng cách chuyển các

khối callus vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay

hoặc màng lọc xoay. Mô callus nuôi cấy nên là loại mô dễ vỡ vụn để có thể thiết

lập được dịch huyền phù tế bào với mức độ phân tán cao nhất. Nuôi cấy huyền

phù tế bào trong môi trường lỏng cung cấp một hệ thống duy nhất cho những

nghiên cứu chi tiết về sinh trưởng và sản xuất các chất chuyển hóa. So với nuôi

cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng lớn sinh khối tế bào mà từ đó

các chất chuyển hóa thứ cấp có thể dễ dàng chiết tách [35].

Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, đến

callus và cuối cùng đến dịch huyền phù [7]. Trong quá trình nuôi cấy, các tế

bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xoáy của môi

trường. Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các

tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Tuy

nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ

lệ nhỏ các cụm tế bào. Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường có

thể cải thiện bằng cách thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy [104]. Mặc

dù sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ bởi sự thay đổi điều kiện môi

trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag của quá trình nuôi cấy, các

tế bào trở nên kết dính với nhau như là một qui luật. Để thu được dịch huyền

phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme phá

hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù

8

đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng

kết khối ban đầu (Fowler và cs 1982) [104].

Cho đến nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được nuôi cấy có sự

hiện diện của cả những tế bào đơn và các khối tế bào. Nhìn chung, môi trường

thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào.

Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi

cao hơn. Thông thường, động học sinh trưởng của các tế bào nuôi cấy huyền phù

là đường hàm mũ; các hợp chất thứ cấp chủ yếu tạo ra trong pha ổn định, liên

quan với trao đổi chất sơ cấp và phân chia tế bào [35].

Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong môi trường lỏng

có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Trong quá trình nuôi

cấy, bình nuôi cấy không chỉ thường xuyên có sự tăng lên của các sản phẩm trao

đổi chất mà còn luôn luôn diễn ra sự trao đổi không khí với bên ngoài. Khi các

chất dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một

số sản phẩm trao đổi chất có hại, thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị

ức chế. Khi đó, thông qua cấy chuyển hoặc thay đổi môi trường nuôi cấy sẽ kích

thích sự sinh trưởng mạnh mẽ trở lại của huyền phù tế bào [12]. Nhìn chung, có

ba phương thức nuôi cấy huyền phù tế bào là nuôi cấy mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ

sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục.

- Nuôi cấy mẻ

Nuôi cấy mẻ là phương thức mà trong suốt thời gian nuôi cấy không thêm

vào chất dinh dưỡng cũng như không loại bỏ sản phẩm cuối cùng của quá trình

trao đổi chất. Do vậy, các điều kiện môi trường luôn thay đổi theo thời gian, mật

độ tế bào tăng lên còn nồng độ cơ chất giảm xuống. Nuôi cấy mẻ được xem là

một hệ thống đóng, quần thể tế bào sinh trưởng và phát triển theo một số pha

nhất định với những điều kiện đặc trưng [7]. Mặc dù tế bào thực vật và tế bào vi

sinh vật có một số điểm khác nhau như kích thước của tế bào thực vật lớn hơn,

chu kỳ sinh trưởng của tế bào thực vật dài hơn, sự trao đổi chất chậm hơn…

9

nhưng nhìn chung sinh trưởng của tế bào thực vật trong nuôi cấy mẻ cũng trải

qua các giai đoạn như tế bào vi sinh vật, gồm có bốn pha. Pha lag (pha tiềm

phát): bắt đầu từ khi callus được đưa vào môi trường cho đến khi có dấu hiệu

phân chia tế bào đầu tiên; trong pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng và

số lượng tế bào. Pha log (pha lũy thừa): ở pha này, sự phân chia và tăng khối

lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng theo hàm mũ); Pha

ổn định: ở pha này, khả năng phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế

bào ổn định. Pha suy vong: sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm

xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển [12].

- Nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng

Đây là một hình thức khác của phương thức nuôi cấy mẻ. Sau khi tế bào

nuôi cấy sinh trưởng cực đại, các chất dinh dưỡng sẽ dần cạn kiệt, lúc này người

ta sẽ cung cấp thêm các chất dinh dưỡng mới vào hệ lên men mà không loại bỏ

dịch nuôi cũ. Trong hệ lên men này, có các bộ phận điều khiển hàm lượng các

chất dinh dưỡng được thêm vào giúp hạn chế hay tăng cường tốc độ sinh trưởng

hoặc sự tích lũy hợp chất thứ cấp. Tuy nhiên, như vậy thể tích hệ lên men sẽ tăng

lên, để hạn chế việc này người ta thường sử dụng dung dịch chất dinh dưỡng

dưới dạng đậm đặc. Phương thức này vẫn được gọi là nuôi cấy mẻ, vì toàn bộ

thể tích của hệ lên men cuối cùng được thu hồi theo từng mẻ [129].

- Nuôi cấy liên tục

Những hạn chế chính của nuôi cấy mẻ đó là tốn thời gian nhiều cho quá

trình khử trùng, bổ sung vào và lấy môi trường ra, làm sạch hệ thống lên men

[48]. Nuôi cấy liên tục là phương pháp kinh tế vì có thể kéo dài thời gian nuôi

cấy hay kéo dài pha log trong một thời gian nhất định. Trong phương thức nuôi

cấy này, dòng đi vào (môi trường mới) bằng với dòng đi ra (gồm môi trường, tế

bào và các chất chuyển hóa) để giữ cho thể tích bình nuôi không thay đổi, và

điều kiện nuôi cấy của hệ thống luôn ổn định [138].

10

Nhìn chung, các phương thức nuôi cấy có tính truyền thống như nuôi cấy

mẻ, nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng và nuôi cấy liên tục trong nuôi cấy

vi sinh vật có thể được dùng trong nuôi cấy tế bào thực vật. Về cơ bản, thiết lập

một phương thức nuôi cấy tế bào phụ thuộc bởi (1) mối quan hệ giữa sinh trưởng

và tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và (2) khả năng các sản phẩm thứ cấp tiết

ra hoặc không tiết ra môi trường [23].

1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào

Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự

sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như

cải thiện điều kiện nuôi cấy [12]. Một số chỉ tiêu dùng để đánh giá động học sinh

trưởng tế bào thực vật trong nuôi cấy, bao gồm thể tích lắng, thể tích đóng gói,

khối lượng tươi và khối lượng khô, mật độ, chỉ số sinh trưởng, thời gian nhân

đôi và một số chỉ tiêu khác của tế bào [135].

- Thể tích lắng và thể tích đóng gói của tế bào

Thể tích lắng của tế bào được xác định bằng cách cho các huyền phù tế

bào trầm tích trong một cái ống có chia vạch và được biểu thị bằng phần trăm thể

tích chung của dịch huyền phù, bao gồm cả sinh khối tế bào. Thể tích đóng gói

của tế bào được xác định bằng cách tương tự sau khi tế bào được nén chặt bởi

quay ly tâm. Hai thông số này cho phép đánh giá nhanh sinh trưởng của tế bào

trong khi vẫn duy trì được điều kiện vô trùng mẫu. Các phương pháp này thuận

lợi để giám sát sự sinh trưởng của tế bào suốt một chu kỳ nuôi cấy trong các bình

tam giác với điều kiện nuôi cấy như nhau, bởi vì dịch huyền phù có thể đưa trở

lại các điều kiện nuôi cấy trước đó. Tuy nhiên, dựa vào thể tích tế bào có lẽ

không phải là cách chính xác để kiểm tra sinh trưởng vì nó phụ thuộc vào hình

thái tế bào [93].

- Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào

Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào cho phép đánh giá sinh

11

trưởng của tế bào chính xác hơn các chỉ tiêu về thể tích tế bào. Tuy nhiên, yêu

cầu của các thao tác mẫu lại tiến hành trong điều kiện không vô trùng. Việc xác

định khối lượng tươi của tế bào ít tốn thời gian hơn khối lượng khô, nhưng nó

không phản ánh được sự gia tăng sinh khối thực của tế bào, đặc biệt là cuối giai

đoạn nuôi cấy, khi mà hầu hết sự tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy là do sự

hấp thu nước [161].

- Mật độ tế bào nuôi cấy

Để thu được giá trị tin cậy về số lượng tế bào trong nuôi cấy huyền phù,

trước hết các khối tế bào phải được phá vỡ bằng cách ủ dịch huyền phù với dung

dịch chromium trioxide 8% hoặc với các enzyme thủy phân như cellulase và

pectinase. Phương pháp sử dụng chromium trioxide thì nhanh hơn và ít phức tạp

hơn dùng các enzyme thuỷ phân, tuy nhiên nó gây trở ngại trong ước tính các tế

bào sống của cùng một mẫu. Phương pháp dùng enzyme duy trì được các tế bào

sống và đánh giá về số lượng các tế bào sống trong cùng một mẫu bởi nhuộm

màu tế bào có thể thực hiện được [122].

- Chỉ số sinh trưởng

Khối lượng tươi và khô của tế bào chỉ cho phép đánh giá sinh khối thuần

túy của mô tại thời điểm lấy mẫu, chỉ số sinh trưởng tương quan với dữ liệu sinh

khối tại thời điểm lấy mẫu và nuôi cấy ban đầu. Nó được tính toán bằng tỉ lệ sinh

khối được tích lũy với sinh khối ban đầu nuôi cấy [93].

- Thời gian tế bào nhân đôi

Thời gian nhân đôi là thời gian để lượng sinh khối của một quần thể tế

bào đạt gấp hai lần so với ban đầu. Một trong những điểm khác biệt lớn nhất

giữa sinh trưởng của tế bào thực vật và tế bào vi sinh vật có liên quan tới tốc độ

sinh trưởng riêng của chúng. Mặc dù kiểu sinh trưởng có thể giống nhau, tế bào

thực vật có thời gian nhân đôi hoặc tốc độ phân chia đo theo ngày, trong khi đó ở

trong nhiều loài vi sinh vật thì xác định theo phút đến giờ. Thời gian nhân đôi

12

nhanh nhất trong nuôi cấy tế bào thực vật được ghi nhận trong nuôi cấy tế bào

cây thuốc lá là 15 giờ [24].

1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào

- Môi trường nuôi cấy

Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của tế bào. Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các

chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và

tăng dần. Ba hợp phần của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế

bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho. Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ

các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các nguyên tố vi lượng và

các chất ĐHST. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc

dù nồng độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp [17].

+ Các chất ĐHST

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các chất ĐHST có ảnh hưởng lớn đến tốc độ

sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các chất của mô thực vật trong nuôi cấy

in vitro cũng như trong cây hoàn chỉnh. Zhao và cs (2001) đã nghiên cứu ảnh

hưởng của 2,4-D và NAA phối hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên sinh

trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết (Saussurea medusa).

Kết quả cho thấy, các môi trường có sự phối hợp giữa BAP với 2,4-D thì không

thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng lên, khả năng

sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt. Sử dụng các môi trường bổ sung phối hợp

giữa BAP với NAA, lượng jaceosidin tích lũy trong tế bào tăng tỷ lệ thuận với

sự gia tăng nồng độ của NAA [189]. Mô của cây cà trái vàng (Solanum

xanthocarpum) khi nuôi cấy trên môi trường chứa 2,4-D thì có khả năng sản xuất

được solasodine, nhưng khi nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA hoặc IBA thì

không sản xuất được chất này [111]. Năm 1993, khi nghiên cứu sản xuất

berberine từ nuôi cấy huyền phù tế bào cây Thalictrum minus, Hara và cs nhận

13

thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung 2,4-D và NAA không có tác dụng kích

thích sản xuất berberine, trong khi đó khả năng sản xuất berberine của tế bào

tăng khi sử dụng BAP [56].

+ Nguồn carbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo

phương thức dị dưỡng. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn

carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào

thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate. Carbon vừa tham gia

tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh

trưởng và tồn tại của tế bào. Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp

carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi

chất [191]

Trong phần lớn các môi trường nuôi cấy, nguồn carbon được bổ sung chủ

yếu là đường sucrose và glucose với nồng độ 20 - 40 g/L. Gautheret (1959) cho

rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là

nguồn carbon tốt nhất, trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose,

galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000) [14]. Ảnh hưởng của nồng độ

sucrose trong môi trường nuôi cấy đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào tam

thất (Panax notoginseng). Khối lượng khô của tế bào tăng tỷ lệ thuận với sự gia

tăng nồng độ sucrose từ 20 đến 40 g/L, nhưng khi nồng độ sucrose lên đến 60

g/L thì dường như ức chế sự sinh trưởng của tế bào [140]. Theo Gunter và cs

(2003), nuôi cấy tế bào cây Silene vulgaris ở các môi trường có nồng độ đường

sucrose thấp (dưới 30 g/L), khả năng sinh trưởng và tổng hợp polysaccharide của

tế bào không cao. Khi tăng nồng độ sucrose lên dến 30 g/L khả năng tích lũy

sinh khối tế bào cũng gia tăng. Môi trường có chứa 30 g/L sucrose hoặc phối hợp

giữa đường sucrose (15 g/L) và glucose (15 g/L) là thích hợp nhất cho sinh

trưởng của tế bào [50].

14

- Điều kiện nuôi cấy

+ Cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu

Cỡ mẫu đưa đưa vào nuôi cấy ban đầu rất quan trọng khi cấy chuyển tế bào

thực vật, và cũng có thể ảnh hưởng đến sự sản xuất hợp chất trao đổi thứ cấp. Khi

lượng mẫu ban đầu thấp hơn lượng mẫu tới hạn thấp nhất thì tế bào thường không

sinh trưởng được [78]. Matsubara và cs (1989) trong nghiên cứu nuôi cấy tế bào

cây Coptis japonica đã nhận thấy, khi lượng mẫu đưa vào nuôi cấy cao thì sinh

khối tế bào và berberine thu được cũng cao. Lượng mẫu đưa vào nuôi cấy thích

hợp nhất cho sinh trưởng và tích lũy berberine của tế bào là 8 g/L, đạt 55 g/L sinh

khối và 3,5 g/L berberine sau nuôi cấy [97]. Lượng mẫu nuôi cấy ảnh hưởng lớn

đến sinh trưởng tế bào được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào cây Gymnema

sylvestre. Với lượng mẫu tế bào đưa vào nuôi cấy là 60 g/L thì khả năng sinh

trưởng của tế bào là cao nhất, nếu lượng mẫu đưa vào nuôi cấy là 80 hoặc 100 g/L

thì sinh trưởng tế bào bị giảm rõ rệt [78]. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy ở mật độ

cao tế bào của cây tía tô (Perilla frutescens ) để sản xuất anthocyanin cho thấy,

lượng mẫu đưa vào nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể lên động học của quá trình sinh

trưởng và tích lũy anthocyanin của tế bào. Sinh trưởng và tích lũy anthocyanin của

tế bào tốt nhất khi nuôi cấy với lượng mẫu nuôi cấy là 50 g/L, sinh khối tế bào đạt

38,3 g/L sau 11 ngày nuôi cấy, và anthocyanin đạt 5,8 g/L sau 10 ngày nuôi cấy;

cao gấp 3,3 lần (lượng sinh khối) và 24 lần (lượng anthocyanin) so với nuôi cấy

mà lượng mẫu chỉ sử dụng là 15 g/L [191].

+ Khuấy trộn

Khuấy trộn là điều cần thiết để phân bố đồng đều tế bào, mô, chất dinh

dưỡng trong pha lỏng [77]. Việc khuấy trộn thường được thực hiện bằng cách

sục khí hoặc dùng cánh khuấy cơ học hoặc kết hợp cả 2 phương pháp trên.

Thủy động lực cho việc hòa trộn cần phải nhỏ để không làm hư hại mô hay tế

bào nhưng phải đủ để kích thích chức năng của tế bào [116]. Hầu hết các chất

dinh dưỡng đều có khả năng hòa tan cao trong nước, do đó trong thời gian lên

15

men nếu chỉ để phân bố đều môi trường thì sự khuấy trộn không thật cần

thiết. Tuy nhiên, đối với oxy hòa tan thì phải có sự khuấy trộn tốt vì khả năng

hòa tan của nó trong môi trường lên men là rất kém, trong khi yêu cầu oxy

cho sự sinh trưởng của các vi sinh vật hiếu khí (hoặc tế bào thực vật và động

vật) lại rất cao [7].

Nghiên cứu của Wang và cs (2010) cho thấy, nuôi cấy tế bào cây

Glycyrrhiza inflata trong hệ lên men, với tốc độ khuấy đạt 150 vòng/phút thì

sinh khối tế bào đạt cao nhất, trong khi đó với tốc độ khuấy ở 100 và 300

vòng/phút thì sự tích lũy sinh khối tế bào kém hơn [171]. Nghiên cứu ảnh hưởng

của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào cây dầu cọ, Choi và cs (2008) đã

khảo sát ở các tốc độ khuấy từ 80 - 335 vòng/phút. Kết quả cho thấy, ở tốc độ

khuấy 120 và 225 vòng/phút, sinh khối tế bào tăng 200%; ở tốc độ khuấy 335

vòng/phút sinh khối tế bào chỉ tăng khoảng 7% so với sinh khối tế bào đưa vào

nuôi cấy ban đầu [33].

+ Sục khí

Sục khí trong nuôi cấy tế bào thực vật nhằm đáp ứng ba chức năng chính

đó là duy trì điều kiện hiếu khí, giảm hấp thụ các sản phẩm bay hơi và loại bỏ

nhiệt sinh ra từ quá trình trao đổi chất. Tốc độ tiêu thụ oxy đặc trưng của tế bào

thực vật phụ thuộc vào dòng tế bào, điều kiện nuôi cấy và giai đoạn sinh trưởng,

nhưng nhìn chung là khoảng 6 x 10−4g O2/g khối lượng khô/phút [72]. Tốc độ

hấp thụ oxy phải đủ lớn để cung cấp đầy đủ lượng oxy cần thiết cho nhu cầu hô

hấp của tế bào và vì thế nó hỗ trợ cho sinh trưởng tế bào và sản xuất các hợp

chất mong muốn, tuy nhiên không nên quá cao bởi vì cả việc cung cấp dư thừa

hoặc thiếu oxy đều có thể ức chế sự sinh trưởng và trao đổi chất thứ cấp của tế

bào. Để tránh những mặt hạn chế của oxy, hàm lượng oxy hòa tan trong môi

trường nuôi cấy phải được giữ trên mức hàm lượng oxy hòa tan tới hạn (thông

thường khoảng 15-20% bão hòa không khí) [72].

16

Lee và cs (2006) nghiên cứu khảo sát sự ảnh hưởng của một số điều kiện

nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào cây Gymnema sylvestre trong hệ

lên men 2 L. Kết quả cho thấy, trong các tốc độ sục khí khảo sát từ 0,1 đến 0,4

L/L/phút thì tốc độ sục khí 0,1 L/L/phút là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế

bào [78]. Thông thường, tốc độ dòng khí thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế

bào thực vật nằm trong khoảng 0,1-0,5 L/L/phút [40]. Tuy nhiên, việc tăng dần

tốc độ dòng khí phù hợp với tình trạng sinh lý tế bào trong suốt quá trình nuôi

cấy có thể có lợi cho sinh trưởng của tế bào. Bằng cách áp dụng kiểu sục khí như

vậy (2 ngày đầu nuôi cấy, sục khí tốc độ dòng 0,5 L/phút và sau đó là 1,0

L/phút) trong nuôi cấy tế bào cây hoa hướng dương (Helianthus annuus) Haas

và cs (2008) đã nhận thấy, sinh khối tế bào tích lũy cao và đạt đến 15 g/L khối

lượng khô [53].

Ảnh hưởng của nồng độ oxy (20,8 - 50%) môi trường nuôi cấy trong hệ

lên men lên khả năng sinh trưởng của tế bào Panax ginseng đã được nghiên cứu.

Nồng độ oxy 40% thì thích hợp cho tích lũy sinh khối và sản xuất ginsenoside,

đạt 12,8 g/L sinh khối khô và 4,5 mg/g ginsenoside. Các nồng độ oxy: 20,8; 30

và 50% thì không thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như tích ginsenoside của tế

bào nuôi cấy [159]. Véronique và cs (1992) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ

oxy lên sinh trưởng của tế bào cây cà rốt (Daucus carota) trong hệ lên men nhận

thấy, nồng độ oxy giảm thì tốc độ sinh trưởng tế bào cũng giảm theo. Kết quả

cũng cho thấy, phản ứng của các loại tế bào khác nhau đối với nồng độ oxy cũng

khác nhau. Đối với nuôi cấy tạo phôi soma, nồng độ oxy 75% đã ức chế khả

năng sinh trưởng của tế bào [166].

1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn

Nhìn chung, nuôi cấy tế bào thực vật lên qui mô lớn là thực hiện quá trình

sinh học ở qui mô phòng thí nghiệm lặp lại gần như có thể để sản xuất một

lượng lớn hơn các sản phẩm mong muốn. Trình tự của một quá trình nâng cấp

điển hình bắt đầu từ nuôi cấy tế bào trong các chai, lọ đến bình tam giác nuôi cấy

17

lắc có dung tích 1 L, sau đó đến hệ lên men bằng thuỷ tinh từ 1-10 L, và sau đó

nâng cấp đến hệ lên men bằng thép không rỉ từ 30-150 L rồi đến 1000 L [181].

Hệ lên men là một hệ thống nuôi cấy tự động mà chức năng chính của nó là cải

thiện khả năng kiểm soát môi trường nuôi để đạt được các điều kiện tối ưu cho

sinh trưởng của tế bào và/hoặc hình thành sản phẩm. Tế bào thực vật được nuôi

cấy trong hệ lên men đầu tiên vào những năm 1960, sử dụng những thiết bị được

làm phù hợp cho nuôi cấy tế bào thực vật từ những thiết bị lên men thương mại

hoặc không thương mại dùng trong nuôi cấy tế bào động vật [123], [144].

Các nghiên cứu trong hệ lên men là khâu cuối cùng của nuôi cấy huyền

phù tế bào thực vật để thương mại hóa các chất trao đổi thứ cấp. Đây là bước

quan trọng vì có nhiều vấn đề có thể phát sinh khi nâng cấp từ nuôi cấy lắc trong

các bình tam giác đến nuôi cấy ở các hệ lên men [181]. Hệ lên men hoạt động

như một nhà máy sinh học sản xuất các sản phẩm có lượng cao với nhiều ưu

điểm như sau: Các sản phẩm được kiểm soát không phụ thuộc vào nguồn thực

vật sẵn có; Tăng các dung tích làm việc; Nuôi cấy đồng nhất do có cơ chế khuấy

trộn bằng cơ học hoặc sục khí; Kiểm soát tốt hơn môi trường nuôi cấy và điều

kiện vật lý vì vậy có thể dễ dàng tối ưu hóa các thông số sinh trưởng như: dinh

dưỡng, pH, nhiệt độ… trong sản xuất các chất chuyển hóa; Có thể kiểm soát các

sản phẩm cuối cùng dưới các điều kiện sinh trưởng; Cải thiện khả năng hấp thụ

các chất dinh dưỡng để kích thích tốc độ nhân nhanh và sản xuất hàm lượng cao

hơn các hoạt chất sinh học; Thu hồi các tế bào đơn giản và nhanh hơn; Thuận lợi

trong các khảo nghiệm về sinh tổng hợp hoặc/và chuyển hóa sinh học có liên

quan với sản xuất các chất trao đổi bởi các enzyme sẵn có; Dễ dàng hơn trong

phân tách các hợp chất mong muốn bởi tính phức tạp thấp của các dịch chiết;

Kiểm soát tốt hơn trong nâng cấp sản xuất trên qui mô lớn [44], [52].

