Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére
Állatkísérletek az Orvostudománybanweb.szote.u-szeged.hu/expsur/allatkiserletek... ·...
Transcript of Állatkísérletek az Orvostudománybanweb.szote.u-szeged.hu/expsur/allatkiserletek... ·...
Állatkísérletek azOrvostudományban
Sebészeti Műtéttani IntézetSZTE ÁOK graduális oktatás 2013 -2014 / 1
Életjelenségek speciális vizsgálómódszerei
Dr. Kaszaki József
Mitől függ a perctérfogat?
Előterhelés(Preload)
Utóterhelés(Afterload)
KontraktilitásdP/dTmax
Szívfrekvencia
CVP Perifériás érellenállás
SVR
Oxigén szállítás (DO2) Oxigén fogyasztás (VO2)
1. A perctérfogatból számolhatótovábbi paraméterek
Feltétel: Az artériás és vénás oxigén szaturáció meghatározása
Oxigénnel telített hemoglobin százalékos aránya a vérben
95-100 %70-80 %
Periféria
DO2 : a keringés által szállított oxygénmennyiség
Összetevői: ■ Oxygén tartalom
a. Hemoglobin (Hb)b. Szaturáció (SO2); a teljesen szaturált
hemoglobin 1.38 ml oxygént szállít (per gram)
■ Perctérfogat (C.O.)
DO2 [ml/min] = CO x [(1,38 x Hb x SaO2) + (0,003 x paO2)]
Oxygen szállítás (DO2)
Oxigén fogyasztás (consumption; VO2)
Oxigén szállítás (delivery; DO2)
Body/Organs
Oxigén fogyasztás = perctérfogat x (artériás – vénásoxigén tartalom)
VO2 [ml/min] = CO x 1,38 x Hb x (SaO2-SvO2)
Ha a Hgb, CO és az A/V szaturáció ismert, a VO2 kiszámítható anélkül, hogy a PO2 értéket ismernénk (oldott O2 = általában a teljes O2 tartalom < 0.3 Vol%-a):
2. Kis vérköri nyomás monitorozásPulmonális artéria nyomás
Pulmonary artery
Pulmonális artéria katéterezés– Swan Ganz katéterrel
Sárga: PA nyomásKék: CVP és injektálásFehér: termisztor kábelPiros: katétervég ballon felfújás
A Swan Ganz katéter pozíciója ajobb szívfélben
Artéria pulmonális nyomás és az ék (wedge)nyomás görbéje
Pulmonalis kapilláris éknyomás:
Hemodinamikailag a bal kamra preloadjárautal, de a mérése körüli bizonytalanságok és a számos befolyásoló tényező miatt a volumenstátus megítélésére csak fenntartásokkal alkalmazható
3. A véráramlás mérése
Elektromágneses áramlásmérés
Ultrahangos flowmérés
Laser-Doppler flowmérés
Transonic ultrahangos véráramlás mérőkészülék és perivaszkuláris áramlás érzékelő
szenzorok.
Lokális véráramlás mérés
Lokális véráramlás mérés
4. A gasztrointesztinális (GI) traktus vizsgáló módszerei
Furness, The Enteric Nervous System, 2008. nyomán
A bélidegrendszer szerveződéseMyentericus plexus
Körkörös izomréteg
Hosszantiizomréteg
Nyálkahártya
Muscularis mucosae
Submucosus plexus
Myentericus plexus
Körkörös izomréteg
Hosszantiizomréteg
Nyálkahártya
Muscularis mucosae
Submucosus plexus
Az GI traktus szekretoros, abszorpciós és motilitási funkcióinak szabályozásáért és összehangolásáért felelős struktúra a bélidegrendszer. A bélidegrendszert több kisebb, nem ganglionált, és két nagyobb, ganglionált plexus építi fel. Ezek a nyálkahártya és a körkörös izomréteg között elhelyezkedő submucosus plexus(Meissner-plexus), valamint a körkörös és hosszanti izomrétegek között található myentericus plexus (Auerbach-plexus). A bélidegrendszer önállóreflexívekkel rendelkezik, s a központi idegrendszertől való nagyfokúfüggetlenség jellemzi.
Lassú hullám Spikes
4.1. A tápcsatorna simaizomzat elektromos aktivitása
A GI kontrakciók ritmusát a simaizom membránban képződő potenciál változás, a lassú hullámok (slow waves) frekvenciája határozza meg, amelyek nem tekinthetők akciós potenciálnak.
