KROMATOGRÁFIA - BMEiaachem.bme.hu/system/files/KROMATOGRAFIA GC-HPLC.pdf · 7 Történet • 1897...
179
1 KROMATOGRÁFIA Előadás BSc. hallgatóknak Dr. Balla József 2016. őszi félév
Transcript of KROMATOGRÁFIA - BMEiaachem.bme.hu/system/files/KROMATOGRAFIA GC-HPLC.pdf · 7 Történet • 1897...
11
KROMATOGRÁFIA
Előadás BSc. hallgatóknak
Dr. Balla József
2016. őszi félév
22
A kromatográfia
felfedezője és névadója
Mihail Szemjonovics
Cvet
(1872-1919)
33
Kromatográfia
44
Edgar Lederer (1908-1988)
Richard Kuhn(1900-1967)
1938 Nobel-díj abszorpciós
kromatográfia
Zechmeiter László(1889-1972)
Cholnoky László(1899-1967)
Karotinoidok
Die chromatographische Adsorptionsmethode. Grundlagen,
Methodik, Anwendungen, Wien, 1937
55
A megoszlási kromatográfia terén végzett
munkásságukért 1952-ben Nobel-díj
kaptak.
A GC KEZDETE
Archer John Porter
Martin
Richard Laurence Millington
Synge
66
Kováts Ervin, Horváth Csaba
77
Történet
• 1897 D.T.Day fullerföld, nyersolaj
• 1906 M.Zwett. A kromatográfia felfedezője és névadója. Chroma graphien, crm gro
• 1937 Zechmeister és Cholnoky (első könyv, angolul)
• 1937 Tiselius: Elektroforézis
• 1940 Ioncserélő kromatográfia Izmailov, Schreiber
• 1941 A.P.Matin és Synge. Megoszlási folyamatok
• 1944 Consden, Gordon, Martin: Papírkromatográfia
• 1952-58 E.Stahl: Rétegkromatográfia
• 1952 James, Martin: Gázkromatográfia
• 1957 E.Kováts: Retenciós index
• 1958 Golay: kapilláris GC
88
• 1961 G.Schay: A gázkromatográfia alapjai, Akadémiai Kiadó, 1961.
• 1963-66 Giddings: Egységes elmélet lehetősége
• 1965-68 Horváth, Huber, Snyder, Kirkland, Halász, SCOTT: HPLC
• 1978-79 Dandenau: kvarcüveg kapilláris
• 1976-80 Regnier, Horváth, Karger: biopolimerek elválasztása
• 1981-83 Jorgenson, Lukács: kapilláris elektroforézis (CE)
• 1982-85 Novotny, Lee: SCF
– GC-MS, HPLC-MS
99
Mozgófázis Állófázis
szilárd folyadék
GÁZKROMATOG-
RÁFIA (GC)
gáz GSzK (GSC)
gáz-szilárd
kromatográfia
GFK (GLC)
gáz-folyadék
kromatográfia
SZUPERKRITIKUS
FLUID
KROMATOGRÁFIA
(SFC)
szuperkritikus
fluidum
SFK (SFC)
FOLYADÉK-
KROMATOGRÁFIA
(LC)
folyadék FSzk (LSC)
VRK (TLC)
vékonyréteg
kromatográfia
IK (IC)
ionkromatográfia
GK (Gél)
gélkromatográfia
FFK (LLC)
PK (PC)
Papír
kromatográfia
1010
idő
A,
A+BA,B
állandómintaáram
AB D
Ac
Bc
állófázis
Detektor jel
1111
idő
A
A,B AB D
állófázis
Detektor jel
diszkrét
minta K
K
Ac c
KBc
K
1212
AB D
állófázis
Detektor jel
c cA B
cE
E
Aidő
idő
Detektor jel
integrális
differenciális
1313
109
2 2000600
GC
LC
IC
SFC
HPLC Gél
300
1414idő
a
c
d
rossz elválasztás: nem szelektívnem hatékony
szelektív
nem hatékony
hatékony
szelektív
hatékony
idő
idő
idő
mV
mV
mV
mV
b
nem szelektív
1515
GC
1616
A gázkromatográfiás elválasztás leírásának
alapkérdései
• -a mozgófázis áramlásával összefüggő problémák
(áramlás szemcsés tölteten és üres csőben),
• -az anyagátmenetet leíró gázkromatográfiás
elméleti megközelítések,
• -a jellemző molekulakölcsönhatások,
• -a koncentrációeloszlás, csúcsalak és az elválasztás
jellemzésére vonatkozó
legfontosabb ismeretek.
1717
Retenció
• Retenciós idők
• Retenciós térfogatok
• Relatív retenció
A
tR A,
B
tR B,
C
tR C,
a mintabemérés pillanataidő
mV
vivőgáz
mintabemérő detektor
kolonna
1 2
tR
tM
1818
Kromatográfiás alapösszefüggések I.
• Bruttó retenciós idő tR
• Holtidő tM
• Redukált retenciós idő t’R= tR - tM
• Kolonnahossz L
• Lineáris áramlási sebesség u
• Megoszlási hányados
• Retenciós tényező
• Csúcsszélesség w
• Relatív csúcsszélesség w/ tR
• Tányérszám N
• Elméleti tányérmagasság HETP=L/N
m
s
c
cK
m
s
M
MR
n
n
t
ttk
1919
Gázkromatográfiás
alapfogalmak
• Megoszlási hányados
• Szelektivitás
• Hatékonyság
• Felbontóképesség
h
h1/2
w
= w = ln 22
ln 22
A = h
=m
Vc max
R
N
2
tR
c max
c(t) 0,607h
w =4
2 2
><
><
>< ><w1
tR2
tR1
w2
><
alapvonal
mV
idő
tR
k
kNRs
1
1
4
512
12
12,
ww
ttR
,R,Rs
2020
Kromatográfiás alapösszefüggések II.
1. A szükséges, de elégséges felbotóképesség.
Általában:
2
2,16
w
tN
R ( )N
LH illetvemaxN minH
11
2
1,
2,
1,
2,
k
k
tt
tt
t
t
MR
MR
R
RM
MR
t
ttk
2. Érzékenység: detektálás!