Các hệ lên men được dùng chủ yếu cho nuôi cấy trên qui mô lớn tế bào

thực vật để sản xuất sinh khối tế bào hoặc các chất chuyển hóa [181]. Hiệu suất

của bất kỳ hệ lên men nào đều tùy thuộc một số khả năng sau: Duy trì nồng độ

18

sinh khối phải cao; Duy trì điều kiện vô trùng; Phân bố đồng đều dinh dưỡng và

các nguyên liệu sống trong nồi lên men thông qua sự khuấy trộn hiệu quả; Tăng

hoặc giảm nhiệt tùy vào yêu cầu nuôi cấy; Tạo ra lực trượt vừa phải. Mức độ

trượt cao có thể nguy hại cho tế bào nuôi cấy, nhưng lực trượt thấp cũng có thể

không mong muốn bởi vì hình thành bọt hoặc bám dính của các khối tế bào lên

cánh khuấy và thành của nồi lên men [86].

Có nhiều kiểu của hệ lên men đã được dùng trong nuôi cấy tế bào thực

vật. Các hệ lên men có tính truyền thống như các hệ lên men khuấy trộn bằng

cánh khuấy, airlift reactors và sủi bọt khí dạng cột sử dụng trong nuôi cấy in

vitro tế bào thực vật đã được phiên bản từ các hệ lên men dùng trong công nghệ

sinh học vi sinh vật [48]. Những nổ lực thiết kế hệ lên men dành riêng cho nuôi

cấy tế bào thực vật được thực hiện vào cuối những năm 1970. Với sự nhận thức

sâu về tính mẫn cảm của các tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro với lực trượt,

vì vậy trong hơn một thập niên, chỉ có dạng hệ lên men airlift được xem là thích

hợp cho nuôi cấy tế bào thực vật [165]. Tuy nhiên, đã có nhiều nghiên cứu tiến

hành nuôi cấy tế bào thực vật trong hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy.

Ritterhaus và cs (1990) đã sử dụng các hệ lên men khuấy trộn bằng cánh khuấy

với dung tích 75, 750, 7.500, 15.000 và 75.000 L để nuôi cấy tế bào cây

Echinacea purpurea, Rauwolfia serpentina và một số thực vật khác trên qui mô

lớn [133]. Wang và Zhong (1996) đã phát triển một loại hệ lên men mới dùng

nuôi cấy in vitro thực vật mẫn cảm với lực trượt đó là hệ lên men khuấy trộn

bằng cánh khuấy ly tâm (CIB) [172]. Zhang và Zhong (2002) cũng đã dùng hệ

lên men CIB (3 L) để nuôi cấy huyền phù tế bào cây tam thất, với tốc độ khuấy

145 vòng/phút, sinh khối tế bào tích lũy đạt 22 g/L [186]. Hơn nữa, các tác giả

này cũng đã nuôi cấy thành công tế bào cây P. notoginseng khi nâng cấp dung

tích hệ lên men này lên đến 30 L, sự tích luỹ sinh khối đạt trên 25 g/L, sản lượng

saponin và polysaccharide cũng cao hơn (1,7 so với 1,5 g/L và 2,9 so với 2,7

g/L). Từ các nghiên cứu này, Zhang và Zhong (2002) cho rằng, hệ lên men CIB

19

có tiềm năng lớn trong sản xuất sinh khối tế bào để chiết tách các chất mong

muốn trên qui mô lớn [186]. Năm 2007, Prakash và Srivastava cũng đã nuôi cấy

thành công tế bào cây Azadirachta indica để sản xuất sinh khối và azadirachtin

trong hệ lên men CIB và nhận thấy, hệ men lên men này tạo ra lực trượt thấp và

khả năng trao đổi oxy cũng được cải thiện [125].

1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC

VẬT NUÔI CẤY IN VITRO

1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật

Ở thực vật, có nhiều loại hợp chất hữu cơ hoặc các chất chuyển hóa được tạo

ra trong quá trình trao đổi chất. Những chất chuyển hóa này được xếp thành nhóm

các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp. Các hợp chất thứ cấp tìm thấy chỉ trong một số

loài thực vật hoặc trong nhóm loài có liên quan nhau, trong khi đó các hợp chất sơ

cấp được tìm thấy trong hầu hết các loài [153]. Trong vài thập kỷ qua, những bằng

chứng từ thực nghiệm và thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở thực vật có các

chức năng cơ bản sau: Bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật ăn cỏ; Kháng nấm,

vi khuẩn, virus; Chống lại sự canh tranh về ánh sáng, nước và chất dinh dưỡng; Thu

hút các loài động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán hạt; Tạo ra các tín hiệu

trong giao tiếp giữa thực vật với các loài vi sinh vật cộng sinh; Chống lại tia tử

ngoại và các tác nhân vật lý bất lợi khác [177]. Arnason và cs (1995) đã công bố

thực vật sản xuất hơn 80.000 hợp chất khác nhau thông qua con đường trao đổi thứ

cấp. Các sản phẩm thứ cấp được dự trữ chủ yếu trong các cấu trúc đặc biệt hoặc

các cơ quan dự trữ như rễ, các tế bào dự trữ, không bào, hệ thống màng…[19]. Các

hợp chất hóa học này được dùng trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc

nhuộm, gia vị, chất tạo mùi, thuốc trừ sâu; chúng đã đóng góp nhiều tỷ đô la trong

sản xuất công nghiệp [47].

1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật

Các hợp chất thứ cấp của thực vật có thể phân thành ba nhóm chính đó là

terpene, phenol và các hợp chất chứa nitrogen.

20

1.2.2.1. Nhóm terpene

Terpene, terpenoid hoặc isoprenoid là các dimer, trimer hoặc polymer của

các đơn vị isoprene. Các đơn vị isoprene thường liên kết để hình thành nên các hợp

chất mạch thẳng hoặc mạch vòng phổ biến với 10 carbon (monoterpenoid), 15

carbon (sesquiterpenoid), 20 carbon (diterpenoid) hoặc 30 carbon (triterpenoid) và

rất hiếm dạng terpenoid được tìm thấy với 25 carbon [153]. Các monoterpene được

tìm thấy rộng rãi trong tinh dầu thực vật, ví dụ như menthol, borneol, linalool…

Chúng được sử dụng như là các chất kháng côn trùng và các chất có hoạt tính dược

lý như giảm đau và kháng viêm. Sesquiterpene là thành phần của tinh dầu ở nhiều

loài thực vật, những hợp chất này có hoạt tính như kháng khuẩn, kháng nấm, diệt

trừ giun sán, chống sốt rét…[51]. Diterpennoid được tìm thấy trong nhiều loài thực

vật và động vật. Một số chất của chúng được ứng dụng trong điều trị bệnh, chẳng

hạn như taxol và các dẫn xuất của chúng được dùng làm thuốc điều trị ung thư,

forskolin chống tăng huyết áp. Triterpene là hợp chất terpene chứa 30 carbon,

chúng cũng được sử dụng nhiều trong dược phẩm [51].

1.2.2.2. Nhóm phenol

Tất cả các hợp chất nhóm phenol có một vòng thơm gắn với các nhóm chức

như hydroxyl, methoxy và các cấu trúc vòng không thơm khác. Chúng có cấu trúc

từ đơn giản với một vòng thơm cho đến các polymer phức tạp như tannin, lignin.

Các hợp chất phenol được tổng hợp bằng con đường shikimate hoặc con đường

acetate. Chúng có hoạt tính dược lý phổ rộng như kháng viêm, giảm đau, kháng

khối u, kháng virus HIV, kháng vi sinh vật, chống oxy hóa, chống loét, bảo vệ

gan… [51], [177].

1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen

Phần lớn các hợp chất thứ cấp của thực vật đều có chứa nitrogen trong

cấu trúc của chúng. Các hợp chất này được biết đến như là các hợp chất

chống lại các động vật ăn cỏ như alkaloid và cyanogenic glycoside. Chúng

21

được quan tâm nhiều bởi tính độc đối với con người và các thành phần dược

chất của chúng [153].

Các alkaloid có dạng tinh thể, có hoạt tính sinh lý trên tất cả các động vật

và được sử dụng trong công nghiệp dược. Alkaloid thường độc với liều lượng

lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được sử dụng làm thuốc chữa bệnh [104].

Các cyanogenic glycoside là vũ khí bảo vệ của thực vật. Chúng không độc cho

chính bản thân thực vật mà sẵn sàng hình thành các phân tử bay hơi có tính độc

khi thực vật bị đe doạ. Một số chất trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm,

chất mùi thực phẩm và dược phẩm [79].

1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào

thực vật

1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước

Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy đã được

tiến hành bởi các nhà khoa học thực vật và vi sinh vật ở nhiều quốc gia. Hầu hết

các ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong công nghệ sinh học đều nhằm vào

mục đích sản xuất các hợp chất thứ cấp và gần đây là sản xuất các chất điều trị

ung thư quan trọng như taxol, vinblastine và vincristine [113]. Những thành tựu

đạt được trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất dùng

để chữa bệnh đã tạo ra khả năng có thể sản xuất trên qui mô lớn các chất

alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, phenol, flavonoid và các amino acid [167].

Taxol là một trong những tác nhân kháng ung thư triển vọng nhất được biết

đến bởi dạng hoạt động độc nhất của nó trên hệ thống vi tế bào hình ống [113].

Hiện nay, sản xuất taxol nhờ nuôi cấy tế bào của các loài Taxus đã trở thành một

trong những ứng dụng rộng rãi trong nuôi cấy tế bào thực vật và đang làm chủ các

giá trị thương mại to lớn của taxol, một chất chỉ có dạng vết trong cây thủy tùng

và tổng hợp hóa học rất đắt tiền [65]. Christen và cs (1989) công bố đầu tiên về

sản xuất taxol (paclitaxel) bởi nuôi cấy tế bào Taxus [34]. Fett-Neto và cs (1995)

22

đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và các yếu tố khác lên sản xuất

trong nuôi cấy tế bào, kết quả sản xuất paclitaxel đạt 0,02% khối lượng khô [41].

Kim và cs (1995) cũng đã tạo ra paclitaxel trong nuôi cấy tế bào cây Taxus

brevifolia sau 10 ngày trên môi trường tối ưu chứa 6% fructose [74]. Bên cạnh sự

tích lũy paclitaxel, một số toxoid cũng đã được tìm thấy cả trong tế bào và môi

trường nuôi cấy tế bào Taxus [71]. Parc và cs (2002) đã sản xuất toxoid bằng nuôi

cấy callus của các cây Taxus được chọn lọc [121]. Để tăng sản xuất toxoid, bổ

sung các amino acids vào môi trường nuôi cấy cũng đã được khảo sát, kết quả cho

thấy, phenylalanine đã tăng sản xuất taxol tối đa trong nuôi cấy tế bào cây T.

cuspidata [92].

Từ xưa, rễ của cây nhân sâm đã được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ,

một dược phẩm quí giá [148]. Ginseng đã được biết đến như là nhân tố kỳ diệu để

tăng cường sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ. Thành phần hoạt chất chính có trong nhân

sâm được xác định là ginsenoside, thuộc nhóm saponin triterpenoid [167]. Furuya

(1988) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường và ĐHST để tăng

lượng ginsenoside [45]. Nuôi cấy tế bào cây nhân sâm trên quy mô lớn đã được

Yasuda và cs (1972) công bố [180]. Sau đó, quy trình nuôi cấy ở quy mô công

nghiệp đã được công ty Nitto Denko (Ibaraki, Osaka, Nhật Bản) thực hiện trong hệ

lên men có cánh khuấy với dung tích 2000 và 20.000 L, năng suất ginsenoside đạt

được là 500-700 mg/L/ngày [60]. Quy trình này được xem như là một bước ngoặc

quan trọng trong thương mại hóa nuôi cấy mô và tế bào ở quy mô lớn. Wang và

Zhong (2002) nhận thấy bổ sung methyljasmonate hoặc dihydro-methyl jasmonate

vào môi trường nuôi cấy đã tăng khả năng hiệu suất ginsenoside của tế bào cây

nhân sâm [173]. Nuôi cấy rễ được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes đã được

tiến hành và hiệu suất ginsenoside đạt được cao hơn 3 lần so với nuôi cấy loại

callus tạo từ rễ bình thường [60]. Các kết quả nghiên cứu này cho thấy, nuôi cấy tế

bào cây nhân sâm vẫn là lĩnh vực thu hút nhằm thương mại hóa trên thế giới và là

tiềm năng to lớn cho công nghiệp hóa sinh [138].

23

L-DOPA là một tiền chất của các alkaloid, betalain và melanine; được

tách chiết từ các cây Vinca faba, Mucuna, Baptisia và Lupinus [148]. Nó còn là

một tiền chất của catecholamine ở động vật và được sử dụng như là một loại

thuốc tiềm năng cho điều trị bệnh Parkinson [62]. L-DOPA được dùng rộng rãi

trong điều trị bệnh nên có nhu cầu lớn và giá thành cao, chính vì thế nuôi cấy tế

bào được xem như là phương thức thay thế để sản xuất L-DOPA nhiều hơn [26].

Teramoto và Komamine (1988) đã tạo callus của cây Mucuna hassjoo, M.

pruriense, M. deeringia và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu

cho thấy, nồng độ cao nhất của L-DOPA thu được khi nuôi cấy tế bào của cây

M. hassjoo trên môi trường MS bổ sung 0,025 mg/L 2,4-D và 10 mg/L kinetin

[156]. Hàm lượng L-DOPA trong tế bào nuôi cấy đạt khoảng 80 mmol/g khối

lượng tươi cũng đã được Vanisree và cs (2004) công bố [162].

Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong rễ của cây Coptis japonica

và trong vỏ của cây Phellondendron amurense. Bằng cách chọn dòng có năng

suất cao, nhóm nghiên cứu của Mitsui và cs đã tạo ra berberine trên quy mô lớn

với năng suất 1,4 g/L sau hơn 2 tuần nuôi cấy [167]. Với việc sử dụng chất kích

kháng polysaccharide của nấm men, Sarin (2005) đã thành công trong việc sản

xuất với mức tương đối cao của berberine trong nuôi cấy tế bào cây T. rugosum

[138]. Ảnh hưởng của permidine lên sản xuất berberine trong nuôi cấy tế bào cây

T. minus cũng đã được công bố bởi Hara và cs (1991) [57].

Diosgenin là tiền chất cho tổng hợp hóa học của thuốc steroidal và cực kỳ

quan trọng trong công nghiệp dược phẩm [39]. Tal và cs (1983) đã nghiên cứu

sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào cây D. deltoidea. Họ nhận thấy rằng

hàm lượng carbon và nitrogen ảnh hưởng lớn đến sự tích lũy diosgenin trong

một dòng tế bào nuôi cấy [154]. Ishida (1988) nhận thấy sản xuất diosgenin được

kích thích khi tiến hành nuôi cấy cố định tế bào cây D. deltoidea, với sản lượng

tăng 25%. Kaul và cs (1969) đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên sản

xuất diosgenin trong nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây D. deltoidea [70]

24

Campothecin là một alkaloid kháng ung thư tiềm năng có trong cây

Camptotheca acuminate (Padmanabha, 2006). Sakato và Misawa (1974) đã

nghiên cứu tạo callus của cây C. acuminata trên môi trường MS bổ sung 0,2

mg/L 2,4-D và l mg/L kinetin và nuôi cấy lỏng với sự có mặt của gibberellin và

L-tryptophan; hàm lượng camptothecin thu được khoảng 0,0025% khối lượng

khô [136]. Nghiên cứu của Thengane và cs (2003) cho thấy, khi nuôi cấy tế bào

cây C. acuminata trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/L NAA thì sự tích lũy

camptothecin đạt được là 0,998 mg/L [160].

Vincristine và vinblastine là các indole alkaloid nhị trùng ngưng đã trở

thành thuốc có giá trị trong hóa trị liệu ung thư bởi hoạt tính kháng ung thư tiềm

năng của chúng chống lại nhiều khối u rắn và bạch cầu. Những hợp chất này

chiết tách thương mại từ số lượng lớn của cây dừa cạn. Do hàm lượng vincristine

và vinblastine chứa trong cây thấp (0,0005%), vì vậy nuôi cấy tế bào đã được

nghiên cứu như một sự thay thế cho sản xuất một lượng lớn các alkaloid này

[113]. Vinblastine hợp thành từ catharanthine và vindoline. Vì vindoline có

nhiều catharanthin trong cây hoàn chỉnh nên nó ít đắt tiền hơn [20]. Nghiên cứu

ảnh hưởng của nhiều hợp chất như vanadyl sulphate, abscisic acid và sodium

chloride lên sản xuất catharanthin cũng đã được công bố bởi Smith và cs (1987)

[146]. Ảnh hưởng của nhiều yếu tố như stress, bổ sung chất điều hòa sinh

trưởng, các chất kích kháng và các tiền chất tổng hợp lên sản xuất indole

alkaloid cũng đã được Zhao và cs (2001a; 2001b) công bố [189], [190].

Các chất tanshinone thuộc nhóm quinoid diterpenoid được cho là những

chất có hoạt tính của cây Salvia miltiorrhiza, chúng được dùng làm dược liệu

truyền thống của Trung Quốc [174]. Nakanishi và cs (1983) đã thiết lập được

một dòng tế bào có chứa một lượng lớn cryptotanshinone từ cây S. miltiorrhiza

[110]. Shimomura và cs (1991) nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định cây S.

miltiorrhiza và khảo nghiệm các điều kiện nuôi cấy cho hiệu suất tanshinone cao

[141]. Sản xuất diterpenoid ở rễ tơ của cây S. miltiorrhiza cũng đã được Hu và

Alfermann (1993) nghiên cứu [61].

25

Podophyllotoxin là nguyên liệu khởi đầu cho việc điều chế các dẫn xuất

bán tổng hợp như toposide, teniposide và được dùng rộng rãi trong điều trị

kháng khối u [31]. Các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum

sinh trưởng rất chậm, việc thu hồi podophyllotoxin từ tự nhiên cũng gặp khó

khăn. Do đó, những hạn chế trong việc cung cấp podophyllotoxin từ tự nhiên cần

phải được khắc phục [117]. Nuôi cấy tế bào cây P. peltatum để sản xuất

podophyllotoxin được nghiên cứu đầu tiên bởi Kadkade (1982) [69]. Để tăng sản

lượng của podophyllotxin, Woerdenberg và cs (1990) đã sử dụng phức chất

conifery1 alcohol và b-cyclodextrin để nuôi cấy huyền phù tế bào cây P.

hexandrum [178].

1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước

Ở nước ta, công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật phát triển vào những năm

1970 và đến nay đã đạt được một số thành công. Một trong những kết quả nuôi

cấy tế bào thành công nhất đó là nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis). Sâm Ngọc Linh có tác dụng phòng chống ung thư, bảo vệ tế bào

gan, kích thích hệ miễn dịch, chống stress và trầm cảm, chống oxy hóa, lão hóa.

Hiện nay, loài cây này bị khai thác cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng [157].

Thanh và cs (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên sản

xuất sinh khối và ginsenoside trong nuôi cây huyền phù tế bào cây sâm Ngọc

Linh. Kết quả cho thấy, môi trường ½MS và MS thích hợp cho cả sản xuất sinh

khối cũng như ginsenoside, sinh khối và ginsenoside đạt lần lượt là 9,8 g/L và

6,81 mg/g khối lượng khô. Nồng độ sucrose tăng từ 20-50 g/L đã tăng sản xuất

sinh khối, tuy nhiên khi sucrose tăng đến 70 g/L thì ức chế cả sinh trưởng và tích

lũy ginsenoside của tế bào. Nồng độ nitrogen thích hợp cho cả sinh trưởng và

tích lũy ginsenoside là 30 mM [157]. Nghiên cứu của Thanh và cs (2008) cũng

cho thấy, NH4NO3 nồng độ 0,5 g/L cho sinh khối lớn nhất và hàm lượng

ginsenoside đạt cao nhất là 6,5 mg/g khối lượng khô. Nồng độ 1,0 g/L của KNO3

thích hợp cho sinh trưởng tế bào nhưng ginsenoside thu được lớn nhất (6,1 mg/g

26

khối lượng khô) lại ở nồng độ 2,0 g/L KNO3. Nghiên cứu còn cho thấy, sinh

trưởng cũng như hàm lượng ginsenoside của tế bào tăng đáng kể khi bổ sung

CaCl2 vào môi trường nuôi cấy [158].

Nghiên cứu sản xuất taxol từ các hệ thống tế bào in vitro cũng đã và đang

được quan tâm bởi các nhà khoa học trong nước. Lê Thị Thuỷ Tiên và cs ( 2006)

đã nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Callus hình

thành và sinh trưởng tốt trên môi trường B5 có bổ sung auxin và cytokinin. Môi

trường có 4 mg/L 2,4-D và 1 mg/L kinetin thích hợp cho sự hình thành và sinh

trưởng callus từ thân non. Callus từ lá non sinh trưởng tốt trên môi trường có 3

mg/L NAA và 0,25 mg/L kinetin. Nuôi cấy tế bào được thiết lập trên môi trường

lỏng có cùng thành phần với môi trường nuôi cấy callus; phân tích cho thấy, có

sự hiện diện của taxol trong callus và huyền phù tế bào, và không tìm thấy taxol

trong môi trường nuôi cấy [16]. Ảnh hưởng của các nguồn carbon lên sinh

trưởng của tế bào cây thông đỏ đã được Nhut và cs (2006) nghiên cứu. Kết quả

cho thấy, môi trường nuôi cấy có bổ sung 30g/L glucose và 30 g/L fructose là

thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [112]. Dương Tấn Nhựt và cs (2007)

cũng đã nghiên cứu thiết lập điều kiện nuôi cấy tế bào cây thông đỏ và tái sinh

callus từ tế bào dịch huyền phù. Các tế bào và callus thu nhận được có thể sử

dụng để nhân, định lượng và tách chiết taxoid [11].

Cà gai leo (Solanum hainanense) là một cây thuốc quý, rễ của chúng

thường được dùng làm thuốc chữa các bệnh phong thấp, đau nhức xương,

ho…[4]. Rễ cây cà gai leo là nơi tích lũy chủ yếu glycoalkaloid, tuy nhiên chúng

có hàm lượng thấp và phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu tự nhiên [15]. Lê

Thị Hà Thanh và cs (2009) đã nghiên cứu sản xuất glycoalkaloid từ tế bào cây cà

gai leo. Kết quả cho thấy, môi trường MS rắn có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm

0,1 mg/L BAP và 1,0 mg/L 2,4-D thích hợp nhất để tạo callus. Huyền phù tế bào

cà gai leo sinh trưởng tốt nhất trên môi trường MS có 40 g/L sucrose; 1,0 mg/L

BAP và 1,0 mg/L 2,4-D, với tốc độ lắc 150 vòng/phút. Hàm lượng glycoalkaloid

27

toàn phần tích lũy cao nhất trong tế bào sau 4 tuần nuôi cấy đạt 48,41 mg/g khối

lượng khô, cao gấp 5,9 lần hàm lượng glycoalkaloid trong rễ cây cà gai leo tự

nhiên 1 năm tuổi [13]. Loc và cs (2010) cũng đã khảo sát sự tích lũy

glycoalkaloid trong nuôi cấy callus của cây cà gai leo [88].