A GI SIMAIZOM MOTOROS AKTIVITÁSA1. Izom kontrakció csak akciós potenciál (AP) megjelenésekor történik
2. Az AP (sorozat) gyakoriságát a lassú hullámok frekvenciája szabja meg
3. A kontrakciók ereje az AP sorozat frekvenciájától függ
GI motilitás monitorozás I.A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő
bélyeg (strain gauge) szenzorral
Strain gaugeszenzor
Computer
V. jugularis
Infúzió
FSG-02 Force/displacement transducer for implantable
GI motilitás monitorozás I.A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő
bélyeg (strain gauge) szenzorral
sec
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
V
-6
-4
-2
0
2
4
6
Original recording of colon motility in rat
GI motilitás monitorozás II.Elektro-Miográfia (EMG)
A bélizomzat elektromos aktivitásának mérése extracellularis szenzorral
Extracellularsensor
Computer
V. jugularis
Infúzió
Ag/AgCl extracellularis szenzor
Szenzor típusok
testfelszíni miográfiás szenzor bélfalba implantált szenzor
Kísérleti elrendezés
testfelszíni miográfiás szenzortestfelszíni miográfiás szenzorbélfalba implantált szenzor(1 vagy 2 pár elektródával) bélfalba implantált szenzor(1 vagy 2 pár elektródával)
Elektrointesztinográfia
Mérés éber állaton. A szenzort a nyakon ejtett nyíláson át vezetjük ki, melyet az állat nem tud lerágni.
eseményFelvétel: 0,01 – 0,5 Hz
A jel:
Gyomor
Vastagbél
Vékonybél
PS: power spectrum, MA2
MA: a PS-hez tarozó legnagyobb magasság érték
Vékonybél spektrumok egy bélischaemia-reperfúziós állatból
AUC - bevarrt
0
50
100
150
200
250
300
350
baseline Ischemia1 Ischemia2 Reperfuzio1 Reperfuzio2
Sham-opIRIR+Met
Görbe alatti területek összehasonlítása
4.2. Az intesztinális permeábilitásvizsgáló módszerei
• Gravimetriás analízis• Kapilláris permeabilitás• Epitheliális permeabilitás
Gravimetriaszövet mintavétel;Nedves-súly méréseSzárítás súlyállandóságig, majd száraz-súly mérés
Nedves / Száraz súly = ödéma becslése
*
* P<0.05
*
Intact region ofthe esophagus
Treated region ofthe esophagus
*
0
0
0
0
0
1
1
1
HCl+bile
*Saline
Bile*x x
Vascular permeability index
Fig. 2
HCl
Vasculáris/kapilláris permeabilitás
Intravénás befecskendezésPermeábilitás fokozódás esetén, a festék-fehérje komplex a szövetekbe jut;A komplex kimosása az erekből;A festék extrahálása a szövetből, formamid-dal;Evans kék spektrofotometriás meghatározása a vérből és a szövetből;
Meghatározása:Evans kék (EB) festékkel, amely a plazma fehérjékhez
kötődik
Permeabilitási index = EB szövetEB plazma
Time (min)180 190 200 210 220 230 240
Plasma-Na fluorescein/lumen-Na fluorescein kg-1 x 104
0
2
4
6
8
10
HCl+bile
Saline
Bile
x
**
**
*
**
x xxx
xx
x
x
x* *
**x
x
Fig. 3
* ** *
x x
xxHCl
“lumen - plazma” irányú permeábilitás változás mérése Na-fluoreszcein (NaFL) clearence
módszerrel
“lumen - plazma” NaFl clearence =plazma NaFL / lumen NaFL
Epitheliális permeabilitás
• 5 mg/ml NaFL beadása a vizsgálandóGI lumenbe;• Vénás vérminta vétel 10 percenként (a minta tárolása sötétben);• A NaFL koncentráció meghatározása spektroflurométerrel (ex: 455 nm, em: 515 nm);
5. Képalkotó vizsgálómódszerek a mikrokeringés in
vivo monitorozására
• Arteriolák, kapillárisok, venulák hálózata (érátmérő <100 μm)• Legfőbb szerepe az oxigén átadása a szöveteknek• Struktúrája, funkciója nem egységes – szervenként eltérő• Központi szerepet játszik a véralvadási, immunológiai
folyamatokban
• A mikrokeringést meghatározó tényezők:– Beáramlási nyomás (driving pressure)– Az arteriolák tónusa és átmérője– Hemorheológiai paraméterek (viszkozitás)Együttvéve: kapillárisok nyitottsága (patency)
• A mikroperfúzió szabályozása:– Miogén (erő-mechanikai hatások)– Metabolikus (O2, CO2, laktát, H+)– Neurohumorális (NO, endothelin,
katekolaminok, stb.)
