Kalıtsal hemolitik anemilere±tsal... · 2017-12-04 · Kalıtsal hemolitik anemilere sistematik...
Transcript of Kalıtsal hemolitik anemilere±tsal... · 2017-12-04 · Kalıtsal hemolitik anemilere sistematik...
Kalıtsal hemolitik anemilere sistematik yaklaşım ve ayırıcı tanıda
yeni nesil dizi analizinin kullanımı
Dr. Yeşim Aydınok
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Kalıtsal Hemolitik Anemiler
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Aile öyküsü Fizik BakıHematolojik İncelemeler
Moleküler Genetik Tanı
Anemi
Splenektomi
Kolelithiazis
Kolesistektomi
Anemi
Subikter
Splenomegali
RetikulositHaptoglobin
Laktik dehidrogenazİndirek bilirubin
Hemogram
RBC indeksleri
Periferik yayma
Kalıtsal Hemolitik Anemiler
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
• Talasemiler (α,β,δβ Talasemi)
• Varyant Hemoglobinler (S,E,D,C,OArab,Lepore)
• Anstabil HemoglobinlerHemoglobinopatiler
• Embden-Meyerhof yolu (Aldolaz, PFK, PGK, GPI, HK, PK, TPI)
• Hekzos monofosfat şant ve Glutatyonmetabolizması (G6PD, GR, GS)
• Nükleotid metabolizması (ADA, AK, P5’N)
Eritrosit enzim bozuklukları
• Yapısal bozukluklar; HS, HE, HPP, SAO
• RBC membran permeabilite değişikliği; HSt (OHSt-hidrositoz, DHSt-xerositoz, CHS,FS)
Eritrosit membranbozuklukları
PFK; Fosfofruktokinaz, PGK; Fosfogliseratkinaz, GPI; Glukozofosfatizomeraz, HK; Hekzokinaz, PK; Pirüvatkinaz, TPI; Triosofosfatizomeraz, G6PD; Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GR; glutatyon redüktaz, GS; glutatyon sentetaz, ADA; adenozin deaminaz, AK; Adenilat kinaz, P5’N; Primidin 5’ nükleotidaz, HS; herediter sferositoz, HE; hereditereliptositoz, HPP; herediter piropoikilositoz,HSt; herediter stomatositoz, OHSt; overhydrated stomatositoz, DHSt; dehydratedstomatositoz, CHS; kriyohidrositoz, FS; familial pseudo hiperkalemi
Hemoglobinopatilerin genetik temeli
• HbA : a2b2
• HbA2 : a2d2
• HbF : a2g2
• HbE2 : a2e2
• HbE1 : z2e2
Harteveld CL and Higgs DR. Orphanet J Rare Dis 2010;5:13,
Galanello and Origa. Orphanet J Rare Dis. 2010, 5:11–26
βHS=upstream regulatory element. β-LCR=β-locus control region
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Alfa ve Beta Talasemide Genotip - Fenotip
Beta Talasemi• β/β = Normal
• β/βT = Taşıyıcı
• β/βDT =Talasemi İntermedya
• βT /βT=Talasemi İntermedya
• βT /βT=Talasemi Major
Alfa Talasemi• αα/αα= Normal
• α-/αα = α+ taşıyıcı
• α-/α- veya -- /αα = α0 taşıyıcı
• -- /-α = Delesyonel HbH (β4)
• --/αTα = Non-delesyonel HbH (β4)
• -- /-- = Hb Barts (g4)
Anormal Hemoglobinler; >1500 DNA varyantı, yapısal protein varyantları oluşturur
J Traeger-Synodinos et al.EJHG, 2015
Orak hücre sendromlarıHbS/S, HbS/βT, HbS/C, HbS/D, HbS/O-Arab, HbS/HbLepore, HbS/E
Chromosome 11
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Hemoglobinopatilerde tanısal yaklaşım
J Traeger-Synodinos et al.EJHG, 2015
• Hemogram
• Periferik kan yayması ve retikulosit
• Hemoglobin fraksiyonlarının analitik ölçümü– Hemoglobin elektroforez:
• Alkali selüloz asetat
• Asidik sitrat agar
– Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
– Kapiller elektroforez (CE)
– İzoelektrik odaklanma (IF)
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
• Anstabil hemoglobinler (OD)− Heinz body hemolitik anemiler− İsopropanol presipitasyon− Isı stabilite testi (50 0C, 1-2 h)
HPLC veya CE ile tanınamaz:• α-talasemi taşıyıcılığı
Hastalıkb- Talasemi
Majorb- TalasemiIntermedia
Delesyonel
HbH
Non-delesyonel
HbH
Başlangıç 3-9. aylar 2-4 yaş >4 yaş 0-3 ay
Fizik Bakı Solukluk, skleralarda subikter, splenomegali
Hemogram
Hb<7 g/dl Hb 8-10 g/dl Hb 9-12 g/dl Hb<7 g/dl
RBC, MCV ve MCH azalmış, RDW artmış, Retikulosit>%8
HPLC / CEHbF>%50,