Cây rau má (Centella asiatica) là loài dược thảo có chứa asiaticoside và

madecassoside. Asiaticoside có hoạt tính chống oxy hóa, chữa bỏng, bảo vệ tế

bào thần kinh và sinh tổng hợp collagen [9]. Nguyễn Hoàng Lộc và cs (2008) đã

nghiên cứu tạo callus và khảo sát khả năng tích lũy asiaticoside trong callus cây

rau má. Kết quả cho thấy, môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA và 2,0

mg/L BAP thích hợp nhất để cảm ứng tạo callus; môi trường có 1,5 mg/L NAA

và 0,5 mg/L kinetin kích thích callus sinh trưởng mạnh. Hàm lượng asiaticoside

tích lũy cao nhất trong callus là 3,12 mg/g tương đương với 0,31% khối lượng

khô [8]. Thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào cây rau má và khảo sát sự tích lũy

asiaticoside trong tế bào nuôi cấy cũng đã được nghiên cứu Loc và An (2010)

nghiên cứu [87].

Cây dừa cạn là một trong những loài cây dược liệu chứa nhiều alkaloid,

diển hình là các chất chữa ung thư rất tốt như vincristine và vinblastine. Bùi Văn

Lệ và Nguyễn Ngọc Hồng (2006) đã nghiên cứu sinh trưởng và tích lũy alkaloid

toàn phần của tế bào cây dừa cạn. Kết quả cho thấy, trên môi trường bổ sung 1,0

mg/L NAA và 0,5 mg/L Kin, sinh khối tế bào và alkaloid toàn phần đạt cao nhất;

nồng độ sucrose 60 g/L tối ưu cho sự tích lũy alkaloid toàn phần. Khi kết hợp

nồng độ chất ĐHST tối ưu. Các tác giả đã thu được lượng vincristin cao trong tế

bào khi nuôi cấy trên môi trường có 1 mg/L NAA; 0,5 mg/L Kin và 60 g/L

sucrose, trong khí đó lá của cây dừa cạn tự nhiên không tìm thấy loại alkaloid

này [5]. Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) là một loài thực vật chứa nhiều

saponin. Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai (2007) đã tạo callus từ các mẫu

cây con trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D. Callus tạo thành sau 14 tuần

được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường lỏng bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và

20% nước dừa để thu sinh khối và chiết rút saponin [6].

28

Như vậy, nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ

cấp ở nước ta cũng có được một số kết quả nhất định. Tuy nhiên, những nghiên

cứu nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm. Phát triển các kỹ thuật nuôi

cấy trong các hệ lên men ở quy mô công nghiệp để sản xuất các hợp chất có hoạt

tính sinh học vẫn còn là một con đường đầy tiềm năng chưa được khai phá hết

của nền công nghệ nuôi cấy tế bào của Việt Nam.

1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN

1.3.2. Thành phần hóa học

Nghệ đen là loài cây thảo dược không độc, chứa nhiều các hợp chất hóa

học có giá trị dược liệu cao. Nhiều nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học

của cây nghệ đen. Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học

tinh dầu từ thân rễ của nghệ đen và tìm thấy các hợp chất như -pinen, camphen,

cineol, camphor và borneol bên cạnh các sesquiterpene, tuy nhiên không phân lập

và xác định được một sesquiterpene nào [131]. Shiobara và cs (1985) đã tách chiết

từ củ nghệ đen được 3 loại sesquiterpenoid đó là curcumeone, curcumanolide-A,

curcumanolide-B [143]. Xingyi (1999) đã nghiên cứu cho thấy, tinh dầu nghệ đen

có chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó chủ yếu là curzerenone, curcumenol,

b-elemene, isocurcumenol [179]. Singh và cs (2002) đã khảo sát thành phần tinh

dầu của một số loài nghệ của Ấn Độ cho thấy, nó có chứa các thành phần chính

như: 1,8 cineol, cymene, α-phellandrene (14,9%) [145]. Mau và cs (2003) đã xác

định được 36 hợp chất từ nghệ đen gồm 17 terpenes, 13 alcohol, và 6 ketones

[100]. Garg và cs (2005) đã nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu từ lá

cây nghệ đen Ấn Độ. Kết quả cho thấy, tinh dầu có chứa 23 hợp chất khác nhau

[46]. Makabe và cs (2006) đã xác định được hơn 10 loại sesquiterpene từ củ nghệ

đen [94]. Champakaew và cs (2007) phân tích tinh dầu bay hơi của củ nghệ đen

nhận thấy, thành phần chính của tinh dầu bao gồm β-tumerone, 1,8-cineole và 7-

zingiberene [28].

29

Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen,

các nghiên cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng đã

được tiến hành. Syu và cs (1998) đã nghiên cứu nhận thấy dịch chiết ethanol của

củ nghệ đen có chứa curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin

[152]. Paramapojn và Gritsanapan (2007) đã nghiên cứu về thành phần

curcuminoid trong củ nghệ đen ở các vùng sinh thái khác nhau của Thái Lan.

Kết quả cho thấy, hàm lượng curcumin, demethoxycurcumin và

bisdemethoxycurcumin lần luợt từ 1,46% đến 5,73% w/w (trung bình 2,73%

w/w); từ 3,15% đến 10,98% w/w (trung bình 7,37%) và từ 0,49% đến 2,99%

w/w (trung bình 1,40% w/w) [119].

Ở nước ta, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đang rất

được quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đánh giá

thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen trồng ở các vùng khác nhau. Phan

Minh Giang và cs (1997) đã công bố thành phần chính trong tinh dầu thân rễ

nghệ đen ở Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [2]. Lê Quý Bảo

và cs (2004) đã công bố thành phần tinh dầu trong thân rễ nghệ đen ở Đô

Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) [1]. Trần Thị Việt Hoa và cs

(2007) đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở

Đà Lạt được trích ly theo phương pháp gia nhiệt thông thường và phương

pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng. Kết quả nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự khác

biệt lớn về thành phần sesquiterpene của nghệ đen ở Việt Nam và các nước

khác [3].

Tóm lại, nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu

bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene; curcuminoid bao

gồm: curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin. Ngoài ra, nghệ

đen còn chứa các chất như tinh bột, chất dẻo và một số chất có vị đắng khác như

tannin và flavonoiod [82].

30

1.3.3. Công dụng

Ngoài nghệ vàng, loài cây được nghiên cứu liên tục và được xem là loại

thảo dược tiềm năng có nhiều hoạt chất sinh học, nghệ đen cũng đang được quan

tâm ngày càng nhiều nhờ các hoạt chất mới được xác định từ nó [32].

1.3.3.1. Công dụng cổ truyền

Cây nghệ đen được trồng rộng rãi dùng làm rau hoặc đồ gia vị ở các quốc

gia Đông, Nam và Đông Nam Á bao gồm Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Nhật

Bản và Thái Lan [137], [58]. Từ lâu, nghệ đen đã được con người dùng trong bài

thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nghệ đen có trong Dược điển XIII của

người Nhật Bản và sử dụng trong thuốc cổ truyền của người Trung Quốc. Nghệ

đen đã từng được kê trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều kinh,

điều trị hội chứng “Oketsu” gây ra do tắt ngẽn mạch máu và cải thiện kinh

nguyệt trong nhiều dạng thuốc pha chế khác nhau [98], [99], [182]. Từ lâu ở

Thái Lan, nghệ đen đã được dùng để làm dịu cơn đau dạ dày, chống tiêu chảy,

chống nôn mửa và sốt. Nó cũng được dùng ngoài da như chất làm se các vết

thương [137]. Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong

gân, ung nhọt và vết thương. Củ nghệ đen giàu tinh bột, được dùng như là nguồn

thay thế cho tinh bột của cây hoàng tinh, lúa mạch và được chú ý dùng làm thực

phẩm cho trẻ sơ sinh, người đang dưỡng bệnh. Bột màu đỏ gọi là “Abir” làm từ

củ nghệ đen khô xử lý với nước sắc cây tô mộc được dùng trong nghi lễ tôn giáo

Hindu. Nó cũng được dùng để sản xuất rượi, nhiều loại nước hoa, mỹ phẩm và

các loại hương liệu khác [36]. Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa

giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa

bệnh phù [108], phong hủi [68].

1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học

- Hoạt tính giảm đau

Shin và cs (1994) khảo sát hoạt tính dược lý của 2 sesquiterpene:

31

cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen. Kết quả cho thấy, cả hai chất

này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối. Nghiên cứu khác cũng cho thấy,

hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao gấp mấy lần so với các loại thuốc

giảm đau thông thường. Dịch chiết dichloromethane từ củ nghệ đen thu được

trong mùa thu và mùa đông đều có tác dụng ức chế sự co thắt ở bụng [142].

- Hoạt tính kháng ung thư

Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt

tính chống ung thư và kháng viêm [58]. Dịch chiết bằng nước của củ nghệ có

hoạt tính chống lại di căn phổi của các tế bào khối u ác tính B16 [139].

Priosoeryanto và cs (2001) nghiên cứu khả năng ức chế sinh trưởng các dòng tế

bào ung thư của dịch chiết ethanol và chloroform củ nghệ đen nhận thấy, dịch

chiết chloroform đã ức chế sinh trưởng tế bào myeloma và tế bào carcinoma;

dịch chiết ethanol ức chế sinh trưởng tế bào myeloma và tế bào carcinoma [126].

Syu và cs (1998) nghiên cứu nhận thấy các curcuminoid có hoạt tính chống các

tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-3 ở người [152]. Jang và cs (1997); Hanif

và cs (1997) cũng đã nhận thấy, các curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả

năng ức chế sinh trưởng khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết

và ung thư biểu mô gan ở người.

Moon và cs (1985) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khối u của polysaccharide

nghệ đen. Kết quả cho thấy, polysaccharide ức chế dòng tế bào ung thư sarcoma

180 với tỷ lệ là 61,1% [105]. Theo Kim và Kim (2000), polysaccharide nghệ đen

làm giảm kích thước khối u trên chuột đã được cấy tế bào sacrom 180 với tỷ lệ 52%

và ngăn chặn đột biến nhiễm sắc thể [75]. Wang và cs (2004) đã thử hoạt tính kích

thích miễn dịch, chống oxy hóa và ung thư trên chuột của polysaccharide nghệ đen.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư, oxy hóa

và tăng cường miễn dịch [170].

Lee và cs (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của một số sesquitertene phân lập

từ các cây họ Gừng lên hoạt tính của các enzyme: cyclooxygenase (COX-2) và

32

nitric oxide synthase (iNOS) trong nuôi cấy đại thực bào chuột được kích hoạt

bởi lipopolysaccharide. Các sesquiterpenoid của nghệ đen có khả năng ức chế

mạnh hoạt tính các enzyme: cyclooxygenase và nitric oxide synthase. Các tác giả

này cũng cho rằng, các sesquiterpene phân lập từ nghệ đen có thể phát triển

thành các chất ức chế COX-2 và iNOS, sản xuất các tác nhân phòng ngừa ung

thư và kháng viêm [80]. Carvalho và cs (2010) nghiên cứu nhận thấy có sự tăng

đáng kể lượng tế bào hồng cầu và bạch cầu tổng số; giảm số tế bào màng bụng

và kích thước khối u trên chuột được tiêm dịch chiết của nghệ đen so với đối

chứng [27].

- Hoạt tính bảo vệ gan

Matsuda và cs (1998) đã nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ

đen có hoạt tính bảo vệ gan. Các sesquiterpene và curcumin bảo vệ chống lại sự

hình thành D-galactosamine/lipopolysaccharide, giảm tổn thương gan ở chuột

[99]. Kết quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen thể sử dụng

như thuốc tiềm năng cho điều trị chứng xơ gan mãn tính [73].

- Hoạt tính kháng loét

Nghệ đen được sử dụng như là phương thuốc chủ yếu trong việc điều trị

các chỗ loét trong hệ tiêu hóa. Tác động của bột rễ nghệ đen lên dịch dạ dày, pH

dạ dày, acid tự do và acid tổng số trong hệ thống tiêu hóa của chuột đã được

nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của

Raghuveer và cs (2003) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có khả năng chống

lại tình trạng tiết nhiều acid và viêm loét trong dạ dày [127]. Watanabe và cs

(1986) đã nghiên cứu hoạt tính kháng loét của 8 dịch chiết từ nghệ đen trên

chuột gây viêm loét dạ dày cấp tính. Các hợp chất furanogermenone và (4S, 5S)-

(+) germencrone 4,5-epoxide của tinh dầu nghệ có hoạt tính ức chế sự hình

thành vết loét trên chuột thực nghiệm [175].

- Hoạt tính kháng viêm

Jang và cs (2001) nhận thấy 3 hợp chất 7-bis (4-hydroxyphenyl)-1,4,6-

33

heptatrien-3-one, procurcumenol và epiprocurcumenol từ dịch chiết củ nghệ đen

có hoạt tính kháng viêm bởi khả năng ức chế sự giải phóng yếu tố TNF-α ở đại

thực bào chuột [63]. Makabe và cs (2006) nghiên cứu khả năng kháng viêm của

các sesquiterpene phân lập từ dịch chiết ethanol của củ nghệ đen cho thấy, hai

hợp chất curzenone và dehydrocurdione có tác dụng ức chế sự hình thành chất

12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (chất tạo thành khi chuột bị viêm tai) với

hiệu quả ức chế tương ứng là 75% và 53% [94]. Yoshioka và cs (1998) đã dùng

chất dehydrocurdione, một sesquiterpene chiết tách từ cây nghệ đen để khảo sát

hoạt tính kháng viêm in vivo và in vitro ở chuột. Kết quả cho thấy,

dehydrocurdione, thành phần chính của nghệ đen có tiềm năng kháng viêm đi

cùng với tác dụng chống oxy hóa [182].

- Hoạt tính chống oxy hóa

Mau và cs (2003) nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu nghệ

đen. Ở nồng độ 20 mg/ml, tinh dầu nghệ đen có hoạt tính tốt trong việc quét gốc

tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl [100]. Các hợp chất curcuminoid phân lập

từ nghệ đen được công bố có hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm tương

đương với các chất này tách từ cây nghệ vàng [96]. Kết quả nghiên cứu của

Paramapojn và cs (2009) đã chứng minh rằng, dịch chiết ethanol củ nghệ đen có

hoạt tính quét gốc tự do. Khả năng quét gốc tự do của các curcuminoid nghệ đen

cao nhất là curcumin rồi đến demethoxycurcumin và thấp nhất là

bisdemethoxycurcumin [120].

Ở nước ta, Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) cũng đã khảo sát hoạt tính

chống oxy hóa và nhận thấy tinh dầu nghệ đen trồng ở Đà Lạt ở nồng độ 20

mg/ml có khả năng chống oxy hóa tương đối cao từ 74,8-77,8%. Cao ether dầu

hỏa của củ nghệ đen có khả năng chống oxy hóa cao nhất từ 61,4-84,5%, với nồng

độ từ 5-20 mg/ml [3].

- Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Hoạt tính kháng các loại vi khuẩn và nấm gây bệnh ở người và thực vật

34

của nghệ đen đã được nhiều nghiên cứu đề cập. Wilson (2005) đã khảo sát

hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của dịch chiết từ củ nghệ đen trên 6 loài vi

khuẩn và 2 loài nấm. Kết quả cho thấy, các loại dịch chiết của củ nghệ đen

đều có khả năng ức chế sinh trưởng của các loài vi khuẩn và nấm kiểm định

(trừ Staphylococcus aureus) [176]. Nghiên cứu của Ficker và cs (2003) về khả

năng kháng nấm gây bệnh ở người của các loại dịch chiết từ 11 loài cây họ

Gừng cho thấy, dịch chiết từ củ nghệ đen có khả năng chống lại các loại nấm

gây bệnh ở người, gồm những loài nấm chống chịu với các chất diệt nấm phổ

biến như amphotericin B và ketoconazole [43]. Joshi và cs (1989) nghiên cứu

nhận thấy, tinh dầu của nghệ đen chứa methyl-p-methoxy-cinnamate là thành

phần kháng các nấm gây bệnh ở người [67]. Philip và cs (2009) nghiên cứu

khả năng kháng khuẩn 32 loại dịch chiết từ 8 loài dược liệu trong các bài

thuốc cổ truyền ở Malaysia trên các loài vi khuẩn nhận thấy dịch chiết của củ

nghệ đen ức chế sinh trưởng của các loài vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa,

S. aureus, Bacillus. subtilis và không ức chế sinh trưởng của vi khuẩn E. coli

[124]. Dịch chiết nghệ đen Thái Lan có hoạt tính kháng 3 chủng vi khuẩn E.

coli, 2 chủng vi khuẩn Salmonella typhimurium, B. cereus, Listeria

monocytogenes, S. aureus, 1 chủng vi khuẩn B. subtilis, Vibrio

parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, và 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas

sp. [155]. Hiệu quả kháng khuẩn của dịch chiết nghệ đen tương đương với các

sản phẩm kháng khuẩn thương mại và sự phối hợp dịch chiết nghệ đen với các

sản phẩm kháng khuẩn đã cải thiện hiệu quả của các sản phẩm này [25]. Singh

và cs (2002) đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bay hơi của củ cây

nghệ đen nhận thấy, tinh dầu ức chế hoàn toàn khả năng sinh trưởng của các

sợi nấm Colletotrichum falcatum [145]. Srvidya và cs (2009) nghiên cứu hoạt

tính kháng khuẩn của dịch chiết củ nghệ đen. Kết quả cho thấy, dịch chiết

hydro ethanolic của nghệ đen có khả năng kháng B. cereus và ức chế tương

đối với K. pneumonia và C. albicans [149].

35

1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen

Mello và cs (2001b) đã thành công trong tái sinh chồi từ callus nghệ

đen trên môi trường lỏng có bổ sung 13,4 mM NAA và 2,2 mM BAP sau 70

ngày nuôi cấy [102]. Miachir và cs (2004) đã nghiên cứu nhân giống in vitro

cây nghệ đen ở từ chồi của thân củ [103]. Bharalee và cs (2005) cũng đã

nghiên cứu nhân giống bằng chồi củ của cây nghệ đen, các cây tạo rễ in vitro

có thể đưa ra trồng ngoài đất [21]. Loc và cs (2005) đã thành công trong nhân

giống in vitro cây nghệ đen và có hơn 95% cây in vitro hình thành rễ sinh

trưởng tốt trong chậu [90]. Anisuzzaman và cs (2008) đã nghiên cứu tạo củ in

vitro cây nghệ đen ở Bangladesh. Chồi in vitro khoảng 10-12 tuần tuổi được

nuôi cấy trên môi trường MS với nồng độ khác nhau của BA, NAA và các

nguồn carbon khác nhau. Củ hình thành tốt nhất trên môi trường có 4,0 mg/L

BA và 6% sucrose sau 7-9 tuần nuôi cấy [18]. Stanly và cs (2010) nghiên cứu

nhân giống in vitro cây nghệ đen ở Malaysia thông qua nhân nhanh chồi in

vitro trên môi trường rắn; nuôi cấy lắc trong bình tam giác và nuôi cấy ngập

chìm tạm thời [150].

Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro, nghiên cứu nuôi cấy callus

và huyền phù tế bào cây nghệ đen cũng đã được công bố. Mello và cs (2001a,

b) đã tạo callus từ đoạn rễ của cây nghệ đen in vitro trên môi trường MS có

3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP trong điều kiện tối [101], [102].

Theo Miachir và cs (2004), callus không hình thành từ mô lá và rễ của cây

nghệ đen in vitro trên môi trường có 2,4-D. Callus hình thành tốt nhất từ đoạn

rễ trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA và nuôi cấy trong tối [103 ].

Mello và cs (2001a) đã nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen.

Kết quả cho thấy, với 0,5 g tế bào trong bình tam giác 125 ml chứa 10 ml

môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP, tốc độ lắc 60

vòng/phút đã thu được khoảng 6 g sinh khối tươi của tế bào sau 35 ngày

nuôi cấy. Kết quả cũng cho thấy, sucrose là nguồn carbon thích hợp cho sinh

36

trưởng của tế bào nghệ đen, các nguồn carbon khác như galactose glycerol và

sorbitol không có vai trò đáng kể trong kích thích sinh trưởng của tế bào

[101]. Miachir và cs (2004) cũng đã thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào cây

nghệ trong bình tam giác 250 ml trên máy lắc. Nuôi cấy 1 g tế bào trong 75

ml môi trường MS có bổ sung 1 mg/L NAA đã thu được sinh khối tế bào cao

nhất là 8 g sau hơn 20 ngày nuôi cấy ở tốc độ lắc 100 vòng/phút [103].

37

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc

chi nghệ (Curcuma), họ Gừng (Zingiberaceae), bộ Gừng (Zingiberales).

Nguyên liệu nghiên cứu là các tế bào callus được tạo ra từ bẹ lá của cây

nghệ đen in vitro (Hình 2.1) [90].

Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nuôi cấy tạo callus từ nguyên liệu bẹ lá của cây nghệ đen in vitro.

- Nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml và

trong hệ lên men 10 L.

- Khảo sát sự tích lũy các hợp chất tự nhiên như tinh dầu, curcumin,

sesquiterpene và polysaccharide trong tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên

men 10 L.

- Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ

đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L.

38

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm

Cây nghệ đen tự nhiên

Cây nghệ đen in vitro

Callus có nguồn gốc từ bẹ lá

Chọn loại callus thích hợp cho nuôi cấy huyền phù

Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác ở các điều kiện và môi trường nuôi cấy khác nhau

Môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp

Cỡ mẫu

Cỡ mẫu

Điều kiện nuôi cấy thích hợp

Khảo sát sự tích lũy của tinh dầu, curcumin, polysaccharide, và sesquiterpene

Phân tích hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

Tốc độ lắc Nguồn carbon Chất ĐHST

Nuôi cấy TB trong hệ lên men ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau

Tốc độ khuấy Tốc độ sục khí

39

Các thí nghiệm của luận án được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Hợp chất

thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế.

2.3.1. Nuôi cấy callus

Bẹ lá (0,2×1,0 cm) của cây nghệ đen in vitro được nuôi trên môi trường

MS [107] có 2% sucrose và 0,8% agar, bổ sung 0,5-4,0 mg/L 2,4-D và 0,5-4,0

mg/L BA để tạo callus. Các callus sơ cấp hình thành từ bẹ lá (có màu trắng, xốp)

được cắt thành các khối nhỏ (đường kính 2-3 mm) cấy chuyển lên môi trường MS

có bổ sung 0,25-4,0 mg/L 2,4-D và 0,25-4,0 mg/L BA để phát triển thành callus

thứ cấp. Các callus thứ cấp có màu vàng, rắn và rời rạc được tách thành những

khối nhỏ (đường kính 1-2 mm) nuôi cấy trên trên cùng môi trường để nhân sinh

khối. Callus được cấy chuyển 2 tuần/lần để tạo nguồn nguyên liệu nuôi cấy huyền

phù tế bào.

