KLİNİK ÖRNEKLERDE GERÇEK ZAMANLI … · •Menenjite yol açan etkeni bilmek, alınacak...
17
Transcript of KLİNİK ÖRNEKLERDE GERÇEK ZAMANLI … · •Menenjite yol açan etkeni bilmek, alınacak...
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü
KLİNİK ÖRNEKLERDE GERÇEK ZAMANLI MULTİPLEKS POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU
YÖNTEMİYLE AKUT BAKTERİYEL MENENJİT TANISI
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü AMAÇ
Bu çalışmanın amacı, doğrudan klinik örneklerde
hızlı ve güvenilir bir şekilde
akut bakteriyel menenjit tanısını koyabilmek ve
N. meningitidis serogrup tayini yapabilmek için
laboratuvarımızda optimize edilen gerçek zamanlı multipleks polimerazzincir reaksiyonu (Gz-multipleks PZR) ile
beş yıllık periyotta saptanan etkenler ve N.meningitidis serogrup dağılımı hakkında veri sunmaktır.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü ÖNEM
• Akut bakteriyel menenjitlerin %80-85’inden S.pneumoniae, N. meningitidis ve H. influenzae tip b sorumludur.
• Ülkemizde bu etkenlere bağlı bakteriyel menenjitlerin bildirimi zorunlu olup, son yıllarda ülkemizdeki hastalık kontrol programları özellikle bu üç etkene yönelmiştir.
• Menenjite yol açan etkeni bilmek, alınacak korunma/kontrol önlemelerini belirlemede, tedavi rejiminin seçiminde, hastalığın şiddeti ve seyri hakkında öngörüde bulunabilmede oldukça önemlidir.
• Bu kapsamda özellikle meningokoksik menenjit tanısının hızla konması hayati öneme sahiptir.
• Ayrıca toplumdaki N. meningitidis serogruplarının belirlenmesi, uygulanacak olan aşı tipi ve kombinasyonuna karar verilmesi açısından da önem arzeder.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
Optimizasyon…
BOS örnekleri, Xin Wang M. et al.,2012’de tarif ettiği çalışmanın “UlusalMoleküler Mikrobiyoloji ReferansLaboratuvarı”nda modifiye edilenşekliyle incelendi.
95°C’de 15 dk. İlk denatürasyonu
94°C’de 60 sn. Denatürasyon60°C’de 90 sn Bağlanma
X50
Üç farklı Gz-multipleksPZR testi optimize edildi
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
Optimizasyon…
Xin Wang, M. Jordan Theodore, Raydel Mair, et al., Clinical Validation of Multiplex Real-Time PCR Assays for Detection of Bacterial Meningitis Pathogens. J Clin Microbiol. 2012 March; 50(3): 702–708. doi: 10.1128/JCM.06087-11.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
Optimizasyon…
Şekil. Neisseria meningitidis duyarlılık çalışması-1: DNA Template olarak kullanılan N. meningitidis suşunun logaritmik dilüsyonları (109-102 cfu/ml).
NHS Gz-multipleks PZR testi; Duyarlılığı: 102 cfu/ml, Özgüllüğü: %100
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
Optimizasyon…
Şekil. N. meningitidis duyarlılık çalışması-2: DNA Template olarak kullanılan N. meningitidis serogrup B suşunun logaritmik dilüsyonları (109-101 cfu/ml).
BCY Gz-multipleks PZR testi; Duyarlılığı: 102 cfu/ml, Özgüllüğü: %100
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
Optimizasyon…
Şekil. N. meningitidis suşunun logaritmik dilüsyonları (104-102 cfu/ml) ve BOS örneği ile yapılan simülasyon çalışması.
NHS Gz-multipleks PZR testinin BOS smülasyonu; Duyarlılığı: 102 cfu/ml,
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
Optimizasyon…Tablo 1. Gz-multipleks PZR yönteminin Duyarlılığının Değerlendirilmesi
No Dilüsyon oranı
DNA Template olarak kullanılan
Neisseria meningitidis suşu
(cfu/ml)
Üreme sonuçları ile Gz-
multipleks PZR sonuçlarının
karşılaştırılması
Üreme
(cfu/ml)CT değerleri
1 1 109 >105 13,84
2 10-1 108 >105 16,85
3 10-2 107 >105 20,57
4 10-3 106 >105 24,49
5 10-4 105 ≈105 27,70
6 10-5 104 ≈104 30,80
7 10-6 103 760 33,55
8 10-7 102 40 35,16
9 10-8 101 - -
10 10-9 1 - -
Çalışmanın saptama limiti 102 cfu/ml olarak tespit edilmiştir. Sekizinci dilüsyon tüpünden ekstakte edilen ve DNA template olarak kullanılan bakteri konsantrasyonu 40 cfu/ml olup; bu da 1 bakteri/reaksiyon karışımı ([bak]/reak.) olarak hesaplanabilir.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
Akreditasyon…Klinik örneklerde, N. meningitidis, H. influenzae ve S. pneumoniae (NHS)’nınaraştırılmasına ve N. meningitidis’inserogruplandırılmasına yönelik laboratuvarımızda valide edilerek akredite olunan üç farklı Gz-multipleks PZR testi:
1. NHS Gz-multipleks testi (NHS miks): N. meningitidis, H. influenzae ve S. pneumoniae’yı saptamaya
2. BCY Gz-multipleks PZR testi (BCY miks): N. meningitidis serogroup B, C ve Y’yi saptamaya yönelik
3. AWX Gz-multipleks testi (AWX miks): N. meningitidis serogrup A, W135 ve X’isaptamaya yöneliktir.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü YÖNTEM
• Temmuz 2012-Ağustos 2017 tarihleri arasında “Ulusal Moleküler Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarı”na gönderilen akut bakteriyel menenjit şüpheli 205 BOS örneği çalışıldı.