3. Elemzési idő
u
H
k
kRk
u
NHktt
n
nsnnonR 2
32
2
,
1
11611
5,1212
1,2,
ww
ttR
RR
sk
kNRs
1
1
4
hatékonyság
szelektivitás retenció
2121
L , t
dx
dp
xp,u,F
pi iu iF, , po uo Fo,,
u = ?
M
dx
dpKu
p
puup oo
p
upu oo
dx
dpK
p
up poo
o
i
p
p
p
L
o
oo pdpKdxup
L
o
L
o
Mooup
pdx
u
dxt
jupp
ppuu o
oi
oio
1)/(
1)/(
2
33
2
)(2
22oioo pp
KLup
p )(
3
33
2222
2
oi
oo
L
o oo
M ppup
Kdp
up
Kpt
pp
Mt
Lu
)(
13
33
22
oi
oo
ppK
upLu
p
)(
)(
2
333
2222
oi
oi
oo
oo
pp
pp
upL
upLu
2222
>F , co
< >dx
dco dxtxcF o
dxxcvcvt mmss
dxx
cvcvt
dxtx
cF mmss
o
vs=Vs/L és vm=Vm/L
xt
c
xc
c
xt
c m
m
ss
állandóxccK ms m
ms
m
t
o vxt
cv
xt
cK
x
cF
1
xc
t
ct
x
tx
c
mm
m
msm
m
m
vKvxt
c
ct
x
xt
c
F
m
z ctxu
msmsz
VKVL
vKvu
F
1 uFL
KV Vz
s m
msR VKVV
2323
tR
c
cmJelc0,1
c0,2
c0,3
a b c
s
c0,1c0,2c0,3
2424
c
v
N - 1 N N + 1
vm vmc vm
vsv
c
cm ( N-1 )
c( N-1 )s
m (N-1)
mN
c Ns
cmN
cm (N+1)
cs (N+1)
s s
o
N,ssN,mmN,m)N(m dcvdcvdV)cc( 1
N,m
N,s
c
cK
N,msN,mmN,m)N(,m KdcvdcvdV)cc( 1 Nmsm dcKvv ,)( effsm vKvv
effN,m)N(,m
N,m
v
dV
cc
dc
1
o
N,mN
c
cy
effv
V
dyy
dy
NN
N 1
!N
ey
N
N
100
N
)N(
N eN
y 2
2
2
1
2525
A van Deemter egyenlet
u
D
d
k
k
u
DdH
s
fmp
2
213
222
g uC
u
BAH s
zónaszélesség
kezdetben
zónaszélesség
egy t idő után
2626
HETP-u
v
Cs . u
A
H
( mm )
B/ u
=0,409 H min
=8,7 opt
u ( cm/s ) 10 15 20
u
0 5
0
0,5
1
H - u
uCu
BAH s
2727
A Golay egyenlet
uD
d
)k(
ku
D
r
)k(
kk
u
DH
s
f
m
cm2
2
2
2
2
13
2
124
11612
uCuCu
BH sm
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
5 10 20 25 30 35 40 45 50 15
H
( mm )
H =0,27 min
0
opt =29,2 u
u (cm/s)
H u
u B / m u C .
. u C s
2828
H B C Cm smin ( ) 2 uB
C Copt
m s
df (m) Cm (%) Cs (%)
0,25 98 2
0,50 82 l8
1,00 67 33
2,00 45 55
5,00 15 85
uD
r
)k(
kk
u
DH
m
cm2
2
2
124
11612
ccmin dr,H 911c
mopt
r
D,u 12
2929
Vékonyfilmes: df < 1 Cm > Cs ( > 100 )
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
H(mm)
u (cm/s)
B/u
Cmu
Csu
40 mm/s2
; Cm =B = 3.10-4
s
Hmin. = 0,22 mm
u opt. = 36,5 cm/s
CsCm >>
Vastagfilmes: df > 1 Cs > Cm ( < 100 )
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
H(mm)
u (cm/s)
Csu
CmuB/ u
C s>> Cm
B&B Analitika Kft.
Kutatás, Fejlesztés, Tanácsadás, Oktatá[email protected]
3030
Relatív retenció:
500 600 700 800 900 1000
100
_
_
lg t'R
lg t'R n
lg t'R n
lg t'R n +1
lg t'R n +1
lg t'R x
lg t'R x lg t'R n
IxI
100_
xI n
AB'
B
C
C'
It t
t tnx
R x R n
R n R n
100 1001
lg lg
lg lg
, ,
, ,
rt
t
V
V
k
k
R
R
R
R2 1
2
1
2
1
2
1,
,
,
,
,
3131
Az elválasztás jellemzése
5,11
1
4
k
kNRs
2
2
22
2 1
116
k
kRN sreq
11
1
4
f
l
sp
k
kln
R
Nn
SN TZt tR n R n
n n
, ,1
1
1
u
H
k
kRk
u
NHktt
n
nsnnon,R 2
322 1
11611
3232
N
20 103
40 103
60 103
80 103
20 103
20 103
20 103
20 103
20 103
20 103
/1N k /4 k/(1+k) Rs
1,05 5 35,35 0,05 0,83 1,47
1,05 5 50,00 0,05 0,83 2,08
1,05 5 61,23 0,05 0,83 2,54
1,05 5 70,70 0,05 0,83 2,93
1,10 5 35,35 0,09 0,83 2,64
1,15 5 35,35 0,13 0,83 3,81
1,20 5 35,35 0,17 0,83 4,99
1,05 10 35,35 0,05 0,90 1,60
1,05 15 35,35 0,05 0,94 1,66
1,05 20 35,35 0,05 0,95 1,68
3333
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20 k
N
.10320 .10340 .10360 .10380
1,05 1,10 1,15 1,20
R s
k)R s =f(
NR s =f( )
R s =f( )
3434
GC-s kolonnák
Szemcsés töltetű
kolonnák
makro töltetű
mikro töltetűadszorpciós
megoszlásos
adszorpciós
megoszlásos
adszorpciós
megoszlásos
kolonnák
PLOT
WCOT
SCOT
kapilláris méretű)(
Kapilláris
3535
Kapilláris kolonnák
PLOT
kapilláris cső fala porózus adszorbens réteg mm
kapilláris 2rc = 0,05 1 mm
WCOT
SCOT
hordozó, 0,1-3 mm
hordozó
megosztófolyadék,
0,01-5mm
megosztófolyadék, 5-20 mm
megosztófolyadék,
mm 0,01-5
3636
10
100
1000
5000 3000 15005
2,5
0,5
1,5
200 500400
NB
ST
WB
belső átmérő, mm
hatékonyság
mm
filmvastag
ág
s
a
a
a
i
im
nt
k
p
c
tásng
104
104
3737
Belső átmérő
(mm)
Filmvastagság
(mm)
Fázisarány
( )
Mintakapacitás
(ng)
0,2 0,1
0,2
500
250
10-20
30-40
0,25 0,1
0,25
1
625
250
63
30-40
100-150
400-500
0,32 0,1
0,25
1
800
320
80
50-70
100-200
400-500
0,53 0,1
0,25
1
5
1325
530
133
27
50-100
200-300
1000-1500
8000-10000
3838
CP
I
I
i
F
i
i
OV
i
1
5
275
1
5100
I I ax by cz du es
I I ax by cz du es
I I ax by cz du es
F sq
F sq
F sq
1
2
5
1 1 1 1 1
2 2 2 2 2
5 5 5 5 5
.............................................
