(1)

การคดเลอกแบคทเรยทมฤทธตานจลนทรยจาก สตวไมมกระดกสนหลงในทะเล

Isolation of Bacteria with Antimicrobial Activity from Marine Invertebrates

อมพรรตน ประไพวงศ Ampornrut Prapaiwong

วทยานพนธนเปนสวนหนงของการศกษาตามหลกสตรปรญญา วทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาจลชววทยา

มหาวทยาลยสงขลานครนทร A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of Master of Science in Microbiology Prince of Songkla University

2555 ลขสทธของมหาวทยาลยสงขลานครนทร

. -d a a tfia2ns1l.ilradu A AA )a oly

^ dd u 6U rt v un1:oo tnon uilnil t:u7t tJqilr'mu081{7tTU01n fla? lililn:ronfluun{

1um;rn

iilriirJ* u1ltfl1?a-tJltt::-otti :Jxlil?{d'tt

G{,tr1 OnI??Ylu'l

R AIUefl::1tfl1:tAU

.@?K-89,ru.*:(T a.r pn fl 6r lr a1 : f o :. r fl'r t n-n un[ n.,r r$b.r 6 or : ;

?:y- 64fl......n:riln1r(Ta{ a'r fl srlor:rl o:.oru'r: riurlrfil

rj:;r,un::rnr:

(a:.nilnr"T:ru draqn;

(o:.rm?n.r rfiuulu;

N:TilNl:

nT:riln1:

vAAuauadhi gua^(-ulautu.ma?ilu1flu li141?7tu'tnufl{lnluntu7ti auile{L?iuu'Iytu''til1,{u]ifluufirilu

,AAri':unflrga.:nr:finur q1ilnfl-nflo::JSotorivru'lg1fl6t:ltraru-rufier grtritrronItoi

6rinur

(C-l&-.dvdd(fl'tfloTto'r:u oT.ailT:9ru t^litfto'lTt)

du un6uu9tutu%o?mu1nu

(o:.nilnffru rirnqnl

(2)

(3)

ชอวทยานพนธ การคดเลอกแบคทเรยทมฤทธตานจลนทรยจาก สตวไมมกระดกสนหลงในทะเล ผเขยน นางสาวอมพรรตน ประไพวงศ สาขา จลชววทยา ปการศกษา 2554

บทคดยอ

แบคทเรยทะเลทมความเกยวของกบสงมชวตอนในทะเลจดเปนแหลงผลตสารออกฤทธ ทางชวภาพทสาคญ การศกษาในครงนไดทาการแยกแบคทเรยทะเลไดทงหมด 514 ไอโซเลท จากตวอยางกลปงหา ปะการง ฟองนาและเพรยง รวมทงสน 26 ตวอยาง ใน 4 จงหวดในฝ งทะเลอนดามนของประเทศไทย พบแบคทเรยทมฤทธการยบยงจลนทรยกอโรคทงหมด 29 ไอโซเลท (5.64 %) โดยไอโซเลท P0915 มฤทธดทสด ซงสารสกด ethyl acetate จาก P0915 ทดสอบโดยวธ broth microdilution assay สามารถยบยงแบคทเรยแกรมบวก Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ATCC 25923, S.aureus ATCC 29213, S.aureus PSU 106, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) NPRC 001R, MRSA NPRC 002R, MRSA NPRC 003R, MRSA NPRC 004R ยบยงแบคทเรยแกรมลบ Vibrio parahaemolyticus PSU 1681 ซงมคา MIC อยระหวาง 256-512 μg/mL และมคา MBC อยระหวาง 512-1,024 μg/mL และยงสามารถยบยงไซยาโนแบคทเรย Microcystis aeruginosa TISTR 8305 ได 93.91 % ทความเขมขนสาร 4,500 μg/mL ผลการบงชชนดของไอโซเลท P0915 โดยการวเคราะหทางชวโมเลกล (16 rDNA analysis) สามารถจาแนกชนดของ ไอโซเลท P0915 ไดเปน Pseudoalteromonas flavipulchra

(4)

Thesis Title Isolation of bacteria with antimicrobial activity from marine invertebrates Author Miss Ampornrut Prapaiwong Major Program Microbiology Academic 2011

ABSTRACT

Marine bacteria associated with marine organisms are important sources of bioactive compounds. Five hundred fourteen bacteria were isolated from 26 samples of sea fan, coral, barnacle and sponges collected from four provinces in the Andaman sea, Thailand. An agar well diffusion method was used to screen for bacteria with an antimicrobial activity.Twenty nine isolates (5.64%) exhibited antimicrobial activity against at least one tested microorganism. Isolate P0915 was the most promising strain that presented a consistently high activity against the tested microorganisms. An ethyl acetate extract from a cell suspension of P0915 inhibited the Gram-positive bacteria; Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 29213, S. aureus PSU 106, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) NPRC 001R, MRSA NPRC 002R, MRSA NPRC 003R, MRSA NPRC 004R and one Gram-negative bacterium; Vibrio parahaemolyticus PSU 1681. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) were determined by a broth microdilution assay and provided values of 256-512 μg/mL and 512-1,024 μg/mL, respectively. An inhibitory activity against Microcystis aeruginosa TISTR 8305 was discovered. A 93.91% decline in the population of M. aeruginosa TISTR 8305 was found when mixed with the ethyl acetate extracts at a concentration of 4,500 μg/mL. Strain P0915 was identified as being closely related to Pseudoalteromonas flavipulchra based on its 16S rDNA sequence analysis.

(5)

กตตกรรมประกาศ การทางานวจยทางจลชววทยาในครงน สามารถสาเรจลลวงไปไดดวยด ดวยความรวมมอของบคคลหลายทาน จงขอขอบคณทกทานทใหคาแนะนา คาปรกษาและใหการสนบสนน จนงานวจยนสาเรจลลวงไปไดดวยด ขอขอบพระคณ ดร.กมลธรรม อาสกล อาจารยทปรกษาวทยานพนธทไดใหคาปรกษาและชวยแนะนาแกไขปญหาตางๆทเกดขนระหวางการทาการทดลองจนทาใหงานวจยนสาเรจลลวงไปไดดวยด และกรณาตรวจแกไขขอบกพรองของวทยานพนธจนมความถกตองสมบรณ ขอขอบคณ รศ.ดร.เสาวลกษณ พงษไพจตร, รศ. ดร. ศภยางค วรวฒคณชย และ ศ. ดร. วราภรณ วฑฒะกล ทใหความอนเคราะหจลนทรยทใชในการทดสอบและใหคาปรกษาเกยวกบวธการทดสอบ ขอขอบคณ อาจารยประจาภาควชาจลชววทยาทกทานทกรณาใหคาแนะนาและคาปรกษาในการแกไขปญหาทเกดขนในระหวางการทางานวจย ขอขอบคณ อาจารยศกดอนนต ปลาทอง ทไดใหการสนบสนนดานขอมลเกยวกบตวอยางสตวไมมกระดกสนหลงในทะเล อกทงยงเออเฟอเกยวกบเรองตวอยางทใชทดสอบ ขอขอบคณ เจาหนาท อทยานแหงชาตหมเกาะเภตรา จงหวดสตล ทไดใหความชวยเหลอในการเกบตวอยางในการทาวทยานพนธครงน ขอขอบคณ เจาหนาทและบคลากรประจาภาควชาจลชววทยาทคอยใหความชวยเหลอและอานวยความสะดวกในดานอปกรณการทดลอง เครองมอและสารเคมตางๆ ในการทางานวจยในครงน ขอขอบคณพๆ นองๆทกทานในทกหองปฏบตการทคอยใหคาแนะนา ชวยเหลอดแลและเปนกาลงใจใหงานวจยในครงนสาเรจลลวงไดดวยด ขอขอบคณ คณแม พนองทกคน ทคอยใหกาลงใจและใหความชวยเหลอในทกๆดานดวยดเสมอมาและสดทายนขอขอบคณเพอนๆทกคนทใหความชวยเหลอและเปนกาลงใจใหกนตลอดมา

อมพรรตน ประไพวงศ

(6)

สารบญ

สารบญ หนา รายการตาราง (7) รายการรป (9) สญลกษณคายอและตวยอ (10) 1. บทนา 1

บทนาตนเรอง 1

บทตรวจเอกสาร 3 วตถประสงค 17

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 17 ขอบเขตการวจย 17 2. วสด อปกรณและวธการทดลอง 18 3. ผลการทดลอง 31 4. วจารณผลการทดลอง 55 5. สรปผลการทดลอง ปญหาและขอเสนอแนะ 61 เอกสารอางอง 63 ภาคผนวก 76 ประวตผเขยน 99

(7)

รายการตาราง ตารางท หนา 1. ชนดและลกษณะของกลปงหาทพบในประเทศไทย 4 2. ตวอยางฟองนาทพบในประเทศไทย 6 3. ตวอยางชนดของปะการง 8 4. การจดกลมแบคทเรยทะเล 11 5. ตวอยาง และ สถานทเกบตวอยาง 18 6. ความสามารถในการยบยงเชอจลนทรยกอโรคของแบคทเรยทะเล 33 ทแยกไดโดยวธ agar well diffusion 7. แหลงทมาของแบคทเรยทมฤทธยบยงจลนทรยทดสอบ 35 8. ประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell suspension 38 จากการบมทระยะเวลาตางๆ 9. ประสทธภาพของการยบยงจลนทรยของ P0915 cell suspension, 40 P0915 cell free supernatant และ P0915 cell free supernatant เขมขน 10. ประสทธภาพในการยบยงจลนทรยกอโรคของ P0915 42 cell suspension โดยวธ agar well diffusion 11. ประสทธภาพของสารสกด ethyl acetate ในการยบยงจลนทรยของ 43 P0915 culture 12. คา MIC, MBC และ MFC ของสารสกดจาก cell suspension 44 ของไอโซเลท P0915 ทสกดดวยตวทาละลายตางๆ 13. การยบยงรากอโรคในพชของ P0915 cell suspension 46 โดยวธ agar well diffusion

(8)

รายการตาราง(ตอ) ตารางท หนา 14. การยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 ของไอโซเลท P0915 48 ทความเขมขนตางๆ หลงเลยงรวมกนท 30oC เปนเวลา 3 วน 15. การทดสอบสารสกด ethyl acetate ของ cell suspension 49 ของไอโซเลท P0915 ในการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 16. การทดสอบการผลตเอนไซมของไอโซเลท P0915 ดวย API ZYM Kit 51

(9)

รายการรป รปท หนา 1. การทดสอบฤทธตาน S. aureus PSU 106 เบองตนของ 32 P0915 cell suspension โดยวธ agar well diffusion 2. การทดสอบประสทธภาพของ P0915 cell suspension 39 จากการบมทระยะเวลาตางๆ ในการยบยง S. aureus PSU 106 โดยวธ agar well diffusion 3. ลกษณะเซลลปกตและเซลลทเปลยนแปลงภายใตกลอง Scanning 50 Electron Microscope (SEM) หลงจากการเลยงรวมกบไอโซเลท P0915 (108 CFU/mL) เปน เวลา 3 วนและหลงการเตมสารสกด ethyl acetate ของ cell suspension ของไอโซเลท P0915 (4,500 μg/mL) เปนเวลา 3 วน 4. แถบทดสอบเอนไซม API ZYM Kit 52 5. ลกษณะทางสณฐานวทยาของไอโซเลท P0915 บนอาหาร 53 ASW agar และเมอสองดภายใตกลองจลทรรศน 6. Phylogeneic Tree แสดงตาแหนงไอโซเลท P0915 ใน 54 genus Pseudoalteromonas ทไดทาการวเคราะหทาง ชวโมเลกล (16S rRNA analysis)