2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào

2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác

Thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào bằng cách cấy chuyển 2 g callus (14

ngày tuổi) vào bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS có 2% sucrose, bổ

sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, nuôi trên máy lắc với tốc độ lắc 100

vòng/phút. Sau 10 ngày nuôi cấy, 2 g tế bào được chuyển sang môi trường mới có

thành phần tương tự và nuôi trong cùng một điều kiện cho đến khi thu được dịch tế

bào huyền phù đồng nhất.

Sau 3 lần cấy chuyển, dịch huyền phù tế bào đồng nhất, sinh khối của tế

bào 10 ngày tuổi được sử dụng nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml

môi trường MS có 2% sucrose, bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA với các

điều kiện khác nhau như: cỡ mẫu 2-5 g, tốc độ lắc từ 80-180 vòng/phút để đánh

giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào.

Sau khi khảo sát một số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng của tế

bào trong bình tam giác, trên máy lắc (cỡ mẫu, tốc độ lắc), sử dụng 3 g sinh khối

40

tế bào (10 ngày tuổi) từ thí nghiệm thăm dò điều kiện nuôi cấy thích hợp tiếp tục

nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml, chứa 50 ml môi trường MS bổ sung các

nguồn carbon khác nhau: sucrose, fructose và glucose (nồng độ: 20-70 g/L), và

các chất ĐHST khác nhau: BA (0,25-2,5 mg/L) và 2,4-D (0,25-2,5 mg/L) ở dạng

riêng rẽ hoặc phối hợp. Nuôi ở tốc độ lắc 120 vòng/phút để đánh giá ảnh hưởng

của yếu tố môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của tế bào.

2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men

100 g sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy trên bình tam giác 250

ml trong môi trường cơ bản MS có 3% sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và

2,4-D 1,5 mg/L được đưa vào hệ lên men có tổng thể tích 14 L, thể tích làm

việc 10 L (BioFlo 110, New Brunswick Scientific, USA) chứa môi trường MS

lỏng có 3% sucrose, bổ sung 2,4-D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, cỡ mẫu 100-

250 g, tốc độ khuấy 100-200 vòng/phút, tốc độ sục khí 1,5-3,5 l/phút. Sinh

khối tế bào được thu 2 ngày một lần trong suốt 18 ngày để khảo sát khả năng

sinh trưởng của chúng.

Tất cả môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 trước khi khử

trùng ở 121oC trong 15 phút. Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được duy trì ở

nhiệt độ 25 2oC, điều kiện chiếu sáng khoảng 2000 lux (cho các thí nghiệm

nuôi cấy callus) và khoảng 500 lux (cho các thí nghiệm nuôi cấy huyền phù

tế bào trong bình tam giác 250 ml và hệ lên men 10 L), thời gian chiếu sáng

8-10 giờ/ngày.

2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào

Khả năng sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù được đánh giá thông

qua khối lượng tươi, khối lượng khô, chỉ số sinh trưởng của tế bào.

Sinh khối tươi của tế bào thu được bằng cách lọc chân không dịch

huyền phù tế bào, sau đó rửa bằng nước cất để loại bỏ môi trường, cân để xác

định khối lượng tươi.

41

Sinh khối tươi của tế bào được sấy khô trong tủ sấy ở 500C cho đến khi

khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô của tế bào.

Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính theo công thức: I

FI W

WG

Trong đó, WF: khối lượng tươi tế bào sau một thời gian nuôi cấy, WI: khối

lượng tươi tế bào lúc đưa vào nuôi cấy.

2.3.4. Định lượng tinh dầu

Xác định tinh dầu được thực hiện theo phương pháp của (Manzan và cs

2003) [95]. 4 g khô của tế bào nghệ đen được nghiền mịn và cho vào bình nút

mài chứa 50 ml dung môi petrol ether, lắc 180 vòng/phút ở 40ºC trong 6 giờ.

Quá trình chiết lặp lại 3 lần. Sau khi chiết, dung dịch được cô trên máy cô quay

chân không (Heidolph, Đức) để loại bỏ dung môi và thu tinh dầu.

2.3.5. Định lượng curcumin

Tách chiết curcumin được tiến hành theo phương pháp của Paramapojn và

Gritsanapan (2009) [120]. Hòa 2 g bột mịn của tế bào nghệ đen trong 20 ml

ethanol 70%. Hỗn hợp được phá bằng sóng siêu âm trên máy T 700/H (Elma,

Đức) trong 30 phút ở 30oC. Sau đó, thể nổi được lọc bằng giấy Whatman (No.

1), bã được chiết lại với cùng dung môi cho tới khi hết hoàn toàn (dịch chiết cuối

cùng là không màu). Dịch chiết nhiều lần được trộn lại và làm giàu bằng máy cô

quay chân không (Heidolph, Đức) .

Mẫu sau khi cô được hòa tan với ethanol 70% đến 10 ml, lọc bằng màng

Millipore 0,25 μm (Sartorius, Đức) và pha loãng dịch chiết 5 lần. 20 μl của dịch

chiết được đưa vào máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bằng Hamilton

syringe. Điều kiện chạy HPLC ở nhiệt độ phòng: cột Vertisep GES C18 (5 µm;

4,6×150 mm), tốc độ chạy 1,2 ml/min, thời gian chạy 10 phút, detector đọc ở

bước sóng 420 nm, pha tĩnh là silica gel (pha ngược) và pha động là

acetonitrile:acetic acid 2% (50:50, v/v).

42

Phân tích HPLC được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo

Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). Tất cả dung môi đạt

tiêu chuẩn phân tích được mua từ các hãng Sigma (Mỹ) và Merck (Đức). Hòa

tan curcumin chuẩn (≥ 94%) bằng ethanol 70% ở các nồng độ từ 0,1-1 mg/ml để

dựng đường chuẩn. Hàm lượng curcumin (% khối lượng khô) của tế bào được

tính theo phương trình đường chuẩn y = 10805,46 x (r2 = 0,966).

2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước

Tách chiết polysaccharide được thực hiện theo phương pháp của Sun và

cs (2005) [151]. 1 g bột mịn của tế bào nghệ đen được chiết Soxhlet (Selecta,

Tây Ban Nha) trong 3 giờ với ethanol 80% để loại bỏ chất màu, làm bất hoạt các

enzyme, và biến tính các protein tự do. Phần cặn được cho vào bình tam giác 150

ml, thêm vào 30 ml nước cất, sau đó chiết trong thiết bị làm sạch bằng sóng siêu

âm T 700/H (Elma, Đức) ở 600C trong 30 phút. Dịch chiết được thêm vào 40 ml

ethanol 95%, ủ qua đêm ở 40C để kết tủa polysaccharide. Ly tâm thu kết tủa và

rửa sạch bằng hỗn hợp diethyl ether và acetone (1:1 v/v) để thu polysaccharide.

Hòa tan kết tủa polysaccharide trong 3 ml nước cất, sau đó thêm vào 1 ml

phenol và 7 ml H2SO4, ủ trong bể điều nhiệt ở 400C trong 30 phút. Làm lạnh đến

nhiệt độ phòng trong 20 phút. So màu trên máy quang phổ BioMate 3 UV-Vis

(Thermo Spectronic, Mỹ) ở bước sóng 485 nm. Mẫu trắng có thành phần giống

như mẫu phân tích nhưng không có polysaccharide. Hàm lượng polysaccharide

được xác định dựa vào đường chuẩn D-glucose (4-20 mg/ml) (Chaplin và cs

1994) [30] và tính toán theo hệ số chuyển đổi sang polysaccharide là 3,168 (Li

và cs 2007) [83]. Phương trình đường chuẩn D-glucose như sau: y = 0,0668x với

R2 = 0,996.

2.3.7. Xác định sesquiterpene

Xác định sesquiterpene theo phương pháp của Jang và cs (2004) [64]. Lấy

1 g mẫu bột mịn của tế bào nghệ đen chiết trong 3 giờ với dung môi methanol.

43

Quá trình chiết lặp lại 3 lần. Dịch chiết trộn lại, lọc và cô bằng hệ thống cô quay

chân không (Heidolph, Đức) cho tới khô. Mẫu sau đó được hòa tan trong hỗn

hợp ethyl acetate và nước (1:1 v/v). Phần hòa tan trong ethyl acetate được cô cho

tới khô, sau đó hòa tan trong methanol, lọc bằng màng Millipore 0,25 μm

(Sartorius, Đức), lấy 50 μl để chạy HPLC pha ngược. Điều kiện chạy HPLC ở

nhiệt độ phòng như sau: cột Vertisep GES C18 (5 µm, 4,6 ×150 mm), pha động

methanol 60%, tốc độ dòng 1 ml/min, độ hấp thu quang đo ở bước sóng 254 nm.

Phân tích HPLC được thực hiện trên máy Spectra System (Thermo

Electron, Mỹ) bằng chương trình ChromQuest (ver. 4.2.34). Tất cả dung môi đạt

tiêu chuẩn phân tích được mua từ hãng Merck (Đức).

2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen được xác định theo

phương pháp khuếch tán đĩa thạch của Lehrer và cs (1991) [81]. Sử dụng dịch

huyền phù (106 - 108 CFU/ml) của các chủng vi khuẩn Bacillus cereus ATCC

11778, Staphylococcus aureus ATCC 6538, và Escherichia coli ATCC 25922

(Bansal, 2003). 100 µl dịch huyền phù của mỗi chủng được bổ sung lên đĩa Petri

chứa 20 ml môi trường dinh dưỡng dạng rắn, dùng que cấy dàn đều tế bào vi

khuẩn trên mặt thạch. Khoan 3 lỗ đường kính 6 mm trên đĩa môi trường, sau đó

cho vào mỗi lỗ 70 µl tinh dầu (50 mg/ml), dung dịch DMSO được dùng làm đối

chứng. Đặt đĩa môi trường trong tủ lạnh khoảng 8 giờ, sau đó nuôi trong tủ ấm ở

37oC, sau 24 giờ xác định đường kính vô khuẩn D - d (D: đường kính vòng vô

khuẩn; d: đường kính lỗ khoan).

2.3.9. Xử lý thống kê

Mỗi thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần. Số liệu thực nghiệm được tính

trung bình mẫu ± sai số chuẩn và phân tích Ducan’s test (p<0,05) bằng chương

trình SAS.

44

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN

Callus thường được dùng làm nguồn nguyên liệu khởi đầu để thiết lập

nuôi cấy huyền phù tế bào của thực vật. Vì vậy, tìm ra môi trường dinh dưỡng

thích hợp cho nuôi cấy callus là rất cần thiết. Bảng 3.1 trình bày kết quả tạo

callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro trên các môi trường khác nhau sau 90

ngày nuôi.

Bảng 3.1. Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro

2,4-D (mg/L)

BA

(mg/L)

% mẫu vật

tạo callus Sinh trưởng của callus

Hình thái callus

- - - - -

0,5 0,5 15,74c ++ Trắng, mọng nước

1,0 1,0 46,01a ++++ Trắng, xốp

2,0 2,0 40,10b ++++ Trắng, xốp

3,0 3,0 10,20d +++ Trắng, mọng nước

4,0 4,0 8,20cd + Trắng, mọng nước

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

(Duncan’s test).

++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng

kém; - : không xuất hiện callus.

Các môi trường có bổ sung BA và 2,4-D đều kích thích tạo callus, trong

khi đó môi trường không bổ sung chất ĐHST lại không tạo callus. Môi trường có

bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA

45

là thích hợp nhất (tỷ lệ tạo callus từ 40,1-46,01%), callus có màu trắng, xốp và

có khả năng sinh trưởng tốt (Hình 3.1A). Ở các môi trường còn lại tỷ lệ tạo

callus thấp (8,2-15,74%), callus có màu trắng và mọng nước (Hình 3.1B).

Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro. (A) callus trắng và

xốp, (B) callus trắng và mọng nước.

Mello và cs (2001b) đã tạo được callus nghệ đen từ đoạn rễ trên môi

trường MS có 3% sucrose, bổ sung 13,4 µM NAA và 2,2 µM BA, nuôi trong

điều kiện tối. Nghiên cứu của Miachir và cs (2004) cho thấy, callus nghệ đen

hình thành từ đoạn rễ sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L

NAA, nhưng nếu nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4 D trong điều kiện

tối thì callus sẽ không xuất hiện [102].

Trong nghiên cứu của chúng tôi, các ĐHST như NAA và KIN cũng đã

được thăm dò khi nuôi cấy bẹ lá, tuy nhiên chúng cho kết quả rất kém, callus

sinh trưởng yếu trên môi trường có NAA và hóa nâu trên môi trường có KIN.

Chúng tôi cũng đã khảo sát khả năng hình thành callus từ đoạn rễ trên các môi

trường có bổ sung 2,4-D, BA, KIN, và NAA. Trên hầu hết các môi trường thí

nghiệm, mô rễ tạo callus rất kém hoặc callus có màu trắng, mọng nước và hơi

nhầy, sinh trưởng rất chậm.

Trong việc chọn dòng tế bào callus để thiết lập nuôi cấy huyền phù, các

dòng callus rắn và dễ vỡ vụn (friable) thường được lựa chọn làm nguyên liệu

B A

46

nuôi cấy huyền phù tế bào do chúng có khả năng sinh trưởng nhanh và ổn định

trong môi trường lỏng [165]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, callus điều có khả

năng sinh trưởng mạnh trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L

BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA. Tuy nhiên, các callus này có dạng

xốp và khó vở vụn nên không thích hợp để làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù

tế bào. Vì thế, cần phải chọn các dòng tế bào callus thích hợp hơn để thiết kế

nuôi cấy huyền phù.

Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy chuyển lên

môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L. Kết quả cho thấy, các

callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa

nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1

mg/L BA phát triển thành dạng callus thứ cấp có khả năng sinh trưởng tốt nhất

trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi

trường còn lại không có tác dụng kích thích sinh trưởng callus (callus sinh

trưởng kém hoặc hóa nâu và chết) sau 4 tuần cấy chuyển.

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của

callus

2,4-D (mg/L)

BA

(mg/L)

Sinh trưởng

của callus Hình thái callus

0,25 0,25 + Trắng và mọng nước

0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc

1,00 1,00 ++ Trắng và xốp

2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước

4,00 4,00 - Hóa nâu và chết

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở

p<0,05 (Duncan’s test).

++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh

trưởng kém; - : không sinh trưởng.

47

Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy

Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được

trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA sau 4 tuần được

cấy chuyển 2 tuần một lần lên môi trường có thành phần tương tự để nhân sinh

khối callus, tạo nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác.

3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC

3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy

Sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy trên môi trường MS có 2%

sucrose, bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,5 mg/L được dùng làm nguyên liệu để

khảo sát. Tế bào với các cỡ mẫu ban đầu khác nhau (2, 3, 4, 5 g tế bào) được nuôi

cấy trên môi trường lỏng có thành phần giống như môi trường sinh trưởng tốt

nhất của callus, ở tốc độ lắc 100 vòng/phút. Kết quả ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi

cấy lên sinh trưởng của tế bào trong khoảng thời gian từ 2 đến 18 ngày được trình

bày ở bảng 3.3.

Kết quả cho thấy, với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là

4,12 g tươi (0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì

sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41 g khô) và

chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh khối đạt cực đại sau

12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và 7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng

chỉ số sinh trưởng thấp chỉ đạt 1,54 và 1,44.

48

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù

trong bình tam giác

2 g tế bào 3 g tế bào 4 g tế bào 5 g tế bào TN

FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI

2 2,22c 0,18d 1,11 3,14d 0,28c 1,05 4,07c 0,32b 1,02 5,20d 0,39c 1,04

4 2,52c 0,24c 1,26 3,52c 0,32c 1,17 4,34c 0,35b 1,09 5,32d 0,42c 1,06

6 3,00b 0,24c 1,50 4,00c 0,35b 1,33 4,94c 0,37b 1,24 5,61c 0,44c 1,12

8 3,30b 0,30b 1,65 4,53b 0,38b 1,51 5,65b 0,40b 1,41 6,09c 0,47b 1,22

10 3,50b 0,33b 1,75 4,92b 0,40a 1,64 6,04a 0,42b 1,51 7,02b 0,48b 1,40

12 3,70a 0,35b 1,85 5,15b 0,40a 1,72 6,15a 0,44a 1,54 7,22a 0,51a 1,44

14 4,00a 0,35b 2,00 5,61a 0,41a 1,87 6,12a 0,46a 1,53 5,68c 0,41c 1,14

16 4,12a 0,37a 2,06 5,21b 0,37b 1,74 5,20b 0,35b 1,30 5,00d 0,32cd 1,00

18 4,01a 0.23c 2,01 4,67b 0,29c 1,56 4,56c 0,27c 1,14 4,12e 0,22d 0,82


p<0,05

TN: thời gian nuôi cấy (ngày); FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI:

chỉ số sinh trưởng

Nghiên cứu cũng cho thấy, mặc dù với cỡ mẫu nuôi cấy là 2 g, sau 14 ngày

chỉ số sinh trưởng của tế bào có cao (2,0), nhưng chất lượng dịch huyền phù tế bào

kém hơn (dịch tế bào có màu vàng nhạt, ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g tế

bào nuôi cấy (dịch huyền phù tế bào có màu vàng đậm, tươi và đồng nhất). Vì thế,

theo nhận định của chúng tôi, sử dụng 3 g tế bào callus nuôi cấy trong bình tam

giác có thể tích 250 ml chứa 50 ml môi trường là thích hợp hơn cả.

Nói chung, xác định cỡ mẫu là rất cần thiết để đảm bảo cho quá trình sinh

trưởng diễn ra hiệu quả. Khi mật độ tế bào trong bình nuôi cấy quá cao hoặc quá

thấp đều làm cho tế bào sinh trưởng kém [111]. Mật độ ban đầu thấp có thể dẫn

đến kéo dài pha sinh trưởng hàm mũ; trong khi đó, nếu mật độ tế bào ban đầu

cao hơn có thể nhanh chóng dẫn đến pha tử vong (Ling và cs 2008) [84]. Ảnh

49

hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền

phù đã được khảo sát trên nhiều loài thực vật khác nhau. Gou và Zhang (2005),

khi nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây gừng nhận thấy, nếu lượng mẫu

ban đầu thấp hơn 0,5% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng chậm, trong khi với lượng

mẫu cao hơn 2,0% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng nhanh [49]. Ling và cs (2008)

nuôi cấy tế bào cây Ficus deltoidea với cỡ mẫu là 2,5-10 ml dịch tế bào huyền

phù, kết quả tế bào sinh truởng tốt nhất ở 10 ml và sinh khối đạt cực đại sau 12

ngày. Nếu lượng mẫu thấp hơn 2,5 ml thì pha thích nghi (pha lag) của tế bào sẽ

kéo dài đến hết ngày thứ 9 [84]. Nagella và Murthy (2010) cũng đã khảo sát

ảnh hưởng của cỡ mẫu ban đầu từ 2,5- 20 g/L lên tích lũy sinh khối của tế bào

cây Withania somnifera nhận thấy, nuôi cấy với lượng mẫu khoảng 10 g/L là

thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [109].

Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào

nghệ đen cho thấy, tế bào nghệ đen sinh trưởng tốt với cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu

là 3 g trong bình tam giác thể tích 250 ml, chứa 50 ml môi trường và sau 14 ngày

sinh khối sẽ đạt cực đại. Trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng cỡ

mẫu nuôi cấy là 3 g và thu hoạch sinh khối sau 14 ngày nuôi cấy để khảo sát ảnh

hưởng các điều kiện nuôi cấy khác lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen.

3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc

Tế bào được nuôi cấy trên môi trường MS có BA 0,5 mg/L và 2,4-D

0,5 mg/L, sucrose 20 g/L, cỡ mẫu ban đầu là 3 g với tốc độ lắc thay đổi từ 80

đến 180 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh

trưởng của tế bào sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.4.

Nhìn chung, tốc độ lắc đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào nghệ

đen. Với tốc độ lắc tăng từ 80 đến 120 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần

lên và đạt cực đại là 5,91 g tươi (0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và

dịch huyền phù tế bào có màu vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên

cao hơn (150-180 vòng/phút), tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế

50

mạnh ở tốc độ lắc 180 vòng/phút, sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g

khô), dịch huyền phù tế bào chuyển sang màu nâu sau 14 ngày nuôi cấy.

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền

phù trong bình tam giác

Tốc độ lắc (vòng/phút) FW DW GI

80 5,00ab 0,34c 1,67

100 5,61b 0,41b 1,87

120 5,91a 0,44a 1,97

150 5,60b 0,42b 1,87

180 4,75ab 0,35c 1,58



FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng

Tốc độ lắc ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng tế bào do liên quan đến việc

cung cấp oxy và chất dinh dưỡng. Lượng oxygen trong môi trường nuôi cấy

đóng vai trò quan trọng quá trình trao đổi chất của tế bào thực vật. Lượng oxy

này chủ yếu phụ thuộc vào lớp không khí trên bề mặt môi trường. Môi trường

lỏng được trộn đều sẽ tăng tốc độ hòa tan của oxy, đồng thời tạo điều kiện dễ

dàng cho tế bào hấp thụ chất dinh dưỡng. Vì vậy, tốc độ sinh trưởng của tế bào

sẽ tăng khi tăng tốc độ lắc đến một giới hạn thích hợp, tuy nhiên khi tốc độ lắc

quá cao sẽ ức chế sinh trưởng do tế bào bị biến dạng gây nên hiện tượng tự phân

làm chết tế bào (Narayanaswany 1994) [111], (Ziv 2000) [193]. Theo nghiên cứu

của Choi và cs (2008), tốc độ lắc thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào cây cọ

dầu nằm trong khoảng từ 120-300 vòng/phút. Nếu tốc độ lắc thấp hoặc cao hơn

(80 và 335 vòng/phút) đều bất lợi cho sinh trưởng của tế bào [33]. Nghiên cứu

của chúng tôi nhận thấy, sinh trưởng của tế bào nghệ nuôi cấy trong bình tam

giác 250 ml cũng chịu ảnh hưởng đáng kể khi thay đổi tốc độ lắc, tế bào sinh

trưởng tốt nhất khi nuôi cấy trên máy lắc ở tốc độ 120 vòng/phút.

51

3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST

Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng của tế bào cây

nghệ đen bằng cách nuôi 3 g tế bào trên môi trường MS có 20 g/L sucrose, bổ

sung các chất 2,4-D và BA ở các nồng độ khác nhau, tốc độ lắc ở 120

vòng/phút.

3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA

Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ sung

BA từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.5. Kết quả

nghiên cứu cho thấy, môi trường có bổ sung BA 0,25 mg/L và 0,5 mg/L có hiệu

quả tương đương (p<0,05) trong kích thích sinh trưởng của tế bào, khối lượng

tươi của tế bào đạt từ 2,06-2,08 g (0,45-0,46 g khô) và chỉ số sinh trưởng xấp xỉ

2,1 là cao nhất. Trên các môi trường có nồng độ BA cao hơn (1,0 -2,5 mg/L),

sinh trưởng của tế bào giảm nhanh và bị ức chế mạnh ở nồng độ BA 2,5 mg/L,

sinh khối tế bào chỉ đạt 4,55 g tươi (0,32 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,52 sau

14 ngày nuôi cấy.