.............................................
.
I I Ii
FiF
isq
, I I Ii
OViOV
isq
275 275
McReynolds (1970)
Rohrschneider
3939
A megosztó-folyadék neve Min.
max.hôm.C
Oldó-
szer
Benzol 1-Butanol 2-Pentanon 1-Nitro-propán Piridin Summa CP-index
Apiezon L 50/300 C,T 32 22 15 32 42 143 3
Butándiol-szukcinát 50/225 C 370 571 448 657 611 2657 63
Carbowax 1540 50/175 C 371 639 453 666 641 2770 66
Carbowax 4000 60/200 C 317 545 378 578 521 2339 55
Carbowax 4000 mono-
sztearát
60/200 C 282 496 331 517 467 2093 50
Carbowax 20M 60/225 C 322 536 368 572 510 2308 55
Carbowax 20M-tereftálsav 60/225 C 321 537 367 573 520 2318 55
Dexsil 300 50/450 T 47 80 103 148 96 474 11
Dexsil 400 50/400 T 72 108 118 166 123 587 14
Dexsil 410 50/400 T 72 286 174 249 171 952 23
DEGA 0/200 A 378 603 460 665 658 2764 66
DEGS 20/200 A 496 746 590 837 835 3504 83
Squalan 20/100 T,C 0 0 0 0 0 0 0
EPON 1001 50/225 A,C 284 489 406 539 601 2319 55
Etilénglikol-szukcinát 100/200 C 537 787 643 903 889 3759 89
FFAP 50/250 C 340 580 397 602 627 2546 60
4040
A megosztófolyadék neve Min.max.hôm.C Oldószer Benzol 1-Butanol 2-Pentanon 1-Nitropropán Piridin Summa CP-index
SE-30 50/300 C 15 53 44 64 41 217 5
SE-52 50/300 C,T 32 72 65 98 67 334 8
SE-54 50/300 C,T 33 72 66 99 67 337 8
XE-60 0/250 A 204 381 340 493 367 1785 42
OV-1 100/350 C,T 16 55 44 65 42 222 5
OV-3 0/350 C,T 44 86 81 124 88 423 10
OV-7 0/350 C,T 69 113 111 171 128 592 14
OV-11 0/350 C,T 102 142 145 219 178 786 19
OV-17 0/375 C,T 119 158 162 243 202 884 21
OV-22 0/350 C 160 188 191 283 253 1075 25
OV-25 0/350 C 178 204 208 305 280 1175 28
OV-73 0/325 T 40 86 76 114 85 401 10
OV-101 0/350 C 17 57 45 67 43 229 5
OV-210 0/275 A 146 238 358 468 310 152 36
OV-275 25/250 A 629 872 763 1106 849 4219 100
OV-1701 0/250 C 67 170 153 228 171 789 19
4141
4242
4343
4444
SGE Restek Quad-rex JW HP Chrom-pack Allteck Supel-co Minõség
BP-1 Rtx-1 007-1 DB-1 HP-1
Ultra-1
CP-Sil 5CB AT-1 SPB-1 SE-30, OV-1,
OV-101,
SP-2100
BP-5 Rtx-5 007-2 DB-5 HP-5
Ultra-2
CP-Sil 8CB AT-5 SPB-5 SE-54, SE-52,
OV-73
BP-10 Rtx-1701 007-1701 DB-1701 - CP-Sil
19CB
AT-1701 SPB-1701 OV-1701
- Rtx-50 007-17 DB-17 HP-50
HP-17
- AT-50 SPB-50 OV-17, OV-2250
BP-21 Stabilwax-
DA
007-FFAP DB-FFAP HP-FFAP CP-Wax
58CB
AT-1000 Nukol SP-1000, FFAP
- Rtx-2340 - - - CP-Sil 88 - SP-2340 SP-2340, OV-275
PONA - 007-1-50-
0.5F
- PONA Squalane - Petro
col 50.2
Squala-ne
BPX
624
Rtx-624 007-624 DB-624 HP-624 CP-Sil
13CB
AT-624 VOCOL -
- Stabil
wax-DB
- CAM - CP-Wax 51 - Carbowax
Amin
-
4545
T,Sz.