(10)

สญลกษณคายอและตวยอ

% = Percentage μL = Microliter μg = Microgram CFU/mL = Colony forming unit per milliliter mm = Millimeter g = Gram mL = Milliliter oC = Degree Celsius rpm = Revolutions per minute MIC = Minimum Inhibitory Concentration MBC = Minimum Biocidal Concentration MFC = Minimum Fungicidal Concentration

1

บทท 1 บทนา

บทนาตนเรอง

ยาปฏชวนะมความสาคญในการรกษาโรคตดเชอเปนอยางมาก แตในปจจบนพบปญหาดอยามากยงขน โดยจลนทรยมกลไกตางๆ ในการตอตานยาปฏชวนะซงทาใหเกดการดอยาขน ดวยเหตน จงมความจาเปนอยางยงทจะตองทาการคนหายาปฏชวนะใหมๆ เพมขนเพอใชในการรกษาโรคตดเชอตอไป โดยมงความสนใจในการคนหายาปฏชวนะจากสงแวดลอม โดยเฉพาะอยางยงจากมหาสมทร เนองจากกวา 70% ของพนทโลกเปนมหาสมทร ซงเปนแหลงทรพยากรทใหญและหลากหลาย เชน บรเวณนาลกทแสงสองไมถง และแนวปะการงในเขตรอนซงมความหลากหลายของระบบนเวศมากทสด เมอเทยบกบระบบนเวศของปาฝนในเขตรอนชน (Colwell, 2002) ระบบนเวศของมหาสมทรประกอบดวยสารประกอบทางเคมตางๆ มากมาย จากรายงานของ Winton (1988), Malakoff (1997) และ Pomponi (1999) ระบวาระบบนเวศทางทะเลเปนแหลงของสารออกฤทธทางชวภาพและสารเคมหลากหลายชนด มรายงานการพบสารดงกลาวเกอบ 30,000 ชนด (สตา, 2551) ตวอยางสารออกฤทธทางชวภาพและสารเคมทพบในทะเล เชน terpenes, polyketides, acetogenins และ peptide เปนตน (Wright, 1998) นอกจากนยงพบสารออกฤทธทางชวภาพทแยกไดจากปะการง เชน alkaloids, prostaglandins (Kelecom, 2002), nephtheoxydiol และ clavukerin C สารทแยกไดจากฟองนาทะเล เชน cyclic peroxide สารทแยกไดจากปะการงออน (soft coral) เชน valerenenol และ entoplopanone สารทไดจากปะการงออนสายพนธ Xeria sp. เชน xeniolone (Kobayashi and Kitagawa, 1994) ซงสารเหลานสามารถนามาใชประโยชนทางการแพทยได โดยอาจจะเปลยนแปลงโครงสรางไปจากเดมโดยอาศยกระบวนการทางกายภาพและชวภาพ (Wright, 1998) เมอ 30-40 ป ทผานมามการพบสารชนดใหมๆ กวา 12,000 ชนด ทเกดขนจากพชทะเล สตวทะเล และจลนทรย โดยจะมการคนพบสารใหมๆ กวา 100 ชนด ในทกๆ ป (Donia and Hamann, 2003) สารสวนใหญพสจนไดวามาจากสตวไมมกระดกสนหลง (Lie and Zhou, 2002) อปสรรคสาคญในการศกษาเรองนคอ การจดหาวตถดบเพราะ ความเขมขนของสารทไดจากสตวทไมมกระดกสนหลงเหลานนอยกวา 1 ในลานของนาหนกเปยก (Proksch et al., 2002) หากตองการสารเหลานเปนจานวนมาก จาเปนตองใชสตวทไมมกระดกสนหลงเปนจานวนมากซงเสยงตอการสญพนธ จากการศกษาของ Friedrich et al. (1999) พบวา กวา 40 % ของมวลชวภาพในเนอเยอของฟองนา Aplysina aerophoba มแบคทเรยอาศยอยรวมกน แบบ symbiotic โดยทแบคทเรยไดอาหารจาก A. aerophoba และแบคทเรยจะ

2 ชวยทาให A. aerophoba คงรปราง การศกษาทผานมามการแยกแบคทเรยจากกลปงหาและฟองนาทสามารถผลตสารทสามารถตอตานจลนทรยกอโรคได เชน ผลตสารตานแบคทเรย, สารตานรา, สารตานไวรส หรอแมกระทงตวฟองนาเองกมการพบสารทสามารถตานมะเรงไดอกดวย (Monks et al., 2002) ดงนนการคดแยกจลนทรยจากสตวไมมกระดกสนหลงในทะเลจงเปนอกทางเลอกหนงทชวยหาสารออกฤทธทางชวภาพ นอกจากนการศกษาของ สตา (2551) พบวากลปงหามความไวตอการตอการถกรกรานโดยจลนทรยทกอโรค เชน พวกแบคทเรยและรา ตวอยางราทเปนสาเหตสาคญของการเกด epizootic ในหมเกาะ West Indies และ ทะเล Caribbean คอ Aspergillus sydowii ซงเปนราทอาศยสงทเนาเปอย เพอการดารงชวต พบไดทงบนบกและในทะเล

ดงนนการศกษาครงนจงมงเนนคดเลอกแบคทเรยทมฤทธตานจลนทรยจากสตวไมมกระดกสนหลง เพอนามาประยกตใชในการยบยงจลนทรยชนดตางๆ ตอไป

3 บทตรวจเอกสาร กลปงหา (ศกดอนนตและคณะ, 2548, http://www.scitour.most.go.th; April 20,2012)

ม ชอวงศ Paramuriceidae และ ชอวทยาศาสตร Paramuricea sp. กลปงหา เปนสตวชนดหนง จดอยในกลมเดยวกบปะการง มขนาดตวแตละตวประมาณ 1-4 มลลเมตร ขนอยกบแตละชนด ตวกลปงหาแตละตว เรยกวา polyp จะเจรญเตบโต อยรวมกนเปนโคโลน มการตดตอเชอมโยงกน แลกเปลยนอาหารซงกนและกน เคลอบอยบนแกนคลายกงไม แกนของกลปงหานเปนสารประกอบโปรตนชนดหนงทเรยกวา “กอรโกนน” (gorgonin) ซงมองคประกอบคลายกบสารทพบในเขาสตว ซงกลปงหาสรางขนมาคาจนรางกาย มลกษณะเปนเสนหรอเปนรปพด ดงนน กลปงหารปพดทเหนจงประกอบไปดวยตวกลปงหา นบพน นบหมนตว เคลอบอยภายนอก กลปงหามสวนทยดเกาะกบพนเรยกวา holdfast เคลอบไปบนพนผว มคณสมบตในการยดเกาะบนพนแขง มความเหนยว แขงแรง

กลปงหาจะพบมากบรเวณรองนาลก 10-15 เมตร อาจเปนบรเวณโขดหนหรอหวแหลม ซงมกระแสนาไหลแรงเนองจากสามารถโอนเอนตามกระแสนาได มกพบกลปงหาในทนาลกและกระแสนาแรง อาจเปนเพราะกลปงหาไมตองแกงแยงพนทกบปะการง เนองจากกลปงหาหลายชนดไมมสาหรายซแซนเทลล ซงเปนสาหรายเซลลเดยว ทอาศยอยรวมเหมอนกบปะการง การทไมมสาหรายเซลลเดยวอยรวมนนทาใหกลปงหาไมมความจาเปนตองพงพาแสงมากนก อกทงกลปงหาเปนสตวทกรองกนแพลงกตอนเปนอาหาร โดยจะใชเขมพษและหนวดทอยรอบปากทง 8 เสน ซงมลกษณะคลายขนนก ชวยจบเหยอในนา สงเขาไปยงสวนของปากซงอยตรงกลางและตอไปยงทอไซโฟโนกลพ (siphonoglyph) ททาหนาทเปนคอหอยและหลอดอาหาร ผานไปสสวนของทองซงฝงอยในเนอเยอซแนนไคม (coenenchyme) ทงน กลปงหาจะมทอขนาดเลกเชอมโยงกนระหวางตวกลปงหาแตละตว เพอสงผานสารอาหารทไดจากการยอยของแตละตวนนไปหลอเลยงเนอเยอและโครงสรางตางๆ ตลอดทงโคโลน นอกจากนกลปงหายงมโครงสรางหนปนขนาดเลกจานวนมากซงเรยกวา สเครอไรท (sclerites) ประกอบกนอยท งโคโลนเพอชวยปองกนเนอเยอของกลปงหาใหปลอดภยและสรางความแขงแรงใหกบโคโลน แมตวกลปงหาจะมขนาดเลก แตสามารถดารงชวตผานพนมรสมและเจรญเตบโตขนเปนโคโลนขนาดใหญได กลปงหาสามารถสบพนธได 2 วธ วธแรกโดยการแตกหนอทโคน เมอตวเกาตายตวใหมกเจรญเตบโตตอไป วธทสองเกดจากการผสมพนธระหวางไขกบอสจ ไขทไดรบการผสมแลวจะเจรญเตบโตตอไปเปนตวเมย เมอตวออนโตจะวายนาจากตวแมไปเกาะทโขดหน เพอสรางกลปงหาตวใหมขนมาซงจะมขนาดโตขนเรอยๆ จากการศกษาของนกชววทยาทางทะเลพบวา กลปงหางอกไดยาวแค 5-200 มลลเมตร ตองใชเวลานานนบป ซงกลปงหาสวนใหญมความจาเพาะตอพนท เชน กลปงหาทพบในประเทศไทยแสดงในตารางท 1

4 ตารางท 1 ชนดและลกษณะของกลปงหาทพบในประเทศไทย

กลปงหา ลกษณะ

1.Solenocaulon ความสงประมาณ 15-40 ซม. โคโลนมการเรยงตวในระนาบเดยว และหอเขาหากนคลายกรวย โคโลนมสแดงดานในของกรวยมสขาว

2.Melithae ความสงตงแต 5-240 ซม. คลายกงไม มการเรยงตวในระนาบเดยว มปมนนกระจายตามกงกานของโคโลน ลาตนมสเหลอง

3.Acabaria ความสงไมเกน 5 เซนตเมตร โคโลนเปนแบบรางแห มกปรากฎปมนน ตามกงกานของโคโลน โคโลนมสสดใส เชน เหลองสด หรอแดงสลบขาว

4.Muricella สงไดมากกวา 70 เซนตเมตร โพลปยดหดได เมอโพลปหดจะปรากฎเปนปมนนบนผวจานวนมาก โคโลนสขาว โพลปสแดง

5.Mopsella

ความสงตงแต 5-240 เซนตเมตร การเรยงตวของโคโลนคลายกงไม มปมนนตามกงกานของโคโลน โคโลนมสแดงและมโพลปสเหลอง

6.Echinogorgia ความสงประมาณ 10-15 เซนตเมตร ผวขรขระเนองจากมแทงหนปน เรยงตวกนรอบโพลป โคโลนมสแดง

7.Euplexaura ความสงประมาณ 70 เซนตเมตร แตละชวงของการแตกแขนงยาวเปนพเศษ โพลปยดหดได โคโลนสเหลอง โพลปสขาว

8.Rumphella

ความสงประมาณ 12-20 เซนตเมตร แตละกงของโคโลนหนาและออนไหว ปลายกงมน โคโลนสเทา นาตาลเทา หรอนาตาลอมเขยว