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù


BA (mg/L) FW DW GI

0,25 6,17a 0,45a 2,06

0,5 6,25a 0,46a 2,08

1,0 5,76b 0,42ab 1,92

1,5 5,92b 0,37b 1,97

2,0 5,41bc 0,35b 1,80

2,5 4,55bc 0,32b 1,52




52

3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D

Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ sung

2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.6. Kết quả

nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có ảnh hưởng tốt nhất lên sinh

trưởng của tế bào, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô) và chỉ số

sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại.

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù


2,4 D (mg/L) FW DW GI

0,25 5,10c 0,42b 1,70

0,5 5,77b 0,43b 1,92

1,0 6,02b 0,45b 2,01

1,5 6,75a 0,52a 2,25

2,0 6,04b 0,46b 2,01

2,5 5,35c 0,36c 1,78




3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA

Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung 2,4-D

0,5 mg/L và BA 0,25-2,5 mg/L; BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,25-2,5 mg/L. Kết

quả sinh trưởng của tế bào sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.7.

53

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền


2,4 D (mg/L) BA (mg/L) FW DW GI

0,5 0,25 5,82b 0,43b 1,94

0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97

0,5 1,0 5,32c 0,40c 1,77

0,5 1,5 5,00c 0,39c 1,67

0,5 2,0 4,45cd 0,38c 1,48

0,5 2,5 4,00d 0,35c 1,33

0,25 0,5 5,12c 0,39c 1,71

0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97

1,0 0,5 6,20b 0,46b 2,07

1,5 0,5 7,22a 0,55a 2,41

2,0 0,5 6,03b 0,43b 2,01

2,5 0,5 6,01b 0,42b 2,00




Nhìn chung, sinh trưởng của tế bào trên các môi trường có bổ sung đồng thời

2,4-D và BA cho kết quả tốt hơn các môi trường chỉ bổ sung riêng rẽ hai chất này.

Khối lượng tế bào và chỉ số sinh trưởng đạt cao nhất trong môi trường có 2,4-D 1,5

mg/L và BA 0,5 mg/L, tương ứng là 7,22 g tươi (0,55 g khô) và 2,41. Ở môi trường

này dịch tế bào huyền phù có màu vàng sáng và đồng nhất. Những môi trường còn

lại không thích hợp lắm cho sinh trưởng của tế bào, hầu hết dịch tế bào huyền phù

ngã sang màu nâu và một số tế bào bị chết sau 14 ngày nuôi cấy.

Tóm lại, sau khi khảo sát trên nhiều môi trường có bổ sung chất ĐHST

ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi nhận thấy môi trường MS có bổ sung 2,4-

D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L là môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ

đen thích hợp nhất, sinh khối tế bào cao nhất là 7,22 g tươi (0,55 g khô), gấp khoảng

2,5 lần so với sinh khối tế bào đưa vào ban đầu sau 14 ngày nuôi cấy.

54

Kittipongpatana và cs (1998) khi nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù cây

Solanum aviculare nhận thấy rằng tế bào sinh trưởng tốt nhất trên môi trường

lỏng MS bổ sung 4,52 M 2,4-D và 4,44 M BAP, chỉ số sinh trưởng tươi và

khô cao nhất tương ứng là 10,38 và 4,43.

3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon

Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sinh trưởng của tế bào nghệ

đen, chúng tôi nuôi cấy 3 g tế bào (10 ngày tuổi) trong môi trường MS có bổ

sung 2,4-D 1,5 mg/L, BA 0,5 mg/L với các nồng độ khác nhau của sucrose,

glucose và fructose từ 20 đến 70 g/L , tốc độ lắc 120 vòng/phút.

3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose

Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 14 ngày

nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8.

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù


Sucrose (g/L) FW DW GI

20 7,22c 0,55b 2,41

30 10,44a 0,66a 3,48

40 8,85b 0,64a 2,95

50 8,80b 0,65a 2,93

60 8,75b 0,70a 2,92

70 6,75c 0,60b 2,25




Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ sucrose thấp (20 g/L) tế bào sinh

trưởng chậm, chỉ đạt 7,22 g khối lượng tươi (0,55 g khô). Sinh trưởng của tế bào

đã tăng mạnh đạt 10,44 g khối lượng tươi (0,66 g khô) với chỉ số sinh trưởng là

3,48 trong môi trường có bổ sung sucrose 30 g/L, dịch huyền phù có màu vàng

55

tươi và khá đồng nhất (Hình 3.3). Ở nồng độ sucrose 40-70 g/L, sinh trưởng của

tế bào giảm, đặc biệt là ở 70 g/L (chỉ đạt 6,75 g tươi/0,60 g khô).

Sucrose được xem là nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế

bào thực vật, nồng độ thường dùng khoảng từ 20 đến 30 g/L (Suzuki và cs

1984). Sucrose vừa là nguồn cung cấp năng lượng vừa là một thành phần nguyên

liệu trong sinh tổng hợp các chất thứ cấp. Tốc độ tăng trưởng sinh khối của tế

bào luôn luôn liên quan trực tiếp với sự tiêu thụ sucrose (Rao và Ravishankar

2002) [132]. Theo Omar và cs (2004) trên môi trường mà tất cả các nguồn dinh

dưỡng ở mức dư thừa, sự gia tăng nồng độ sucrose sẽ dẫn đến tăng sinh khối khô

[114]. Một số nghiên cứu khác như nuôi cấy tế bào cây Solanum eleagnifolium

(Nigra và cs 1990), tế bào cây Solanum chrysotrichum (Villarreal và cs 1997)

[168], tế bào cây Psoralea corylifolia (Shinde và cs 2009) cũng nhận thấy tế bào

tăng sinh khối khô cùng với việc tăng nồng độ sucrose. Tuy nhiên, khi nồng độ

sucrose quá cao sẽ dẫn đến áp suất thẩm thấu vượt giới hạn cho phép của tế bào,

vì thế ảnh hưởng xấu lên sinh trưởng của chúng (Bùi Văn Lệ và cs 2006) [5].

Hình 3.3. Dịch huyền phù của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong bình

tam giác trên môi trường có 3% sucrose

Trong nghiên cứu của chúng tôi nồng độ sucrose 30 g/L là thích hợp nhất

cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen. Kết quả này cũng tương tự với kết quả nuôi

cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha Grushv.) (Thanh và cs

2007) [157], cây nhân sâm (Panax ginseng) (Lian và cs 2002), cây Gynema

56

sylvestre (Lee và cs 2006) [78], và cây Withania somnifera (Nagella và Murthy

2010) [109].

3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose

Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 14 ngày

nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.9. Kết quả cho thấy, tế bào sinh trưởng tương

đối thấp khi được nuôi trong môi trường có glucose 20-30 g/L. Ở nồng độ

glucose từ 40-60 g/L, sinh trưởng của tế bào tăng lên và sinh khối đạt cực đại là

7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng độ 70 g/L đã

ức chế sinh trưởng của tế bào.

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy, bên cạnh đường sucrose, glucose

cũng là nguồn carbon thích hợp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế

bào của nhiều loài thực vật (Kato và cs 2007, Sturn và cs 1999, Koch 2004). Tuy

nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, glucose không phải là nguồn carbon thích

hợp cho sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen, kết quả này cũng tương tự như

nuôi cấy tế bào cây Ficus deltoidea (Ling và cs 2008) [84] và cây Psoralea

corylifolia (Shinde và cs 2009).

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù


Glucose (g/L) FW DW GI

20 3,15cd 0,22c 1,05

30 6,05c 0,42bc 2,02

40 7,12a 0,53b 2,37

50 7,20a 0,55b 2,40

60 7,32a 0,59a 2,44

70 6,65b 0,53b 2,22




57

3.2.4.3. Ảnh hưởng của fructose

Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen được trình bày

ở bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu cho thấy, fructose có ảnh hưởng đáng kể lên sinh

trưởng của tế bào hơn glucose. Khi tăng nồng độ fructose trong môi trường từ 20-

60 g/L, sinh khối tế bào tăng theo và đạt cực đại là 8,40 g tươi (0,62 g khô). Tuy

nhiên, khi fructose bổ sung lên đến 70 g/L thì sinh trưởng của tế bào chậm lại và

chỉ còn 7,65 g tươi (0,57 g khô).

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền


Fructose (g/L) FW DW GI

20 6,72b 0,35c 2,24

30 7.34b 0,55b 2,45

40 7,70ab 0,57b 2,57

50 7,72ab 0,59b 2,57

60 8,40a 0,62a 2,80

70 7,65b 0,57b 2,55




Mặc dù sucrose và glucose được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào

thực vật. Tuy nhiên, mỗi loài lại thích hợp với một nguồn carbon khác nhau cần

cho quá trình hình thành các sản phẩm trao đổi chất của chúng [101]. Trong

nuôi cấy tế bào thực vật, nhiều loại đường đơn cũng đã được sử dụng như

glucose, fructose, sorbitol, galactose... Abdullah và cs (1998) khi nuôi cấy tế

bào cây Morinda elliptica đã cho thấy, fructose 5% giúp tăng khả năng sinh

trưởng của tế bào. Felker và cs (1989) khi nuôi cấy tế bào cây ngô nhận thấy,

fructose được vận chuyển nhanh nhất, tiếp đến là glucose và sau cùng là

58

sucrose. Một số nghiên cứu khác cũng thu được kết quả tương tư, chẳng hạn ở

tế bào của các cây Solanum eleagnifolium (Nigra và cs 1990), Ficus deltoide

(Ling và cs 2008) và Tinospora cordifolia [130].

Mặc dù fructose có tác dụng tốt cho sinh trưởng tế bào của nhiều loài

thực vật, tuy nhiên nếu sử dụng ở nồng độ cao nó sẽ gây ra ức chế chẳng hạn

như trường hợp nuôi cấy tế bào cây thuốc lá và cây Cinchona succirubrum

(Nigra và cs 1990). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, fructose

là nguồn carbon khá thích hợp cho sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen, hỗ trợ

sinh trưởng tế bào mạnh hơn glucose nhưng thấp hơn sucrose.

Từ các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện (cỡ mẫu, tốc độ

lắc) và môi trường (chất ĐHST, nguồn carbon) nuôi cấy lên sinh trưởng của tế bào

cây nghệ đen, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy và thiết lập đường cong sinh trưởng

của tế bào trong điều kiện thích hợp trên môi trường MS có 30 g/L sucrose, 2,4-D

1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút, cỡ mẫu 3 g trong 18 ngày

(Hình 3.4). Sinh khối cực đại của tế bào thu được chỉ sau 14 ngày nuôi cấy là

10,44 g tươi; cao gấp hơn 3 lần so với lượng sinh khối tế bào ban đầu.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Khối

lượn

g kh

ô tế

bào

(g)

Khối

lượn

g tươi

tế

bào

(g)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

Khối lượng tươi tế bào

Khối lượng khô tế bào

Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác trên môi

trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút

59

Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml đặt trên máy lắc

Nghiên cứu của Mello và cs (2001a) ở nghệ đen cho thấy, khi bổ sung 0,5

g tế bào trong 10 ml môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 µM NAA và 2,2 µM

BA, tốc độ lắc 60 vòng/phút sẽ thu được 6 g sinh khối tươi sau 35 ngày [101].

Trong khi Miachir và cs (2004) đã nuôi cấy 1 g tế bào nghệ đen trong 75 ml môi

trường MS có 1 mg/L NAA, tốc độ lắc 100 vòng/phút, sau 20 ngày thu được 8 g

sinh khối tươi [103]. Một số nghiên cứu khác, thời gian để tế bào sinh trưởng

cực đại dài hơn tế bào nghệ đen, chẳng hạn như tế bào cây Solanum

eleagnifolium là 26 ngày (Nigra và cs 1989), Solanum aviculare 28 ngày

(Kittipongpatana và cs 1998), Taxus willichiana 32 ngày [112], Solanum

chrysotrichum 22 ngày (Rodríguez-Monroy và cs 2004) [134], Psoralea

corylifolia 20 ngày (Shinde và cs 2009), Solanum hainanense 28 ngày (Loc và

cs 2009), Withania somniera 28 ngày (Nagella và Murthy 2010) [109].

3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN

3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào

Sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy lắc trên bình tam giác 250 ml

trong môi trường cơ bản MS có 3% sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-

D 1,5 mg/L được sử dụng làm nguyên liệu để khảo sát quá trình sinh trưởng của

tế bào nghệ đen khi nuôi cấy hệ lên men thể tích 14 L, thể tích làm việc 10 L

(Hình 3.6).

60

Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L

Kết quả nghiên cứu trình bày ở hình 3.7 cho thấy, sinh khối tế bào đạt

cực đại ở ngày thứ 14 với 241,67 g tươi (22,28 g khô), sau đó bắt đầu giảm

dần. Sinh khối tươi tế bào chỉ còn lại 132,67 g (10,08 g khô) sau 18 ngày nuôi

cấy. Lúc này, quan sát thấy dịch huyền phù tế bào từ màu vàng chuyển sang

nâu, nguyên nhân có thể liên quan đến sự xuất hiện các sản phẩm phenol

trong môi trường do quá trình chuyển hóa trao đổi chất của tế bào tạo ra.

0

5

10

15

20

25

0

50

100

150

200

250

300

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Khối

lượn

g kh

ô tế

bào

(g)

Khối

lượn

g tươi

tế

bào

(g)




Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men nuôi cấy trên môi

trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút;

sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu 100 g

61

Như vậy, thời gian và động thái sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen

nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L tương tự nuôi cấy trong bình tam

giác 250 ml (Hình 3.4). Thời gian sinh trưởng cực đại của tế bào nghệ đen

trong hệ lên men là 14 ngày, kết quả này cũng tương đương với sinh trưởng

của tế bào cây Gymnema sylvestre (15 ngày) (Lee và cs 2006) [78] và

Solanum chrysotrichum (16 ngày) (Rodríguez-Monroy và cs 2004) [134] khi

nuôi cấy trong hệ lên men.

Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen sau 14 ngày

nuôi cấy trong hệ lên men

Dựa trên kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen,

chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy trong hệ lên

men (cỡ mẫu, tốc độ khuấy, tốc độ sục khí) lên sinh trưởng của tế bào sau 14 ngày.

3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

3.3.2.1. Cỡ mẫu

Lượng mẫu đưa vào nuôi cấy trong hệ lên men là một trong những yếu

tố quan trọng có thể ảnh hưởng đến sự tích lũy sinh khối và các sản phẩm

trao đổi chất. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, cỡ mẫu nuôi cấy

ban đầu đã ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh trưởng của tế bào. Sau 14

ngày nuôi cấy, khả năng tích lũy sinh khối của tế bào tăng lên cùng với sự

62

tăng lượng mẫu nuôi cấy từ 100 đến 200 g tế bào và đạt cực đại là 514,64 g

tươi (47,97 g khô). Tuy nhiên, khi tăng lượng mẫu lên 250 g thì sinh trưởng

của tế bào bị ức chế do tăng mật độ tế bào, vì thế chỉ đạt 441 g tươi (38,89 g

khô) (Bảng 3.11).

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong

hệ lên men 10 L

Cỡ mẫu (g) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)

100 241,67c 22,28d

150 358,33bc 32,68c

200 514,67a 47,97a

250 441,00b 38,89b

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05

(Duncan’s test).

Lee và cs (2006) khi nuôi cấy huyền phù tế bào cây Gymnema sylvestre

cho thấy, cỡ mẫu ban đầu khoảng 60 g/L thích hợp cho sinh trưởng tế bào và tốc

độ sinh trưởng sẽ giảm nếu đưa vào nuôi cấy 80 hoặc 100 g/L [78]. Matsubara

và cs (1989) nghiên cứu ở cây Coptis japonica nhận thấy lượng tế bào nuôi cấy

ban đầu 8 g/L thích hợp cho sự tích lũy sinh khối [97].

3.3.2.2. Tốc độ khuấy

Khuấy trộn có tác dụng làm tăng tốc độ hòa tan của oxy và các chất

dinh dưỡng trong môi trường giúp tế bào sinh trưởng tốt hơn. Nghiên cứu của

chúng tôi cho thấy, khi tăng tốc độ khuấy từ 100 đến 150 vòng/phút thì sinh

khối tế bào cũng tăng theo và cực đại đạt là 561 g tươi (50,84 g khô). Tuy

nhiên, khi khuấy trộn trên 150 vòng/phút thì sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm

và chỉ đạt được 437 g tươi (37,42 g khô) ở 200 vòng/phút (Bảng 3.12).

63

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy

trong hệ lên men 10 L

Tốc độ khuấy (vòng/phút)

Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)

100 435,67c 38,19c

120 514,67bc 47,97b

150 561,00a 50,84a

180 547,33b 50,03a

200 437,00c 37,42c



Paek và cs (2005) cho rằng, trong quá trình nuôi cấy huyền phù, thủy lực

sinh ra do khuấy trộn cần phải nhỏ để không gây nguy hại cho mô hay tế bào

nhưng phải đủ lớn để kích thích các chức năng của chúng [116]. Nguyên nhân

của sự ức chế sinh trưởng tế bào khi nuôi ở tốc độ khuấy cao có thể là do các tế

bào bị phá vỡ cơ học và gây ra hiện tượng tự phân làm chết tế bào (Ziv, 2000)

[193]. Wang và cs (2010) khi nuôi cấy tế bào cây Glycyrrhiza inflata trong hệ

lên men đã nhận thấy sinh khối tế bào đạt cao nhất ở 150 vòng/phút; ở tốc độ

khuấy 100 và 300 vòng/phút, khả năng sinh trưởng của tế bào kém hơn [171].

Nghiên cứu của Choi và cs (2008) cho thấy, tốc độ khuấy 120 và 225 vòng/phút

đã tăng sinh khối tế bào của cây cọ dầu lên đến 200%, nhưng khi khuấy với tốc

độ 335 vòng/phút thì sinh khối tế bào chỉ tăng 7% [33].

3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí

Kết quả của chúng tôi cho thấy, tốc độ sục khí cũng ảnh hưởng lớn đến sinh

trưởng tế bào nghệ đen. Ở tốc độ sục khí 1,5-2,5 L/phút, sinh trưởng của tế bào tăng

dần và đạt cực đại với 603 g tươi (53,25 g khô). Nếu tốc độ sục khí tiếp tục tăng lên

từ 3-3,5 L/phút thì sinh trưởng của tế bào sẽ giảm. Ở tốc độ sục khí 3,5 L/phút, khối

lượng tươi của tế bào chỉ đạt 441 g (33,17 g khô) (Hình 3.9 và Bảng 3.13).

Hàm lượng oxy hòa tan tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sinh

trưởng của tế bào nuôi cấy, khi tốc độ sục khí tăng, tốc độ hòa tan của oxy sẽ

64

tăng. Tuy nhiên, sinh trưởng của tế bào không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với tốc

độ sục khí mà nó bị giới hạn trong một mức độ nhất định. Việc sục khí và khuấy

trộn không chỉ cung cấp oxy cho tế bào mà còn ngăn chặn sự đóng cặn sinh khối

tế bào. Tuy nhiên, nếu tốc độ sục khí và tốc độ khuấy quá cao sẽ làm cho tế bào

bị biến dạng và phá vỡ thành tế bào. Những tế bào khi vỡ sẽ giải phóng

polysaccharide tạo thành bọt, kết dính các mảnh vỡ tế bào lại với nhau và bám

lên thành bình nuôi hoặc tạo thành lớp váng trên bề mặt môi trường. Lớp này

ngăn cản sự lưu thông khí cần thiết gây ra sự thiếu không khí cho sinh trưởng tế

bào (Ziv 2000) [193]. Ngoài ra, khi váng bọt nổi lên trên môi trường sẽ cuốn

theo các tế bào làm cho các tế bào này không tiếp xúc với môi trường dinh

dưỡng và chết do thiếu hụt dinh dưỡng.

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy


Tốc độ sục khí (l/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)

1,5 489,67c 36,9b

2,0 561,00b 50,84a

2,5 603,00a 53,25a

3,0 583,33b 50,33a

3,5 441,00d 33,17b



Ảnh hưởng của sự sục khí trong hệ lên men lên tích lũy sinh khối tế bào

cũng đã được nghiên cứu ở nhiều loài thực vật. Lee và cs (2006) khi nuôi cấy tế

bào cây Gymnema sylvestre trong hệ lên men 2 L cho thấy, tốc độ sục khí 0,1

L/L/phút là thích hợp nhất [78]. Thanh và cs (2005) đã khảo sát ảnh hưởng của

nồng độ oxy (20,8-50%) đến sinh trưởng của tế bào cây nhân sâm nuôi cấy trong

hệ lên men 5 L. Kết quả cho thấy, nồng độ oxy 40% là thích hợp nhất cho sản

xuất sinh khối và chất ginsenoside, trong khi nồng độ oxy 20,8%, 30% và 50%

là không thích hợp cho sinh trưởng của tế bào [159]. Như vậy, nhu cầu oxy của

65

mỗi loài thực vật là không giống nhau và nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như

lượng mẫu nuôi cấy; tốc độ sinh trưởng; hoạt tính sinh lý của tế bào; điều kiện

môi trường xung quanh như nồng độ đường, các chất dinh dưỡng, và sự tích lũy

các sản phẩm độc của quá trình trao đổi chất tế bào.

0

10

20

30

40

50

60

0

100

200

300

400

500

600

700

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Khố

i lượ

ng k

hô tế

bào

(g)

Khố

i lượ

ng tươ

i tế

bào

(g)




Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men nuôi cấy trên môi

trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút;

sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 200 g

3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH

SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN

3.4.1. Hàm lượng tinh dầu

Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi trong hệ lên men 10 L được

trình bày ở bảng 3.14. Nhìn chung, hàm lượng tinh dầu (% khối lượng khô) của

tế bào tăng dần từ 2-14 ngày nuôi cấy và đạt giá trị cực đại là 2,57% cao hơn của

củ nghệ đen tự nhiên (1,61%) khoảng 1,6 lần (p<0,05). Hàm lượng tinh dầu tích

lũy trong tế bào giảm nhanh sau 16 đến 18 ngày; đặc biệt sau 18 ngày nuôi cấy,

hàm lượng tinh dầu chỉ còn 1,09% khối lượng khô. Điều này có thể giải thích là

do sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau khi đạt cực đại vào ngày thứ 14, tế bào

có pha sinh trưởng ổn định rất ngắn, sau đó tế bào bước nhanh vào pha suy vong

66

sau 16 đến 18 ngày nuôi cấy (Hình 3.9); lúc đó hiện tượng phân hủy (tự phân)

của tế bào diễn ra mạnh mẽ dẫn đến khả năng tích lũy tinh dầu trong tế bào cũng

giảm theo rất nhanh.

Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L

Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng tinh dầu (%)

2 1,41c

4 1,49c

6 1,57bc

8 1,98c

10 2,32b

12 2,42b

14 2,57a

16 1,68bc

18 1,09d

MTN 1,61c



MTN: củ của cây nghệ đen tự nhiên 01 năm tuổi

Nghiên cứu sự tích lũy tinh dầu trong tế bào thực vật nuôi cấy in vtro

cũng đã được nhiều tác giả công bố. Chẳng hạn, Figueiredo và cs (1995) nuôi

cấy tế bào cây Achillea millefolium L. ssp. mille đã thu được hàm lượng tinh dầu

0,002% cao gấp 2 lần tinh dầu có trong cây tự nhiên, và thành phần tinh dầu

cũng nhiều hơn. Nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây Origanum vulgare L.

cho thấy, sự tích lũy tinh dầu đạt 0,095% (trong callus) và 0,06% (tế bào nuôi

cấy huyền phù) cao hơn hàm lượng tinh dầu tích lũy trong tế bào của cây tự

nhiên (chỉ đạt 0,042%) (Arafeh và cs 2006).

Nghệ đen là cây thảo dược có chứa tinh dầu bao gồm các chất thuộc nhóm

sesquiterpene và monosesquiterpene [82]. Hàm lượng tinh dầu trong củ của cây

nghệ đen tự nhiên là 0,22% khối lượng tươi [1] hoặc xấp xỉ 1,5% khối lượng khô

67

[10]. Mau và cs (2003) nhận thấy, tinh dầu nghệ đen có hoạt tính tốt trong việc

quét gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl [100]. Nghiên cứu của Trần Thị

Việt Hoa và cs (2007) nhận thấy, tinh dầu nghệ đen trồng ở Đà Lạt, Việt Nam có

khả năng chống oxy hóa tương đối cao [3]. Với kết quả nghiên cứu này, chúng tôi

nhận thấy nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ đen là một phương thức triển vọng

trong việc thu hồi nguồn tinh dầu có giá trị cao từ loài thảo dược này.

3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số

Bảng 3.15 trình bày hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số

(% khối lượng khô) trong tế bào nghệ đen tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau.

Nhìn chung, hàm lượng polysaccharide tăng từ 2 - 10 ngày nuôi cấy và đạt cực

đại là 6,55% thấp hơn khoảng 1,4 lần so với củ nghệ đen (9,46%) (p<0,05). Hàm

lượng polysaccharide của tế bào giảm sau 12 ngày nuôi cấy và giảm rất nhanh

chỉ đạt khoảng 1,6-2,01% trọng lượng khô sau 16 đến 18 ngày.

Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số của tế bào nghệ

đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L

Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng polysaccharide (%)

2 1,73e

4 2,23d

6 3,53cd

8 5,15bc

10 6,55a

12 5,76b

14 4,53c

16 2,01d

18 1,60e

MTN 9,46g



MTN: củ của cây nghệ đen 01 năm tuổi

68

Trong những thập kỷ gần đây, các polysaccharide có nguồn từ thực vật đã

được chú ý đặc biệt trong lĩnh vực y sinh học bởi chúng có nhiều hoạt tính sinh

học tốt trong điều trị bệnh và không có tính độc (Schepetkin và cs 2006). Nuôi

cấy tế bào thực vật được xem là nguồn bổ sung có hiệu quả các sản phẩm tự

nhiên từ thực vật, bao gồm polysaccharide. Cho đến nay, có hơn 130 loài thực

vật đã được sử dụng trong nuôi cấy tế bào để sản xuất các polysaccharide có hoạt

tính sinh học (Mahmoudifar và cs 2000). Gunter và cs (2003) đã nghiên cứu nuôi

cấy tế bào cây Silene vulgaris nhằm sản xuất các polysaccharide [50]; Zhang và

Zhong (2002) cũng đã dùng hệ lên men CIB (thể tích 30 L) nuôi cấy huyền phù

tế bào cây tam thất để thu các chất hợp chất như saponin, polysaccharide với

hàm lượng đạt được lần lượt 1,7 và 2,9 g/L [186].

Nhiều nghiên cứu cho thấy, polysaccharide của các loài thuộc chi nghệ

như C. longa, C kwangsiensis, C. xanhthorrhiza có các hoạt tính quý: tăng

cường khả năng miễn dịch, ức chế khối u, chống oxi hóa…(Zeng và cs 2002;

Yuea và cs 2010). Ở cây nghệ đen, một số nghiên cứu cho thấy, các

polysaccharide của nó có khả năng ức chế sinh trưởng của tế bào khối u, ngăn

cản đột biến nhiễm sắc thể, kích thích chức năng của đại thực bào [75], [105],

[169]. Wang và cs (2004) đã tách chiết của củ nghệ đen tự nhiên bằng sắc ký cột

và xác định hàm lượng polysaccharide tổng số là 33,12% [169]. Kết quả nghiên

cứu của chúng tôi thì hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số của tế

bào nghệ đen nuôi cấy in vitro đạt 6,55% sinh khối khô, sau 10 ngày nuôi cấy là rất

có triển vọng trong sản xuất các polysaccharide có hoạt tính sinh học của nghệ đen

bằng con đường nuôi cấy tế bào.

3.4.3. Hàm lượng curcumin

Dựa trên kết quả nghiên cứu sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên

men 10 L, chúng tôi đã khảo sát sự tích lũy curcumin của chúng trong quá trình

nuôi cấy. Kết quả phân tích HPLC được trình bày ở các hình 3.10-3.12 và bảng

3.16. Phổ HPLC của curcumin chuẩn có 1 đỉnh (peak) duy nhất ở thời gian lưu là

69

2,05 phút. Một peak có thời gian lưu tương đương cũng được tìm thấy ở dịch

chiết của củ nghệ đen tự nhiên (2,08 phút) và tế bào nuôi cấy ở các thời gian

khác nhau từ 2-18 ngày (1,97-2,09 phút). Phân tích HPLC cũng nhận thấy, đây là

peak có diện tích lớn nhất trong phổ HPLC của tế bào in vitro cũng như củ nghệ

tự nhiên. Dựa vào phổ HPLC của curcumin chuẩn, có thể xác định rằng, thành

phần chính curcuminoid trong dịch chiết của tế bào nghê den nuôi cấy là

curcumin, giống trong củ nghệ đen tự nhiên.

Ngoài ra, phổ phân tích HPLC dịch chiết của củ nghệ đen tự nhiên còn có

thêm 2 peak khác, một peak có thời gian lưu như peak thứ hai ở tế bào nuôi cấy

(1,79 phút), peak còn lại có thời gian lưu là 1,21 phút. Dịch chiết tế bào nuôi cấy

có một peak thứ ba rất nhỏ với thời gian lưu khoảng 1,6 phút. Sự biến mất của

peak thứ ba 1,21 phút (ở dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên) trong tế bào in vitro có

thể là do sự chuyển hóa sinh học của curcuminoid đã xảy ra trong nuôi cấy tế bào.

Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L


Thời gian lưu (phút)

Diện tích peak (mAU)

Hàm lượng curcumin (%)

2 2,09 1909 0,44g

4 1,98 2226 0,52e

6 2,05 2285 0,53e

8 2,00 2442 0,56e

10 1,97 4244 0,98b

12 1,99 4448 1,03b

14 2,07 5034 1,16a

16 1,99 3631 0,84c

18 2,07 2573 0,60d

MTN 2,06 1868 0,43g




70

Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.16 cho thấy, hàm lượng curcumin (theo %

khối lượng khô) tích lũy trong tế bào tăng dần từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 14, đạt

cực đại là 1,16%, sau đó giảm từ ngày 16-18 cùng với sinh trưởng của tế bào

(Hình 3.9). Nhìn chung, hàm lượng curcumin trong tế bào ở các thời gian nuôi

cấy khác nhau đều cao hơn trong củ nghệ đen tự nhiên (0,43%), lúc cao nhất gấp

khoảng 2,7 lần.

Thông thường, các hợp chất thứ cấp tích lũy nhiều nhất vào cuối giai đoạn

sinh trưởng cực đại. Đã có những bằng chứng rõ ràng cho thấy có mối quan hệ

ngược giữa tốc độ sinh trưởng và khả năng sản xuất các chất thứ cấp. Khi tốc độ

sinh trưởng cao, các quá trình sơ cấp của tế bào là phân chia tế bào và sản xuất sinh

khối tế bào đã diễn ra mạnh mẽ. Ngược lại, trong pha tĩnh khi sự sinh trưởng giảm,

lúc này hoạt động sản xuất và tích lũy các chất thứ cấp mới tăng lên [7]. Nghiên cứu

quá trình sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi trong hệ lên men cho thấy, pha sinh

trưởng ổn định của tế bào rất ngắn, sau khi tế bào sinh trưởng cực đại thì sinh khối

giảm ngay (từ ngày thứ 14 đến 16) (Hình 3.9). Vì vậy, hàm lượng curcumin được tổng

hợp cao nhất vào cuối giai đoạn tế bào sinh trưởng cực đại (14 ngày) là hợp lý. Kết quả

này của chúng tôi cũng tương tự kết quả nghiên cứu khả năng sản xuất jaceosidin của

tế bào S. medusa. Hàm lượng jaceosidin và sinh khối tế bào đều đạt cực đại vào ngày

thứ 14 của quá trình nuôi cấy [189].

Ngoài ra, quá trình tích lũy các hợp chất thứ cấp không giống nhau giữa các

loài, không phải loài thực vật nào cũng tăng tích lũy các hợp chất thứ cấp khi sinh

trưởng của tế bào đi vào pha ổn định. Khi nuôi cấy tế bào T. cordifolia, Rao và cs

(2008) nhận thấy rằng trong khi khối lượng khô tế bào đạt cực đại (9,9 g/L) sau 36

ngày nuôi cấy, thì hàm lượng berberine trong tế bào lại thu được cao nhất vào ngày

24 trong pha log của tế bào [130]. Mặt khác, nhiều nghiên cứu cho thấy, tế bào

nuôi cấy huyền phù có khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp cao hơn so với cây

tự nhiên, chẳng hạn như tế bào in vitro của cây Solanum chrysotrichum có hàm

lượng sprirostanol saponin khoảng 14 mg/g, cao gấp 50 lần so với hàm lượng

71

của nó trong lá cây tự nhiên (Villarreal và cs 1997) [168], hoặc tế bào cây dừa

cạn nuôi cấy in vitro cũng có lượng vincristin cao hơn lá tự nhiên [5].

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, curcumin có khả năng chống

được sự phát sinh khối u; ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung

thư buồng trứng [55], [66], [152]; chống đông máu và hạ huyết áp; chống

viêm nhiễm, kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào [152]. Syu và cs (1998) nghiên

cứu đã nhận thấy, dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa curcumin,

demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [152]. Paramapojn và

Gritsanapan (2007) phân tích HPLC thành phần curcuminoid trong củ nghệ

đen của Thái Lan cho thấy, hàm lượng curcumin, demethoxycurcumin và

bisdemethoxycurcumin lần luợt từ 1,46% đến 5,73% w/w (trung bình 2,73%

w/w); từ 3,15% đến 10,98% w/w (7,37%) và từ 0,49% đến 2,99% w/w (1,40%

w/w) [119]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, curcumin tích lũy

trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro với hàm lượng khá cao (1,16%), điều

này có khả năng gợi ý tế bào nghệ đen in vitro có triển vọng là nguồn nguyên

liệu thích hợp để sản xuất curcumin, vì chỉ cần trong thời gian ngắn khoảng 2

tuần là đã có thể tạo được nguyên liệu sản xuất thay vì trong tự nhiên trồng

phải mất hàng năm mới có.

Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩn (0,5 mg/ml)

72

Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên

73

Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế

bào nghệ đen sau 2-18 ngày nuôi cấy


3.4.4. Xác định sesquiterpene

Sesquiterpennoid là các hợp chất C15 được tạo thành bởi liên kết của 3 đơn

vị isoprenoid. Chúng có mặt trong nhiều tổ chức sống bao gồm thực vật bật cao.

Khoảng 140 hợp chất sesquitertene khác nhau được tách chiết từ chi Curcuma và

được chia thành 10 nhóm cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, hầu hết các hợp chất

này nằm trong 3 nhóm chính là bisabolane, germacrane và guaiane.

74

Sự phân bố của sesquiterpene trong tế bào nghệ đen được phân tích bằng

HPLC. Kết quả cho thấy, sự hiện diện của các peak phân tách trong củ nghệ tự

nhiên nhiều hơn trong tế bào huyền phù (Hình 3.13). Nhìn chung, các peak có

thời gian lưu liên quan với các hợp chất sesquiterpene (được đánh số từ 1-9)

trong củ nghệ và tế bào huyền phù có chiều cao phổ hấp thụ (mAU) khác nhau,

đặc biệt là peak số 1 và 4 (Bảng 3.17). Chẳng hạn, peak số 1 (thời gian lưu 4,7

phút) có độ hấp thụ là 6,05 mAU trong củ nghệ nhưng chỉ đạt 2,55 mAU trong tế

bào huyền phù, ngược lại peak số 4 (thời gian lưu 7,5 phút) ở tế bào huyền phù

có độ hấp thụ là 7,33 mAU còn củ nghệ là 2,23 mAU. Một số peak hiện diện

trong củ nghệ (5-8) thì không có hoặc chỉ có ở dạng vết (< 1 mAU) trong tế bào

huyền phù. Tuy nhiên, ở tế bào huyền phù lại xuất hiện những peak mới (không

đánh số) với các thời gian lưu xấp xỉ 6,8; 7,8; 8,2 và 9,2 phút tương ứng với độ

hấp thụ 1,38-4,10; 5,62-7,54; 1,70-8,41 và 1,06-8,38 mAU. Kết quả này cho

thấy, trong quá trình nuôi cấy tế bào đã xuất hiện sự chuyển hóa sinh học của các

sesquiterpen, tạo ra những hợp chất sesquiterpen khác so với củ nghệ tự nhiên.

Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy

ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự nhiên

Hợp chất sesquiterpene (số)/thời gian lưu (phút) Thời gian nuôi cấy (ngày) 1/4,7 2/5,1 3/6,0 4/7,5 5/12,7 6/13,8 7/19,2 8/20,5 9/26,7

2 2,11 - 2,49 5,99 - vết vết vết -

4 1,93 - 2,23 5,76 - vết vết vết -

6 1,15 vết 2,81 3,17 - vết - - -

8 1,06 - 1,54 3,57 - - - - -

10 1,22 - 1,02 4,05 - vết vết - -

12 1,04 vết 2,14 3,29 - vết - vết -

14 2,55 1,59 - 7,33 - vết - vết -

16 1,58 - 3,82 4,04 - vết - - -

18 2,36 1,15 1,15 5,11 - vết - vết -

MTN 6,05 2,59 2,15 2,23 6,23 1,46 3,59 1,29 1,19


76

Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế bào

nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 đến18 ngày

Sakui và cs (1992) đã nuôi cấy tế bào callus nghệ đen hơn 2 năm để khảo

sát sự chuyển hóa sinh học của sesquiterpene và chứng minh có sự chuyển hóa

sesquiterpen mạch vòng thành viên số 10 thuộc nhóm germacrone thành

sesquiterpene thuộc nhóm guaiane. Chuyển hóa sinh học trong nuôi cấy in vitro

tế bào thực vật cũng đã được thông báo ở nhiều loài chẳng hạn, Sakamoto và cs

(1994) nuôi cấy tế bào của các cây Lonicera japonica, Bupleurum falcatum,

Polygonum tinctorium và Solidago altissima đã nhận thấy có sự chuyển hóa

germecrone thành guaiane, eudesmane và secoguaiane; Hashimoto và cs (1999)

nuôi cấy tế bào cây Heteroscyphus planus nhận thấy có sự chuyển hóa cubenene

thành 7-hydroxycalamene; Chuyển hóa geranyl acetate và linalyl acetate thành

geraniol, linalool, a-terpineol cũng đã xuất hiện trong nuôi cấy tế bào cây

Peganum harmala [192]. Như vậy, nuôi cấy tế bào thực vật được xem là một

phương thức hiệu quả sản xuất các hợp chất thứ cấp cũng như các chất chuyển hóa

của chúng (Rao và Ravishankar, 2002). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy

có sự tích lũy một số hợp chất sesquiterpene trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro

giống như trong củ nghệ tự nhiên, đồng thời trong tế bào cũng đã xuất hiện một số

sesquiterpene khác với củ tự nhiên (có thể do chuyển hóa sinh học); kết quả này có

thể gợi ý quan trọng trong sản xuất sesquiterpene cũng như các hợp chất thứ cấp

mới có hoạt tính sinh học quý thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen.

77

3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN

Kết quả trình bày ở bảng 3.18 cho thấy, tinh dầu tách chiết từ tế bào và

củ nghệ đen tự nhiên đều có khả năng ức chế sinh trưởng của cả 3 loài vi

khuẩn: Escherichi coli, Staphylococcus aureus và Bacills cereus. Nhìn chung,

tinh dầu thu được từ tế bào nghệ đen có khả năng kháng khuẩn cao nhất thể

hiện qua đường kính vòng ức chế (Hình 3.14). Tinh dầu tế bào nuôi cấy ức

chế mạnh nhất đối với S. aureus (đường kính vô khuẩn 31 mm), sau đó đến B.

cereus (22,33 mm) và kém nhất đối với E. coli (18,33 mm). Trong khi đó,

khả năng ức chế sinh trưởng của tinh dầu củ nghệ đen tự nhiên đối với B.

cereus và E. coli là tương đương nhau (16 mm và 17,67 mm), kém nhất là đối

với S. aureus chỉ đạt 14 mm.

Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen. A: E. coli ATCC 25922.

B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: đối chứng. TN: tinh dầu củ

nghệ đen tự nhiên. TB: tinh dầu của tế bào nghệ đen

78

Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen

Đường kính vòng vô khuẩn D-d (mm) Vi khuẩn

Đối chứng Tinh dầu tế bào Tinh dầu củ nghệ

B. cereus ATCC 11778 0 22,33b 16,00a

E. coli ATCC 25922 0 18,33b 17,67a

S. aureus ATCC 6538 0 31,00a 14,00a

Đối chứng: không có tinh dầu nghệ đen

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả, vi khuẩn Gram âm thường ít nhạy cảm

với hoạt tính của nhiều loại tinh dầu hơn vi khuẩn Gram dương (Dorman 2000;

Ruberto và cs 2000; Senatore và cs 2000; Tsigarida và cs 2000). Điều này có thể

do sự khác nhau về cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram âm và Gram

dương. Vi khuẩn Gram âm có lớp màng bao quanh thành tế bào, chính lớp này

đã ngăn cản sự khuếch tán của các hợp chất kỵ nước thông qua lớp chất

lipopolysaccharide (LPS). Ngược lại, các vi khuẩn Gram dương không có lớp

màng này nên tinh dầu có thể tiếp xúc trực tiếp với lớp LSP thành tế bào vi

khuẩn, do đó làm tăng khả năng thấm của các ion, sự thất thoát các hợp chất nội

bào hoặc làm suy yếu hệ thống enzyme của vi khuẩn (Cowan, 1999; Wendakoon

và Sakaguchi, 1995).

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, các hợp chất thu được từ tế bào thực vật

nuôi cấy in vitro có khả năng kháng các loại vi sinh vật. Kết quả nghiên cứu của

Paré và cs (1991) cho thấy, hợp chất aurone tách chiết từ tế bào cây

Cephalocereus senilis nuôi cấy huyền phù có khả năng ức chế sinh trưởng của

các vi khuẩn Gram âm. Robles-Zepeda và cs (2009) cũng nhận thấy, các chất

kháng vi sinh vật (phytoalexin) tách chiết từ tế bào cây xương rồng (Mamillaria

huitzilopochitli) nuôi cấy huyền phù có khả năng ức chế sinh trưởng của 8 loài

nấm gây bệnh ở thực vật.

Trên đối tượng cây nghệ đen, đã có một số công trình nghiên cứu khả

năng kháng khuẩn của tinh dầu, tuy nhiên việc khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

79

chủ yếu từ tinh dầu chiết rút ở củ nghệ đen ngoài tự nhiên. Srvidya và cs (2009)

nghiên cứu cho thấy, tinh dầu của củ nghệ đen ở Ấn Độ có tác dụng ức chế một

số vi khuẩn, trong đó tác dụng ức chế sinh trưởng mạnh đối với vi khuẩn B.

cereus nhưng tương đối với E. coli và S. aureus [149]. Wilson và cs (2005)

nghiên cứu tính kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen tự nhiên ở Nam Ấn Độ cũng

cho thấy, nó ức chế sinh trưởng nhiều loài vi sinh vật nhưng không ức chế S.

aureus và E. coli [176]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, tinh dầu thu

được từ tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro có khả năng ức chế sinh trưởng của cả

3 loài vi khuẩn kiểm định là S. aureus, B. cereus và E. coli.

80

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

KẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả thu được, chúng tôi rút ra những kết luận sau đây:

1. Môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung thêm BA

0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L thích hợp cho nuôi cấy callus từ bẹ lá cây nghệ đen

in vitro. Callus được tạo thành có màu có màu vàng, rắn và rời rạc được dùng

làm nguyên liệu để thiết lập nuôi cấy huyền phù.tế bào.

2. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L

và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế

bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml. Sinh khối đạt cực đại là 10,44 g tươi

(0,66 g) sau 14 ngày khi nuôi cấy với cỡ mẫu là 3 g.

3. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5

mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí 2,5

L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L.

Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô) sau 14 ngày nuôi cấy với

cỡ mẫu là 200 g.

4. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt cao nhất là 2,57% khối lượng khô

sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh dầu ở củ cây nghệ đen tự nhiên 1

năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế bào đạt cao nhất là 1,16% sau 14 ngày

nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin ở củ cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi.

Đã có chuyển hóa sinh học curcuminoid trong nuôi cấy tế bào. Hàm lượng

polysaccharide trong tế bào cao nhất là 6,55% khối lượng khô sau 10 ngày nuôi

cấy, thấp hơn ở củ nghệ tự nhiên khoảng 1,4 lần. Có sự tích lũy các hợp chất

sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy. Thành phần sesquiterpene hiện diện trong tế

bào huyền phù ít hơn so với củ cây nghệ 1 năm tuổi. Trong tế bào có 3-4 peak

của sesquiterpene giống như tế bào củ nghệ. Đã có chuyển hóa sinh học

sesquiterpene trong nuôi cấy tế bào.

81

5. Tinh dầu tế bào cây nghệ đen có khả năng ức chế mạnh sinh trưởng

của 3 chủng vi khuẩn B. cereus ATCC 11778 (đường kính vô khuẩn 31 mm),

S. aureus ATCC 6538 (22,33 mm) và E. coli ATCC 25922 (18,33 mm). Nhìn

chung, khả năng kháng khuẩn của tinh dầu thu hồi từ tế bào nuôi cấy in vitro

khá cao.

ĐỀ NGHỊ

1. Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy các hoạt chất sinh học trong tế

bào nghệ đen.

2. Nghiên cứu thành phần và hoạt tính của curcuminoid, sesquiterpenes,

polysaccharides được sản xuất từ tế bào nghệ đen.

82

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Nguyen Hoang Loc, Vo Chau Tuan, Doan Huu Nhat Binh, Truong Thi

Bich Phuong, Tae-Geum Kim and Moon-Sik Yang (2009), “Accumulation of

sesquiterpenes and polysaccharides in cells of zedoary (Curcuma zedoaria

Roscoe) cultured in a 10 L bioreactor”, Biotechnology and Bioprocess

Engineering 14, pp. 619-624.