A mikrokeringés fiziológiája
REOXIGENIZÁCIÓ
REPERFÚZIÓ
HIPOXIA
ISCHAEMIA
„NO-REFLOW”jelenség
MIKROKERINGÉSI ELÉGTEENSÉG
KERINGÉSI SHOCK
MiMikkrorokeringkeringééss didisszzfunfunkkcicióó
Vörösvértestek
Deformabilitás,Aggregáció
O2 transport zavar
Koaguláció
Endogénantikoagulánsok ↓Mikrovaszkuláris
trombózis
Leukocita aktiváció
Adhézió,Cytokinek,
ROS
Endothel Diszfunkció
Barrier,Koaguláció,
Regulációs zavar
Autoregulácios diszfunkció
Mikrocirkulációs shunt Oxigén ellátás-igény mismatch
Hypoxia
Celluláris Distress
Mitochondrium diszfunkcióApoptózis
Szervielégtelenség
A mikroperfúzió monitorozásának eszközeiés jellegzetességei
A A mikrocirkulmikrocirkuláácicióó monitorozmonitorozáása sa
LLéézer Doppler zer Doppler ááramlramláásmsméérrőő
OPS/SDFOPS/SDFkkéépalkotpalkotááss
NIRSNIRS
FluorescenceFluorescencequencingquencing
microscopymicroscopy
MikrogyMikrogyööngyngytechniktechnikáákk
MRIMRI
Áramlás
Áramlás
Oxigenizáció,Áramlás
Oxigenizáció,Perfúzió
Oxigéntenzió
Perfúzió,Áramlási sebesség
„„SidestreamSidestream Dark FieldDark Field””„„SDFSDF””::
az OPS tovaz OPS továábbfejlesztett bbfejlesztett verziverzióójaja
Ince C (2005) Crit Care 9:S13-S19Groner W. Nature Med (1999) 5:1209-1212
OrthogonOrthogonáálislis PolarizPolarizáácicióós s SpectrSpectráálislis kkéépalkotpalkotáás s
””OPSOPS””
Hol alkalmazható?Csak vékony, epithel réteggel fedett struktúrák esetén alkalmazható,amelyek átvilágításához elegendő a szövet mélyéről visszaérkező depolarizált fény - amely hátulról világítja meg a felszín alatti struktúrákat.
1. Ideális, nem invazív alkalmazási terület: a sublinguális régió
A A sszzublingualublingualisis mimikkrocirrocirkkululáácciióó kklinilinikkaaiijelentjelentőősséégege
Pentobarbital anaesthesia OPS mikrokeringésvizsgálat
Vérnyomás szenzor
Intestinalis tonométer CVP katéter
Transzpulmonálisperctérfogat mérés
Sublingualis tonométer
Artériás kanül
Sublinguális vs intesztinális tonometriaSublinguális tonometria vs OPS videomikroszkópia
A nyelv alatti mucosa mikrokeringA nyelv alatti mucosa mikrokeringéésesekontroll kontroll áállapotbanllapotban
A nyelv alatti mucosa mikrokeringA nyelv alatti mucosa mikrokeringééseseshockosshockos áállapotbanllapotban
Sakr et al. Crit Care Med (2004) 32:1825-1831
Azok a szeptikus páciensek, akiknél a szublinguális mikroperfúziócsökkenése kismértékű (22 %-os) volt, felépültek a súlyos kórállapotból, ellentétben azokkal, akiknél ez a csökkenés jelentős (44 %-os) volt.
A A sszzublingualublingualisis mimikkrocirrocirkkululáácciióó kklinilinikkaaiijelentjelentőősséégege
A mikrocirkulációs dysfunkció volt azegyetlen és szenzitiv tényező a végkimenetel előrejelzésében.