9. Hicksonella ความสงอาจจะมากกวา 60 เซนตเมตร กงหนาและแขง โคโลนมการแตกกงเปนค โคโลนสเทา นาตาลเทา หรอ นาตาลอมเขยว

10.Junceella

ความยาวตงแต 5-450 เซนตเมตร การเรยงตวของโพลปไมเปนระเบยบ ความหนาของเสนจะไมเสมอกนและอาจมการแตกแขนง

11.Ellisella

ความสงประมาณ 60 เซนตเมตร โคโลนมการแตกกงเปนค กงแขนงจะยาวมาก โพลปยดหดได ผวมตมเลกๆ กระจายทว โคโลนมสสดใส เชน แดง สม นาตาลแดง

12.Ctenocella ความสงตงแต 5-120 เซนตเมตร การเรยงตวของโคโลนมลกษณะเปนซ คลายหว โคโลนมหลายส เชน เหลอง ขาว นาตาลออน เปนตน

13.Subergorgia

ความสงตงแต 25-450 เซนตเมตร การเรยงตวของโคโลนคลายพด มลกษณะสานกนคลายรางแห สงเกตไดงายจากขนาดอนใหญโต มการ เรยงตวในระนาบเดยว โคโลนมสเหลอง

ทมา: http://www.TalayThai.com; January 7, 2009

5 ฟองนา

ฟองนาเปนสงมชวตทจดอยใน Phylum Porifera แปลวา ผมลาตวเปนรพรน ฟองนาเปนสตวไมมกระดกสนหลงโบราณทมโครงสรางรางกายแบบงายๆ เนองจากการเรยงตวของเซลลแบบหลวมๆ และไมมลกษณะของเนอเยอทแทจรง เซลลของฟองนามลกษณะพเศษทไมพบในสตวชนดอนคอ ความสามารถในการเปลยนแปลงหนาทของเซลลจากหนาทหนงไปเปนหนาทอกอยางหนงได (Totipotency) ลาตวเปนรพรนและมทอนากระจายอยท วตว โดยมระบบทอนา (Water canal system) ทประกอบดวยทอเลกๆ ตามลาตวเปนทอนาเขา (Ostium) ผนงลาตวประกอบดวยเนอเยอสองชน เนอเยอชนนอกเปนเซลลรปรางแบนเรยงกนคลายแผนกระเบอง ประกอบดวยเซลลทเปนปลอก มแสเซลลชวยโบกพดใหนาเคลอนผานลาตว เรยกเซลลเหลานวาเซลลปลอกคอ (Choanocyte) เซลลพเศษเหลานทาหนาทจบอาหารและออกซเจน ไวหายใจ สวนนาทผานการกรองแลวจะไหลออกมาทางทอนาออก (Osculum) ซงสวนมากมขนาดใหญทอเดยว โครงรางของรางกาย (Skeleton) ประกอบดวยหนามฟองนา (Spicules) และหรอเสนใยฟองนา (Spongin fibers) มโครงสรางคาจนระหวางเนอเยอชนนอกกบชนใน คอ อยในชนมเซนไคม เรยกวา ขวาก (spicule) ทาใหฟองนาคงรปรางอยได ขวากสามารถแบงตามสารทเปนสวนประกอบได 3 ชนด คอ ขวากหนปน (Calacreous spicule) เปนขวากทประกอบดวยหนปน พบในฟองนาหนปน, ขวากแกว (Siliceous spicule) เปนขวากทประกอบดวยซลกา, สปองจน (Spongin) ไมใชขวากแตเปนเสนใยทประกอบดวยสาร สเกลอโรโปรตน (Scleroprotein)

ฟองนาจดจาแนกตามลกษณะของขวากออกได 4 Classes ดงน

1. Class Calcarea เปนฟองนาทมขวากเปนหนปนมรปรางรปเขมหรอม 3 แฉก หรอ 4 แฉก ลกษณะแขงเปราะ เรยกฟองนาพวกนวา ฟองนาหนปน (Calcareous sponges) ไดแก ฟองนาแจกนสนาเงน Xestospongia sp. 2. Class Hexactinellida เปนฟองนาทมขวากเปนรป 6 แฉก เปนสารประกอบพวกซลกา สานกนเปนตาขายเรยกฟองนานวา ฟองนาแกว (Glass sponges) มรปรางคลายแจกน หรอถวยมลกษณะสวยงาม เปนฟองนาทอาศยอยในทะเลบรเวณนาลก ไดแก กระเชาดอกไมของวนส (Venus’s flower basket, Euplectella) 3. Class Demospongiae เปนฟองนาทมลกษณะออนนมเนองจากเปนเสนใยทมสารประกอบพวกสเกลอโรโปรตน หรอบางชนดอาจมขวากเปน ซลกาผสมใยโปรตน ไมมหนปนเปนสวน ประกอบ ฟองนาพวกนอาศยอยในทะเล มสสนตาง ๆ ไดแก ฟองนาถตว (Spongia) ฟองนาดอกเหด (Pterion) และฟองนาจด (Spongilla) 4. Class Sclerospongiae เปนฟองนาทพบอาศยอยตามรอยแตกของปะการง จงเรยกฟองนา

6 ปะการง ลกษณะทวไปจะคลายฟองนาในชนเดโมสปอนเจย (Class Demospongiae) แตฟองนาในชนน จะมโครงสรางเปนหนปนบาง ๆ หมอยภายนอก มขวากเปนซลกา และเสนใยโปรตน เปนฟองนาทพบนอยมาก ไดแก Calcifibrospongiae ฟองนาเปนสตวเกาะตดอยกบทตามพนทะเล (Sessile animals) สามารถสบพนธไดทงแบบอาศยเพศและไมอาศยเพศ บางชนดมการเลยงตวออนไวในระบบทอนาของตวเอง ตวอยางฟองนาทพบในประเทศไทย ดงแสดงในตารางท 2 (http://www.lib.kmutt.ac.th; March 3, 2010) ตารางท 2 ตวอยางฟองนาทพบในประเทศไทย

Species

ชอสามญ

Xestospongia sp. ฟองนาเคลอบแขงสมวง Gelliodes petrosioides ฟองนาเคลอบแขงสฟา Petrosia sp. ฟองนาเคลอบสมวง Xestospongia sp. หรอ Petrosia sp. ฟองนาครกแขนง Coelocarteria singaporensis ฟองนากระชาย Haliclona (Halichoclona) sp. ฟองนาคลานสสม Paratetilla bacca (Selenka) ฟองนาลกกอลฟ Chondrilla nucula (Schmidt) ฟองนาหนงสดา Clathria (Thalysias) sp. ฟองนาเคลอบสสม Iotrochota purpurea (Bowerbank) ฟองนาเคลอบสเหลองดา Iotrochota baculifera Ridley ฟองนาสดาเมอกมวง Hyrtios gumminea (Ridley) ฟองนายดหยนสดา Oceanapia sagittaria (Sollas) ฟองนาทอพมสแดง ทมา: http://www.smcrrc.go.th/kokra_spong.html; January 7, 2009 (สเมตต ปจฉาการ, 2547)

7 ปะการง

ปะการง เปนสงมชวตทอาศยอยในทะเล จดอยในชนแอนโธซวและจดเปนพวกดอกไมทะเล ปะการงแตละตวมขนาดเลกเรยกวาโพลฟ แตจะอาศยรวมกนอยเปนโคโลนทประกอบไปดวยโพลฟเดยวๆจานวนมาก ปกตแลวโพลฟจะมขนาดเสนผานศนยกลางไมกมลลเมตร ดานนอกเปนชนผนงอพเธลเลยม สวนดานในเปนเนอเยอคลายวนทรจกกนวา เมโซกล โพลฟมสมมาตรรศมและมหนวดโดยรอบชองปากทอยตรงกลางทเปดตอเนองไปทกระเพาะอาหารหรอซเลนเทอรอนไปยงทอาหารถกยอยและปลอยของเสย หนวดทงหลายของโพลฟจะทาการจบเหยอโดยการใชเซลลททาใหเกดอาการระคายเคองแสบรอนทเรยกวาเขมพษ มเซลลหลายชนดทพฒนาขนมาเพอการจบเหยอและทาใหเหยอสลบ การเกดโครงสรางแขงเนอปนดานนอกเกดจากการสะสมตวของแรอะราโกไนต โดยโพลฟทาหนาทจบไอออนของแคลเซยมจากนาทะเลใหทาปฏกรยากบกาซคารบอนไดออกไซดจากสาหราย อตราการตกสะสมของแรอะราโกไนต มความแปรผนอยางมากในระหวางชนดพนธและสภาพสงแวดลอมรอบขางทอาจจะมากถง 10 กรม/ตารางเมตรของโพลฟ/วน ทงนขนอยกบแสงสวาง กลาวคอในชวงกลางคนจะผลตไดเพยงประมาณรอยละ 90 ตากวาการผลตในชวงกลางวน

สวนการสบพนธแบบอาศยเพศของปะการง สวนใหญแลวปะการงจะสบพนธแบบใชเพศ โดยประมาณแลวรอยละ 25 จะเปน

ปะการงทสรางแนวปะการงทโคโลนหนงๆจะประกอบไปดวยเพศเดยว สวนทเหลอจะเปนโคโลนชนดทมสองเพศ ประมาณรอยละ 75 ของปะการงชนดทสรางแนวปะการงทตวออนเกดจากการปฏสนธภายนอกโคโลนแม โดยการปลอยเซลลสบพนธ (ไขและสเปรม) ออกไปสมวลนาทะเลแพรกระจายไปไดระยะทางไกลๆ เมอเซลลสบพนธหลอมรวมกนในระหวางการปฏสนธ

สวนการสบพนธแบบไมอาศยเพศของปะการง เชน การแตกหนอ ทาใหโคโลนของปะการงมการเพมขนาดขน การเพมขนาดของโคโลนจะ

เกดขนเมอมคอรอลไลตตวใหมตวหนงเตบโตมาจากโพลฟตวเตมวย การแบงตวตามความยาว จะเรมตนดวยการขยายขนาดของโพลฟแลวตามดวยการ

แบงตวของกระเพาะ ปากจะแบงตวออกแลวเกดเปนหนวดชดใหม จากนนโพลฟแตละตวทงสองจะสรางสวนของลาตวและโครงสรางภายนอกทขาดหายไปใหเปนโพลฟทสมบรณ

การแบงตวในแนวขวาง เกดขนเมอโพลฟและโครงสรางภายนอกเกดการแบงตวเองในแนวขวางออกเปนสองสวน หมายความวาสวนหนงจะมสวนแผนฐานรองดานลางและอกสวนหนงเปนแผนชองปากดานบน โพลฟใหมทงสองนกจะสรางสวนทขาดหายไปใหเปนโพลฟใหมทสมบรณ

การแตกตว เกดขนในปะการงบางชนดโดยเฉพาะอยางยงปะการงในวงศฟงจอด ทโคโลนสามารถแตกออกเปนสองสวนหรอมากกวาในชวงแรกๆของพฒนาการ

8

การหนออกของโพลฟ เกดขนจากโพลฟหนงๆทงโคโลนตวเองแลวไปสรางถนฐานใหมแลวพฒนาการไปเปนโคโลนใหม

การแตกออก จรงๆแลวถอเปนชนดหนงของการแตกตว เกดขนจากโคโลนหนงแตกหกระหวางการเกดพายหรอเหตการณอนๆททาให โคโลนเกดการแตกหก สวนทแตกหกออกมาแตละชนสามารถเจรญเตบโตพฒนาเปนโคโลนใหมได (http://th.wikipedia.org/wiki; January 7, 2009)

