Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju...
Transcript of Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju...
![Page 1: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/1.jpg)
Fakultet veterinarske medicineUniverzitet u Beogradu
Laboratorija za genetiku zivotinjaKatedra za Biologiju
Postupci pripreme za obavljanje molekularno-
genetičkih аnаlizа
Izolacija (ekstrakcija)DNK i RNK
![Page 2: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/2.jpg)
• Pre svega, te metode omogućavaju korišćenje bilo kog uzorka kojisadrži DNK životinje (osim krvi, mogu se koristiti dlake, saliva,brisevi bukalne i vaginalne sluznice, mleko, sperma, uzorci tkiva,koža, perje, nokti, kandže, kosti, zubi i arhivirani preparati) što jeznačajno za analizu uginulih ili ubijenih životinja i praćenje zaraza.
• Uzimanje uzorka za DNK analize iz živih jedinki je neinvanzivno,
• Uzorci DNK se lako mogu transportovati između laboratorija ijako dugo čuvati, što omogućava retrospektivnu analizu uslučajevima kada životinje više nisu dostupne.
Molekularno-genetičke analize koje sebaziraju na PCR metodologiji pružajubrojne metodološke prednosti u odnosu nasve druge metode tradicionalno primenjivaneu veterinarskoj medicini i stočarstvu.
![Page 3: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/3.jpg)
• Analiza DNK može se obaviti u veoma ranim fazama životajedinke, odnosno čak i na stupnju embriona (prenatalnadijagnostika) nezavisno od pola.
• Prednost molekularne dijagnostike je i to što se, za razliku odklasičnih metoda, svi koraci mogu automatizovati.
• Automatizacijom se postiže istovremena i brža obrada većegbroja uzoraka pod standardizovanim uslovima i smanjuje rizik odkontaminacije i dobijanja lažno-pozitivnih rezultata.
• Korišćenjem internih kontrola, postiže se veća pouzdanost ipreciznost analize.
![Page 4: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/4.jpg)
Zbog svega navedenog, molekularno-genetičke analizenalaze primenu u brojnim oblastima veterine, kao što su:
1. molekularna dijagnostika naslednih bolesti
2. detekcija i tipizacija virusnih, bakterijskih, gljivičnih patogena iparazita
3. determinacija pola ptica i embriona sisara
4. provera roditeljstva i verifikacija pedigrea
5. otkrivanje genskih lokusa vezanih za ekonomski značajneproizvodne karakteristike
6. odabir jedinki za odgajivačke programe i selekciju
7. kontrola namirnica
8. forenzičke analize
![Page 5: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/5.jpg)
Izolacijanukleinskih kiselina
Izolacija DNK iz ćelije podrazumeva oslobađanje DNK iz virusa, prokariotskih i eukariotskih ćelija: - jedra - nuklearna DNK- mitohondrija-mtDNK i plastida-pDNK
![Page 6: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/6.jpg)
Izolacija DNK
Izolacija DNK obavlja se primenom hemikalija i postupaka kojima se razbijaju i liziraju: • ćelijski zid • ćelijska membrana i • membrane organela (jedra, mitohondrija i plastida)
ali i veoma čvrsti zidovi spora (bakterija, protozoa) i brojne čvrste tvorevine (hitinska kutikula, kosti, rožne tvorevine, keratin ...)
![Page 7: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/7.jpg)
http://slideplayer.com/slide/4448258/FORENZIKA
![Page 8: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/8.jpg)
http://www.alo.rs/spreceno-krijumcarenje-lobanje-i-rogova-kozoroga/20463
FORENZIKA
![Page 9: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/9.jpg)
FORENZIKA
![Page 10: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/10.jpg)
What Happened to Richard III?
Missing for 500 years
Slain in battle in 1485, Richard III was the last medieval king of England. He did not have a state burial as the whereabouts of his body was unknown. A skeleton discovered in a carpark near Grey Friars Church in Leicester,
![Page 11: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/11.jpg)
izolacija (ekstrakcija) DNK ili RNK iz biološkihuzoraka je PRVI KORAK procesa analize DNK/RNK.
Izolacija DNK
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/
![Page 12: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/12.jpg)
Ekstrakcija DNK (klasičnom metodom – bez kolonica / silikatnih membrana)
Ekstrakcija DNK iz brisa bukalne sluznice obuhvata sledeće korake:
1) sakupljanje ćelija bukalne sluznice 2) razbijanje ćelija da se iz njih oslobodi DNK3) odvajanje DNK od proteina i ćelijskih ostataka 4) izolacija koncentrovane DNK
Oprema koja je potrebna za ekstrakciju DNK
![Page 13: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/13.jpg)
- Uzimanje ćelija epitela bukalne sluznice obavlja se pomoću vatiranog vrha štapića za uzimanje brisa.
- Bris (vatirani vrh štapića) treba staviti u epruvetu (1,5 ml). Bris sadrži stotine „finih“ (tankomembranoznih) ćelija bukalne sluznice. Unutar svake ćelije nalazi se jedro, a unutar jedra je DNK.
Detalji svakog koraka ekstrakcije:
1) sakupljanje ćelija bukalne sluznice (bris)
![Page 14: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/14.jpg)
2) razbijanje ćelija da se iz njih oslobodi DNK
- Odsecanje brisa (vrha štapića) kako bi epruveta mogla da se zatvori.
