KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN
Transcript of KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 1
KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
1. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, 2nd ed., CRC, Taylor & Francis, 83-1782. Kayser, O, 2001, Pharmaceutical Biotechnology, Wiley VCH, p 103
Tujuan Topik
• Mahasiswa mampu menjelaskan profil /sifat/karakter protein yang mungkin digunakan untuk mengkarakterisasi protein target
• Mahasiswa mampu menjelaskan metode analisis dan memilih metode yang sesuai untuk mengkarakterisasi protein target
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan2
PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN
untuk TERAPI (PROTEIN TERAPETIK)
Penyiapan host (kloning - TDR)
ProduksiProtein
Isolasi – Purifikasi –Karakterisasi Protein
Formulasi
BIOPROSES
(organisme hidup)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 4
PRODUK REKOMBINAN
PROSES HULU(up stream)
PROSES HILIR(down stream)
PRODUKSI(FERMENTASI)
➢ Isolasi gen target
➢ Konstruksi vektorrekombinan
➢ Transformasi kesel inang
➢ Seleksi klon
➢ Pemisahan sel
➢ (lisis sel )
➢ Isolasi protein
➢ Pemekatanprotein
➢ Pemurnian
➢ Karakterisasi
➢ Formulasi
➢ Batch
➢ Fed-batch
➢ Continuous batch
Profil/Karakter Protein
1. Struktur protein
– Struktur primer, sekunder, tersier, kuarterner
– Monomer, homo-mer / hetero-mer
– Modifikasi /konjugasi
(glikoprotein, lipoprotein, ribonukleoprotein,
PEGilasi-polietilen glikol)
– Domain/daerah ikatan spesifik
(Ag – Ab, protein pengikat ke reseptor atau ligantertentu
–Globul / fiber
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 5
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Produksi Protein Rekombinan 6
Struktur Protein
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 7
Struktur Protein
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 8
Profil/Karakter Protein
2. Urutan protein → sekuensing protein
3. Komposisi asam amino → analisis as. amino
4. Situs pemotongan protease → peptide mapping
5. Ukuran protein
– Panjang/jumlah asam amino
– Bobot molekul (kDa) → http://web.expasy.org/compute_pi/
6. Muatan protein (pI) → http://web.expasy.org/compute_pi/
7. Hidrofilisitas/hidrofobisitas→http://web.expasy.org/protscale
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 9
Sisi pemotongan protein
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Rekombinan 10
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 11
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 12
Karakter Protein
8. Stabilitas (pH, T, tekanan, dll)
9. Aktivitas biologis
– enzimatik (substrat → produk)
– proteolysis/protese, hemolysis
– faktor pertumbuhan
– dll
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 13
Aktivitas Biologis (hemolisis)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 14
Tujuan Mengkarakterisasi Protein
• Jika sudah diketahui → uji dilakukan untuk mengkonfirmasi identitas / karakter protein target
• Jika belum diketahui → uji dilakukan untuk mengetahui karakter (karakterisasi) protein target
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 15
Karakterisasi Protein
Untuk mengetahui atau mengkonfirmasi :
• Identitas protein
• Kemurnian
• Cemaran/pengotor
• Jumlah/konsentrasi protein
• Stabilitas→ untuk penyimpanan/formulasi
• Aktivitas/Potensi
• Spesifisitas pengikatan/reaksi silang
• Sterilitas
• Kontaminasi
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 16
JENIS PENGOTOR (CEMARAN)TERKAIT INANG TERKAIT PROSES TERKAIT PRODUK
= VARIAN PRODUK
PROTEIN INANG KOMPONEN MEDIUM
PERTUMBUHAN
(ANTIBIOTIK)
SUBSTITUTSI / DELESI
ASAM AMINO
DNA INANG PEREAKSI PURIFIKASI AKIBAT KETIDAK
STABILAN FISIK
(PRODUK
TERDENATURASI,
AGREGAT)
ENDOTOKSIN MATERIAL KOLOM
PURIFIKASI
AKIBAT KETIDAK
STABILAN KIMIA
(PRODUK
TERDEAMIDASI,
TEROKSIDAS)
KOMPONEN LAIN DARI
SEL INANG
VARIASI GLIKOSILASI
Karakterisasi Protein 17Sekolah Farmasi ITB
Karakterisasi Protein 18
USP
Sekolah Farmasi ITB
Spesifikasi Farmakope (Monografi)
Sekolah Farmasi ITB Karakterisasi Protein 19
KUALITAS
KEAMANAN
EFIKASI
Spesifikasi (farmakope)
1. Identitas: kimia dan
konformasi
2. Kemurnian dan ketidak
kemurnian
3. Aktivitas biologis/potensi
Imunogenitas
Cemaran/Pengotor
Kontaminan
Identitas
Kemurnian
Aktivitas biologis/potensi
KARAKTERISASI PROTEIN
1. Identitas → konfirmasi struktur / komposisi molekular
– Ukuran protein, muatan, struktur, urutan, komposisi as. amino
– Posttranslational modification (profil glikosilasi)
– Amino acid analysis, Peptide mapping, MALDI-MS, ESI – MS (electrospray ionization), koefisien extinsi, pI, struktur kristal, NMR, spektrum CD (circular dichroism), HPLC, CE, PAGE