ตารางท 3 ตวอยางชนดของปะการง แบงตามลกษณะภายนอกไดดงน

ปะการง

ลกษณะภายนอก

1. ปะการงเขากวาง มลกษณะคลายเขากวาง บรเวณกงจะมตมอยโดยรอบ ตมเหลานคอทอยของตวปะการง

2. ปะการงแบบแผน แบนราบ

มลกษณะคลายโตะบางครงอาจซอนกนเปนชน

3. ปะการงแบบหมหอ มลกษณะแผขยายหมฐานพนทปะการงตดอย

4. ปะการงแบบเปนกอน มลกษณะเปนกอนคลายกอนหน

5. ปะการงแบบกงกอน

มลกษณะการรวมกนเปนกระจกคอนขางแนน แตไมตดเปนกอนเดยวกน

6. ปะการงแบบเปนแผน มลกษณะซอนๆ กนเปนกระจก คลายใบไมหรอผก

7. ปะการงแบบเหด มลกษณะการแผออกคลายดอกเหด

8. ปะการงสนาเงน มสนาเงนอยในเนอของหนปน

ทมา: http://www.dnp.go.th/npo/html/Research/Coralreef/Coralreef.html; January 7, 2009 จากการทกลปงหา ฟองนา ปะการง สามารถดารงชวตอยไดในสภาพแวดลอมในทะเล

ซงมความหลากหลายและมสภาวะการแขงขนทสง แสดงวาสงมชวตเหลานนาจะมกลไกในการ

9 ตอสเพอการอยรอด จงเปนทมาของความสนใจจลนทรยซงมความเกยวของกบกลปงหา ฟองนา และปะการง (Friedrich et al., 1999) เพรยง เพรยง (barnacle) เปนสตวทะเลไมมกระดกสนหลงประเภทสตวขาปลอง มหลายชนดในอนดบ Thoracica เปลอกหมตวมหกแผนเรยงซอนกน รปรางของเปลอกมหลายแบบ เชน รปกรวยควา มปากเปดดานบน เปลอกบรเวณปากบางและคม เกาะอยตามหนและวสดอน ๆ ทนาทวมถง เชน Balanus amphitrite ขนาดเสนผาศนยกลางทฐานประมาณหนงเซนตเมตร เพรยง สวนใหญประมาณ 75% จะอาศยอยในนาตน สวนประมาณอก 25% จะเปนเพรยงนาลก ซงเพรยงบางชนดสามารถอยในนาทลกถง 600 เมตร ได ความหลากหลายของจลนทรยในทะเล

จานวนรวมสายพนธแบคทเรยทเปนทรจก ในโลกมเพยงประมาณ 4,000 สายพนธเทานนจากจานวนรวมของแบคทเรยทงหมดประมาณ 3,000,000 สายพนธ ซงคดเปน 0.1 % (Groombridge, 1992)

เนองจาก 75 % ของพนผวโลกถกปกคลมดวยมหาสมทร จลนทรยในระบบนเวศทางทะเลจงมความซบซอนและหลากหลายโดยธรรมชาต การศกษาทางจลชววทยารวมไปถงศกษารปแบบของชวตบรเวณผวนาและลกลงไป ในแถบชายฝ งทะเลและไกลออกไปจากชายฝ งทะเล ระบบนเวศทไดศกษาเปนพเศษ คอบรเวณปากภเขาไฟใตนา, ระบบนเวศแนวปะการงเขตรอน, ระบบนเวศปากแมนา, บง, นาเกลอ (saitpans), backwaters, ปาชายเลน บรเวณเหลานทมความอดมสมบรณและธาตอาหารทหลากหลาย ซงในสงแวดลอมทางทะเลกประกอบไปดวยทอยอาศยของจลนทรยทะเล ดงน

1. บรเวณผวนาทสมผสอากาศ 2. บรเวณทองนา (ประกอบไปดวยจลนทรยทดารงชพแบบอสระ) 3. บรเวณผวหนาตะกอนทตดตอกบพนนา 4. บรเวณตะกอน 5. บรเวณพนผวอนภาคของสารอนทรยและสารอนนทรย 6. บรเวณผวภายนอกและภายในของพชและสตว 7. บรเวณสภาพแวดลอมทเปนทสด เชน รอนจด, เยนจด, เคมจด เปนตน การศกษาในครงนมความสนใจจลนทรยทอาศยอยบรเวณผวภายนอกและภายในของ

พชและสตว ซงพชและสตว (แพลงกตอนไปจนถงสตวเลยงลกดวยนม) บนพนผวของมน (เชน epibiotic) และโพรงภายใน (เชน endobiotic) มความเหมาะสมในการใหจลนทรยตางชนดกนเจรญได

10 แบคทเรยทะเล

นยามของแบคทเรยทะเลขนอยกบความสามารถในการเจรญ ในความเขมขนของนาทะเลเทานน แบคทเรยทะเลหลายสายพนธตองการ โซเดยมไออน, โพแทสเซยมไอออนและแมกนเซยมไอออน สวนบางสายพนธยงตองการคลอไรดไอออนและเฟอรรกไอออน โดยทวไปแลวแบคทเรยทะเลมความสามรถเจรญไดเฉพาะในนาทะเลเทานน แบคทเรยทงหมดทอาศยอยในนาทะเลอาจจะไมใชแบคทเรยทะเลทแทจรง บรเวณใกลชายฝ งทะเล 95 % ของประชากรแบคทเรยอยในรปแบบทนเกลอ มเพยง 5% ทเปนแบคทเรยทะเลทแทจรง สวนในมหาสมทรเปดและทะเลนาลก แบคทเรยทะเลทแทจรงเปนสายพนธทโดดเดน

ในมหาสมทรมนาอย 1022 ลตร และในนานนประกอบไปดวยแบคทเรย 108-109 CFU/L แบคทเรยสวนใหญของโลก ( 1030 ) อาศยอยในสวนของทองนาทะเล แบคทเรยทเหลอสวนใหญอาศยอยในตะกอนนาทะเลซงครอบคลม 70% ของพนผวโลก แหลงพลงงานสาคญของแบคทเรยคอแสงแดด แตแสงแดดจะใชไดเฉพาะบรเวณทผวนา สวนแบคทเรยในนาและตะกอนคาดวาจะตองใชพลงงานในรปแบบอนๆทแตกตางกนออกไป ในมหาสมทรสวนใหญจะเปนแบบ oligotrophic (Purushothaman and Jayalakshmi, 2010)

รปแบบการดารงชวตของแบคทเรยมความหลากหลายเปนอยางมาก ในดานความตองการสารอาหาร นบเปนเรองยากมากทจะทาการจาแนกแบคทเรยและมการใชระบบตางๆเปนจานวนมากในการคนหาแบคทเรยเหลาน ระบบทใชในการจดจาแนกคอความเหมอนกนตามสายววฒนาการ (Woese and Fox, 1977) ซงวธการนเปนวธการทไดรบการยอมรบอยางแพรหลาย ซงการจดกลมนจะแยกเปน prokaryotes, archaebacteria และ eubacteria ซงหากแบงแบคทเรยเหลานตามแหลงคารบอนและแหลงพลงงานทแบคทเรยตองใชจะถกแบงเปน autotrophs และ heterotrophs

กลม autotrophs จดตามแหลงพลงงานทใชจะถกจดเปน photoautotrophs ใชแสงอาทตยเปนแหลงพลงงาน และ chemoautotrophs ใชสารอนนทรยเปนแหลงพลงงาน แบคทเรยในกลม chemoheterotrophic เปนตวแทนแบคทเรยกลมใหญ ถกแบงตามลกษณะทางสณฐานวทยาและสรรวทยา ถงแมจะอยในกลมอนกรมวธาน แตแบคทเรยแสดงความหลากหลายของเมตาบอลซมทสงมากและบางกลมยงมความสามารถเฉพาะตวในการใชธาตอาหารตามสภาพแวดลอมทอย ซง Fenical และ Jensen (1993) ไดทาการจดกลมแบคทเรยทะเลไวดงน

11 ตารางท 4 การจดกลมแบคทเรยทะเล (Fenical and Jensen, 1993)

Archaebacteria Autotrophic Eubacteria

Chemoheterotrophic Eubacteria

Eukaryotes

Chemoautotrophs Photoautotrophs Gram positive Fungi Methanogens Anoxygenic

photosynthesis Endospore forming rods and cocci

Higher fungi

Thermoacidophiles Purple and green photosynthetic bacteria (Order Rhodospirillales)

Non spore forming rods

Ascomycetes

Chemoheterotrophs Oxygenic photosynthesis

Non spore forming cocci (family Micrococceae)

Deuteromycetes

Halophiles Cyanobacteria (order Cyanobacteriales)

Actinomycetes and related organisms

Basidiomycetes

Prochlorophytes (order Prochlorales)

Lower fungi (class Phycomycetes

Chemoautotrophs Nitrifying bacteria (family Nitrobacteraceae)

Rods and cocci aerobic (family Pseudomonadaceae)

Colorless sulfur oxidizing bacteria

Facultative (family Vibrionaceae)

Methane oxidizing bacteria (family Methylococcaceae)

Anaerobic (sulfur reducing bacteria)

12 ตารางท 4 (ตอ) การจดกลมแบคทเรยทะเล (Fenical and Jensen, 1993)

งานวจยทเกยวของกบจลนทรยและสตวไมมกระดกสนหลง

ในชวงระยะเวลาทผานมา มการศกษาสารตางๆทแยกไดจากสตวไมมกระดกสนหลงในทะเลทมฤทธในการยบยงเซลลมะเรงและเชอกอโรคตางๆ เชน สารตานจลนทรยจากฟองนาทะเล 10 ชนด ทเกบตวอยางจากมหาสมทรแอตแลนตกชายฝ ง Morocco และจากอาวไทยนามาสกดโดยใช chloroform เมอนามาทดสอบฤทธตานแบคทเรย 4 สายพนธ และเชอรา 5 สายพนธ โดยเทคนค Agar disc method ผลทไดคอ สามารถยบยงอยางนอยทสด 1 สายพนธ คดเปน 50% และ 20% สามารถยบยงเชอราได ขณะเดยวกนกไดมการสกดสารจาก Hippospongia communis และ Ircnia varaibilis ทเกบจากแหลงเดยวกนซงสามารถยบยง Candida tropicalis R2 (เปนสายพนธทดอ amphotericin B และ nystatin) รวมไปถงแบคทเรยและเชอราชนดอนดวย ซงตรวจสอบฤทธยบยงเชอรา โดยการหาคา MIC มาตรฐาน โดยวธการ Broth dilution method และวธ Two test media ( Rifai et al., 2004 )

มรายงานวาตวอยางฟองนาจากประเทศบราซล สามารถทจะผลตสารตานจลนทรย สารตานเชอรา และสารตานมะเรง ทาใหมการคนพบสารใหมทใชรกษาผปวยได โดยสามารถยบยงแบคทเรย คอ Staphylococcus aureus ATCC 6538P, Bacillus subtilis ATCC 6633, S. epidermidis ATCC 12228, Escherichia coli ATCC 25922 และ Micrococcus luteus

Archaebacteria Autotrophic Eubacteria

Chemoheterotrophic Eubacteria

Eukaryotes

Halophiles Gliding bacteria (order Cytophagales and Beggiatoales) Spirochaetes (order Spirochaetales) Spiral and curved bacteria (family Spirillaceae) Budding, and/or appendaged bacteria Mycoplasma (class Mollicutes

13 ATCC 9341 โดยม chloramphenicol เปนยาทใชในเปรยบเทยบ สวนเชอราทยบยงไดคอ Candida albicans ATCC 10231, Saccharomyces cerevisiae ATCC 1600 (Monks et al., 2002)