HbA2 <%3.5
HbF %10-50 (%100)
HbA2 >% 3.5
HbH (0.8–40%)HbA2↓
EbeveynlerHer ikisi
HbA2 %3.5-7.0
Bir veya her ikisi atipik taşıyıcı
Her ikisi MCV/MCH ↓MCV/MCH ↓/ sınır MCV/MCH
HPLC normal
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Şid
det
ska
lası
Genotip SessizHbH
Klasik HbH
Non-delesyonelHbH
Transfüzyon bağımlı HbH
HbHhidrops
αα/αα--/-α
+ β thal--/-α --/αTα --/αTα
αTα/αTα--/αTα
αTα/αTα
Normal Asemptomatik Talasemi intermedia Talasemi major Hydrops
Genotip β-Talasemi Trait(2.belirleyici)
Homozigot β-Talasemi(2. belirleyici)
Klasik NTD β-Talasemi
Transfüzyon bağımlıβ-Talasemi
ΒN/ βN βN/ βT
ααα/ααΒN/ βD β++/ β+
+ α-/α-β0/ β+
+ HbH β++/ β+ β++/ β0
β+/ β0
Normal Talasemi intermedia Talasemi major
Alfa ve Beta Talasemide Fenotip-Genotip
Swee Lay Thein Hematology 2013:354-361
BCL11A rs1427407 (G>T)BCL11A rs10189857 (A>G)g.-158 (C>T)
HBS1L-MYB rs28384513 (A>C)HBS1L-MYB rs9399137 (T>C)
KLF1 sekans analizi
β-gen kümesi dışında sekonder belirleyiciler
2. kromozom6. kromozom
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Mutasyon tipi Moleküler Genetik Yöntem
Nokta mutasyon Reverse hybridization ve HBB, HBA, HBD DNA sekans1
Delesyon Reverse hybridization ve HBB, HBA, HBD MLPA2
1. DNA sekans; Sanger dizi analizi, 2. MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification
Hematolojik verilerin klinikle uyumsuz kaldığı kompleks durumları doğrulukla tanımlamada ve çoklu transfüzyon almış olguların tanısında moleküler testlere gereksinim vardır.
Hemoglobinopati Tanısında Moleküler Testler
Chromosome 11 HBD HBB
HBA
Kalıtsal Hemolitik Anemiler
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
• Talasemiler (α,β,δβ Talasemi)
• Varyant Hemoglobinler (S,E,D,C,OArab,Lepore)
• Unstabil HemoglobinlerHemoglobinopatiler
• Yapısal bozukluklar; HS, HE, HPP, SAO
• RBC membran permeabilite değişikliği; HSt (OHSt-hidrositoz, DHSt-xerositoz, CHS,FS)
Eritrosit membranbozuklukları
• Embden-Meyerhof yolu (Aldolaz, PFK, PGK, GPI, HK, PK, TPI)
• Hekzos monofosfat şant ve Glutatyon metabolizması (G6PD, GR, GS)
• Nükleotid metabolizması (ADA, AK, P5’N)
Eritrosit enzim bozuklukları
PFK; Fosfofruktokinaz, PGK; Fosfogliseratkinaz, GPI; Glukozofosfatizomeraz, HK; Hekzokinaz, PK; Pirüvatkinaz, TPI; Triosofosfatizomeraz, G6PD; Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GR; glutatyon redüktaz, GS; glutatyon sentetaz, ADA; adenozin deaminaz, AK; Adenilat kinaz, P5’N; Primidin 5’ nükleotidaz, HS; herediter sferositoz, HE; hereditereliptositoz, HPP; herediter piropoikilositoz,HSt; herediter stomatositoz, OHSt; overhydrated stomatositoz, DHSt; dehydratedstomatositoz, CHS; kriyohidrositoz, FS; familial pseudo hiperkalemi
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
HS Gen Protein Kalıtım
HS1 ANK1 Ankyrin AD
HS2 SPTB Spectrinβ AD
HS3 SPRA1 Spectrinα AR
HS4 SLC4A1 Band3 AD
HS5 EPB4.2 Band 4.2 AR
HE Gen Protein Kalıtım
HE1 EPB41 Band 4.1 AD
HE2 SPRA1 Spectrinα AD
HE3 SPTB Spectrinβ AD
HPP SPRA1 Spectrinα AR
HSt Gen Protein Kalıtım
OHS RHAG Rh type A AD
DHS1 PIEZO1 Piezo-type ion channel AD
DHS2 KCNN4 Ca-act-K channel pr4 AD
FP ABCB6 ATP binding cassette AD
CHC SLC4A1 Band 3 AD
Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11); 1284-94
Eritrosit membran bozukluklarında tanı
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
HS HPP HE SEAO HSt
İlk basamak incelemeler:• Aile öyküsü ve kalıtım şekli• Hb, MCV, MCH, MCHC• Periferik yayma
ODODODOR%75 OD%25 OR
MCV: N MCV: 50-60 MCV: N MCV: artmışMCV: N
Hemolitik anemi, sarılık ve splenomegali
Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11); 1284-94King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):304-25.
