CELULCELULÁÁRNA IMUNOLRNA IMUNOLÓÓGIAGIALABORATLABORATÓÓRNE METRNE METÓÓDYDY

PRIETOKOVPRIETOKOVÁÁ CYTOMETRIACYTOMETRIA

RNDr. Mira Horváthová, PhD.

ÚKIA, LF SZU v Bratislave akademický rok: 2014/2015

Oddelenie klinickej imunológie

• Laboratórium bunkovej imunológie a prietokovej

cytometrie

• Imunochemické laboratórium

• Laboratórium tkanivových kultúr

Typy imunityz hľadiska efektorového

humorálna imunita

sprostredkovanáprotilátkami, komplement, CRP

bunková imunita

celulárnafagocyty, NK bunky, lymfocyty

Základné formy bunkovej imunity

získaná imunitašpecifická, adaptívna

vrodená imunitanešpecifická, prirodzená

druhová, kmeňová, individuálna

NešpecifickáFagocytujúce bunky

Bunky NKBazofily, žírne bunky

ŠpecifickáCD4+ lymfocytyCD8+ lymfocyty

Pamäťové bunky CD45RO

Zložky

Bunková imunita

Imunita, ktorú realizujú bunky patriace do imunitného systému.

špecifická bunková imunita

T- a B-lymfocyty

prirodzená alebo nešpecifická bunková imunita

profesionálne fagocyty - neutrofily, eozinofily, monocyty/makrofágy

prirodzené cytotoxické bunky - NK bunky

bazofily, žírne bunky (mastocyty)

dendritické bunky – bunky prezentujúce antigén – predstavujú spojku medzi nešpecifickou a špecifickou zložkou imunity

QuickTime™ and a TIFF (LZW) decompressor are needed to see this picture. QuickTime™ and aTIFF (LZW) decompressorare needed to see this picture.

adaptívnaimunita

natívna imunita

Bunkové línie

Robert Beatty mcb.berkeley.edu

• dostatočne široké spektrum vhodných imunologických metód

• znalosť klinickej hodnoty imunologických vyšetrení

• racionálna indikácia imunologických vyšetrení

• komplexné hodnotenie výsledkov vyšetrení s klinickým stavom

Predpoklady racionálnej diagnostiky

VyVyššetrenie bunkovej imunityetrenie bunkovej imunity

• analýza živých buniek• správny odber

EDTA, heparín• uchovávanie vzoriek pri

izbovej teplote• rýchly transport materiálu

do laboratória

• krv

• BAL

• cerebrospinálna tekutina

• synoviálna tekutina

StanovenieStanovenie imunologickýchimunologických parametrovparametrov

•Akútne štádium ochorenia •Skríningové vyšetrenia•Monitorovanie liečby

• Autoimunita

• Zápal

• Hypersenzitivita

• Alergia

• Imunodeficiencia

• Normálna funkcia

• Deficiencia alebo funkčnánedostatočnosť

• Hyperaktivita alebo neprimeranáaktivita

Sledovanie bunkových imunitných Sledovanie bunkových imunitných

mechanizmovmechanizmov

• Počet leukocytov a diferenciálny leukogram

• Vyšetrenie subpopuláciílymfocytov

• Expresia adhezívnychmolekúl

• Funkčná aktivita T a B lymfocytov, NK buniek

• Funkcie neutrofilov, bazofilov, eozinofilov,

monocytov/makrofágov

Laboratórne metódy klinickej imunológie

MikroskopiaBurkerova komôrka

Krvný náter

Fuchs-Rosenthalová komôrka

Hematologický analyzátorKrvný obraz

Diferenciál

Prietokový cytometerRelatívny a absolútny

počet leukocytov

Počet leukocytov a diferenciálny leukogram

Krvný náter I.

The Image Atlas - Carden Jennings Publishing Co., Ltd.

lymfocytmonocyt

The Image Atlas - Carden Jennings Publishing Co., Ltd.

neutrofil

eozinofil

bazofil

Krvný náter II.