Ny. Á
K
B D
minta
segédgázok
E A/D
C
1
2
3
4
vivőgáz
forrás
(2-3 bar)
make-up split
szeptum
purge
GC általános felépítése
4646
Mintabeviteli megoldások
4747
kolonnára
minta be
vivőgáz
kolonnára
mintahurok
minta be
vivőgáz
a) b)
mintahurok
Gázminta bemérés
4848
Mintaáram elosztó: splitter elvi vázlata
vivőgáz
szeptum
"purge" gáz
üveg, kvarc betét(liner)
split
mintaáramleosztás
változtatható áramlásiellenállások
szeptum
kapilláris
kolonna
áramlás
szabályozó
fűtés
4949
Splitless bemérés
vivőgáz
kapilláris
kolonna
vivőgáz
kapilláris
kolonna
mikrofecskendő
zárva
zárva
nyitva
nyitva
a) b)
adszorbens adszorbens
5050
Oldószerhatás
idő
idő
Detektorjel
Detektorjel a
b
5151
PTV injektor
vivőgáz
szeptum
"purge" gáz
(liner)
split
mintaáramleosztás
változtatható áramlásiellenállások
szeptum
kapilláris
kolonna
áramlás
hűtés
kvarc betét
fűtés
szabályozó
programozott
programozott
kvarcgyapot
5252
GC-s detektorok
• 1. hővezetőképességi detektorok,
• 2. ionizációs detektorok,
• 3. fotometriás detektorok
• 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás
detektorok (MSD)
• 5. elektromos vezetőképességi detektorok,
• 6. oxigén szelektív detektor,
• 7. kombinált detektorok, stb.
5353
Melyik előnyösebb detektorként?
Z DAH DFH linearitási típus
LOD LOQ tartomány 1. 2.
MSD -
10-16A
10-15 g 10-10 g 104-105 Univerzális,
specifikus
koncentráció
FID 10-14 A 10-12
g/s
10-5 g/s 107 szerves tömegáram
érz.
ECD 10-14V 10-13 g 10-9 g 104 specifikus konc. érz.
FPD P - 10-12
gP/s
10-7 gP/s 105 (lgA-
lgc)
specifikus tömegáram
érz.
FPD S - 10-10
gS/s
10-7 gS/s 103 (lgA-
lgc)
specifikus tömegá.
ramérz.
PID 10-14 A 10-13 g 10-9 g 104 specifikus konc. érz.
5454
Követelmények a készülékekkel
szemben:
ex
RD
kol
Rtelj
N
t
F
V
N
tA
2
2
2222
1212
2222
kolexdetinj
5555
Fast GC k ∞
smmin CCBH 2sm
optCC
Bu
uD
r
u
DH
m
cm
24
2 2
Hmin= 0,6rc
c
mopt
r
D,u 96
5656
5757
GC-s detektorok
• 1. hővezetőképességi detektorok,
• 2. ionizációs detektorok,
• 3. fotometriás detektorok
• 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás
detektorok.
• 5. elektromos vezetőképességi detektorok,
• 6. oxigén szelektív detektor,
• 7. kombinált detektorok, stb.
5858
B
K
M R
vivőgáz
B
K
M R
vivőgáz
a) b)
B
K
vivőgáz M R
K
K
B
B vivőgáz
HWD, TCD kapcsolás
5959
vivőgáz
B
M R
B
M R
vivőgáz
moduláló
gázáram
moduláló
gázáram
mérőszál mérőszál
szabadba szabadba
X X
a) b)
mikro-TCD
6060
Az ionizációs detektorok
működési elve
1010
vivőgáz
energia
UR
R >
V=1V-1kV
o
o
elektródok
6161
FID elvi vázlata
anód (+)
katód (-)
kolonna
láng
tömítéshidrogén
levegő
6262
A lángban lejátszódó
folyamatok
2500 K
előmelegítőzóna
reakció zóna (pirolízis)
1500-2000 K
O2
O2
O2
O2
O2
oxidációs zóna
2 21. H HO2O+ + H. H 1 230,3 kJ
H + +2. 2O HO O kJH 2
67,8
+ kJH23. HO + O2HH H 3
-63,2
HO ++ HH24. O H 4 kJ4,4
kJ
Rekombinációs reakciók
H.2OH kJ+5. +HO XX + H5 -500
H X X+6. H + H2 + H 6 -436,3kJ
2O X+7. O O + X + H 7
-498,6 kJ
H1
7-1435
1. C Hn m
pirolízisC Hn . + (m-n) H.
+2. C Hn . On . OC Hn .oxidáció
On +CH +3. OC Hn . n eionizáció
6363
A FID jellegörbéje, érzékenysége
24 lnm
A
Fc
h
dt
dm
ha
i
i
max
i
max
i
iD
t
R i(A)
R i
(A)
I0I0
tg = aD
10-1210
-5g/s g/s
aD=R i
dni
dt
dn idt
24
12
lnM
nqa
i
cD M
g
6464
AFID
anód (+)
katód (-)
kolonna
láng
tömítés
hidrogén
levegő
RbCl
só
gyöngy
6565
sugár ionizációs
detektorok: Ar, He
+
-
Ni63
fólia
1000-2000 V-ospolarizációs
feszültség
Ar vivôgáz
kolonna
AreMMAr
AreArAr
eArAr
eV,
eV,
611
815
2
2
6666
ECD
kolonna
Ni63
fólia
kollektorelektród
+
katód
-
öblítő gáz
make-up gáz( )
be
öblítő gáz
ki
polarizációs
feszültség 1-10V
6767
Az ECD érzékenysége
imax
maxiio
max
max,i
max
iD
Mc
cI
c
R
c
ha
g
iiioD
MIa
1g
t
R i
(A)
V
t
t
5-150ms
ms1
Elektronkonc.