- Nalivanje lizirajućeg rastvora* (grč. lysis = razgradnja, raspadanje, razaranje, razlaganje)
- Inkubacija u vodenom kupatilu na 56C (10 min – 30 min, zavisno od tipa uzorka, ali dovoljno dugo da se
oslobodi DNK).
- *Lizirajući rastvor sadrži dva važna sastojka: deterdžent i enzim proteinazu K.
Deterdžent razbija ćelijsku i jedarne membrane čime omogućava pucanje ćelija i oslobađanje DNK iz njih.
Međutim, DNK je i dalje veoma čvrsto obavijena proteinima (histonima), te proteinaza K seče i odvaja histone da oslobodi DNK.
![Page 15: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/15.jpg)
3) odvajanje DNK od proteina i ćelijskih ostataka
- Tokom prethodnog koraka (inkubacije u vodenom kupatilu) oslobođena je DNK i uklonjen vrh štapića iz epruvete. Sledeći korak je dodavanjerastvora koncentrisane soli u epruvetu.
- So obezbeđuje da se proteini i drugi ostaci (razbijenih) ćelija grupišu.
- Epruveta se stavlja u centrifugu
- Obezbedi se „balans“ stavljanjem druge epruvete sa istom zapreminom tečnosti (može i obična voda).
- Centrifugiranjem epruvete na velikoj brzini postiže se da teške grupe proteina i ćelijskih ostataka spadnu (stalože se) na dno epruvete, dok DNK lanci ostaju difuzno raspoređeni u tečnom sadržaju epruvete.
- Tečni sadržaj epruvete prenosi se u čistu epruvetu, dok talog (proteine i ćelijske ostatke) ostaje u epruveti koju bacamo.
![Page 16: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/16.jpg)
- Dodaje se izopropil alkohol u epruvetu sa rastvorenom DNK i promeša okretanjem epruvete. Time se postiže da se DNK, koja nije rastvorljiva u izopropil alkoholu, izdvoji iz rastvora u vidu grupa (ugrušaka) vidljivih golim okom.
- Epruveta se centrifugira, pri čemu se ovog puta centrifugiranjem na dno epruvete „spušta na dno“ (taloži) zgrušana DNK.
- Tečna faza (supernatant) se ukloni iz epruvete, a DNK sačuva (može se ostaviti u tom stanju ili da se ponovo rastvori u adekvatnom (blagoslanom) puferu ili vodi.
4) izolacija koncentrovane DNK
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/
Prikaz opisanog procesa EKSTRAKCIJE DNK nalazi se na linku:
![Page 17: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/17.jpg)
![Page 18: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/18.jpg)
DNK izolacija iz uzoraka sperme i dlakakorišćenjem seta ”DNeasy® Blood & Tissue Kit”(Qiagen).
Izolacija DNK goveda
![Page 19: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/19.jpg)
Uzorci sperme (minitube za VO)
![Page 20: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/20.jpg)
![Page 21: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/21.jpg)
Priprema uzorkovanih dlaka za izolaciju DNK
goveda
![Page 22: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/22.jpg)
DNK izolacija iz uzoraka
krvi korišćenjem setova:
GeneJET™ Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific)
• DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen)
![Page 23: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/23.jpg)
![Page 24: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/24.jpg)
• Za izolaciju DNK pčela najčešće se koriste noge pčela
Izolacija DNK pčela
• DNeasy® Tissue Kit(Qiagen)
![Page 25: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/25.jpg)
DNeasy Plant Mini Extraction Kit(Qiagen) + tečni azot
Izolacija DNK endoparazita pčela –mikrosporidija Nosema sp.
![Page 26: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/26.jpg)
Izolacija DNK
![Page 27: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/27.jpg)
Izolacija DNK
![Page 28: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/28.jpg)
Za izolaciju DNK Varroa destructorkoriste se cele jedinke parazita
Izolacija DNK pčelinjeg krpeljaVarroa destructor
Kapa Express Extract kit(Kapa Biosystems)
![Page 29: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/29.jpg)
Inkubiranje
![Page 30: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/30.jpg)
http://bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/
![Page 31: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/31.jpg)
https://www.qiagen.com/us/Resources
Mol. Biol. Methods•DNA
What is DNA?DNA extraction technologies
Working with DNA: Good laboratory practiceConversions for nucleic acids: DNA
Molecular conversions for DNASpectrophotometric measurement of DNA concentration
Sample storage prior to extraction of genomic DNASample disruption for extraction of genomic DNAWorking with DNA: Good microbiological practice
![Page 32: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/32.jpg)
https://www.qiagen.com/us/Resources
Mol. Biol. Methods•RNA
What is RNA?microRNA
miRNA mimics and inhibitorssiRNA and RNAi
General remarks on handling RNAStabilization of RNA in biological samples
RNA sizes and molecular weightsRNA isolation: Disruption and homogenization of starting materials
Special considerations for isolation of RNA from different sample sourcesStorage of RNA
Quantification of RNASpectrophotometric measurement of RNA concentration
Determining RNA quality
![Page 33: Laboratorija za genetiku zivotinja Katedra za Biologiju ...katedre.vet.bg.ac.rs/~biolog/images/stories/VET_GENETIKA/03_IZOLACIJA_DNK_2017.pdfFakultet veterinarske medicine Univerzitet](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022041607/5e354ad9a9aa9735d15c3329/html5/thumbnails/33.jpg)
https://www.qiagen.com/us/ResourcesE-Learning
•Virtual Demos