จากการศกษาของ Tadesse et al. (2008) ทไดคนพบสารประกอบทแยกไดจากกลปงหาและฟองนาซงสารประกอบเหลานสามารถตานเชอแบคทเรยกอโรคในปลาและในคนได โดยสามารถตานแบคทเรยแกรมบวกคอ Bacillus sp., Staphylococcus aureus ซงมฤทธ เทยบเทากบยาตานจลนทรยพวก penicillin, vancomycin, chloramphenicol รวมไปถง polymyxin

อกทงยงมการศกษาตวอยางฟองนา 7 ชนด จากทะเลเมดเตอรรเนยนของ Touati et al. (2007) พบวาเมอนาสารสกดทแยกไดมาทดสอบฤทธในการยบยงแบคทเรยกอโรค 8 สายพนธและเชอรากอโรคอก 6 สายพนธ ปรากฏวาสารสกดจาก Agelas oroides และ Axinella damicornis สามารถยบยง Pseudomonas aeruginosa และ Listeria monocytogenes ทดอยา gentamicin รวมไปถง Enterococcus faecalis สวนสารสกดจาก Axinella damicornis สามารถยบยงเชอแบคทเรยกอโรคไดทง 8 สายพนธและสารสกดจาก Agelas oroides สามารถยบยงเชอรากอโรคไดทกสายพนธ

Galeno and Martinez (2006) ทาการศกษาฤทธตานจลนทรยของฟองนาทะเล 24 สายพนธโดยทดสอบกบเชอแบคทเรยกอโรค คอ S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 และเชอ Candida albican ATCC 10231 เมอสกดสารจากฟองนาโดยใชตวทาละลายทแตกตางกน คอ methanol, chloroform และ n-hexane โดยใชวธ Disc diffusion assay ปรากฏวา ม 19 สายพนธทมฤทธตานจลนทรยและม 3 สายพนธทมประสทธภาพในการยบยงมากทสด คอ Leucetta aff. Florida, Clinachyrella kuekenthali และ Svensea zeai ซงฟองนาบางสายพนธ เชน Topsentia ophiraphidites ประสทธภาพของการยบยงขนกบตวทาละลายทใชในการสกดดวย ซงเมอใช methanol ในการสกดจะสามารถยบยงแบคทเรยแกรมลบไดด สวน Ircinia strobilina ยบยงเชอแบคทเรยแกรมบวกไดด

สวน Aceret et al. (1998) พบวา Sinularia flexibilis เปนปะการงออนทพบแบคทเรยและสาหรายปกคลมบรเวณผว และมการสรางสารพวก Sinulariolide และ Flexibilide ทสามารถตอตานสงมชวตอนทมารกราน ซงสามารถนาสารนมาทาเปนสารปฏชวนะได โดยมการสมตวอยางปะการง และนามาแชเยอกแขง เพอสกดสารเคมและแยกใหได diterpenes และทดสอบฤทธตานจลนทรยโดยวธ Disc assay method และใชวธ Tube dilution technique เปนวธทดสอบความเขมขนตาสดทยบยงเชอได ผลการศกษาจากทงสองวธพบวาสารสกดสามารถยบยงเชอแกรมบวกได 2 สายพนธคอ Bacillus sp. และ S. aureus ซงใหผลเทยบเทากบยา penicillin, chloramphenicol, vancomycin และ polymixin

14

ถงแมวาจะมการคนพบสารตานจลนทรยจากสตวไมมกระดกสนหลง เชน กลปงหาและฟองนาบางชนด แตประสทธภาพของสารตอตานนจะขนอยกบสภาพแวดลอมและอณหภมทเปลยนแปลงไป (Munro and Munro, 2003) ซงสารเหลานอาจจะเพมประสทธภาพในการตอตานหรอชวยสงเสรมการเจรญของจลนทรยทกอโรคได (Alker et al., 2001) จากการศกษาผลตภณฑธรรมชาตในทะเล ผลตภณฑธรรมชาตทไดจากจลนทรยจดเปนอนดบ 3 รองจาก พวกฟองนา (Sponga et al., 1999) และ coelenterates (Blunt et al., 2004) และหากมการนาสตวไมมกระดกสนหลงดงกลาวมาใชประโยชนมากขน โดยไมมการเพาะเลยงทดแทนกจะทาใหเกดการสญพนธได จากรายงานของ Friedrich et al. (1999) ทพบวา กวา 40% ของมวลชวภาพในเนอเยอของฟองนา Aplysina aerophoba มแบคทเรยอาศยอย จงนาไปสความคดทวา แบคทเรยเหลานนาจะมฤทธตานจลนทรยกอโรคได ดงนนทางเลอกทดทางหนงคอ การเพาะเลยงจลนทรยทมความเกยวของกบสตวไมมกระดกสนหลง เพอทดสอบหาฤทธตานเชอกอโรค เนองจากมการศกษาจานวนมากทรายงานความสมพนธของการอยรวมกนของจลนทรยกบสตวไมมกระดกสนหลงในทะเล เชน มรายงานถงการคดแยกแบคทเรยทไดจากฟองนาแถบ Antarctic ซงมสภาพแวดลอมทรนแรง แสดงถงความสามารถของฟองนาและแบคทเรย ทมความอดทนตอสภาพแวดลอมตางๆ ไดอยางหลากหลาย และจากการศกษาความหลากหลายของจลนทรยโดยวธ 16S rDNA sequencing ยงมการพบ α และ γ-Proteobacteria (17.3 และ 65.3%), CFB group ของ Bacteroidetes (10.7%) และ Actinobacteria (6.7%) (Mangano et al., 2008)

การศกษาแบคทเรยในตวอยางฟองนา 4 สายพนธจากทะเลจนใต คอ Stelletta tenui, Halichrondia, Dysidea avara และ Craniella australiensis โดยการหาลาดบเบสของ 16S rRNA gene เทยบผลกบฐานขอมล BLAST ไดแบคทเรยทงหมดสไฟลม คอ Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes และ Actinobacteria (Li et al., 2005)

นอกจากนมการศกษาความหลากหลายของจลนทรยในตวอยาง สาหราย เพรยงหวหอม และปะการง จากทางตอนเหนอของชายฝ งทะเลแถบบราซล พบเชอรา 256 สายพนธ คดแยกออกมา แตกตางกน 24 สกล รวมไปถง Ascomycota, Zygomycota และ Basidiomycota แบคทเรย 181 สายพนธ แตกตางกน 41 สกล เชน Bacillus, Ruegeria, Micrococcus, Pseudovibrio และ Staphylococcus (Menezes et al., 2010)

Gandhimathi et al. (2008) ไดทาการแยก Actinomycetes จากฟองนาทะเลซงมฤทธ ในการยบยงเชอแบคทเรยและรากอโรคได โดยสามารถยบยงแบคทเรยไดทง แกรมบวกและ แกรมลบ ไดแก Micrococcus luteus, Streptococcus haemolyticus, Klebsiella pneamoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis, Bacillus spp., Pseudomonas aeruginosa,

15 Staphylococcus aureus สวนเชอราทสามารถยบยงไดคอ Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus และ Candida tropicalis

Ely et al. (2004) คดแยก แบคทเรยและรา จากตวอยางฟองนา 7 ชนด และ สาหราย 2 ชนด ในแถบชายฝ งทะเลของประเทศอนเดย เพอคนหาสารตานจลนทรย ในการทดลองน สารสกด Methanolic จากสงมชวตในทะเลเหลานน แสดงกจกรรมในการตานจลนทรยไดหนงชนดหรอมากกวานน โดย Sigmadocia carnosa แสดงกจกรรมการยบยงทกวาง แตไมสามารถยบยง Fusarium sp. ได Echinogorgia ไมมฤทธยบยงแบคทเรย แต Echninogorgia reticulate ยบยง Rhodotorula sp. ได แตนอยมาก และ E. compecta สามารถยบยง Fusarium sp. และ Nocardia sp. ได เชอทมฤทธยบยงแบคทเรยคอ Haliclona cribricutis และ Chrotella australiensis สามารถยบยง Klebsiella sp. และ Vibrio cholerae ไดตามลาดบ

Anand et al. (2005) คดเลอก แบคทเรยทะเล 75 สายพนธทมความเกยวของกบฟองนา 4 ชนด (Echinodictyum sp., Spongia sp., Sigmadocia fibulatus และ Mycale mannarensis) ทไดจากชายฝ ง Tuticorin coast ในแถบ อาว Mannar เพอศกษาการผลตสารปฏชวนะ ทมผลยบยงแบคทเรย 4 สายพนธ คอ Bacillus subtilis, Escherichai coli, Vibrio parahaemolyticus, V. harveyi และรากอโรคอก 1 ชนด คอ Candida albicans โดยใชวธ agar-overlay พบวา 21 % ของแบคทเรยทแยกไดสามารถสรางสารสารปฏชวนะ โดยมกจกรรมยบยงแบคทเรยในชวงกวางหรอมความจาเพาะตอชนดของแบคทเรย และพบวาแบคทเรยสายพนธ SC3 มประสทธภาพสงในการยบยงจลนทรยและเจรญเตบโตไดด หลงจากนนไดนา culture broth มาสกดดวย ethyl acetate และนามาแยกสวนดวย reverse phase HPLC พรอมกบหา fraction ทมกจกรรมการยบยงแบคทเรยสง จากการศกษาสณฐานวทยาและสรระวทยาของ SC3 พบวาเปนแกรมบวก รปแทง สรางสปอรได เคลอนทได ผลต catalase และ oxidase จากการวเคราะห Phylogenetic โดยการเปรยบเทยบและการวเคราะหลาดบเบสของ 16S rRNA gene พบวามลาดบเบสทคลายคลงกบ Vibrio และ Bacillus ประมาณ 95-99% การศกษาครงนเปนรายงานครงแรกเกยวกบการวเคราะหสายพนธของแบคทเรยทมความเกยว ของกบฟองนาในแถบทะเลอนเดยทสามารถผลตสารปฏชวนะได

ในการคดแยกแบคทเรยจากตวอยางฟองนาจากทะเลเมดเตอรเรเนยนแลวนามาศกษา ฤทธตานจลนทรย ซงสามารถยบยงเชอกอโรคได 5 สายพนธ คอ Escherichia coli, Staphylococcus lentus, Candida sp., Bacillus subtilis และ Mycobacterium sp. หลงจากศกษาลาดบเบสของ 16S rDNA ของเชอแบคทเรยในตวอยาง ทาใหแยกไดสองกลมคอ α และ γ - Proteobacteria เมอศกษาทางดาน Phylogenetic พบวา γ- Proteobacteria เทยบเคยงไดกบ Vibrio sp. และ Pseudoalteromonas sp. (Thiel and Imhoff, 2003)

16

อกทงยงมการศกษาแบคทเรยทอยทผวของฟองนา Petrosia ficiformis ซงจากการแยกโดยวธการดงเดมและวธการชวโมเลกล ผลปรากฏวาคดแยกไดทงหมด 57 สายพนธแบงไดดงน คอ Pseudoalteromonas sp., Flavobacter sp., Micrococcus sp., Bacillus sp., Corynebacterium, Actinomyces sp., Streptomyces sp., Vibrio sp., Aeromonas sp., Enterobacteriaceae เมอนามาวเคราะหแบบ Random Amplified Polymophic DNA (RAPD) พบวาหลายไอโซเลทมฤทธตานจลนทรย โดยทดสอบกบเชอกอโรคในคนคอ E. faecalis, S. aureus, Micrococcus sp. ซง 2 สายพนธทวเคราะหแยกไดคอ Rhodococcus sp. และ Pseudomonas sp. โดยการทา 16S rRNA gene sequencing (Chelossi et al., 2004)