Hematologické analyzátory

plne automatizovanplne automatizovanéé systsystéémymy -- krvný obrazkrvný obraz (KO) a/alebo (KO) a/alebo diferencidiferenciáálny lny popoččet et ((DiffDiff) ) –– rerežžim KO alebo KO/im KO alebo KO/DiffDiff

dva základné princípy merania - optický (analýza prechádzajúceho svetla, rozptýleného svetla, fluorescencia) a impedančný

z merania získavame informacie o počte buniek (kvantitatívna analýza) a veľkosti, tvare a zložení buniek (kvalitatívna analýza)

princípy meraní môžu byť na jednotlivých analyzátoroch rôzne kombinované

technológie využívajú: : absorbanciu, cytochémiu, fokusovanú prietokovúimpendanciu; laserový systém charakterizuje bunkový povrch, tvar a reflektivitu

princíp variability impedancie -- bunky so slabou elektrickou vodivosbunky so slabou elektrickou vodivosťťou ou prechprecháádzajdzajúú úúzkym kalibrovaným otvorom,zkym kalibrovaným otvorom, prerupreruššujujúú tok prtok prúúdu du –– stanovenie stanovenie popoččtu tu ččastastííc a ich vec a ich veľľkosti na zkosti na zááklade poklade poččtu a výtu a výššky elektrických impulzovky elektrických impulzov

Typy hematologických analyzátorov

� s 3-populačným diferenciálnym rozpočtom WBC

� s 5-populačným diferenciálnym rozpočtemWBC

WBC = leukocyty, RBC = erytrocytyWBC = leukocyty, RBC = erytrocytyNE#, NE% = NE#, NE% = neutrofilyneutrofilyLY#, LY% = LY#, LY% = lymfocytylymfocytyMO, MO% = MO, MO% = monocytymonocytyEO#, EO% = EO#, EO% = eozinofilyeozinofilyBA#, BA% = BA#, BA% = bazofilybazofily

HgbHgb = hemoglob= hemoglobíín, HCT = n, HCT = hematokrithematokrit (relat(relatíívny objem erytrocytov vo vny objem erytrocytov vo vzorke krvi), MCV = stredný objem erytrocytov, MCH = stredný objvzorke krvi), MCV = stredný objem erytrocytov, MCH = stredný objem em hemoglobhemoglobíínu, MCHC = strednnu, MCHC = strednáá koncentrkoncentráácia hemoglobcia hemoglobíínu v erytrocytenu v erytrocyte , , RDW = RDW = šíšírka distriburka distribuččnej krivky erytrocytov, PLT = nej krivky erytrocytov, PLT = trombocytytrombocyty, MPV , MPV = stredný objem = stredný objem trombocytovtrombocytov

Krvný obraz a diferenciKrvný obraz a diferenciáálny polny poččet leukocytovet leukocytov

Referenčné hodnoty leukocytov v krvi

% 10e3/ul

WBC 4,0 - 11,0

NE 45,0 - 70,0 NE# 2,0 - 7,50

LY 20,0 - 40,0 LY# 1,50 - 4,00

MO 3,0 - 10,0 MO# 0,20 - 0,80

EO 1,0 - 5,0 EO# 0,04 - 0,35

BA 0,0 - 0,5 BA# 0,00 - 0,10

Hodnotenie výsledkov

� neutropénia (napr. HIV, SLE, TBC, protizápalové lieky, antihistaminiká)

� lymfocytopénia - znížená tvorba (napr. SCID); zvýšená deštrukcia (napr. SLE, myastenia gravis, cytostatická)

� eozinopénia (napr. kortikosteroidy, hemodialýza, akútne infekcie, trauma)

� lymfocytóza (infekčné ochorenia vírusového pôvodu)

� eozinofília (napr. astma bronchiale, alergická granulomatóza, eozinofilová leukémia)

� leukocytóza (napr. Wegenerova granulomatóza)

� neutrofília (infekčné ochorenia bakteriálneho pôvodu)