Karakterisasi Protein
2. Kemurnian dan Ketidak murnian→modifikasi ?
- Glikosilasi (hiper/hipo), ikatan disulfida (alternatif), deamidasi,
oksidasi, fosforilasi, asetilasi, sulfasi, sulfoksidasi, gamma-karboksilasi, pyroglutamat.
–Aktivitas/efikasi , toksisitas
–Peptide mapping, MS, SDS PAGE, RP-HPLC
Deamidasi Amino Acid
School of Pharmacy ITB Pharm. Biotechnology-FA4202 Vaksin Rekombinan 22
KARAKTERISASI PROTEIN
3. Penentuan Jumlah / Kuantifikasi Protein– Spektrometri UV, kolorimatri (Bradford, Lowry, BCA-
Bicinchoninic, biuret), Kjeldahl, Bioassay, Immunoassay
4. Stabilitas, Penyimpanan dan Sterilitas– Mempengaruhi kualitas, keamanan dan efikasi.
– Stabilitas fisik, kimia, biologi, mikrobiologi
5. Spesifisitas pengikatan dan Cross-reactivity– Produk antibodi
– Uji pengikatan, epitope mapping/kabohidrat
– In vitro + → in vivo
Karakterisasi Protein (software)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 24
Karakterisasi Protein (software)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 25
METODE UNTUK KARAKTERISASI PROTEIN
• Metode karakterisasi tergantung pada profil/ karakter protein target
• Karakter protein → sudah diketahui / belum ?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 26
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 29
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 30
1. Spektrometri UV → Absorbansi pad 280nm
Absorbance of aromatic amino acid, i.e. tryptophan, tyrosine, phenylalanine
Protein tanpa atau sedikit as. Amino aromatik?
1 Abs of 280 nm = 1 mg/mL protein
2. Kolorimetri→ absorbans pada sinar tampak/→ visible 400 – 700 nm, perlu kurva standar dari protein standar yang diketahui
jumlah/konsentrasinya (mis : BSA-bovine serum albumin)* Lowry Method :Reaksi biuret : Protein (Nitrogen) + copper (II) pada kondisi basa dapat direduksisehingga mengubah Folin Ciocalteu phosphomolybdicphosphotungstic acid →heteropolymolybdenum blue
PENENTUAN KONSENTRASI PROTEIN
Analisis asam amino
• Penentuan komposisi asam amino suatu protein target
• Identitas, kontaminan, modifikasi
ANALISIS ASAM AMINO
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 32
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 33
BERDASARKAN:
1. UKURAN → SDS-PAGE, Mass Spec
2. MUATAN → ISOELEKTRIC FOCUSING
3. Kombinasi Massa dan muatan → Elektroforesis 2D, CE
4. IMMUNOASSAY → Western blot/ ELISA
KARAKTERISASI PROTEIN
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 34
SDS - PAGE
➢ Protein didenaturasi – oleh SDS & ß-merkaptoetanol
tujuan : protein memiliki struktur yang seragam
struktur linier
➢ Protein bermuatan negatif
➢ Pada medan listrik: protein bermigrasi ke kutub positif
➢ Jarak migrasi berdasarkan bobot molekul
➢ membutuhkan media berpori → gel poliakrilamid
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 35
GEL AKRILAMID
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 36
Sebelum penambahan SDS
Setelah penambahan SDS
Bermuatan -
Daerah hidrofob
KERJA SDS TERHADAP PROTEIN
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 37
PERSENTASE AKRILAMID
KAPASITAS PEMISAHAN
15% 15 – 45 kDa
12,5% 15 – 50 kDa
10% 18 – 75 kDa
7,5% 30 – 120 kDa
5% 60 – 212 kDa