การศกษาของ Wilson et al. (2009) พบวาแบคทเรยจากทะเลเปนแหลงทอดมไปดวยสารตานจลนทรย จากความหลากหลายของจลนทรยในระบบนเวศทางทะเลซงมมากมายนนคาดวาจะมสารตานจลนทรยชนดใหมใหคนพบได โดยแบคทเรยทศกษานนอาศยอยในทองทะเล ซงแบคทเรยเหลานจะอาศยบนโฮสตและพนททางภมศาสตรทเหมาะสมกบการดารงชพ การศกษาลกษณะความสามารถในการเจรญของประชากรจลนทรยบนพนผวทะเล ททาเรอซดนย ประเทศออสเตรเลยและทดสอบกจกรรมของสารตานจลนทรยนนพบวา 47% ใน 104 ไอโซเลท ของตวอยางแบคทเรยจากทะเลทแยกจากทาเรอซดนย ไมสามารถจาแนกไดถงระดบจนส ไดดวยวธ 16S rRNA gene ขณะทการทดสอบสารตานจลนทรย 104 ไอโซเลท พบวามแบคทเรยทผลตสารตานจลนทรย 10 ไอโซเลท และม 8 ไอโซเลท ทมความสมพนธใกลเคยงกน โดย 8 ไอโซเลททมความสมพนธใกลเคยงกนมฤทธยบยงการเจรญของเชอเปาหมายโดยการยบยงนนตองใชสารใสทมความเขมขนทไมนอยกวา 6.6%v/v และเมอศกษาชนดของโมเลกลของสารยบยงและการศกษา Polarity extractions ของสารตานจลนทรยจากเชอ 8 ไอโซเลท พบวาสารตานจลนทรยนนมข วสงและถกยบยงไดโดย Proteinase K ซงแสดงวาสารตาน จลนทรยเปนสารประกอบพวกโปรตน โดยการศกษานเปนการศกษาครงแรกทมการเชอมขอมลระหวาง phylogeny ของแบคทเรยกลมเกาะตดพนผวกบการผลตสารตานจลนทรย

การคดเลอกจลนทรยทสามารถยบยงเชอแบคทเรยทกอโรคและเชอรา Aspergillus sp. F33 และ F36 ซงเปนเชอราทแยกไดจากกลปงหาทเปนโรค โดยทมงานวจยของ รศ.ดร. เสาวลกษณ พงษไพจตร (Phongpaichit et al., 2006) ภาคจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร ซงคาดวา Aspergillus sp. F33 อาจเปนเชอราทกอใหเกดโรคในกลปงหา จากการศกษาของสถาบนวจยและพฒนาทรพยากรทางทะเล ชายฝ งทะเลและปาชายเลน จงหวดภเกต ไดมการคนพบโรคทเกดกบปะการงและกลปงหา โดยมรายงานกลปงหาทเกดโรค ทงในแถบมหาสมทรอนโด-แปซฟคและแถบมหาสมทรแอตแลนตค (ทะเลแครบเบยน) เชน โรคแถบสขาว (white band disease) แถบสดา (black band disease) แถบสนาตาล (brown band disease) โรคพวกนมทงทเกดจากเชอแบคทเรยและเชอรา โดยเฉพาะรา Aspergillus ซง

17 ในประเทศไทยเองไดมการคนพบทแถบเกาะสมลนเมอหลายปกอน ทาใหกลปงหาทกองหนใตนา Fantasy Reef เสยหายไปมาก เมอปลายป พ.ศ. 2549 ไดพบปะการงดาวใหญ (Diploastrea heliopora) ทแนวปะการงดานตะวนออกของเกาะราชาใหญกาลงเกดโรคแถบสขาวอกดวย ซงหากสามารถคดแยกจลนทรยทสามารถผลตสารทยบยงรากอโรคในกลปงหาและปะการงเหลานได กอาจจะนาไปสการประยกตใชไดในอนาคต วตถประสงคของการวจย 1. คดแยกและบงชแบคทเรยทมฤทธตานจลนทรยทแยกไดจากสตวไมมกระดกสนหลงในทะเล 2. ศกษาประสทธภาพของนาเลยงเชอและสารสกดจากนาเลยงเชอของแบคทเรยทมฤทธตาน จลนทรย 3. หาคา MIC, MBC และ MFC ของสารสกดทแยกได ประโยชนทคาดวาจะไดรบ

คดแยกจลนทรยทมฤทธยบยงจลนทรยกอโรค ซงอาจจะนาไปสการคนพบสารตาน จลนทรยชนดใหมได

ขอบเขตการวจย

คดแยกเชอแบคทเรยจากตวอยางสตวไมมกระดกสนหลงในทะเล ซงคาดวาจะไดแบคทเรยทใชในการทดสอบ 500 ไอโซเลท เพอทดสอบการยบยงจลนทรยกอโรคของนาเลยงเชอและสารสกดหยาบ รวมทงหาคา MIC, MBC และ MFC และบงชชนดของแบคทเรยทมฤทธ ตานจลนทรยกอโรค

18

บทท 2 วสด อปกรณและวธการทดลอง

2.1 วสด 2.1.1 ตวอยาง ตารางท 5 ตวอยางสตวไมมกระดกสนหลงในทะเล และ สถานทเกบตวอยาง

วนทเกบ ตวอยาง

ชนดตวอยาง จานวน สถานทเกบ ผอนเคราะหในการเกบตวอยาง

9

พฤศจกายน 2551

กลปงหา Paramuricea sp.

3

จงหวดตรง (เขาเมง, เกาะยา, เกาะมา, เกาะไหง,

เกาะมกต, หนกวนอม)

คณะผวจย

ปะการงออนหนามDendronephthya sp.

3

24พฤศจกายน, 3 ธนวาคม

2551

กลปงหา Paramuricea sp.

2

จงหวดกระบ

(หมเกาะสมลน)

อาจารยศกดอนนต ปลาทอง ภาควชาชววทยา คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร ปะการงสมอง

Platygyra sp. 1

9 ธนวาคม

2551

กลปงหา Paramuricea sp.

2

จงหวดสตล

(เกาะเขาใหญ)

เจาหนาท

สถานเพาะเลยงสตวนาชายฝ งจงหวดสตล

ฟองนาสมวง Halichondria sp.

1

1 สงหาคม 2552

กลปงหา Paramuricea sp.

3 จงหวดสตล (เกาะเขาใหญ)

เจาหนาท สถานเพาะเลยงสตวนาชายฝ ง

จงหวดสตล 26 ตลาคม

2552

กลปงหา Paramuricea sp.

6

จงหวดภเกต (อาวมะขาม)

คณธรวฒน จรตงาม นกวชาการประมงปฏบตการ ศนยวจยและพฒนาประมง

ชายฝ งภเกต

ฟองนาแจกนดา Aplysina sp.

3

ปะการงเขากวาง Acropora spp.

1

เพรยงหาน Lepas anatifera

1

19 2.1.2 จลนทรยทดสอบ 2.1.2.1 แบคทเรยทแยกไดจากผปวยของโรงพยาบาลสงขลานครนทร

ไดรบความอนเคราะหจาก ศ. ดร. วราภรณ วฑฒะกล ภาคจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร

1. Vibrio parahaemolyticus PSU 1681 2. Escherichia coli PSU 95 3. Staphylococcus aureus PSU 106 4. Salmonella Typhimurium PSU 101

2.1.2.2 แบคทเรยกอโรค

ไดรบความอนเคราะหจาก รศ. ดร. ศภยางค วรวฒคณชย ภาคจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร

1. Staphylococcus aureus ATCC 29213 2. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 001R 3. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 002R 4. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 003R 5. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 004R 6. Acinetobacter baumannii AB 045 7. Pseudomonas aeruginosa PA 3 8. Pseudomonas aeruginosa PA 8 9. Pseudomonas aeruginosa PA 10

10. Pseudomonas aeruginosa PA 14

2.1.2.3 แบคทเรยกอโรคสายพนธมาตรฐาน ไดรบความอนเคราะหจากหองปฏบตการจลชววทยาภาคจลชววทยา คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร 1. Bacillus subtilis 2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 3. Staphylococcus aureus ATCC 25923

20 2.1.2.4 ราทแยกไดจากกลปงหาทเปนโรค

ไดรบความอนเคราะหจาก รศ. ดร. เสาวลกษณ พงษไพจตร ภาคจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร

1. Aspergillus sp. F33 2. Aspergillus sp. F36

2.1.2.5 รากอโรคพช ไดรบความอนเคราะหจาก รศ. ดร. ศภยางค วรวฒคณชย ภาคจลชววทยา

คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร 1. Sclerotium rolfsii 2. Pythium aphanidermatum 3. Magnaporthe grisea 4. Phytophthora palmivora 5. Phytophthora botryosa 6. Ganoderma lucidum 7. Rigidoporus microporus 8. Rhizoctonia solani

2.1.2.6 สาหราย

Microcystis aeruginosa TISTR 8305

2.1.3 สารเคม 1. อาหารเลยงเชอ (ภาคผนวก ก)

- Artificial sea water agar (ASWA) - Artificial sea water broth (ASWB) - Luria Bertani broth (LB) - Mueller-Hinton agar (MHA) - Mueller-Hinton broth (MHB) - Potato dextrose agar (PDA) - Sabouraud dextrose broth (SDB) - Tryptic soy agar (TSA)

21

2. ยาตานจลนทรย (ภาคผนวก ก) - Amphotericin B

- Chloramphenicol

3. สารเคมทวไป (ภาคผนวก ก) ส

- Crystal violet - Iodine

- Safranin - Resazurin

ตวทาละลาย

- Ethyl acetate - Hexane - Methanol - Methanol:chloroform (1:1)

สารเคมอนๆ

- 70% และ 95% (Ethyl alcohol) - 20% Glycerol - 1% Tween-80 - Artificial Sea Water (ASW) - Sterile normal saline solution (0.85% NaCl) - Sodium sulfate anhydrous (Na2SO4)

2.1.4 อปกรณ

- จานเพาะเชอ (Petri dish) - สไลด (Slide) - พาสเจอรปเปต (Pasteur pipette) - ปเปต (Pipette) ขนาด 1, 5 และ 10 มลลลตร - กลองจลทรรศน ( Microscope) - กรรไกร (scissor)

22

- หลอดทดลอง (Test tube) 13 X 100 มลลเมตร และ 16 X 100 มลลเมตร - ตะเกยงแอลกอฮอล (Bunsen burner) - ปากคบ (Forceps) - ตบมเชอ (Incubator) - ตอบฆาเชอ (Hot air oven) - เครองควบคมอณหภม (Water bath) - หมอนงฆาเชอ (Autoclave) - เขมเขยเชอ (Needle) - หวงเขยเชอ (Loop) - แทงแกวโคงงอ (Spreader) - ขวดฝาเกลยว (duran bottle) ขนาด 250, 500 และ 1000 มลลเมตร - เครองวด pH (pH meter) - Eppendorf - Tips - Foil - Cylinder - Mortar - Vortex - Vernier caliper - Hot plate

23 2.2 วธการทดลอง 2.2.1 การแยกเชอแบคทเรยจากตวอยาง เกบตวอยางกลปงหา ปะการง ฟองนาและเพรยง ใสในถงทบรรจนาทะเลบรเวณทเกบตวอยาง รดปากถงดวยยาง นาถงตวอยางแชในกระตกนาแขง นากลบหองปฏบตการเพอทดสอบภายใน 24 ชม.