állandó feszültségű
üzemmód esetén
6868
Az ECD relatív érzékenysége
Vegyület Relatív
érzékenység
Vegyület Relatív
érzékenység
benzol 0,06 oktafluor-propán 1,0
aceton 0,50 trifluor-klór-metán 3,3
di-n-butiléter 0,60 trifluor-klór-etén 100
metil-butirát 0,90 pentafluor-klór-etán 170
1-butanol 1,00 1,1-difluor-2,2-diklór-etén 670
1-klór-bután 1,00 difluor-diklór-metán 3*104
1,4-diklór-
bután
15,00 kloroform 3,3*104
klór-benzol 75,00 1,1,2-triklór-etén 6,7*104
1,1-diklór-
bután
111,00 bróm-trifluor-metán 8,7*104
1-bróm-bután 280,00 1,1,2-trifluor-1,2,2-triklór-etán 1,6*105
bróm-benzol 450,00 1,1,1-trifluor-2-bróm-2-klór-
etán
4,0*105
kloroform 6*104 1,1,1,2,2,3,3-heptafluor-3-jód-
propán
6,0*105
1-jód-bután 6*104 1,1,2,2-tetrafluor-1,2-dibróm-
etán
7,7*105
széntetraklorid 6*104 fluor-triklór-metán 1,2*106
6969
PID DID
kolonna
Xelámpa
kvarcablak
(-)
(+)
He
kolonna
szikrakisülés
(-)
(+)
He
vivőgáz
7070
FPD
PM PM
FID monitorelektród
FID monitorelektród
hűtő
interferenciaszűrő
interferenciaszűrő
H2
H2
H2
levegő
levegő
levegő
++
- -
kolonna
kolonna
a b
H2 + levegő
PM
levegő
gyújtó
kolonna
P,S szűrő
7171
AED
479,6 nm
Ar make-up gáz
hűtővíz
plazma
kvarc ablak
kolonna
tükör
diffrakciós rács
fókuszáló rés
diódasordetektor
O 777,2 nm
F 685,6 nm
C 495,7 nm
H 486,1 nm
Br 478,6 nm
S 180,7 nm
P 178,1 nm
N 174,2 nm
Clenergia
7272
Fontosabb detektorok jellemzői
Z DAH DFH aD Linearitási
tartomány
Típus 1. Típus 2.
TCD - 10-6 g 10-1 g 106
mVcm3/m
g
104-105 univ. konc.
FID 10-14 A 10-12 g/s 10-5 g/s - 107 szerves tömegára
m érz.
ECD 5-6 V 10-13 g 10-9 g - 104 spec. konc.
FPD P - 10-12 gP/s 10-7
gP/s
- 105 spec. tömegára
m érz.
FPD S - 10-10 gS/s 10-7
gS/s
- 103 spec. tömegára
m érz.
PID 10-14 A 10-13 g 10-9 g - 104 spec. konc.
MS 10-6 V 10-15g 10-9g 104-106 univ.
szelektív
7373
Mindennapi feladataink:
1. az irodalom követése,
2. a mintavétel, mintaelőkészítés problémáinak
áttekintése,
3. a gázkromatográfiás elválasztás,
4. a minőségi azonosítás, mennyiségi elemzés
kérdéseinek eldöntése,
5. az eredmények megadása és dokumentálása,
valamint
6. az eredmények hihetőségének a bizonyítása,
7. gyakori feladat a készülék hibáinak felismerése és
elhárítása.
7474
Gyakorlati alkalmazások
• Permanens gázok mennyiségi elemzése
• Szénhidrogénipari elemzések
• Környezetvédelmi analízis
• Gyógyszeripari elemzések
• Élelmiszerek, mezőgazdasági termékek
gázkromatográfiás vizsgálata, stb.
7575
HPLC
7676
A HPLC-s elválasztás
• Célja: minden termikusan érzékeny nemionos, ionos és
ionizálható szerves és szervetlen alkotók eredményes
elválasztása és a identifikálása, azaz a szükséges és
elégséges felbontóképesség biztosítása:
5,1212
1,2,
ww
ttR
RR
s
k
kNRs
1
1
4
7777
Hatékonyság
Szelektivitás
Kapacitás
7878
A szorpciót eredményező kölcsönhatások:
• 1. diszperziós: apoláris-apoláris (hidrofób)
• 2. indukciós: apoláris-poláris
• 3. orientációs: poláris-poláris
• 4. H-hidas: donor-akceptor
• 5. ionos
• 6. biospecifikus
• 7. molekulaméret MINTA
» S M
» (álló) (mozgó)
7979
Szelektivitás:
állófázis megválasztása
eluens összetétel megválasztása
izokratikus
gradiens elúció
hőmérséklet szerepe
8080
Az elválasztás hatékonysága I.
u
D
d
k
k
u
DdHETP
s
pmp
2
213
222
g
van Deemter egyenlet:
uCu
BAH m
• : töltési tényező
• dp: a kolonnatöltet átlagos szemcseátmérője
• Dm: az alkotó lineáris diffúziós állandója a mozgó fázisban
• g : a töltet zeg-zugosságát kifejező tényező
• u : az eluens lineáris áramlási sebessége
• k : a retenciós tényező
• Ds : az alkotó lineáris diffúziós állandója az álló fázisban
8181
Az elválasztás hatékonysága II.
• A : az áramlási egyenetlenségekből származó csúcsszélesedés
– („eddy-diffusion”)
• B : a diffúzió csúcsszélesítő hatása
• Cs : az anyagátadás csúcsszélesítő hatása
• Knox-egyenlet:
m
p
p
s
/
D
ud
d
Hh
CB
Ah
31
8282
Az elválasztás hatékonysága III.