RESOLUSI GEL AKRILAMID
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 38
A. separating gel
PERSIAPAN SDS PAGE
B. stacking gel
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 39
Chemsrv0.pph.univie.ac.at/methods.htm
CHAMBER SDS-PAGE
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 40
205 kDa
116 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
29 kDa
Pewarnaan Coomassie blue Silver (Ag) staining
LoD :
Coomassie : 36 - 47 ng Perak : 0,5 - 1,2 ng
CONTOH HASIL SDS-PAGE
SDS-PAGE NON-REDUCING
• TANPA -MERCAPTOETHANOL
• IKATAN DISULFIDE TIDAK TERPOTONG
• JIKA DILAKUKAN BERSAMA DENGAN SDS PAGE REDUCING DAPAT MEMBERIKAN INFORMASI MENGENAI ADA/TIDAKNYA JEMBATAN DISULFIDA
Karakterisasi Protein 41Sekolah Farmasi ITB
SDS-PAGE REDUCING DAN NON-REDUCING
Karakterisasi Protein 42Sekolah Farmasi ITB
Tereduksi Tidak tereduksi
Native-PAGE
• Tanpa penambahan SDS
• Protein tidak terdenaturasi
• Non-denaturing PAGE
• Migrasi protein pada gel berdasarkan konformasi protein
Karakterisasi Protein 43Sekolah Farmasi ITB
ELEKTROFORESIS
• KEMURNIAN DAN HOMOGENITAS
• DENATURASI, AGREGASI, OKSIDASI, DEAMIDASI
• SDS-PAGE NON-REDUCING : AGREGASI, OLIGOMERISASI
• KONTAMINAN
• STABILITAS PROTEIN: PERUBAHAN ASAM AMINO; HOMOGENITAS; DEAMIDASI GLUTAMIN & ASPARAGIN (LEBIH ASAM)
• GLIKOSILASI (ASAM SIALAT)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 45
➢ Karakterisasi protein berdasarkan muatan totalnya
➢ Menggunakan gel akrilamid
➢ Dilakukan dengan gradient pH antara katoda dan anoda dalam larutan amfolit
➢ pI (titik isoelektrik) = pH → muatan total protein 0 →protein akan berhenti bermigrasi
ISOELECTRIC FOCUSING (IEF)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 46
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 PRODUKSI PROTEIN SKALA BESAR 47
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 48
www.food.rdg.ac.uk/online/fs460/lecture4/lecture4.htm
ISOELECTRIC FOCUSING (IEF)
IEF (Isoelectro Focusing)
N C
Asp (acid)Normal/WT
N C
Arg (basic)Mutan
N C
Mutan Glu (neutral)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 50
ALAT ISOELECTRIC FOCUSING
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 51
➢ Kombinasi IEF & SDS-PAGE
➢ Untuk mengkarakterisasi/membedakan protein dengan BM sama tapi muatan berbeda
➢ Untuk mengkonfirmasi kemurnian protein
Pertama : isoelectric focusing
Kedua : SDS-PAGE
ELEKTROFORESIS 2 DIMENSI
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 52
ELEKTROFORESIS 2 DIMENSI
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 53
HASIL ELEKTROFORESIS 2D
ELEKTROFORESIS KAPILER(Capillary Zone Electrophoresis)
Memisahkan protein berdasarkan rasio massa/muatan
Karakterisasi Protein 54Sekolah Farmasi ITB
Maldi-Tof / Mass Spect / LC MS-MShttp://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture23/Lecture23.html
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 55
http://theravalues.com/english/services/pro_ms.html
Spektroskopi Massa(Mass Spectrometry)
❑ Penentuan berat molekul
❑ Lebih akurat dari SDS-PAGE
❑ Jumlah sampel yang dieprlukan lebih sedikit
Sekolah Farmasi ITB 56Karakterisasi Protein
Berbagai metode ionisasi:
❑ Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