• Vietnámi törpesertések (átlagos testtömeg: 23±3 kg) • Altatás: ketamin-xilazin indukció im., propofol fenntartó iv.• Mesterséges lélegeztetés
Jobb felső lebeny OPSmikrokeringés vizsgálat
Pulzoximéter
Endotracheálistubus
Artériás vérnyomás szenzor
Centrális vénás nyomás
Mikrocirkulációs paraméterek változása a tüdő alveolusaiban
= mikrokeringés felvétel
0.perc 15. perc 30. perc 45. perc
Thoracotomia PEEP = 5 PEEP = 10
PEEP = 15
PEEP = 5
N=6
Kevés adat ismert a PEEP okozta mikrocirkulációsváltozásokról a tüdőben
PEEP hatása az oxigenizációra
Atelektázia megszűnése - intrapulm. shunt
Parciális oxigén nyomás (PaO2)
Artériás oxigén szaturáció (SaO2)
Artériás oxigén szaturációés parciális nyomás
Idő (perc)0 15 30 45
Artériás oxigén szaturáció (%)
92
94
96
98
100
**
PEEP= 5PEEP= 10
PEEP= 15
PEEP= 5
*
Idő (perc)
Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
0 15 30 45
Artériás oxigén parciális nyomása (Hgmm)
50
60
70
80
90
100
*
PEEP= 5PEEP= 10
PEEP= 15
PEEP= 5
*
TÜDŐ MIKROKERINGÉS (OPS)PEEP 5 vízcm
Tüdő mikrokeringés → PEEP 15 vízcm
Tüdő mikrokeringés → PEEP 5 vízcm
Alveolus terület
Idő (perc)0 15 30 45
Alveoláris terület (μm2)
500
600
700
800
900
1000
1100 *
PEEP= 5PEEP= 10
PEEP= 15
PEEP= 5
Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
Alveolus kapillárisok perfúziós rátája
Idő (perc)0 15 30 45
Alveolus perfúziós ráta
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
* *
PEEP= 5PEEP= 10
PEEP= 15
PEEP= 5
Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
Áramlási sebesség az alveoláris és perialveoláris kapillárisokban
Idő (perc)0 15 30 45
Alveolus vvt sebesség (μm s-1)
300
350
400
450
500
550 *
*
PEEP= 5PEEP= 10
PEEP= 15
PEEP= 5
Idő (perc)0 15 30 45
Perialveoláris vvt sebesség (μm s-1)
300
350
400
450
500
550
600*
PEEP= 5PEEP= 10
PEEP= 15
PEEP= 5
A PEEP emelése után az alveoláris és perialveoláris perfúzióeltérő dinamikájú növekedése eredményezi az artériás oxigén tenzió és szaturáció fokozódását.
A mikrokeringés és a makrokeringéskapcsolata
Normál állapotban a mikrokeringés relatíve független a globális hemodinamikai változásoktól.
DEmikrocirkulációs elváltozások mutathatók ki elfogadhatónak tekintett szisztémás hemodinamikaicélértékek esetén is;
A keringési elégtelenség megszüntetését célzó terápiás beavatkozás esetén, a mikrokeringés reakciója gyakran eltér annak globális hatásától → jellemző példája az un. „no-reflow” jelenség
Gasztrointesztinális mikrokeringés
– a keringés redisztributio áldozata keringési shockban
Idő (perc)0 30 60 90 120 150 180 210 240
Hgmm
30
60
90
120
150
zselatinhidroxietil-keményítődextrán
Vérzéses shock
Artériás Középnyomás
Volumen resuscitatio
* P<0.05 vs kontroll érték (0 perc)
A volumen reszuszcitáció végpontja: a kontroll MAP 75%-ának elérése, max. 50 ml/kg kolloid infúzió;
idő (perc)0 30 60 90 120 150 180 210 240
μm/s
200
300
400
500
600
700
800
Zselatin Hidroxietil-keményítő (Voluven)Dexrán (Rheomacrodex)
Vérzéses shock
Vörösvértest Áramlási Sebesség a Villusokban
Volumen resuscitatio
P<0.05 vs konroll érték (0 perc)
*
*
*
*
*
*#
P<0.05 vs Voluven csoport#
#*
Kaszaki J, Wolfárd A, Szalay L, Boros M: Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc 38:826-828, 2006.
OPS
Károsodott mikrocirkuláció esetén – a mikrokeringésireakciók NEM egységes természetüek, és mértékük, kiterjedésük sem hasonló.
A károsodás gyakori megnyilvánulása, a perfúzióheterogenitásának fokozódása.
Az oszcilláló mikroperfúzió (flowmotion) a lokális oxigenizáció változást indukál
(Tsai AG and Intaglietta M, Int J Microcirc Clin Exp(1991) 12:75-88).
A mikrokeringés speciális sajátossága:
a heterogenitás
A funkcionális kapilláris denzitás meghatározása
Perfundált kapillárisok hosszaterület Mikrocirkulációs shunt: amikor a
µpO2 kevesebb lesz, de a vénás pO2változatlan marad
Sinaasappel et al. J Appl Physiol (1996) 81:2297-2303.