• Bakteriyel menenjit ön tanılı hastalar her yaş grubundan olup, bunların %25'i (n=49) beş yaş altı çocuklardı.
• Örneklerin tümü NHS miks ile üç etken açısından araştırıldı.
• N. meningitidis pozitifliği saptanan örnekler BCY miks ve AWX miks ile serogruplandırıldı.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü BULGULAR
Tablo. 2012-2017 tarihleri arasında laboratuvarımızda etken saptanan BOS örneklerinin değerlendirilmesi
Hasta No Yaş Cins Diğer Geldiği Yer Sonuç CT Değeri Serogruplama
4 N.meningitidis Pozitif 28,88 B
7 N.meningitidis Pozitif 34,61 NT
8 N.meningitidis Pozitif 28,69 B
9 N.meningitidis Pozitif 40,42 NT
11 N.meningitidis Pozitif 37,94
12 1 E İstanbul N.meningitidis Pozitif 13,23 B
18 61 E Kırşehir N.meningitidis Pozitif 17,75 W135
21 2 K İstanbul N.meningitidis Pozitif 31,67 B
27 11 K Suriyeli hasta Ankara N.meningitidis Pozitif 28,81 B
29 15 E Hastanın 14 gün sonra gönderilen ikinci BOS örneği NEGATİF
Adana N.meningitidis Pozitif 19,88 B
31 8 K 29 no'lu hastanın temaslısı Adana N.meningitidis Pozitif 33,30 B
32 Ankara N.meningitidis Pozitif 22,08 B
33 11 E Adana N.meningitidis Pozitif 30,39 B
40 4 E Ankara N.meningitidis Pozitif 28,41 A
41 4 E Ankara N.meningitidis Pozitif 35,01 NT
44 2 K Ankara N.meningitidis Pozitif B
46 K Trabzon N.meningitidis Pozitif NT
47 12 E İstanbul N.meningitidis Pozitif 30,97 B
48 E Ex İstanbul N.meningitidis Pozitif 16,79 B
52 10 E İstanbul S.pneumoniae pozitif
55 3 K Ankara N.meningitidis Pozitif 37,20 B
57 0 E İstanbul N.meningitidis Pozitif 33,56 B
60 21 K 1 hafta ara ile alınan 2.BOS örneğinde N. meningitidisnegatifleşti
Kırşehir N.meningitidis Pozitif 31,39 NT
62 9 E İstanbul N.meningitidis Pozitif 18,25 B
65 0 E İstanbul N.meningitidis Pozitif 31,91 B
68 21 E Askeri Birlik Van N.meningitidis Pozitif 32,22 B
70 0 E Ankara S.pneumoniae pozitif
74 2 E Antalya N.meningitidis Pozitif 35,52 NT
76 7 K İstanbul N.meningitidis Pozitif 26,58 B
77 3 E Antalya S.pneumoniae pozitif
81 2 E Ankara N.meningitidis Pozitif 19,52 B
85 2 E Ankara N.meningitidis Pozitif 32,50 B
88 E Ankara N.meningitidis Pozitif 35,50 B
89 13 E İstanbul S.pneumoniae pozitif
94 2 E Ex İstanbul N.meningitidis Pozitif 35 B
95 E Ankara N.meningitidis Pozitif 35 B
100 8 E Ankara S.pneumoniae pozitif
105 36 K Ankara S.pneumoniae pozitif
111 N.meningitidis Pozitif 42,52 NT
114 29 K Ankara N.meningitidis Pozitif 35,09 NT
116 N.meningitidis Pozitif 39,35 NT
118 6 E Ankara N.meningitidis Pozitif 29,12 Y
124 10 E Ankara S.pneumoniae pozitif
130 38 K Ankara H.influenzae pozitif
150 30 E Ankara S.pneumoniae pozitif
154 10 E Gaziantep N.meningitidis Pozitif 30,42 B
158 12 K İstanbul N.meningitidis Pozitif 34 C
161 14 K İstanbul N.meningitidis Pozitif 30,4 Y
167 Hastanın iki hafta ara ile alınan 2. BOS örneğinde N.meningitidis yine POZİTİF (CT:36,11) bulunurken, S.pneumoniae saptanmadı.