Laboratórne metódy klinickej imunológie

E-rozetové testyIzolácia lymfocytov

Mikroskopiafluorescenčná

Prietokový cytometer

Subpopulácie lymfocytov

Izolácia lymfocytov(napr. Ficoll-Verografin, Telebrix)

lymfocyty - prstenec

granulocytyerytrocyty

Ficoll-Verografínový gradient

plazmakrvné doštičky

E-rozetové testy

� určovanie počtu T-lymfocytov na základe tvorby E roziet

� hviezdicovitá adherencia ovčích erytrocytov na ľudskú T bunku cez LFA-3/CD2 interakciu

� aktívne a celkové E rozety - v závislosti od pomeru Ery/Lya doby odčítania

Prietoková cytomteria

� zlatý štandard stanovenia bunkových populácií

� rýchla metóda

� senzitívna

� automatizovaná

� štatistické spracovanie

Optický systém cytometra

bunková suspenzia

nosnákvapalina

laser

šošo

vky

prietokovákomôrka

vzorka

filtre

fluores

cenčn

ý

detektor

fluor

esce

nčný

detekto

r

šošovky

šošo

vky

počítač

procesor signálov

bočný svetelný rozptyl

predný svetelný rozptyl

Imunofenotypizácia

analýza heterogénnej bunkovej populácie, charakterizácia bunkových subpopulácií

Princíp:Bunky označené rôznymi fluorochrómami prechádzajú jedna za druhou prietokovou komôrkou cytometra, v ktorej ich pretína laserový lúč

Rozptýlené svetlo a emitovaná fluorescencia sú rozdelené systémom hranolov, optických filtrov a zrkadiel podľa vlnovej dĺžky emitovanej fluorescencie.

Metóda: : Imunofenotypizácia leukocytovv ľudskej periférnej krvi

• odber krvi do EDTA

• inkubácia krvi s monoklonovou protilátkou značenou fluorochrómom

• lýza červených krviniek lyzačným roztokom

• zastavenie reakcie

• analýza vzoriek na prietokom cytometri

Identifikácia buniek – CD znaky

� CD (Cluster of Differentiation; súbor povrchových znakov)

� T-lymfocyty: CD3+, CD3+CD4+ (pomocné), CD3+CD8 (cytotoxické)

� aktivované T-lymfocyty: CD3+HLADR+

� B-lymfocyty: CD19+

� NK bunky: CD3-CD(56+16)+

� monocyty/makorofágy: CD14+

� leukocyty: CD45+

� CD4/CD8 = IRI, imunoregulačný index

Referenčné hodnoty diferenciačných antigénov lymfocytov

% absolútny počet

10e3/ul

CD3+ 64,00 - 81,90 0,77 - 2,20

CD3+CD4+ 36,50 - 53,90 0,39 -1,34

CD3+CD8+ 21,80 - 36,40 0,50 - 0,99

CD3-CD(16+56)+ 4,00 - 27,00 0,09 - 0,50

CD3+/HLA-DR+ 2,40 - 11,80 0,04 - 0,38

CD19+ 7,20 - 18,40 0,10 - 0,53

CD4/CD8 IRI 0,90 - 2,60

Povrchové adhezívne molekuly

veľká rodina imunoglobulín - napr. ICAM-1 (CD54), VCAM (CD106), CD2, LFA-3 (CD58), signalizačné receptory CD28 a CTLA-4 a ich ligandy CD80 a CD86, antigénne špecifické receptory TCR a BCR, MHC gp I a II, koreceptory lymfocytov CD4 a CD8 a inéintegríny - CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18selektíny - CD62L, CD62P, CD62Emucíny - MAdCAM, GlyCAM-1, CD43

Aktivačné markery

CD69 (lektín)CD25 (receptor pre IL-2)CD71 (transferín)HLADR

Význam imunofenotypizácie

� diagnostika a klasifikácia primárnych a sekundárnych imunodeficitov

� určovanie pôvodu a klasifikácia leukémií a lymfómov

� monitorovanie imunoterapie a chemoterapie u imunodeficientných stavov a malígnych ochorení