• Cs= Hanyagátadás= Háramlásidiff+ Hfilmellenállás + Hpórusdiff+ Hkinetikai
uD
d
)k(
kcH
m
p
aáramlási
2
2
1
0
22
0
22
00
)1()1(30
)(
kDkk
udkkkkH
m
pórus
pórusdiff
ad
kinkkk
k
kkk
kH
2
0
2
2
0 )1)(1(
2
)1)(1(
2
8383
u0
0,005
0,010
0,015
0,020
0 1
0,3
2 3
0,9
4
1,1 cm3/min
H( mm )
H - u Hmin =0,0065 mm
uopt=1,7 ( cm/s )
.Cs uuB/
A
8484
Áramlás szemcsés tölteten
• : az eluens viszkozitása
• : a kolonna áramlási ellenállása
2
pd
Lup
8585
HPLC-s elválasztások:
• 1. Normál fázisú (NP)
• 2. Fordított fázisú (RP)
• 3. RP ionpár kromatográfia
• 4. Ioncserés kromatográfia
• 5. HILIC
• 6. UHPLC
• 7. Méretkizárásos
• 8. Affinitás kromatográfia
• 9. Hidrofób kölcsönhatáson alapuló
• 10. Konvergens kromatográfia
• 11. Folyadék-folyadék megoszlásos
• 12. Elektrokromatográfiás módszerek
8686
LC módszer Állófázis minősége Mozgófázis minősége
NP-HPLC, normálfázisú kr. poláris töltet apoláris
RP-HPLC, fordított fázisú kr. apoláris töltet poláris
IC ionkromatográfia
-ionpár kromatográfia apoláris töltet poláris eluens+ionpárképző
-ioncserés kromatográfia
(HPIC)
töltéssel rendelkező töltet puffer oldat
-ionkizárásos kromatográfia kationcserélő töltet puffer oldat
SEC, méretkizárásos
kromatográfia
pórusos töltet víz, vagy szerves oldószer
HIC, hidrofób kölcsönhatáson
alapuló kromatográfia
hidrofób felületű töltet sótartalmú oldat: csökkenő
sókoncentráció
HILIC, hidrofil kölcsönhatáson
alapuló kromatográfia
erősen poláris töltet apoláris, majd növekvő
polaritású
Oszlopos megoldású HPLC módszerek
87
A szilikagél mint állófázis alapanyag:
polikovasavak halmaza
a leggyakrabban használt állófázis
• Fajlagos felülete: 200-400 m2/g
• Pórusmérete: 20-100A (2-10nm)
• Pórustérfogat: 0,1-3 cm3/g
• Szemcseméretek: 1,3; 1,7; 3; 5 µm
• Módosított szilikagél carbon telítettsége: 5-20%
8888
8989
9090
9191
9292
9393
9494
9595
Méretkizárásos kromatográfia
9696
9797
toluene - ethyl acetate (93:7 v/v), next sprayed with vanillin in H2SO4 and heated. From left to right oils
from: bergamot, cedar, eucalyptus, syzygium, malaleuca, lavandula, mint, orange, pine, spruce.
Identified components: B1 and L1 - linalol, B2 and L2 - linalyl acetate, E1 - cinneol, G1 - eugenol, G2 -
carryophyllene. Doubtfully identified components - C1 - cedrol, M3 - menthol, P1 - limonene.
Rétegkromatográfia
9898
HPLC Töltetek fejlődése
Őskor: Szabálytalan, 100 -300 µm, gravitáció
(-1966)
Kőkor: Szabálytalan, 30 -100 µm (40 -70 µm)
(1965-1969) Száraz töltés, kényszeráramlás (pumpa)
Első generáció: Szabálytalan, 10 -15 µm Porózus felületű,
(1970-) Iszapfázisú töltés, hatásosság
Kémiailag kötött ( fordított) fázisok
Polimer gélek
Második generáció: Gömbalakú, 3 -5 µm Endcapping
(1980-) Tágpórusú (WP) töltetek (30 -400 nm)
Poláris (Diol, NH2, CN) fázisok
Hatásosság + szelektivitás
Polimer töltetek
Királis töltetek
9999
Harmadik generáció: Szintézis szilánokból, nagy tisztaság
(1990-) 3 -5 µm, Endcapping, védett (stabil)
fázisok (SB)
Hatásosság + szelektivitás + stabilitás
+ reprodukálhatóság
Nemporózus töltetek, 1-2 µm,
Gyorsaság
Monolit töltetek
Héjszerkezetű töltetek
100100
Töltetek anyaga
Szervetlen oxidok:
szilika gél
alumínium-oxid
TiO2, ZrO2
hidroxil-apatit (Ca3(PO4)2)
Szerves polimerek:
sztirol-divinilbenzol
poli-alkilmetakrilát
polivinil-alkohol-észter
poliéter
alkilált poliakrilamid
dextrán-akrilamid
Porózus grafitált karbon (PCG)
101101
Töltetek aktív részei
Adszorbens / normál fázisú: szilika-gél-SiOH
Alumínium-oxid Al2O3
Florisil Mg2SiO3
Diol -(CH2)3-OCH2-CHOH-CHOH
Amino -(CH2)3-NH2
Ciano -(CH2)3-CN
Fordított fázisú: Oktadecil -(CH2) 17-CH3
Oktil -(CH2)7-CH3
Etil -CH2CH3
Ciklohexil -CH2CH2-C6H11
Fenil -CH2CH2CH2-C6H6
Endcapping
Embedding
-CH2-CH2-CH2-CF3
102102
Ioncserélő:
anioncserélő: Amino -(CH2)3-NH2
Kvaterner amin -(CH2)3-N+- (CH3)3
kationcserélő: Karbonsav -(CH2)2COOH
Propil szulfonsav -(CH2)3SO2OH
Benzol szulfonsav -(CH2)3- -SO2OH
Királis fázisok: a,AGP, (R) Urea, (R)DBF
ciklodextrin
Affinitási töltetek: Fenilboronát
Biospecifikus ligandok
SEC töltetek: Silica
Polimer
HIC töltetek: Silica
Polimer
103103
NP-HPLC mozgó fázisokkal szembeni elvárások
– polaritás
– viszkozitás
– UV áteresztés
– tisztaság
– toxicitás mentesség
– forráspont
– oxigén oldódás
– víztartalom
– elegyíthetőség
– ár
104104
• Alap oldószerek:
• n-hexán
• n-heptán
• izooktán
• Oldhatóság növelők:
• diklór-metán
• diklór-etán
• kloroform
• Modifikátorok: észterek, éterek, alkoholok, stb.