2. Võ Châu Tuấn, Nguyễn Hoàng Lộc (2010), “Sản xuất curcumin từ tế

bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) nuôi cấy trong hệ lên men 10 L”, Tạp

chí Công nghệ Sinh học, 8(3B), tr. 1459-1464.

3. Nguyễn Thị Phúc Lộc, Võ Châu Tuấn, Nguyễn Hoàng Lộc (2010),

“Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu chiết xuất từ tế bào nghệ đen

(Curcuma zedoaria Roscoe) nuôi cấy trong hệ lên men 10 L”, Tạp chí Công

nghệ Sinh học 8(3B), pp. 1465-1471.

4. Vo Chau Tuan, Vu Duc Hoang, Nguyen Hoang Loc (2011), “Cell

suspension culture of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe)”, VNU Journal of

Science, Natural Sciences and Technology 27, pp. 64-70.

83

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Lê Quý Bảo (2004), “Các cấu tử dễ bay hơi của thân rễ Nga truật (Curcuma

zedoaria Roscoe) trồng ở tỉnh Nghệ An và Hà Tĩnh”, Tạp chí Dược học

343, tr. 9-11.

2. Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hưng, Phan Tống Sơn (1997), “Đóng góp vào

việc nghiên cứu các sesquiterpenoid trong thân rễ nghệ đen (Curcuma

zedoaria Roscoe)”, Tạp chí Hóa học và Công nghiệp Hóa chất 4, tr. 9-11.

3. Trần Thị Việt Hoa, Trần Thị Phương Thảo, Vũ Thị Thanh Tâm (2007),

”Thành phần hóa học và tính kháng oxy hóa của nghệ đen (Curcuma

zedoaria) trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Phát triển KH&CN 10(4), tr. 37-47.

4. Vũ Văn Hợp, Vũ Xuân Phương (2003), “Các loài chứa alkaloid trong họ Cà

(Solanaceae Juss.) ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 25(4), tr. 27-31.

5. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006). “Ảnh hưởng của chất điều hòa

tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù

tế bào dừa cạn (Catharanthus rouse)”, Tạp chí Phát triển KH &CN 9,

tr. 59-66.

6. Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai (2007), “Bước đầu nghiên cứu sự tạo

dịch treo tế bào cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa Harms)”, Tạp chí

phát triển KH &CN 10(7), tr. 11-16.

7. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình Công nghệ tế bào, Nxb Đại học

Huế.

8. Nguyễn Hoàng Lộc, Đoàn Hữu Nhật Bình, Phan Đức Lâm, Phan Thị Á

Kim, Trương Thị Bích Phượng (2008), “Nghiên cứu khả năng tích lũy

asiaticoside trong mô sẹo rau má (Centella asiatica (L.) Urban)”, Tạp

chí Công nghệ sinh học 6(4B), 873-881.

84

9. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, Hà

Nội.

10. Lã Đình Mỡi, Lưu Đàm Cư (2002), Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt

Nam, Tập 2, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 245-250.

11. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn

Khiêm, Lê Thị Xuân (2007), “Nuôi cấy tế bào và phục hồi mô sẹo từ

huyền phù tế bào cây thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiaana Zucc.)”,

Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2), tr. 205-215.

12. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn

Minh, NguyễnThị Phương Thảo (2009), Cơ sở công nghệ sinh học-

Công nghệ sinh học tế bào, Tập 3, Nxb. Giáo dục, Hà Nội.

13. Lê Thị Hà Thanh, Đoàn Hữu Nhật Bình, Nguyễn Hoàng Lộc (2009), “Sản

xuất glycoalkaloid từ tế bào cây cà gai leo (Solanum hainanense

Hance)”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Nxb. Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 697-700.

14. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và

ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.

15. Nguyễn Bích Thu, Phạm Kim Mãn (2000), “Nghiên cứu phương pháp

định lượng glycoalkaloid trong cây cà gai leo (Solanum hainanense

Hance) bằng phương pháp acid màu”, Tạp chí Dược liệu 5(4), tr.

104-108.

16. Lê Thị Thủy Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng (2006), “Tạo mô

sẹo và dịch huyền phù tế bào có khả năng snả xuất taxol từ lá và thân

non cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc.”, Tạp chí Công nghệ Sinh

học 4(2), tr. 221-226.

17. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nxb Giáo dục, Hà Nội.

85

Tiếng Anh

18. Anisuzzaman M., Sharmin A., Mondal S.C., Sultana R., Khalekuzzâmn M.,

Alam I., Alam M.F. (2008), “In vitro microrhizome in Curcuma

zedoaria (Christm.) Roscoe-a conservation prioritized medicinal plant”,

Biological Sciences 8(7), pp. 1216-1220.

19. Arnason J.T., Mata R., Romeo J.T. (1995), Phytochemistry of medicinal

plants, Plenum Press, New York.

20. Aslam J., Mujib A., Nasim S.A., Sharma M.P. (2009), “Screening of

vincristine yield in ex vitro and in vitro somatic embryos derived

plantlets of Catharanthus roseus L. (G) Don.”, Sci Hort 119, pp. 325-

329.

21. Bharalee R., Das A., Kalita M.C. (2005), In vitro clonal propagation of

Curcuma caesia Roxb and Curcuma zedoaria Rosc. from rhizome bud

explants”, Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 14, pp. 61-63.

22. Bouque V., Bourgaud F., Nguyen C., Guckert A. (1998), “Production of

daidzein by callus cultures of Psoralea species and comparison with

plants”, Plant Cell Tissue and Organ Culture 53, pp. 35-40.

23. Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier E. (2001), “Production of plant

secondary metabolites: a historical perspective”, Plant Science 161, pp.

839-851.

24. Bu’lok J., Kristiansen B. (1987), Basic Biotechnology, Academic Press,

London, pp. 525-544.

25. Bugno1 A., Nicoletti M.A., Almodóvar A.A.B., Pereira T.C., Auricchio

M.T. (2007), “Antimicrobial efficacy of Curcuma zedoaria extract

as assessed by regression compared with comercial mouthrinses

mouthrises”, Brazilian Journal of Microbiology 38, pp. 440-445.

86

26. Canter P.H., Thomas H., Ernst E. (2005), “Bringing medicinal plants into

cultivation: opportunities and challenges for biotechnology”, Trends

Biotechnol 23, pp. 180-185.

27. Carvalho F.R., Vassão R.C., Nicoletti M.A., Maria D.A. (2010), “Effect of

Curcuma zedoaria crude extract against tumor progression and

immunomodulation”, Venom Anim Toxins incl Trop Dis 16, pp. 324-341.

28. Champakaew D., Choochote W., Pongpaibul Y., Chaithong U., Jitpakdi A.,

Tuetun B., Pitasawat B. (2007), “Larvicidal efficacy and biological

stability of a botanical natural product, zedoary oilimpregnated sand

granules, against Aedes aegypti”, Parasitol Res 100, pp. 729-737.

29. Chan L.K., Thong W.H. (2004), “In vitro propagation of Zingiberaceae

species with medicinal properties”, plant Biotechnol 6, pp. 181-188.

30. Chaplin M.F., Kennedy J.F. (1994), Carbohydrate analysis. A practical

approach, 2nd ed., Oxford University Press, Oxford, UK., pp. 143-204.

31. Chattopadhyay S., Farkya S., Srivastava A.K., Bisaria V.S. (2002),

“Bioprocess considerations for production of secondary metabolites by

plant cell suspension cultures”, Biotechnol Bioprocess Eng 7, pp. 138-149.

32. Chena W., Lua Y., Gao M., Wua J., Wanga A., Shic R. (2010),

“Antiangiogenesis effect of essential oil from Curcuma zedoaria in

vitro and in vivo”, Ethnopharmacology Doi:10.1016/j.jep.2010.09.031.

33. Choi D.S., Andrade M.H.C., Willis L.B., Cho C., Schoenheit J., Boccazzi

P., Sambanthamurthi R., Sinskey A.J., Rha C. (2008), “Effect of

agitation and aeration on yield optimization of oil palm suspension

culture”, Journal of Oil palm Research Special Issue on Malaysia-MIT

Biotechnology Partnership Programme, 1, pp. 23-34.

34. Christen A.A., Bland J., Gibson G.M. (1989), “Cell cultures as a means to

produce taxol”, Proc Am Assoc Cancer Res 30, pp. 566.

87

35. Davey M.R., Anthony P. (2010), Plant Cell Culture, John Wiley & Sons,

Ltd.

36. Duke J.A. (2003), CRC Handbook of Medicinal Spices, CRC Press, Boca

Raton, USA.

37. Eibl R., Werner S., Eibl D. (2009), “Bag bioreactor based on wave induced

motion: characteristics and applications” Adv Biochem Eng Biotechno

115, pp. 55-87.

38. Eibl R., Eibl D. (2002), “Bioreactors for plant cell and tissue cultures”, In:

Oksman-Caldentey K-M, Barz W (eds) Plant biotechnology and

transgenic plants, Marcel Dekker, New York, pp 165-199.

39. Eibl R., Eibl D. (2006), In Plant Tissue Culture Engineering. Focus on

Biotechnology, vol 6, Springer Berlin-Heidelberg-New York, pp. 203-227.

40. Eibl R., Eibl D. (2008), “Design of bioreactors suitable for plant cell and

tissue culture”, Phytochem Rev 7, pp. 593-598.

41. Fett-Neto A.G., Pennington J.J., DiCosmo F. (1995), “Effect of white light

on taxol and baccatin III accumulation in cell cultures of Taxus

cuspidata Sieb and Zucc.”, Plant Physiol 146, pp. 584-590.

42. Fett-Neto A.G., Zhang W.Y., DiCosmo F. (1994), “Kinetics of taxol

production, growth and nutrient uptake in cell suspensions of Taxus

cuspidate”, Biotechnology and Bioengineering 44, pp 205-210.

43. Ficker C.E., Smith M.L., Susiarti S., Leaman D.J., Irawati C., Arnason J.T.

(2003), “Inhibition of human pathogenic fungi by members of

Zingiberaceae used by the Kenyah (Indonesian Borneo)”,

Ethnopharmacol 85, pp. 289-293.

44. Fulzele D.P. (2000), Bioreactor technology for large scale cultivation of

plant cell suspension cultures and production of bioactive compounds,

BARC Newsletter.

88

45. Furuya T. (1988), Saponins (ginseng saponins). Cell cultures and somatie cell

genetics of plants, vol 5, Academic Press, San Diego, CA, pp. 213-234.

46. Garg S.N., Naquvi A.A., Bansal R.P., Bahl J.R., Kumar S. (2005),

“Chemical composition of the essential oil from the leaves of Curcuma

zedoaria Rosc. of Indian origin”, Essent Oil Res 17, pp. 29-31.

47. Gautam P.L., Raina R., Srivastava U., Raychaudhuri S.P., Singh B.B.

(1998), Prospects of medicinal plants, Indian Society of Plant Genetic

Resources, NBPGR, New Delhi.

48. Georgiev M.I., Weber J., Maciuk A. (2009), “Bioprocessing of plant cell

cultures for mass production of targeted compounds”, Appl Microbiol

Biotechnol 83, pp. 809-823.

49. Gou Y., Zhang Z. (2005), “Establishment and plant regeneration of somatic

embryogenic cell suspension cultures of Zingiber officinale Rosc.”,

Scientia Horticulturae, 107, pp. 90-96.

50. Gunter E. A., Ovodo Y. S. (2003), “Production of polysaccharides by Silene

vugaris callus culture depending on carbohydrate of the medium”,

Nauka Interperiodica 68(6), pp. 882-889.

51. Guirib-Fakim A. (2006), “Medicinal plants: Tradition of yesterday and

drugs of tomorrow”, Mol Aspects Med 27(1), pp. 1-93.

52. Gupta S.D., Ibaraki Y. (2006), Plant Tissue Culture Engineering, Springer,

Printed in the Netherlands.

53. Haas C., Weber J., Ludwig-Mueller J., Deponte S., Bley T., Georgiev M.

(2008), “Flow cytometry and phytochemical analysis of a sunflower cell

suspension culture in a 5-L bioreactor”, Z Naturforsch 63, pp. 699-705.

54. Halina S.L., Leslaw P. (2003), “The effect of carbohydrate source on the

development of Brassica napus L. immature embryos in vitro”, ACTA

Biologica Cracoviensia Series Botanica 45(2), pp. 83-190.

89

55. Hanif R., Qiao L., Shiff S.J., Rigas B, (1997), “Curcumin, a natural plant

phenolic food additive, inhibits cell proliferation and induces cell cycle

changes in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandin-

independent pathway”, Lab Clin Med 130(6), pp. 576-584.

56. Hara M., Kitamura T., Fukui H., Tabata M. (1993), “Induction of berberine

biosynthesis by cytokinins in Thalictrum minus cell suspension

cultures”, Plant Cell Reports 12, pp. 70-73.

57. Hara M., Kobayashi Y., Fukui H., Tabata M. (1991), “Enhancement of

berberine production by spermidine in Thalictrum minus cell

suspension cultures”, Plant Cell Rep 10, pp. 494-497.

58. Hong C.H., Hur S.K., Oh O.J., Kim S.S., Nam K.A., Lee S.K. (2002),

“Evaluation of natural products on inhibition of inducible

cyclooxygenase (COX-2) and nitric oxide synthase (iNOS) in cultured

mouse macrophage cells”, Ethnopharmacol 83, pp. 153-159.

59. Hong H.C., Noh M.S., Lee W.Y., Lee S.K. (2002), “Inhibitory effects of

natural sesquiterpenoids isolated from the rhizome of Curcuma

zedoaria on prostaglandin E2 and nitric oxide production”, Planta

Medica 68, pp. 545-547.

60. Hu W.W., Yao H.U., Zhong J.J. (2001), “Improvement of Panax

notoginseng cell cultures for production of ginseng saponin and

polysaccharide by high-density cultivation of pneumatically agitated

bioreactors”, Biotechnol Prog 17, pp. 838-846.

61. Hu Z.B., Alfermann A.W. (1993), “Diterpenoid production in hairy root

cultures of Salvia miltiorrhiza”, Phytochemistry 32, pp. 699-703.

62. Huang S.H., Shen Y.W., Chan H.S. (2002), “Development of bioreactor

operation strategy for L-DOPA production using Stizolobium hassjoo

suspension culture”, Enzyme Microb Technol 30, pp. 779-791.

90

63. Jang M.K., Sohn D.H., Ryu J.H. (2001), “A curcuminoid and

sesquiterpenes as inhibitors of macrophage TNF-alpha release from

Curcuma zedoaria”, Planta Med 67(6), pp. 550-552.

64. Jang M.K., Sohn D.H., Ryu J.H. (2004), “A curcuminoid and two

sesquiterpenoids from Curcuma zedoaria as inhibitors of nitric oxide

synthesis in activated macrophages”, Arch. Pharm. Res. 27, pp. 1220-1225.

65. Jennewein S., Park H., Dejong J.M., Long R.M., Bollon A.P., Croteau RB

(2005), “Coexpression in yeast of Taxus cytochrome P450 reductase

with cytochrome P450 oxygenases involved in taxol biosynthesis”,

Biotechnol Bioeng 89, pp. 588-598.

66. Jiang M.C., Yang-Yen H.F., Yen J.J., Lin J.K. (1996), “Curcumin induces

apoptosis in immortalized NIH 3T3 and malignant cancer cell lines”,

Nutr Cancer 26(1), pp. 111-120.

67. Joshi S., Singh A.K., Dhar D.N. (1989), “Isolation and structure elucidation

of potential active principle of Curcuma zedoaria rhizomes”, Herba

Hung 28(1), pp. 95-98.

68. Joy P.P., Thomas J., Mathew S., Skari B.P. (1998), Medicinal Plants:

Tropical Horticulture, Calcutta, India: Naya Prakash.

69. Kadkade P.G. (1982), “Growth and podophyllotoxin production in callus

tissues of Podophyllum peltatum”, Plant Sci Lett 25, pp. 107-115.

70. Kaul B., Stohs S.J. Staba E.J. (1969), “Dioscorea tissue cultures. Influence

of various factors on diosgenin production by Dioscorea deltoidea

callus and suspension cultures”, Lloydia 32, pp. 347-359.

71. Ketchum R.E.B., Rithner C.D., Qiu D., Kim Y.S., Williams R.M., Croteau

R.B. (2003), “Taxus metabolites: methyl jasmonates preferentially

induces production of taxoids oxygenated at C-13 in Taxus media cell

cultures”, Phytochemistry 62, pp. 901-909.

91

72. Kieran P. (2001), “Bioreactor design for plant cell suspension cultures”, In:

Cabral JMS (ed) Principles of multiphase reactor design, Harwood

Academic Publishers, New Jersey, pp 391-426.

73. Kim D.I., Lee T.K., Jang T.H., Kim C.H. (2005), “The inhibitory effect of

a Korean herbal medicine, Zedoariae rhizoma, on growth of cultured

human hepatic myofibroblast cells”, Life Sci 77(8), pp. 890-906.

74. Kim J.H., Yun J.H., Hwang Y.S., Byun S.Y., Kim D.I. (1995), “Production

of taxol and related taxanes in Taxus brevifolia cell cultures: effect of

sugar”, Biotechnol Lett 17, pp. 101-106.

75. Kim K.I., Kim J,W, (2000), “Antitumor, genotoxicity and anticlastogenic

activitives of polysaccharide from Curcuma zedoaria”, Mol Cells

10(4), pp. 392-398.

76. Kobayashi Y., Fukui H., Tabata M. (1991), “Effect of carbon dioxide and

ethylene on berberine production and cell browning in Thalictrum

minus cell cultures”, Plant Cell Rep 9, 496-499.

77. Leathers R.R., Smith M.A.L., Christie A.J. (1995), “Automation of the

bioreactor process for mass propagation and secondary metabolism”,

In: Christie JA, Kozai T & Smith ML (eds). Automation and

Environmental Control in Plant Tissue Culture, Kluwer Academic

Publishers, Dordrecht, pp. 187–214.

78. Lee E.J., Mobin M., Hahn E.J., Paek K.Y. (2006), “Effects of sucrose,

inoculum density, auxin, and aeretion volume on cell grow of Gymnema

sylvestre”, Plant Biology 49 (6), pp. 427-431.

79. Lee J.M. (2001), Biochemical Engineering, Prentice Hall, Inc. USA.

80. Lee S.K., Hong C.H., Huh S.K., Kim S.S., Oh O.J., Min H.Y., Park K.K.,

Chung W.Y., Hwang J.K. (2002), “Suppressive effect of natural

sesquiterpenoids on inducible cyclooxygenase (COX-2) anf nitric oxide

synthase (iNOS) activity in mouse marcrophage cells”, Environ Pathol

Toxicol Oncol 21(2), pp. 141-148.

92

81. Lehrer R.I., Rosnman M., Harwig S.S., Jackson R., Eisenhauer P. (1991),

“Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides”,

Immunol Methods 137, pp. 167-173.

82. Leonel M., Sarmento S.B.S., Cereda M.P. (2003), “New starches for the

food industry: Curcuma longa and Curcuma zedoaria”, Carbohydrate

Polymers 54, pp. 385-388.

83. Li X.L., Zhou A.G. (2007), “Preparation of polysaccharides from

Acanthopanax senticosus and its inhibition against irradiation-induced

injury of rat”, Carbohydr Poly-mers 67, pp. 219-226.

84. Ling O.S., Kiong A.L.P., Hussein S. (2008), “Establishment and

optimisation of growth parameters for cell suspension cultures of Ficus

deltoidea”, American-Eurasian Journal of Sustainable Agriculture,

2(1), pp. 38-49.

85. Linsmaier E.M, Skoog F. (1965), “Organic growth factor requirements of

tobacco tissue cultures”, Physiol Plant 18, pp. 100-127.

86. Lipksy A.K.H. (1992), “Problems of optimisation of plant cell culture

processes”, Biotechnol 26, pp. 83-97.

87. Loc N.H., An N.T.T. (2010), “Asiaticoside production from cell culture of

centella (Centella asiatica L. Urban)”, Biotechnol Bioprocess Eng

(accepted).

88. Loc N.H., Anh N.H.T., Binh D.H.N., Yang M.S., Kim T.G. (2010),

“Production of glycoalkaloids from callus cultures of Solanum

hainanense Hance”, Plant Biotechnol 37, pp. 96-101.

89. Loc N.H., Diem D.T.H., Binh D.H.N., Huong D.T., Kim T.G., Yang M.S.

(2008), “Isolation and characterization of antioxidation enzymes from

cells of Zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe) cultured in a 5 l

bioreactor”, Mol Biotechnol 38, pp. 81-87.

93

90. Loc N.H., Duc D.T., Kwon T.H., Yang M.S. (2005), “Micropropagation of

zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe)-a valuable medicinal plant”, Plant

Cell, Tissue and Organ Culture 81, pp.119-122.

91. Loc N.H., Duc D.T., Kwon T.H., Yang M.S. (2005), “Micropropagation of

zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe)-a valuable medicinal plant”, Plant

Cell Tiss Organ Cult 81, pp.119-122.

92. Long R.M., Croteau R. (2005), “Preliminary assessment of the C13- side

chain 2’-hydroxylase involved in taxol biosynthesis”, Biochem Biophys

Res Commun 338, pp. 410-417.

93. Loyola-Vargas V.M., Vázquez-Flota F. (2006), Plant Cell Culture

Protocols, Humana Press Inc., USA.

94. Makabe H., Maru N., Kuwabara A., Kamo T., Hirota M. (2006), “Anti-

inflammatory sesquiterpenes from Curcuma zedoaria”, Nat Prod Res

20, pp. 680-686.

95. Manzan ACCM, Fabio ST, Eliane B, Nanci PP (2003) Extraction of

essential oil and pigments from Curcuma longa L, by steam

distillation and extraction with volatile solvents. J Agricult Food

Chem 51: 6802-6807.

96. Masuda T., Jitoe A., Isobe J., Nakatani N., Yonemori S. (1993),

“Antioxidative and anti-inflammatory curcumin-related phenolics from

rhizomes of Curcuma domestica”, Phytochemistry 32, pp. 1557-1560.

97. Matsubara K., Kitani S., Yoshioka T., Morimoto T., Fujita Y., Yamada Y.

(1989), “High density culture of Coptis japonica cells in creases

berberine production”, Chem Tech Biotechnol 46, pp. 61-69.

98. Matsuda H., Morikawa T., Toguchida I., Ninomiya K., Yoshikawa M.

(2001c), “Inhibitors of nitric oxide production and new sesquiterpenes,

zedoarofuran, 4-epicurcumenol, neocurcumenol, gajutsulactones A, and

B, zedoarolodes A and B, from Zedoariae rhizoma”, Chem Pharma

Bull 49, pp. 1558-1566.

94

99. Matsuda H., Ninomiya K., Morikawa T., Yoshikawa M. (1998), “Inhibitory

effect and action mechanism of sesquiterpenes from zedoariae rhizoma

on D–galactosamine/lipopolysaccharide -induced liver injury”, Bioorg

Med Chem Lett 8, pp. 339-344.