� diagnostika a monitorovanie autoimunitných ochorení

� monitorovanie imunity po transplantácii orgánov

� posudzovanie stavu imunity pri infekcii vírusom HIV

LaboratLaboratóórne metrne metóódy klinickej imunoldy klinickej imunolóógiegie

Fagocytárna aktivita %

Fagocytárny indexMikroskopia

Prietoková cytometria

Respiračné vzplanutietest INT

Chemiluminiscencia

Prietoková cytometria

Cídna aktivitaMikroskopia

Prietoková cytometria

Funkčné testy granulocytov

Fagocytózanešpecifická imunitná odpoveď

� profesionálne fagocyty - Ne, Eo, Mo/Ma

� funkcia fagocytov

efektorová - fagocytóza a eliminácia mikroorganizmov za účasti baktericídnych látok (napr. defenzíny) a hydrolytických enzýmov (napr. lysozým)

regulačná - produkcia cytokínov, prostaglandínov, leukotriénov a pod.

Proces fagocytózy

1. rozpoznanie a adhézia

2. ingescia a tvorba fagozómu

3. fúzia lyzozómu a fagozómu –fagolyzozóm, degranulácialyzozómu

4. usmrtenie, inaktivácia a degradácia

5. exocytóza - vylúčenie

Metóda: Fagocytárna aktivita a fagocytárny index

test sleduje ingesciu častíc fagocytmi

• FA - % fagocytujúcich buniek, ktoré obsahujú 1 a viac pohltených častíc

• FI - priemerný počet častíc, ktoré pohltil jeden fagocyt

• mikroskopia: May-Grünwald a Giems-Romanovski roztok

• prietoková cytometria: fluorescenčne značené častice

Referenčné hodnoty - fagocytóza

FA % 75,00 - 95,00

FI 1,25 - 4,00

Respiračné vzplanutie

� aktivácia NADPH-oxidázy - vznik NADP+ a superoxidovéhoradikálu O2

-, z ktorého ďalšími reakciami vzniká tzv. singletový kyslík, peroxid vodíka a hydroxylový radikál –tzv. reaktívne kyslíkové intermediáty (ROI)

� účinným mikrobicídnym prostriedkom fagocytov je aj oxid dusnatý (NO), produkuvovaný enzýmovým komplexom NO syntáza - vznik reaktívnych intermediátov dusíka (RNI)

Stanovenie respiračného vzplanutia

INT testdôkaz schopnosti fagocytov produkovať superoxid a ďalšie reaktívne formy kyslíka

zafarbenie roztoku jódnitrotetrazólia (INT) pri inkubácii leukocytov a fagocytovateľných častíc; intenzita zafarbenia je úmerná schopnosti leukocytov usmrcovať baktérie po ich fagocytóze

chemiluminiscenčný test

chemiluminiscencia - fenomén svetelnej emisie oxidačných produktov chemických reakcií, uvoľnenie energie; amplifikátorsvetelnej energie je luminol; detekcia luminometrom

Stanovenie respiračného vzplanutia- prietoková cytometria

sledovanie produkcie kyslíkových radikálov

• nefluorescenčná látka vstupuje do buniek a oxiduje sa v nich (napr. dihydrorhodamin 123→rhodamin 123, DHE→EB)

• po excitácii svetlom vlnovej dĺžky 488 nm dochádza k emitácii zeleneného alebo červeného svetla

Stanovenie mikrobicídnej aktivity fagocytov

sledovanie ingescie a schopnosti fagocytov usmrtiť mikrób

� určuje sa počet usmrtených mikróbov fagocytmi

� mikroskopické vyhodnotenie - farbenie mŕtvych mikróbov metylénovou modrou

� prietoková cytometria - intracelulárne poškodenie baktérií alebo kvasiniek sa stanoví propidium jodidom po izolácií leukocytov a ich osmotickej lýze

Význam funkčných testov granulocytov

dagnostika primárnych/sekundárnych deficiencií fagocytózy a sledovanie funkčných a metabolických porúch fagocytov

napr. chronická granulomatózna choroba, deficiencia myeloperoxidázy, deficiencia tuftsínu, syndróm lenivých leukocytov, deficiencialeukocytovej adhézie, prechodná dysfunkcia neutrofilov, Downovsyndróm, kryoglobulinémia