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
HS HPP HSt
Hemolitik anemi, sarılık ve splenomegali
Eritrosit membran bozukluklarında tanı
MCV N MCHC>34.5 g/dl
MCV 50-60 MCV >90DHS; MCHC >36 g/dl
OHS; MCHC 24-30 g/dl
Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11); 1284-94King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):304-25.
Gallagher PG. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2015
Eritrosit membran bozukluklarında tarama testleri
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
% lysis
[NaCl]
Ozmotik frajilite testi(sensitivite %68)
Eosin-5’-maleimide testi(sensitivite %92-93)
Adolfo I, et.al. Haematologica, 2016; 101(11); 1284-94King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):304-25.
Eritrosit membran bozukluklarında tarama testleri
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Tanı OF EMA
HS
HPP
OHSt
DHSt
OIHA
CDA-II
N/
N/
CDA-II; hafif hemolitik anemi, splenomegali,mikrosferositler ve OF artışı var. RetikulositHS’dan daha düşük. Splenektomiden tam yararlanmaz. Moleküler analiz: SEC23B
Polyacrylamide gel electrophoresis
Hafif olgular (%8-11) tanımlanamayabilir
King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):304-25.Bolton-Mags PHB, et.al, British Journal of Haematology, 156, 37–49
Eritrosit membran bozukluklarında moleküler genetik tanı
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Protein (Gen) Kromozom Ekzon (n) Hastalık
Alfa spektrin (SPTA1) 1q22-23 52 HS, HE
Beta spektrin (SPTB1) 14q23-24.1 35 HS, HE
Ankyrin (ANK1) 8p11.2 43 HS
Band 3 (SLCA41) 17q21-22 20 HS, SAO,CHS
Protein 4.1 (EPB41) 1p33-34.2 21 HE
Protein 4.2 (EPB42) 15q15-21 13 HS
RhAG (RHAG) 6p12-21 10 OHSt
PIEZO1 (FAM38A) 16q24.2-16qter 51 DHSt
Glut1 (SLCA2A1) 1p31.3-35 10 CHS
ABCB6 (ABCB6) 2q35-36 19 FP
HS;herediter sferositoz, HE; herediter eliptositoz, SAO; güney asya ovalositoz, CHS; kriyohidrositoz, FP; familial pseudohiperkalemi
King MJ, et.al, Int J Lab Hematol. 2015;37(3):304-25
Eritrosit membran bozukluklarında moleküler genetik tanı
Aile öyküsünün açık olduğu
Fenotipik özellikleri uyumlu
Tarama testlerinin kuşku taşımadığı olgular
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
Karmaşık fenotipik özellikleri olan
Açık bir genotip/fenotip korelasyonu kurulamayan
Genetik danışma veya yönetimi sorunlu olgular
Kalıtsal Hemolitik Anemiler
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
• Talasemiler (α,β,δβ Talasemi)
• Varyant Hemoglobinler (S,E,D,C,OArab,Lepore)
• Unstabil HemoglobinlerHemoglobinopatiler
• Yapısal bozukluklar; HS, HE, HPP, SAO
• RBC membran permeabilite değişikliği; HSt (OHSt-hidrositoz, DHSt-xerositoz, CHS,FS)
Eritrosit membranbozuklukları
• Embden-Meyerhof yolu (Aldolaz, PFK, PGK, GPI, HK, PK, TPI)
• Hekzos monofosfat şantı ve Glutatyon metabolizması (G6PD, GR, GS)
• Nükleotid metabolizması (ADA, AK, P5’N)
Eritrosit enzim bozuklukları