100. Mau J.L., Eric Y.C.L., Nai-Phon Wang, Chien-Chou C., Chi-Huarng C.,

Charng-Cherng (2003), “Composition and antioxidant activity of the

essential oil from Curcuma zedoaria”, Food Chem 82, pp. 583-591.

101. Mello M.O., Dias C.T.S., Amaral A.F.C., Melo M. (2001a), “Growth of

Bauhinia forficata Link, Curcuma zedoaria Roscoe and Phaseolus

vulgaris L. cell suspension cultures with carbon sources”, Scientia

Agricola 58, pp. 481-485.

102. Mello M.O., Melo M., Appezzato-da-Glória B. (2001b), “Histological

analysis of the callogenesis and organogenesis from root segments of

Curcuma zedoaria Roscoe”, Brazilian Archives of Biology and

Technology 44(2), pp. 197-203.

103. Miachir J.I., Romani V.L.M., de Campos Amaral A.F., Mello M.O.,

Crocomo O.J., Melo M. (2004), “Micropropagation and callogenesis of

Curcuma zedoaria Roscoe”, Sci Agric (Piracicaba, Braz) 61(4), pp.

427-432.

104. Misawa M. (1994), Plant tissue culture: An alternative for production of

useful metabolite, FAO Agricultural Services Bulletin.

105. Moon C.K., Park K.S., Lee S.H., Yoon Y.P. (1985), “Antitumor activities

of several phytopolysaccharides”, Archives of Pharmacal Research

8(1), pp. 42-44.

106. Mulabagal V., Tsay H.S. (2004), “Plant cell cultures- an alternative and

efficient source for the production of biologically important secondary

metabolites”, International Journal of Applied Science and Engineering

2(1), pp. 29-48.

95

107. Murashige T., Skoog F. (1962), “A revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures”, Physiol Plant 15, pp. 473-497.

108. Nadkarni K.M. (1999), Indian Materia Medica, 3rd edn, Mumbai, India:

Popular Prakashan Private Limited.

109. Nagella P., Murthy H.N. (2010), “Establishment of cell suspension cultures

of Withania somnifera for the production of withanolide A”, Bioresour

Technol., 101(17), pp. 6735-9.

110. Nakanishi T., Miyasaka H., Nasu M., Hashimoto H., Yoneda K. (1983),

“Production of cryptotanshinone and feruginol in cultured cells of

Salvia miltiorrhiza”, Phytochemistry 22, pp. 721-722,

111. Narayanaswany S. (1994), Plant cell and tissue culture, McGraw-Hill

Publishing Company, New Dehli.

112. Nhut D.T., Tram N.T., Don N.T. (2006), “Effect of sucrose, glucose and

fructose in proliferration of Hymalaya Yew (Taxus wallichiana Zucc.)

cell suspesion cultures -a potetial source for taxol production”, Pro Int

Workshop Biotechnology in Agricut, Nong Lam University, Ho Chi

Minh city, Vietnam, pp. 142-145.

113. Oksman-Caldentey K.M., Inze D. (2004), “Plant cell factories in the post

genomic era: new ways to produce designer secondary metabolites”,

Trends Plant Sci 9, pp. 433-440.

114. Omar R., Abdullah M.A., Hasan M.A., Marziah M. (2004), “Development

of growth medium for Centenlla asiatica cell culture via response

surface methodology”, American Applied Sciences, 1(3), pp. 215-219.

115. Padmanabha B.V., Chandrashekar M., Ramesha B.T., Hombe G.H.C.,

Rajesh P.G., Suhas S., Vasudeva R., Ganeshaiah K.N., Shaanker R.

(2006), “Patterns of accumulation of camptothecin, an anti-cancer

alkaloid in Nothapodytes nimmoniana Graham, in the Western Ghats,

India. Implications for identifying high-yielding sources of the

alkaloid”, Curr Sci 90, pp. 95-100.

96

116. Paek K.Y., Chakrabarty D., Hahn E.J. (2005), “Application of bioreactor

systems for large scale production of horticultural and medicinal

plants”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 81, pp. 287-300.

117. Palazon J., Moyano E., Bonfill M., Cusido R.M., Pinol M.T. (2006), In

floriculture, ornamental and plant biotechnology. Advances and topical

issues, Global Science Books, Ltd: London, UK, pp. 209-221.

118. Pamplona C.R., de Souza M.M., da Silva Machado M., Cechinel Filho V.,

Navarro D., Yunes R.A., Monache F.D., Niero R. (2006), “Seasonal

variation and analgesic properties of different parts from Curcuma

zedoaria Roscoe (Zingiberaceae) grown in Brazil”, Z Naturforsch 61,

pp. 6-10.

119. Paramapojn S., Gritsanapan W. (2007), “Variation of curcuminoids in

ethanolic extract of Curcuma zedoaria rhizomes in Thailand by HPLC”,

Planta Med 73, pp. 797-1034.

120. Paramapojn S., Gritsanapan W. (2009), “Free radical scavenging activity

determination and quantitative analysis of curcuminoids in Curcuma

zedoaria”, Current Science 97(7), pp. 1069-1073.

121. Parc G., Canaguier A., Hocquemiller R., Chriqui D., Meyer M. (2002),

“Production of taxoids with biological activity by plants and callus

cultures from selected Taxus genotypes”, Phytochemistry 59, pp. 725-730.

122. Paszty C., Lurquin P.F. (1987), “Improved plant protoplast plating/selection

technique for quantitation of transformation”, Bio Techniques 5, pp.

716-718.

123. Payne G., Bringi V., Prince C., Shuler M. (1991), Plant cell and tissue

culture in liquid systems, Hanser Publishers, Munich.

124. Philip K., Malek S.N.A., Sani W., Shin S.K., Kumar S.A., Lai H.S., Serm

L.G., Rahman S.N.S.A. (2009), “Antimicrobial activity of some

medicinal plants from Malaysia”, American Journal of Applied Sciences

6(8), pp. 1613-1617.

97

125. Prakash G., Srivastava A.K. (2007), “Azadirachtin production in stirred

tank reactors by Azadirachta indica suspension culture”, Process

Biochem 42, pp. 93-97.

126. Priosoeryanto B.P., Sumarny R., Rahmadini Y., Nainggolan G.R.M.,

Andany S. (2001), “Growth inhibition effect of plants extract

(Mussaenda pubescens and Curcuma zedoaria) on tumour cell lines in

vitro”, Proceeding of the 2nd SEAG, South East Asian Germany Alumni-

Network, Los Barios, The Philippines on August, pp. 27-31.

127. Raghuveer Gupta PS, Ali MM., Eranna D and Ramachandra SS. (2003),

“Evaluation of anti-ulcer effect of root of Curcuma zedoaria in rats”,

Indian Traditional Knowledge 2(4), pp. 375-377.

128. Rajasekaran T., Ravishankar G.A., Venkataraman L.V. (1991), “Influence

of nutrient stress on pyrethrin production by cultured cells of pyrethrum

(Chrysanthemum cinerariaefolium)”, Curr Sci 60, pp.705-707.

129. Ramawat K.G., Merillon J.M. (2004), Biotechnology Secondary

Metabolites, Science Publishers, Inc. Plymouth, UK.

130. Rao B.R., Kumar V., Amrutha N., Jalaja N., Vaidyanath K., Rao A.M.,

Polavarapu S.R.R., Kishor P.B.K. (2008), “Effect of growth regulators,

carbon source and cell aggregate size on berberine production from cell

cultures of Tinospora cordifolia Miers”, Current Trends in

Biotechnology and Pharmacy, 2(2), pp. 269-276.

131. Rao B.S., Shintre V.P., Simonsen J.L. (1928), “Essential oil from rhizome of

Curcuma zedoaria Rosc.”, Soc Chem Ind 47, pp. 171-172.

132. Rao S.R., Ravishankar G.A. (2002), “Plant cell cultures: chemical factories

of secondary metabolites”, Biotechnology Advances 20, pp. 101-153.

133. Ritterhaus E., Ulrich J., Westphal K. (1990), “Large-scale production of

plant cell cultures”, Iaptc Newsl 61, pp. 2-10.

98

134. Rodríguez-Monroy M., Trejo-Espino J.L., Jimenez-Aparicio A., de la Luz

M.M., Villarreal M.L., Trejo-Tapia G. (2004), “Evaluation of

morphological properties of Solanum chrysotrichum cell cultues in a

shake flask and fermentor and rheological properties of broths”, Food

Technol. Biotechnol. 42 (3), pp. 153-158.

135. Ryu D.D.Y., Lee S.O., Romani R.J. (1990), “Determination of growth rate

for plant cell cultures: comparative studies”. Biotechnol Bioeng 35, pp.

305-311.

136. Sakato K., Misawa M. (1974), “Effects of chemical and physical conditions

on growth of Camptotheca acuminata cell cultures”, Agri Biol Chem

38, pp. 491-497.

137. Saralamp P., Chuakual W., Temsirikul R., Clayton T. (2000), Medicinal

plants in Thailand. Volume 1, Amerin Printing and Publishing Public

Co., Ltd., Bangkok, Thailand.

138. Sarin R. (2005), “Useful metabolites from plant tissue cultures”, Biotechnol

4, pp. 79-93.

139. Seo W.G., Hwang J.C., Kang S.K., Jin U.H., Suh S.J., Moon S.K. (2005),

“Suppressive effect of Zedoariae rhizome on pulmonary metastasis of

B16 melanoma cells”, Ethnopharmacol 101, pp. 249-257.

140. Sheper T. (2001), Advances in biochemical engineering biotechnology-

plant cells (Vol 72), Springer-Verlag, Berlin Heideberg.

141. Shimomura K., Kitazawa T., Okamura N., Yagi A. (1991), “Tanshinone

production in adventitious roots and regenerates of Salvia miltiorrhiza”,

Nat Prod 54 (6), pp. 1583 -1587.

142. Shin K.H., Yoon K.Y., Cho T.S. (1994), “Pharmacologycal activities of

sesquiterpenes from the rzhome of Curcuma zedoaria”, Saengyak

Hakhoechi 25, pp. 221-225.

99

143. Shiobara Y., Asakawa Y., Kodama M., Yasuda K., Takemoto T. (1985),

“Curcumenone, curcumanolide A and cucumanolide B, three

sesquiterpenoids from Curcuma zedoaria”, Phytochemistry 24, pp.

2629-2933.

144. Shuler M.L., Kargi F. (2002), Bioprocess Engineering, Basic Concepts, 2nd

edn. Prentice Hall, NJ, USA.

145. Singh G., Singh O.P., Maurya S. (2002), “Chemical and biocidal

investigations on essential oils of some Indian Curcuma species”, Prog

Crystal Growth and Charact 45, pp.75-81.

146. Smith J.I., Smart N.J., Misawa M., Kurz W.G.W., Tallevi S.G., DiCosmo F.

(1987), “Increased accumulation of indole alkaloids by some cell lines

of Catharanthus roseus in response to addition of vanadyl sulphate”,

Plant Cell Rep 6, pp. 142-145.

147. Smollny T.H., Wichers T., Risk D., Van Zwam A., Shasavari A.,

Alfermann A.W. (1992), “Formation of lignans in suspension cultures

of Linum album”, Planta Med Suppl 58, pp. 622.

148. Srivastava S., Srivastava A.K. (2007), “Hairy root culture for mass-

production of high-value secondary metabolites”, Crit Rev Biotechnol

27, pp. 29-43.

149. Srvidya A.R., Yadev A.K., Dhanbal S.P. (2009), “Antioxidant and

antimicrobial activity of rhizome of Curcuma aromatica and Curcuma

zeodaria, leaves of Abutilon indicum”, Arch Pharm Sci & Res 1(1), pp.

14-19.

150. Stanly C., Bhatt A., Keng C.L. (2010), “A comparative study of Curcuma

zedoaria and Zingiber zerumbet plantlet production using different

micropropagation systems”, African Journal of Biotechnology 9(28),

pp. 4326-4333.

100

151. Sun Y.L., Tang J., Gu X.H., Li D.Y. (2005), “Water-soluble

polysaccharides from Angelica sinensis (Oliv.) Diels: Preparation,

characterization, and bioacitivity”, Int Biol Macromol 36, pp. 283-

289.

152. Syu W.J., Shen C.C., Don M.J., Ou J.C., Lee G.H., Sun C.M. (1998),

“Cytotoxicity of curcuminoids and some novel compounds from

Curcuma zedoaria”, Nat Prod 61, pp. 1531-1534.

153. Taiz L., Zeiger E. (2006), Plant physiology, Sinauer Associates, Inc

Publishers, Massachusetts, pp. 315-344.

154. Tal B., Rokem J.S., Goldberg I. (1983), “Factors affecting growth and

product formation in plant cells grown in continuous culture”, Plant

Cell Rep 2, pp. 219-222.

155. Tepsorn R. (2009), Antimicrobial activity of Thai traditional medicinal

plants extract incorporated alginate-tapioca starch based edible films

against food related Bacteria including foodborne pathogens, PhD

Thesis, University of Hohenheim, Thailand.

156. Teramoto S., Komamine A. (1988), Biotechnology in agriculture and

forestry, Medicinal and aromatic plants IV. Springer-Verlag, Berlin,

Heidelberg, pp. 209-224.

157. Thanh N.T., Ket N.V., Yoeup P.K. (2007), “Effecting of medium

composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension

culture of Panax vietnamensis Ha et Grushv”, VNU Journal of sicence

Natural and Technology 23, pp. 269-274.

158. Thanh N.T., Ket N.V., Yoeup P.K. (2008), “Effects of macro elements on

biomass and ginsenoside production in cell suspension culture of Ngoc

Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, VNU Journal of

sicence Natural and Technology 23, pp. 269-274.

101

159. Thanh N.T., Yu K.W., Hahn E.J., Peak K.Y., Murthy H.N. (2005b), “High

density cultivation of Panax ginseng cells in balloon type bioreactors:

role of oxygen supply on biomass and ginsenoside production”,

Genetics and Applications 2, pp. 7-13.

160. Thengane S.R., Kulkarni D.K., Shrikhande V.A., Joshi S.P., Sonawane

K.B., Krishnamurthy K.V. (2003), “Influence of medium composition

on callus induction and camptothecin(s) accumulation in Nothapodytes

foetida”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 72, pp. 247-251.

161. Trejo-Tapia G., Arias-Castro C., Rodríguez-Mendiola M. (2003),

“Influence of the culture medium constituents and inoculum size on the

accumulation of blue pigment and cell growth of Lavandula spica”.

Plant Cell Tiss Org Cult 72, pp. 7-12.

162. Vanisree M., Lee C.Y., Shu-Fung L., Nalawade S.M.L., Yih C., Tsay H.S.

(2004), “Studies on the production of some important secondary

metabolites from medicinal plants by plant tissue cultures”, Bot Bull

Acad Sin 45, pp.1-22.

163. Vanisree M., Tsay H.S. (2004), “Plant cell cultures-an alternative and

efficient source for the production of biologically important secondary

metabolites”, Int J Appl Sci Eng 2, pp. 29-48.

164. Vasil I.K. (2008), “A history of plant biotechnology: from the cell theory of

Schleiden and Schwann to biotech crops”, Plant Cell Rep 27, pp. 1423-1440.

165. Verpoorte R., Contin A., Memelink J. (2002), “Biotechnology for the

production of plant secondary metabolites”, Phytochem Rev 1, pp.13-25.

166. Véronique J., Genestier S., Courduroux J. C. (1992), “Bioreactor studies on

the effect of dissolved oxygen concentration on growth and

differentiaton of carrot (Daucus carota L.) cell culture”, Plant Cell

report 11(12), pp. 605-608.

102

167. Vijaya S.N., Udayasri P.V.V., Aswani K.Y., Ravi B.B., Phani K.Y., Vijay

V.M. (2010), “Advancements in the production of secondary

metabolites”, Natural Products 3, pp. 112-123.

168. Villarreal M.L., Arias C., Feria-Velasco A., Ramirez O.T., Quintero R.

(1997), “Cell suspension culture of Solanum chrysotrichum (Schldl)- A

plant producing an antifungal spirostanol saponin”, Plant Cell Tissue

and Organ Culture, 50, pp. 39-44.

169. Wang G.L., Luo H.M., Fang H.J., Jiang D., Huang H.G. (2004),

“Fractionation of polysaccharide from Curcuma zedoaria Rosc. and its

bioactivities”, Ying Yang Hsueh Pao 26(5), pp. 366-369.

170. Wang G.L., Luo H.M., Fang H.J., Jiang D., Huang H.G. (2004),

“Fractionation of polysaccharide from Curcuma zedoaria Rosc and its

bioactivities”, Ying Yang Hsueh Pao 26(5), pp. 366-369.

171. Wang G.R., Qi N.M., Wang Z.M. (2010), “Application of a stir-tank

bioreactor for perfusion culture and continuous harvest of Glycyrrhiza

inflata suspension cells”, African Journal of Biotechnology 9 (3), pp.

347-351.

172. Wang S.J., Zhong J.J. (1996), “A novel centrifugal impeller bioreactor. I.

Fluid circulation, mixing, and liquid velocity profiles”, Biotechnol

Bioeng 51, pp. 511-519.

173. Wang W., Zhong J.J. (2002), “Manipulation of ginsenoside heterogeneity in

cell cultures of Panax notoginseng by addition of jasmonates”, Biosci

Bioeng 93, pp. 48-53.

174. Wang X., Morris-Natschke S.L., Lee K.H. (2007), “New developments in

the chemistry and biology of the bioactive constituents of Tanshen”,

Med Res Rev 27, pp. 133-148.

103

175. Watanabe K., Shibata M., Yano S., Cai Y. Shibuya H., Kitagawa I. (1986),

“Antiulcer activity of extracts and isolated compound from zedoary

(Gajustsu) cultivated in Yakushima (Japan)”, Yakugaku Zasshi 106(12),

pp. 1137-1142.

176. Wilson B., Abraham G., Manju V.S., Mathew M., Vimala B.,

Sundaresan S., Nambisan B. (2005), “Antibacterial activity of

Curcuma zedoaria and Curcuma malabarica tubers”,

Ethnopharmacol 99, pp. 147-151.

177. Wink M. (1999), Biochemistry of plant secondary metabolism. Annual

plant reviews, vol 2, Sheffield Academic Press.

178. Woerdenbag H.J., Van U.W., Frijlink H.W., Lerk C.F., Pras N., Malingre

T.M. (1990), “Increased podophyllotoxin production in Podophyllum

hexandrum cell suspension cultures after feeding coniferyl alcohol as β-

cyclo dextrin complex”, Plant Cell Rep 9, pp. 97-100.

179. Xingyi (1999), "The chemical constituents of the essential oil from

Curcuma zedoaria (Christm) Rosc”, Guang Zhiwu 19 (1), pp. 95-96.

180. Yasuda S., Satosh K., Ishi T., Furuya T. (1972), Studies on the cultural

conditions of plant cell suspension culture. Fermentation

technology today, Society for fermentation Technology, Osaka,

Japan, pp. 697-703.

181. Yesil-Celiktas O., Gurel A., Vardar-Sukan F. (2010), Large scale

cultivation of plant cell and tissue culture in bioreactors, Transworld

Research Network, Kerala, India.

182. Yoshioka T., Fujii E., Endo M., Wada K., Tokunaga Y., Shiba N., Hohsho

H., Shibuya H., Muraki T. (1998), “Antiinflammatory potency of

dehydrocurdione, a zedoary-derived sesquiterpene”, Inflamm Res

47(12), pp. 476-481.

104

183. Zenk M.H. (1978), “The impact of plant cell culture on industry”, in

Frontiers of Plant Tissue Culture 1978 (Thorpe, T. A., ed.), Intl.

Assoc. Plant Tissue Culture, Univ. of Calgary Printing Services, pp.

1-13.

184. Zenk M.H., EI-Shagi H., Schulte U. (1975), “Anthraquinone production by

cell suspension cultures of Morinda citrifolia”, Planta Med Suppl, pp.

79-101.

185. Zhang Q., Rich J.O., Cotterill I.C., Pantaleone D.P., Michels P.C. (2005), “14-

Hydroxylation of opiates: Catalytic direct autoxidation of codeinone to 14-

hydroxycodeinone”, Am Chem Soc 127, pp. 7286-7287.

186. Zhang Z.Y., Zhong J.J. (2004), “Scale-up of centrifugal impeller bioreactor

for hyperproduction of ginseng saponins and polysaccharide by high-

density cultivation of Panax notoginseng cells”, Biotechnol Prog 20,

pp.1076-1081.

187. Zhang Z.Y., Zhong J.J. (2004), “Scale-up of centrifugal impeller bioreactor

for hyperproduction of ginseng saponins and polysaccharide by high-

density cultivation of Panax notoginseng cells”, Biotechnol Prog 20,

pp.1076-1081.

188. Zhao J., Verpoorte (2007), “Manipulating indole alkaloid production by

Catharanthus roseus crll culture in bioreactors: from biochemical

processing to metabolic engineering”, Phytochem Rev 6, pp. 435-457.

189. Zhao D., Xing J., Li M., Lu D., Zhao Q. (2001), “Optimization of growth and

jaceosidin production in callus and cell suspension cultures of Saussurea

medusa”, Plant Cell Tissue and Organ Culture 67, pp. 227-234.

190. Zhao J., Zhu W., Hu Q. (2001b), “Enhanced catharanthine production in

Catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in

shake flasks and bioreactors”, Enzyme Microb Technol 28, pp. 673-681.

105

191. Zhong J.J., Yoshida T. (1995), “High-density cultivation of Perilla

frutescens cell suspensions for anthocyanin production: Effects of

sucrose concentration and inoculum size”, Enzyme and Microbial

Technology 17, pp. 1073-1079.

192. Zhu L. (1993), Aromatic plants and essential constituents, Hai Feng

Publishing Co., Hong Kong.

193. Ziv M. (2000), “Bioreactor technology for plant micropropagation”,

Horticultural Reviews, 24, pp. 14-23.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

Muối khoáng Nồng độ (mg/l)

Potasium nitrate (KNO3) 1900

Amonium nitrate (NH4NO3) 1650

Calcium chloride (CaCl2.H2O) 440

Magnesium sulfate (MgSO4.7H2O) 370

Potassium phosphate (KH2PO4) 170

Na2EDTA.2H2O 37,2

Manganese sulfate (MnSO4.4H2O) 22,3

Ferrous sulfate (FeSO4.7H2O) 27,8

Zinc Sulfate (ZnSO4.7H2O) 8,6

Boric Acid (H3BO3) 6,2

Potassium Iodine (KI) 0.83

Sodium molybdate (Na2MoO4.2H2O) 0,25

Colbalt chloride (CoCl2.6H2O) 0,025

Cupric Sulfate (CuSO4.5H2O) 0,025

Vitamin Nồng độ (mg/l)

Myo-inositol 100

Nicotinic acid 0,5

Pyridoxine HCl 0,5

Thiamine HCl 0,1

Glycine 2

Sucrose 30 g/l

Agar 8 g/l

Phụ lục 2: Hình ản h thí nghiệm

Hình: Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml, trên máy lắc

Hình: Tế bào nghệ đen để lắng trong bình tam giác 250 ml

Hình: Sinh khối tươi của tế bào nghệ đen thu được sau khí nuôi cấy 14 ngày


LỜI CẢM ƠN -...

Documents

Transcript of LỜI CẢM ƠN -...