ตดตวอยาง 1 g ลางดวย 70% alcohol และ sterile artificial seawater (ASW) (ตวอยางฟองนาลางดวย ASW เพยงอยางเดยว) บดดวยครกบดยาใหละเอยด นาไปทาการเจอจางดวยวธ ten-fold dilution ใน ASW ปรมาตร 9 mL ทาการเจอจางตอไปจนถง 10-7 ดดตวอยางทความเจอจาง 10-5, 10-6, 10-7 ปรมาตร 0.1 mL spread ลงบน ASW agar โดยทา ความเจอจางละ 3 plates นาไปบมท 30 oC เปนเวลาอยางนอย 3 วน คดเลอกโคโลนทแตกตางกน เขยเชอดงกลาวมา restreak บน ASW agar เพอใหไดโคโลนเดยวๆ เกบแบคทเรยทบรสทธใน ASW agar slant เกบไวท 4 oC สาหรบนาไปทดสอบฤทธตานจลนทรยตอไป 2.2.2 การทดสอบความสามารถในการยบยงเชอจลนทรยเบองตนโดยวธ agar well diffusion (Lorian, 1996) 2.2.2.1 การเตรยมแบคทเรยเพอทดสอบความสามารถในการยบยงเชอจลนทรย

เลยงแบคทเรยทแยกไดบรสทธแลวจากตวอยางกลปงหา ปะการง ฟองนาและเพรยง บนอาหาร ASW agar บมทอณหภม 30 oC เปนเวลา 48 ชวโมง นาเชอใน ASW agar มาปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS (0.85 % NaCl) ดดเชอ 0.3 mL เลยงใน ASW broth 3 mL บมใน shaker ความเรว 120 rpm ทอณหภม 30 oC เปนเวลา 48 ชวโมง 2.2.2.2 การทดสอบฤทธตานเชอรา

2.2.2.2.1 การเตรยมเชอราสาหรบการทดสอบ เลยง Aspergillus sp. F33, F36 บนอาหาร PDA บมทอณหภม 30 oC เปนเวลา 3 วนเพอใหเจรญกอนทจะทาการทดสอบกบเชอแบคทเรยทแยกไดจากตวอยาง

2.2.2.2.2 การเตรยม spore suspension ใชเขมเขยเชอรา เขย spore ราทใชในการทดสอบ ใสใน 1% Tween-80 ปรมาตร 9 mL

เขยาใหเขากนดวย vortex ดด spore suspension ปรมาตร 0.1 mL หยดลงบน Haemacytometer นบสปอรรา นามาคานวณ โดยใชสตร 4B x 106 cells (โดย B คอจานวนสปอรราทนบไดใน 5 ชองรวมกนแลวหารดวย 5) คานวณใหได 107 สปอรตอ 1% Tween-80 ปรมาตร 1 mL

24

2.2.2.2.3 ทดสอบฤทธตานเชอรา ทดสอบฤทธการยบยงดวยวธ agar well diffusion โดยการดด spore suspension จาก

ขอ 2.2.2.2.2 0.1 mL ผสมกบ soft agar 4 mL (ภาคผนวก ก) จะได spore suspension ทมความเขมขน 106 สปอรตอ soft agar 4 mL แลว overlay ทบบน ASW agar (20 mL ASW agar/plate) หลงจากนนเจาะหลม ASW agar ดวย Pasteur pipette ทฆาเชอแลวโดยใชสวนทายของ pasteur pipette กดลงไปในเนอ ASW agar นาแบคทเรยทแยกไดในขอ 2.2.2.1 ทเลยงใน ASW broth ปรมาตร 80 μL หยอดในหลม บมท 30 oC เปนเวลา 3 วน แลววด inhibition zone โดย Vernier caliper

2.2.2.3 การทดสอบฤทธตานเชอแบคทเรย

2.2.2.3.1 การเตรยมเชอแบคทเรยกอโรค นาแบคทเรยกอโรคเลยงบนอาหาร TSA ยกเวน V. parahaemolyticus PSU 1681 ใหเลยงบน TSA +1% NaCl แบคทเรยทงหมดบมทอณหภม 35 oC เปนเวลา 24 ชวโมง

2.2.2.3.2 การทดสอบฤทธตานแบคทเรยกอโรค ทดสอบฤทธการยบยงดวยวธ agar well diffusion ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5

McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอปรมาตร 0.1 mL ผสมกบ soft agar 4 mL เขยาดวย Vortex ใหเขากนจะไดเชอกอโรคความเขมขน 107 CFU/mL แลว overlay ทบบน ASW agar (20 ml ASW agar/plate) หลงจากนนเจาะหลม ASW agar ดวย Pasteur pipette ทฆาเชอแลวโดยใชสวนทายของ Pasteur pipette กดลงไปในเนอ ASW agar นาแบคทเรยทแยกไดในขอ 2.2.2.1 ทเลยงใน ASW broth ปรมาตร 80 μL หยอดในหลม บมท 30 oC เปนเวลา 24 ชวโมง แลววด inhibition zone โดย Vernier caliper 2.2.3 การทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell suspension จากการ บมทระยะเวลาตางๆ

การเตรยม P0915 cell suspension นาโคโลน P0915 อาย 48 ชม. ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ P0915 10 mL ใสในอาหาร ASW broth ปรมาตร 100 mL บมใน orbital shaker ทอณหภม 30 oC 120 rpm เกบ cell suspension ชวโมงท 48, 72, 96, 120 เพอไปทดสอบตามขอ 2.2.2 ดงแผนภมท 1 (ภาคผนวก ข.) (คานวณสถตโดยใช One Way ANOVA ดวยโปรแกรม SPSS 15 สาหรบ Windows)

25 2.2.4 การทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell free supernatant

การเตรยม P0915 cell free supernatant นาโคโลน P0915 ทมอาย 48 ชม. ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 10 mL ใสในอาหาร ASW broth ปรมาตร 100 mL บมใน orbital shaker ทอณหภม 30 oC 120 rpm เปนเวลา 48 ชม. นา cell suspension ตกตะกอนเซลลโดยทาการหมนเหวยงทความเรว 10,000 rpm อณหภม 4 oC เปนเวลา 30 นาท นาสวนทเปน supernatant มากรองผานกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมโครเมตร นา cell free supernatant ไปทดสอบตามขอ 2.2.2 ดงแผนภมท 2 (ภาคผนวก ข.)

2.2.4.1 การทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell free supernatant เขมขน การเตรยม cell free supernatant นาโคโลน P0915 ทมอาย 48 ชม. ปรบความเขมขน

ของเชอใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 10 mL ใสในอาหาร ASW broth ปรมาตร 100 mL บมใน orbital shaker ทอณหภม 30 oC 120 rpm เปนเวลา 48 ชม. นา P0915 cell suspension ตกตะกอนเซลลโดยทาการหมนเหวยงทความเรว 10,000 rpm อณหภม 4 oC เปนเวลา 30 นาท นาสวนทเปน supernatant มากรองผานกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมโครเมตร นา cell free supernatant มาทาใหเขมขนขนโดยการทา Freeze drying

เมอได Freeze dried cell free supernatant ละลายตวอยาง Freeze dried cell free supernatant ดวย 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) ปรมาตร 1 mL เตมนากลนปราศจากเชอใหปรมาตรครบ 10 mL ซงสารละลาย Freeze dried cell free supernatant มความเขมขนขนเปน 10 เทา จากความเขมขนของ cell free supernatant นา Freeze dried cell free supernatant ทละลายแลวไปทดสอบตามขอ 2.2.2 ดงแผนภมท 3 (ภาคผนวก ข.) 2.2.5 การทดสอบประสทธภาพของสารสกดจากเชอแบคทเรย 2.2.5.1 การเตรยมไอโซเลท P0915 กอนสกด

2.2.5.1.1 การเตรยม Cell free supernatant ในการทา Freeze drying นาโคโลน P0915 ทมอาย 48 ชม. ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland

(1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 10 mL ใสในอาหาร ASW broth ปรมาตร 100 mL บมใน orbital shaker ทอณหภม 30 oC 120 rpm เปนเวลา 48 ชม. นา P0915 cell suspension ตกตะกอนเซลลโดยทาการหมนเหวยงทความเรว 10,000 rpm อณหภม 4 oC เปนเวลา 30 นาท นาสวนทเปน supernatant มากรองผานกระดาษกรองขนาด 0.45 ไมโครเมตร นา cell free supernatant มาทาใหเขมขนขนโดยการทา Freeze drying

26

2.2.5.1.2 การเตรยม cell suspension ในการทา Freeze drying นาโคโลน P0915 ทมอาย 48 ชม. ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland

(1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 10 mL ใสในอาหาร ASW broth ปรมาตร 100 mL บมใน orbital shaker ทอณหภม 30 oC 120 rpm เปนเวลา 48 ชม. นา cell suspension มาทาใหเขมขนขนโดยการทา Freeze drying

2.2.5.1.3 การเตรยม cell suspension เพอสกดสาร นาโคโลน P0915 ทมอาย 48 ชม. ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland

(1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 20 mL ใสในอาหาร ASW broth ปรมาตร 200 mL บมใน orbital shaker ทอณหภม 30 oC 120 rpm เปนเวลา 48 ชม. นาไปสกดดวยตวทาละลายโดยตรงโดยไมผานการ Freeze drying

2.2.5.1.4 การเตรยม whole cell pellets เพอสกดสาร นาโคโลน P0915 ทมอาย 48 ชม. ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland

(1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 10 mL ใสในอาหาร ASW broth ปรมาตร 100 mL บมใน orbital shaker ทอณหภม 30 oC 120 rpm เปนเวลา 48 ชม. นา P0915 cell suspension ตกตะกอนเซลลโดยทาการหมนเหวยงทความเรว 10,000 rpm อณหภม 4 oC เปนเวลา 30 นาท เทสวนทเปน supernatant ทง นาสวนของตะกอนเซลลหลงหมนเหวยงเกบไวเพอนาไปสกดสารออกฤทธตอไป

ผลจากการทา Freeze drying ไดสารสขาวออกเหลอง รวน หลงจากนนนา Freeze dried cell free supernatant, Freeze dried cell suspension, cell suspension และ whole cell pellets มาทาการสกดดวย Ethyl Acetate ตามขนตอนดงตอไปน

2.2.5.2 การสกดสารตวอยางดวย Ethyl Acetate (EtOAc) ดดแปลงมาจากวธของ Al- Zereini (2006)

นา Freeze dried cell free supernatant หรอ Freeze dried cell suspension หรอ cell suspension หรอ whole cell pellets มาทาการสกดดวย EtOAc สามครง ครงทหนง นา ตวอยาง 200 mL (หากตวอยางเปนของแขงใหชงตวอยางมา 5 g ผสมกบนากลน 200 mL) ใสกรวยสกดสาร เตม EtOAc 100 mL ปดฝากรวย คลายกรวย เขยาแลวคลายกรวย จนกวาแรงดนในกรวยจะเหลอนอยลง หนบกรวยไวกบขาตง รอใหนากบ EtOAc แยกชนออกจากกน เปดฝากรวยไขสวนนาออกและเทสวน EtOAc ออกทางปากกรวย เกบสวน EtOAc สวนท 1 ไว นาสวนนามาเทใสกรวยทาการสกดครงทสอง เตม EtOAc 100 mL แลวทาเชนเดยวกบครงแรก

27 ไขสวนนาออก เทสวน EtOAc สวนท 2 เกบไว การสกดครงทสาม นาสวนนามาใสกรวย เตม EtOAc 100 mL แลวทาเชนเดยวกบครงทหนงและสอง ไขสวนทเปนนาออก เท EtOAc สวนท 3 เกบไว