PFK; Fosfofruktokinaz, PGK; Fosfogliseratkinaz, GPI; Glukozofosfatizomeraz, HK; Hekzokinaz, PK; Pirüvatkinaz, TPI; Triosofosfatizomeraz, G6PD; Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz, GR; glutatyon redüktaz, GS; glutatyon sentetaz, ADA; adenozin deaminaz, AK; Adenilat kinaz, P5’N; Primidin 5’ nükleotidaz, HS; herediter sferositoz, HE; hereditereliptositoz, HPP; herediter piropoikilositoz,HSt; herediter stomatositoz, OHSt; overhydrated stomatositoz, DHSt; dehydratedstomatositoz, CHS; kriyohidrositoz, FS; familial pseudo hiperkalemi
Eritrosit enzimbozuklukları
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
OD
X-bağlı
X-bağlı
• HNSHA;− Heterojen bir grup bozukluk
– Tamamen kompanse hemoliz– Transfüzyona bağımlı– Doğumda fatal anemi
− Splenomegali/sarılık/kolelithiazis− Demiri yükü (NTD olanlar dahil)
• En sık enzim bozuklukları;− G6PD (Akut hemolitik kriz)− PK (hafif-şiddetli/NSHA)− P5’N (orta şidet-Tx yok/NSHA)
• Nadir enzim bozuklukları*(nöromuskuler bzk.,mental retard.,myopati)
− Hexokinaz− Glukoz-6-fosfat izomeraz*− Fosfofruktokinaz*− Aldolaz*− Triezofosfat izomeraz*− Fosfogliserat kinaz*
• Normokrom normositer kronik hemolitik anemi• Spesifik membran bozukluğu yok• OF ve EMA test normal• HPLC varyant hemoglobin yok• DAT negatif
Eritrosit enzim bozukluklarında tarama testleri
• Spektrofotometrik yöntemle enzim aktivitesi (IU/Hb) ölçümü– rezidüel enzim aktivitesi ve klinik şiddet arasında korelasyon yoktur
– enzimin invitro stabilitesi
– lökosit ve trombositlerin örnekten uzaklaştırılması (isosymes)
– kan transfüzyonu
– hasta örneğindeki retikulosit sayısı (HK, PK, G6PD ve P5’N de enzim aktivitesi genç eritrositlerde yüksektir) sonucu etkileyebilir
(P5’N ve diğer nükleotid metabolizması enzimlerinin saptanmasında basit ve tekrarlanabilir bir tarama yöntemi yoktur.)
• DNA düzeyinde tanının doğrulanması
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
NGS
Yeni nesil dizi analizi (NGS)
Ekzom Tüm Genom Hedeflenmiş
Hangi yeni nesil dizi analizi ?
Tüm Genom/Ekzom Dizi Analizi
%1.5
Genom/Ekzom Hedeflenmiş
• Bir çok genin bir arada çalışılması; hızlı analiz, düşük maliyet• Yeni bulunan genler kolayca panele dahil edilebilir• Elde edilen veri ile başa çıkılabilir• Hedef zenginleştirme ile ekzonların yanısıra, ‘splice sites’, intron ve
regulatör bölgeler kapsanabilir• Tanımlanan yeni varyantların patojenitesini değerlendirmek
için aile bireyleriyle birlikte çalışılması uygun olur• Yeni nesil dizi analizi ile saptanan DNA varyantları
Sanger dizi analizi ile doğrulanır
Hedeflenmiş Yeni Nesil Dizi Analizi
11. TPHD Kongresi, 4-7 Mayıs 2017, İzmir
• Kalıtsal hemolitik anemiler heterojen bir grup hastalıktır.• Klinik bulgular çoğu kez ayırt ettirici değildir.• Geleneksel testler tanı koymada yetersiz kalabilir.• Kompleks genetik yapının Sanger dizi analizi ile taranması zaman ve
kaynak kaybıdır
BA C D E HF G
Hi Seq ve MiSeqillumina Inc., San Diego, CA, USA
Thermo Fisher ScientificIon torrent, S.L., Waltham MA, USA