(APCI)
❑ Chemical Ionisation (CI)
❑ Electron Impact (EI)
❑ Electrospray Ionisation (ESI)
❑ Fast Atom Bombardment (FAB)
❑ Field Desorption / Field Ionisation (FD/FI)
❑ Matrix Assisted Laser Desorption
Ionisation (MALDI)
❑ Thermospray Ionisation (TSP)
Sekolah Farmasi ITB 57Karakterisasi Protein
Sekolah Farmasi ITB Karakterisasi Protein 58
Sekolah Farmasi ITB Karakterisasi Protein 59
Monoisotopic mass of neutral peptide Mr(calc):1099.6237
Sekolah Farmasi ITB 60Karakterisasi Protein
Sekolah Farmasi ITB 61Karakterisasi Protein
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 62
➢ Karakterisasi protein berdasarkan reaksi imun Antigen – Antibodi
➢ Untuk mendeteksi protein spesifik dalam campuran
➢ Bisa diperoleh informasi mengenai ukuran protein menggunakan rainbow protein marker
➢ Menggunakan antibodi spesifik anti-protein target (sebagai antibodi primer)
➢ Antibodi sekunder → terkonjugasi dengan enzim untuk visualisasi
contoh : horse radish peroxidase (HRP)
alkaline phosphatase (AP)
WESTERN BLOT
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 63
Protein ditransfer ke membrane nitroselusosa SDS-PAGE
Dilabel dengan Ab spesifik
Visualisasi
Ab 2o
Ab 1o
Membran nitroselulosa
Protein target
AP+ Nitro blue tetrazolium (NBT)
+ 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl phosphate
(BCIP)
Ab 2o
ungu
Hasil Western Blotrainbow protein marker
SDS-PAGE VS WESTERN BLOT
Karakterisasi Protein 64Sekolah Farmasi ITB
ELISA = Enzyme linked immunosorbant assay
Karakterisasi Protein 65Sekolah Farmasi ITB
ELISA vs WB?
Karakterisasi Protein 66Sekolah Farmasi ITB
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 67
• Sekuensing ujung N (10-15 asam amino pertama) – degradasi Edman
•Sekuensing ujung C – karboksi peptidase
•Pemetaan peptida - menggunakan protease
→ LC-MS/MS
KARAKTERISASI STRUKTUR PRIMER / URUTAN PROTEIN
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 68
N C
Sekuensing ujung amino
Pemetaan peptida
Sekuensing ujung karboksi
SEKUENSING PROTEIN
• IDENTITAS
• HOMOGENITAS (mAb)
• PRODUK PROTEOLITIK
PEMETAAN PEPTIDA (PEPTIDE MAPPING)
• Identitas
• Konfirmasi stabilitas genetik
• Konsistensi lot/batch produksi
• Peptida terglikosilasi (mAb)
• Perbedaan asam amino (1 atau >1)
Struktur 2D/3D Protein
• Difraksi X Ray
– Diperlukan kristal protein murni → Teknik tersendiri
• NMR
– Protein kecil 25kD
• Electron Micrograph
– Resolusi rendah
• Spektra CD
Sekolah Farmasi ITB 71Karakterisasi Protein
Kristalografi Sinar X
Sekolah Farmasi ITB 72Karakterisasi Protein
Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance)
•Sampel dipaparkan pada medan magnet yang kuat
•Spin inti atom
•Penyerapan gelombang oleh inti-inti atom tertentu →
melepaskan radiasi
•H-NMR, C-NMR
Sekolah Farmasi ITB 73Karakterisasi Protein
Mikroskop Elektron
Mikroskop yang menggunakan
elektron untuk memperoleh
gambaran suatu sampel →
perbesaran
Dengan perbesaran mendekati 1
juta kali (106).
Sekolah Farmasi ITB 74Karakterisasi Protein
CIRCULAR DICHROISM (CD)
Spektroskopi Circular Dichroism (CD) merupakan metode optik yang dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi kiralitas dalam suatu molekul.