Térben változóheterogenitás
nem-perfundált
perfundált
A vörösvértest áramlási sebességének (RBCV) súlyozott számtani átlaga:
v1t1 + V1T1+ v2t2 + V2T2+ … vntn + VnTn
t1 + T1 + t2 + T2 + … tn + Tn
Súlyozó faktor = az áramlási periódusok relatív időtartama
RBCV(µm/sec)
≈ 700
≈ 100
időt1 t2 t3 tnT1 T3T2 Tn
v1 v1 v2 v3 vnv2 v3 vn
Gyors áramlás
Lassú áramlás
A-RBCV =
IdIdőőbeli heterogenitbeli heterogenitáássAz Az ááramlramláási mintsi mintáázat vzat vááltozltozáása a sa a villusbanvillusban
• Kiindulási állapot: folyamatos áramlás• Vérzéses shock: oszcilláció• Újraélesztés: folyamatos áramlás / oszcilláció
Szabó et al. Shock 21:320-329, 2004.
hypoperfundált terület
Normál perfúzió, magasabb RBCV értékek
(a: relative area 40%)(lower average RBCV)
(A: relative area 60%)(higher average RBCV)
Térbeli heterogenitás
A(RBCV) + a (RBCV)A + a (A + a = 1)RBCV RBCV =
RBCV RBCV = 0.6 RBCV + 0.4 RBCV
A vörösvértest áramlási sebesség (RBCV) terterüület arlet aráányosannyosanssúúlyozott lyozott áátlagatlaga
Vasomotio (flowmotion) monitorozás a bőrben
HeterogenitHeterogenitáás norms normáál kl köörrüülmlméények knyek köözzöött,tt,LLéézer Doppler flow mzer Doppler flow méérrééss
Vasomotio (flowmotion) monitorozás a tesztiszben
Termoregulációval összefüggőperiodicitás
A leukocyta-endothelsejt interakciómonitorozásának eszközei
és jellegzetességei
Leukocyta-endothel sejt interakció
Rolling Adhézió Transzmigráció
E-selectinP-selectin
(+vérlemezke)
VCAM-1ICAM-1(intercellularisadhéziós molekula 1)
L-selectin CD11a/CD18CD11b/CD18
endothelialisPECAM-1érendothel
leukocyta
leukocytaPECAM-1
kapilláris lumen
interstitium
Fluoreszcens Intravitális VideomikroszkópiaFluoreszcens Intravitális VideomikroszkópiaVideVideóó--felvevfelvevőő
MONITORMONITOR-- ggöördrdüüllőő leukocitaleukocita-- kitapadkitapadóó leukocitaleukocita--funkcionfunkcionáális kapilllis kapillááris ris denzitdenzitááss--VvtVvt ááramlramláási sebesssi sebesséégg
FFéényforrnyforrááss
CCDCCD--kamerakamera
ObjektObjektíívv
Tibia
Kontraszt erősítés (fluoreszcenstransz- és epi-illumináció)
Fluoreszcens markerek:Leukocyták – Rhodamin 6G
Vörösvértestek – FITC jelölés
Permeabilitás – Na-fluorescein
IVM video:Periosteális perfúzió és leukocyta adhézió
végtag ischaemiában
Mikrocirkulációs paraméterek változása máj ischaemia-reperfúzió
során, patkány modellben
Kontroll mikroperfúzió a májban (NaFl)Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)
Máj mikroperfúzió reperfúzió alatt (Na Fl)Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)
Leukocyta-endothel sejt interakció normál májban (IVM)
Leukocyta-endothel sejt interakció reperfúzió alatt (IVM)
Mikrocirkuláció összegzés
• Az első, ami sérül, és az utolsó ami felépül.
• A mikrocirkuláció károsodásának jele, a perfúzióheterogenitása, amely oxigén extrakciós deficitet eredményez;
• A mikroperfúzió állapota meghatározhatja a végkimenetelt;
• A mikrocirkuláció helyreállítása → terápiás végpont.
Microcirculation Recruitment ManoeuvresInce C (2005) Critical Care 9:S13-S19
• Rendezni kell a kóros áramlási heterogenitást
• Az a cél, hogy a nyissuk ki és tartsuk is nyitva a mikrokeringést a pumpafunkciótámogatásával, vazopresszorok korlátozott használatával és megfelelő folyadékadásával
Köszönöm a figyelmet!