NP-HPLC mozgó fázisok
105105
RP-HPLC mozgó fázisok
• acetonitril
• 1,4-dioxán
• etanol
• 2-propanol
• metanol
• tetrahidrofurán
• VÍZ
106106
Oldószerek jellemző adatai
Oldószer Refraktív
index
(20 ºC)
Polaritás
[P’]
Viszkozitás
[cP, 20ºC]
Forráspont
[ºC]
UV
Cut off
[nm]
Tetrahidrofurán 1.4072 4 0.55 66 212
Dioxán 1.4224 4.8 1.37 101.3 215
Acetonitril 1.3441 5.8 0.38 81.6 190
2-Propanol 1.3772 3.9 2.40 82.3 205
Etanol 1.3614 - 1.20 78 210
Metanol 1.3284 5.1 0.55 64.7 205
Víz 1.333 10.2 1 100 190
107107
Oldószerek jellemző adatai
Oldószer Oldószer
erősség
(εº)
Oldhatósági
paraméter
(δ)
Polaritási
index
(P’)
Sűrűség
[g/cm3]
Viszkozitás
[cP 20ºC]
Forráspont
[ºC]
UV
Cut off
[nm]
n-Pentán 0.00 7.1 0.00 0.626 0.22 36 200
n-Heptán 0.01 7.2 0.20 0.684 0.42 98 200
Izooktán 0.01 7.3 0.10 0.690 0.50 99 200
CCl4 0.14 8.6 1.60 1.594 0.97 77 265
Toluol 0.22 8.9 2.4 0.867 0.59 110 285
Dietiléter 0.29 7.4 2.90 0.708 0.24 35 220
Kloroform 0.31 9.3 4.10 1.483 0.57 61 250
Diklórmetán 0.32 9.7 3.10 1.327 0.44 40 250
Tetrahidrofurán 0.35 9.1 4.00 0.881 0.46 66 220
Metil-etilketon 0.39 9.8 4.70 0.805 0.40 80 330
Etilacetát 0.45 9.6 4.40 0.900 0.45 77 260
Acetonitril 0.50 11.7 5.80 0.786 0.37 82 210
2-Propanol 0.63 11.5 3.90 0.785 2.90 82 200
Etanol 0.68 12.7 4.30 0.791 1.20 79 210
Metanol 0.73 14.4 5.10 0.791 0.60 65 205
Víz >0.73 23.4 10.20 1.000 0.89 100 -
108108
Az oldószerek erőssége
1 eosz=1,1eoalox
2. .
3.
4. Snyder-féle polaritási index: etanol (akceptor),
dioxán (donor)
nitrometán (orientáció)
i
iv
i
ii
V
RTH
V
E
,21
accdonorinddiszpi
nitromdioxet KKKP logloglog,
109109
RP-HPLC elválasztás optimalizálása
• SZELEKTIVITÁS
• Hatékonyság
• Kapacitás
• Az elválasztások pH függése:
– ionos és ionizálható alkotók (savak, bázisok)
– nem disszocibilis alkotók elválasztása (nem pH függő)
110
Az ionizálható vegyületek jellemzői:
-elektrolitos disszociáció (pKa),
- ionizálhatók szerves és vizes fázisok közötti megoszlás (lgD)
Nem ionizálható vegyületek
- oktanol-víz megoszlási hányadosa (lgP),
víz
okt
c
clgPlg
apKpH
sav lgPlgDlg
101
pHpK
bázisalgPlgDlg
101
111
aqaq
org
savAAB
ABD
BAAB
aqaq
org
bázisBAB
ABD
112112
2 7
pKa
pKa + 1,5A B
pH
Rete
nció
s idő
113113
2 10
pKb
pKb + 1,5A B
pH
Rete
nció
s idő
114114
pH szerepe:
savak, bázisok, sók
115115
• pH beállítás
– ammónium –formiát 2,8-4,8 pH
– ammónium-acetát 3,8-5,8 pH
– ammónium-hidroxid 8-11 pH
– amm.-hidrogén-karbonát 6-8 pH
116116
HILIC
117117
HILIC
118118
HILIC
119119
UHPLC
120120
121121
122122
123123
124124
Gradiens elúció
125125
126126
127127
IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIA
128
129129
Ioncserélő állófázisok 1.
• Kationcserélők
– erős –SO3- H+
– gyenge -COO- H+
• Anioncserélők
– erős -N+(CH3)3 OH-
– gyenge -N+H3 OH-
130130
Ioncserélő állófázisok 2.
• divinil-benzol gyöngy kopolimer alap
• módosított szilikagél alap
• polisztirol alap
• polimetil-metakrilát alap
• Porózus, pórusméret 2-40 nm
• Héjszerkezetű HPIC
131131
Eluensek
• Kationok meghatározásához
– híg HCl (0,01M)
• Anionok méréséhez
– híg NaHCO3, Na2CO3, KOH
• VEZETŐKÉPESSÉGI DETEKTÁLÁS!
132132
Ioncsere-ionkromatográfia
• Döntő az állófázis ioncserélő kapacitása
– Teljes ioncsere: nagy ioncserélő kapacitás
• 2-10 mgeq/g
– Ionkromatográfia: kis ioncserélő kapacitás
• 0,1-0,2 mgeq/g
• Megvalósítás
– Kiszorításos módszer
– Elúciós módszer
133133
• Kétkolonnás elválasztás, ionelnyomó
kolonna (supressor): nagy ioncserélő kapacitás!
– kémiai
– elektrokémiai
• Egykolonnás elválasztás
134134
Kationok elválasztása erős kationcserélőn
• Állófázis: kis kapacitású szulfonsavas
• Mozgófázis: 0,01M HCl
• Minta: Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+,…(Cl-)
R-SO3- H+ Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+,…(Cl-) ELVÁLNAK
• Supressor: nagy kapacitású anioncserélő kvaterner amin
R-N(CH3)3+ OH- + H+Cl- R-N(CH3)3
+ Cl- + H2O
R-N(CH3)3+ OH- + Li+Cl- R-N(CH3)3
+ Cl- +Li+OH-
Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2- (OH-)
135135
Anionok elválasztása
• Állófázis: kis kapacitású kvaterner amin
• Mozgófázis: 0,01M NaHCO3, Na2CO3, KOH
• Minta: F-, Cl-, Br-, NO2-, NO3-, HPO42-, SO4
2- , I-, ClO4-, BrO3
-
R-N(CH3)3+ HCO3
- + Na++ F-, Cl-, Br-,…. elválnak!
• Supressor: nagy kapacitású kationcserélő R-SO3
- H+ + Na+ HCO3- R-SO3
- Na+ + H2CO3
R-SO3- H+ +Na+ F-, Cl-… R-SO3
- Na+ + (H+)F-, Cl-, …..