Dasar tersebut dapat digunakan untuk memperoleh informasi mengenai struktur sekunder dan tersier dari suatu protein.
Circular dichroism mengukur perbedaan absorpsi cahaya terpolarisasi ke kanan dan kiri.
Sekolah Farmasi ITB 75Karakterisasi Protein
Sekolah Farmasi ITB 76Karakterisasi Protein
Sekolah Farmasi ITB 77Karakterisasi Protein
KOMBINASI KARAKTER
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan78
Isolat Produsen CGTaseLab Bioteknologi Farmasi - SF ITB (2010)
E. coli LT1B
Agar Horikoshi
Hidrolisis pati & Aktivitas siklisasi-β
Hidrolisis pati Siklisasi-β
I2/KI
phenolphtalin
coomassie blue
Native-PAGE
Coomassie biru
Penetapan Bobot Molekul
I2/KIcoomassie blue
SDS-PAGE
97 kDa
66 kDa
45 kDa
M 1 2
Spesifisitas Produk
Inte
nsi
ty (
mV
)
Retention time (min)
Standard α:β:γ-CD = 1:5:5 (μg/μL)
α-CD β-CD γ-CD
Pregelatinated1% Soluble starch
Non-pregelatinated10% Soluble starch
Non-pregelatinated1% Soluble starch
Ratio = 0 : 81 : 18Amount = 0 : 4.48 : 1.02 (μg/μL)
Ratio = 0 : 1 : 0Amount = 0 : 0.33 : 0 (μg/μL)
Ratio of α : β : γ -CyclodextrinRatio = 0 : 83 : 18Amount = 0 : 2.85 : 0.6 (μg/μL)
HPLC-Refraction Index detectorColumn : Waters Spherisorb® 5,0 µm NH2 4,6 mm x 250 mmH20 : Acetonitrile (70:30), 1.0 ml/min
KuisReteplase akan diproduksi sebagai protein rekombinan. Reteplase (r-PA) adalah domain aktif human tissue plasminogen activator yang terdiri atas 357 asam amino, dengan 9 jembatan disulfida, dan pI 6.9. Agar protein dapat dimurnikan dengan kolom chitin, dipilihplasmid pYXC, dan gen disisipkan dengan enzim restriksi BamHI dan XbaI menggunakaninang S. cerevisiae. Reteplase dapat mengalami deamidasi pada asam amino Gln-21 dan Asn-267.
1. Setelah purifikasi dengan kolom chitin, protein dipotong dengan factor Xa dan fragmen dipisahkan. (a) Metode apa yang sesuai untuk memastikan kemurnianreteplase yang dihasilkan? (b) Ilustrasikan hasilnya. (c) Apa saja pengotor yang potensial ada, dan merupakan pengotor terkait apa?
Untuk reteplase sebagai API, (a) pilih metode karakterisasi yang sesuai untukmasingmasing aspek berikut, dan (b) ilustrasikan hasilnya.
1. Identitas (4 metode)
2. Kemurnian (2 metode)
3. Pengotor dengan bobot molekul lebih tinggi
4. Protein inang
5. Protein mutan
6. Protein terdeamidasi
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 83
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 84
• Apa yang dimaksud dengan splicing dan di mana proses tersebut terjadi? Apakah proses splicing terjadi di semua sel ? Apa implikasi proses tersebut dalam kloning gen
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 85
• Pada sistem operon Lac dimana laktosa berlaku sebagai induser, apa yang terjadi jika sel yang memiliki sistem tersebut ditumbuhkan pada kondisi (A) media tanpa laktosa dan (B) media dengan laktosa? Apa yang terjadi pada sel untuk kondisi A dan B jika urutan operator dimutasi?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 86
• Bila kita akan menghasilkan protein rekombinan yang gen pengkodenya terdiri atas tiga ekson dan dua intron, bagaimana cara kita membuat DNA sisipannya? Jelaskan!
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 87
• Bila kita akan menghasilkan protein rekombinan di ragi, vektor apa yang digunakan? Jelaskan mengapa demikian?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 88
• Bila protein yang akan dipurifikasi mempunyai muatan total negatif, bersifat hidrofil dan berukuran 54 kDa, sistem purifikasi apa yang saudara akan gunakan untuk memperoleh protein murni?
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 89