Ankara N.meningitidis ve S.pneumoniae POZİTİF
NmCT:23,50-SpCT:35,00
Nm:Serogrup B
170 E Ankara S.pneumoniae pozitif 31
172 12 E Bolu S.pneumoniae pozitif 32
175 66 K Ankara S.pneumoniae pozitif 34
177 52 K Yozgat S.pneumoniae pozitif 33,87
180 16 K Adana S.pneumoniae pozitif
181 5 E Suriyeli hasta, kliniği meningikoksik menenjit ile uyumlu. Hastanın 2 yaşındaki kardeşi ex. Kardeşinin kliniği benzer ama örnek alınamamış
Adana N.meningitidis Pozitif 43,68 NT
183 10 K İstanbul S.pneumoniae pozitif 36,10
184 2 E Adana S.pneumoniae pozitif 37,61
185 1 K Trabzon S.pneumoniae pozitif 33,41
190 6 K Suriyeli hasta İstanbul N.meningitidis Pozitif 39,95 NT
197 5 K Adana S.pneumoniae pozitif 35
198 2 E Kastamonu N.meningitidis Pozitif 35,57 B
199 7 E Mersin N.meningitidis Pozitif 38,60 B
200 K Ankara S.pneumoniae pozitif 28,81
201 1 İstanbul S.pneumoniae pozitif 26,62
202 1 E Adana S.pneumoniae pozitif 29,62
207 E Hastanın 9 gün ara ile gelen ikinci BOS örneğinde sonuç NEGATİF
Ankara N.meningitidis Pozitif 31,12 NT
216 1 E İstanbul N.meningitidis Pozitif 30,39 B
Tablo. 2012-2017 tarihleri arasında laboratuvarımızda etken saptanan BOS örneklerinin değerlendirilmesi
Hasta No Yaş Cins Diğer Geldiği Yer Sonuç CT Değeri Serogruplama
67 örnek (%32,7) etken POZİTİF
• 46 N.meningitidis (1 vakada hem N.meningitidis hem de S.pneumoniae saptandı)
• 20 S.pneumoniae pozitif• 1 H.influenzae pozitif
46 N.meningitidis pozitif
• 27 serogrup B (%58,7) • 2 (%4,3) serogrup Y • 1’er serogrup A, C ve W135
(%2,1)• 11 NT (%23,9)
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü SONUÇ
Gz-multipleks PZR yönteminin NHS’ye bağlı akut bakteriyel menenjitin hem direk tanısında hem de N.meningitidis’in tiplendirmesinde hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğu görüldü.
Hızlı tanı: hastalığın tedavisi ve kontrolü açısından,
etkenin serogruplandırılması: korunma/kontrol ve aşı politikaları
açısından önem arzetmektedir.
Elde edilen sonuçlar, N. meningitidis serogrup B’nin ülkemizde yaygınlaştığını gösterirken; bu konuda ulusal düzeyde kapsamlı sürveyans çalışmalarının yapılması gerektiği ortaya çıkmaktadır.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü SONUÇ
Gz-multipleks PZR yönteminin NHS’ye bağlı akut bakteriyel menenjitin hem direk tanısında hem de N.meningitidis’in tiplendirmesinde hızlı ve güvenilir bir yöntem olduğu görüldü.
Hızlı tanı: hastalığın tedavisi ve kontrolü açısından,
etkenin serogruplandırılması: korunma/kontrol ve aşı politikaları
açısından önem arzetmektedir.
Elde edilen sonuçlar, N. meningitidis serogrup B’nin ülkemizde yaygınlaştığını gösterirken; bu konuda ulusal düzeyde kapsamlı sürveyans çalışmalarının yapılması gerektiği ortaya çıkmaktadır.
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü N.meningitidis ve S.pneumoniae pozitifliği
Sarı: NHS PK
Kırmızı: Hasta
Mavi: RK
T.C. Sağlık BakanlığıTürkiye Halk Sağlığı KurumuHalk Sağlığı Genel Müdürlüğü BULGULAR
Bu süreçte başlıcası; • İç Anadolu (n=101) • Marmara (n=42) • Akdeniz (n=38) • Karadeniz (n=11)
bölgelerinden olmak üzere toplam 23 ilden merkezimize örnek akışı olmuştur.