Br-, NO2-, NO3-, HPO42-, SO4
2- , I-, ClO4-, BrO3
-
136136
137137
138138
Ionmozgékonyságok
139139
A supressor kolonnát regenerálni kell!
• Kationcserélőt tömény kénsavval
• Anioncserélőt tömény nátronlúggal
140140
Egykolonnás elválasztás
• Eluens: gyenge elektrolitok
– benzoesav
– citromsav
– o-ftálsav
– bórsav
– glukonsav
– stb.
141141
Egykolonnás elválasztás
142142
Gyenge ioncserélők pH függése
• Az ioncserélő kapacitás pH függő!
– gyenge kationcserélő
– gyenge anioncserélő töltetek esetén
• Erős ioncserélők kapacitása független a pH-tól!
143143
Gyakorlati alkalmazások:
• Főként anionok elválasztása
• Aminosavak savas közegben kationos
elválasztása
144144
145145
Kiszorításos ioncserés elválasztások
146146
HPLC készülékek felépítése
• Eluens szállítás,
• Mintabevitel
• Elválasztó kolonna
• Detektor
• adatfeldolgozás
147147
148148
149149
150150
151151
Kolonnák: töltés, csatlakozások
152152
Mintabevitel: manuális, automatikus
153153
Detektorok
Mass LOD
HPLC detector Commercially available(commercial)
Mass LOD
(state of the art)
Absorbance Yes 100pg-1ng 1pg
Fluorescence Yes 1-10 pg 10fg
Electrochemical Yes 10pg-1ng 100fg
Refractive index Yes 100ng-1µg 10ng
Conductivity Yes 500pg-1ng 500ng
Mass spectrometry Yes 100pg-1ng 1pg
FT-IR Yes 1µg 100ng
Light scattering Yes 10µg 500ng
Optical activity No - 1ng
Element selective No - 10ng
Photoionisation No - 1pg-1ng
154154
155155
DAD
156
157157
158158
159159
RI detektor: törésmutató mérés
160160
ELSD: evaporating light scattering detector
161161
162162
CAD: Corona® Charged Aerosol Detector (CAD® )
163163
164
• Elektromos vezetőképességi detektor
• MS detektorok
wall-jet detektor
165165
A HPLC gyakorlati alkalmazásai
• Környezeti analízis (víz, talaj, hulladék)
• Gyógyszeranalízis
– hatóanyagok
– metabolitkutatás
– Késztermék analízis
• Élelmiszer elemzés
• Szermaradvány vizsgálatok
• Technológiai termékek elemzése
• Fehérjekutatás és analízis
166
Gyakorlati példák
167
168
Drotaverin HCl illékony szennyezőinek HS-GC-
MS meghatározása
Simaizom görcsoldó
tárolás közben etil-klorid képződik
NO
O
O
O
ClH
1/2 C2H5OH
V G
V L
minta, m , , c i,L
gőztér
termosztáló folyadék
T= állandó
i o
169
Kapilláris kolonna: DB-624 25mx0,2mmx1,12µm (6% cianopropilfenil- 94% polidimetilsziloxán)
Hőprogram: 40oC izoterm 1 percen át, majd 5oC/perc felfűtési sebesség 15 oC-ig
Oldószer: DMSO
Termosztálási hőmérséklet: 80 oC, idő 20 perc, mintabevitel 1 ml
Detektor: MS
Etilk
lorid -
2.5
95
pA
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
9.00
10.00
Minutes
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00
Megengedett etil-klorid koncentráció a Drotaverin hatóanyagban:
750 ppm
170
171
Filmtabletta analízisegyulladásgátló, lázcsillapító
172
173
Ibuprofen melléktermékeinek az elválasztása
Oszlop: 150×4,6 mm; C18 álló fázis (5 µm) (Ajánlott: BDS
Hypersil C18 5µm)
Eluens:tisztított víz – acetonitril – ortofoszforsav = 600 : 340 :
0,5; az elegyedési egyensúly beállta után tisztított vízzel 1000
térfogategységre hígítva.
Áramlási sebesség: 2,0 ml/min
Hullámhossz: 214 nm
Hőmérséklet: 25 °C
Mérés időtartama: 40 perc
Injektált térfogat: 20 µl
174
175
Aceclofenac: gyulladásgátló
Impurity A Impurity B Impurity C
Impurity DImpurity F
Impurity G Impurity H
Impurity E
Impurity I
176
Log D - pH diagram
-2
-1
0
1
2
3
4
5
6
0 2 4 6 8 10 12 14 16
pH
Lo
g D
Aceclofenac
Impurity A
Impurity B
Impurity C
Impurity D
Impurity E
Impurity F
Impurity G
Impurity H
Impurity I
gyakorlatilag semleges
Imp. B, C, D, E, F
semleges
Imp. I
gyenge sav
Aceclofenac,
Imp. A, G H
177
Aceclofenak és szennyezéseinek az analízise
min0 10 20 30 40 50
mAU
0
5
10
15
20
25
*VWD1 A, Wavelength=275 nm (ACEC0414\006-0701.D - ACEC0414\091-0901.D)
10.2
22 -
1
12.1
44 -
2
16.6
48 -
3
18.6
64
19.7
41 -
4
31.1
76 -
5
32.2
95
35.7
99 -
6
37.2
17 -
7
37.9
21 -
8
40.5
40 -
9
42.6
74 -
10
1. Impurity A 2. Aceclofenac 3. Impurity G 4. Impurity H 5. Impurity I
6. Impurity D 7. Impurity B 8. Impurity E 9. Impurity C 10. Impurity F
178178
A mennyiségi elemzés alapjai
0 KHi i
KFH
iA
AJi ,
tg = ai
m i=ai
iA
ci=a iiA
m i ci
l. kalibrációs módszer,
2. addíciós módszer
3. belső standard módszer
iii maA
iii caA
179179
• Ajánlott irodalom:
• Dr. Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai,
Edison House Kft., Budapest, 2006.
• Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és
gyakorlata, Edison House Kft., Budapest, 2006.