เตมนากลนลงไปในกรวยสกดประมาณ 100 mL นา EtOAc ทง 3 สวนมารวมกน แลวเทใสกรวยสกด ทาการเขยาอยางขางตน แลวรอใหสวนนาและสวน EtOAc แยกชนกน ไขสวนนาออก เท EtOAc เกบไว

เตม sodium sulfate anhydrous (Na2SO4) ลงไปเพอเอานาทปนอยออก โดยเตมทละนอยแลวเขยาแลววางทงไวจนสงเกตเหน Na2SO4 จบเปนกอน กรองเอา Na2SO4 ออก โดยใชกรวยกรอง ทมช นกรองเปนสาลทผานการลางดวย organic solvent แลว นาสวน EtOAc ทกรอง Na2SO4 ออกแลวไปทาการระเหย EtOAc ออกทอณหภม 30 oC ดวยเครอง Evaporator

ละลายสารสกดจากขวดระเหยสารดวย EtOAc เทสวนของ EtOAc เกบใสขวดแกว ทาการระเหย EtOAc ทใชละลายออก เกบสารทเหลออยในขวดไวท 4 oC (แผนภมท 4)

ละลายสารสกดจากแบคทเรย ดวย 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) ใหไดความเขมขน 100 mg/mL สาหรบเกบเปน stock solution แลวเจอจางดวย DMSO ในอตราสวน 1:10 หลงจากนนนาสารสกดทสกดไดไปทดสอบฤทธยบยงตามขอ 2.2.2 2.2.5.3 การหาคา MIC, MBC และ MFC (ดดแปลงวธ broth micro-dilution จาก CLSI M38-A(2002),M7-A8 (2009)) ดงน

ละลายสารสกด ethyl acetate ดวย 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) ใหไดความเขมขน 100 mg/mL สาหรบเกบเปน stock solution ดด 10% DMSO ปรมาตร 20 μL ลงไปในทกหลมของ 96 well plate หลงจากนนดดสารสกดใสหลมแรก ปรมาตร 20 μL ดงนนหลมแรกจะมความเขมขนเปน 1,024 μg/mL ทาการเจอจางไปเรอยๆจะได 10 ความเขมขน อยในชวงระหวาง 0.25-1,024 μg/mL โดยทาความเขมขนละ 3 ซา เตม SDB ปรมาตร 80 μL ลงไปในทกหลม หลงจากนนเตม spore suspension ของเชอรา (2.2.2.2.2) (spore ทผสมกบอาหาร SDB ในอตราสวน 1:10) ปรมาตร 100 μL ลงใน 96 well plate ทม สารสกด cell suspension และอาหาร SDB ในขางตน โดยมชดควบคม negative control ทเตม spore suspension กบอาหาร SDB และ positive control เตม amphotericin B และ spore suspension ของเชอรา (แผนภมท 5) บมทอณหภม 25 oC เปนเวลา 3 วน ทาการอานคา MIC การอานคา MIC จะเตมส 0.18% resazurin ปรมาตร 10 μL เมอบมไปแลว 68 ชม. บมท 25 oC ตอไป 4 ชม. แลวอานผล โดยถาส resazurin กลายเปนสชมพ-บานเยน แสดงวามการเจรญของเชอรากอโรค หากส resazurin ยงมสคงเดมคอ สนาเงน-มวง แสดงวาไมมการเจรญเตบโตของเชอกอโรค นาหลมท

28 มนาเงนมา streak บนอาหาร PDA แลวบมทอณหภม 25 oC เปนเวลา 3 วน เพออานคา MFC การทดสอบฤทธตานแบคทเรยกทาเชนเดยวกนคอ นาสารสกดจากเชอแบคทเรยมาละลายดวย dimethyl sulfoxide (DMSO) ใหไดความเขมขน 100 mg/mL สาหรบเกบเปน stock solution ดด 10% DMSO ปรมาตร 20 μL ลงไปในทกหลมของ 96 well plate หลงจากนนดดสารสกดใสหลมแรกปรมาตร 20 μL ดงนนหลมแรกจะมความเขมขนเปน 1,024 μg/mL ทาการเจอจางไปเรอยๆจะได 10 ความเขมขน อยในชวงระหวาง 0.25-1,024 μg/mL โดยทาความเขมขนละ 3 ซา เตม MHB ปรมาตร 80 μL ลงไปในทกหลม หลงจากนนเตม bacterial suspension (2.2.2.2.2) (bacterial suspension ทผสมกบอาหาร MHB ในอตราสวน 1:10) ปรมาตร 100 μL ลงใน 96 well plate ทม สารสกด cell suspension และอาหาร MHB ในขางตน โดยมชดควบคม negative control ทเตม bacterial suspension กบอาหาร MHB และ positive control เตม chloramphenicol และ bacterial suspension (แผนภมท 5) บมทอณหภม 35 oC เวลา 24 ชวโมง ทาการอานคา MIC การอานคา MIC จะเตมส 0.18% resazurin ปรมาตร 10 μL เมอบมไปแลว 20 ชม. บมท 35 oC ตอเปนเวลา 4 ชวโมง แลวอานผล โดยถาส resazurin กลายเปนสชมพ-บานเยน แสดงวามการเจรญของเชอกอโรค หากส resazurin ยงมสคงเดมคอ สนาเงน-มวง แสดงวาไมมการเจรญเตบโตของเชอกอโรค นาหลมทมนาเงนมา streak บนอาหาร TSA แลวบมทอณหภม 35 oC เวลา 24 ชวโมง เพออานคา MBC ทมา : http://www.ncbi.nlm.nih.gov, arch 1,2010, ( ศรนช, 2550) 2.2.6 การยบยงรากอโรคพชของ P0915 cell suspension

ปรบความเขมขนของแบคทเรยทตองการทดสอบใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 1 mL เลยงใน ASW broth 10 mL บมใน shaker ความเรว 120 rpm ทอณหภม 30 oC เปนเวลา 48 ชวโมง

ใชพาสเจอรปเปต (Pasture pipette) เจาะหลมบนอาหาร PDA plate ไวดานหนง ตดเสนใยราวางบนอาหาร PDA plate ในดานตรงกนขามใหมระยะหาง 3 ซม. หยด cell suspension อาย 48 ชวโมง ปรมาตร 80 μL ลงไปในหลม นาไปบมท อณหภม 25 oC เปนเวลา 3-7 วน วด inhibition zone

29 2.2.7 การทดสอบประสทธภาพของการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 ของ P0915 cell suspension โดยวธ microdilution method ดดแปลงมาจากวธของ Kim et al. (2009)

นาเชอ P0915 ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 1 mL เลยงใน ASW broth 10 mL บมใน shaker ความเรว 120 rpm ทอณหภม 30 oC เปนเวลา 48 ชวโมง

ทาการปรบความเขมขน P0915 cell suspension ใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ทาการเจอจาง ใหไดปรมาณเชอ 101-108 CFU/mL ดดเชอใสใน 96 well plate ปรมาตร 100 μL ตอหลม ใส M. aeruginosa TISTR 8305 (ความหนาแนน 2.8x106 cells/mL) ลงไปในหลมละ 100 μL บมในทๆ มแสงสวาง ทอณหภม 30 oC เปนเวลา 3 วน ทาการนบเซลลสาหรายทเหลออยดวย Haemacytometer 2.2.8 การทดสอบประสทธภาพของการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 ของ สารสกด ethyl acetate P0915 cell suspension โดยวธ microdilution method เจอจางสารสกด ethyl acetate P0915 cell suspension ใน 96 well plate ใหไดความเขมขนสดทายเปน 500, 1,500, 2,500, 3,500, 4,500 μg/mL ตอหลม (แตละหลมมสารสกดปรมาตร 100 μL) ใส M. aeruginosa TISTR 8305 (ความหนาแนน 2.8x106 cells/mL) ลงไปในหลมละ 100 μL บมในทๆ มแสงสวาง ทอณหภม 30 oC เปนเวลา 3 วน ทาการนบเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ทเหลออยดวย Haemacytometer 2.2.9 การตรวจสอบการเปลยนแปลงของไซยาโนแบคทเรยภายใตกลองจลทรรศนแบบ สองกราด (Scanning Electron Microscope (SEM)) ไดทาการสงตวอยางไซยาโนแบคทเรยเพอตรวจสอบการเปลยนแปลงท ศนยเครองมอวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร ทาการทดสอบโดยเครอง Scanning Electron Microscope, JSM-5800 LV, JEOL, JAPAN วธการทดสอบ อางองตามวธปฏบตงาน เลขท WI-RES-SEM5800-001 และ WI-RES-SEM-001 โดยใชกาลงขยาย x 1,500, x 8,000, x 25,000

30 2.2.10 การทดสอบความสามารถในการผลตเอนไซมของไอโซเลท P0915 โดย API ZYM Kit (by Biomerieux)

ทาการเลยงเชอ ไอโซเลท P0915 บนอาหาร ASW agar บมทอณหภม 30 oC เปนเวลา 48 ชม. นาไอโซเลท P0915 ดงกลาวเตรยม suspension ใน NSS ปรมาตร 2 mL ใหมความขน 5-6 McFarland (4.8x109 – 9.6 x109 CFU/mL) ทาการ label ลงบนขอบผนงถาด เตมนากลนในหลมของถาด 5 mL เพอเพมความชน แกะแถบทดสอบเอนไซม แตละอนออกมา วางแถบทดสอบเอนไซมในกลองบม นาไอโซเลท P0915 ทเตรยมไว หยดลงไปในหลมบนแถบทดสอบเอนไซม หลมละ 65 μL หลงจากเตมไอโซเลท P0915 แลว ปดฝาถาด บม ท 37 oC เปนเวลา 4-4.5 ชม. หลงจากบมครบตามเวลา แลว หยด ZYM A หลมละ 1 หยด และ ZYM B หลมละ 1 หยด ลงไปในแตละหลมบนแถบทดสอบเอนไซม รอสเปลยนอยางนอย 5 นาท ภายใตแสง ถาผลเปนบวกจะเปลยนสอยางถาวรตามแตชนดของเอนไซม ถาผลเปนลบจะเปลยนเปนไมมสเมอเทยบกบหลมควบคม อานผลโดยเปรยบเทยบกบแถบส แผนภมท 6 (ภาคผนวก ข.)

2.2.11 การบงชชนดของจลนทรยทคดแยกไดทางชวโมเลกล

การบงชชนดของแบคทเรยทมฤทธตานจลนทรย โดยการวเคราะหทางชวโมเลกล (16 rDNA analysis) ความยาว 1500 เบส primers ทใชคอ 20F (5’-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3’, positions 9-27 on 16S rDNA by the E. coli numbering system; Brosius et al., 1981) และ 1500R (5’-GTT ACC TTG TTA CGA CTT-3’, position 1509-1492 on 16S rDNA by the E. coli numbering system; Brosius et al., 1981) โดยสงตรวจวเคราะหทศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต (National Center for Genetic Engineering and Biotechnology) (เอกสารอางอง ภาคผนวก ค.)

31

บทท 3 ผลการทดลอง

3.1 ผลการแยกเชอแบคทเรยจากสตวไมมกระดกสนหลงในทะเลและการทดสอบ

ความสามารถในการยบยงเชอจลนทรย จากการเกบตวอยางสตวไมมกระดกสนหลงในทะเลอนดามนใน 4 จงหวด คอ จงหวด

สตล, จงหวดตรง, จงหวดกระบและภเกต เพอคดเลอกแบคทเรยทมฤทธตานจลนทรยกอโรค สามารถแยกแบคทเรยไดทงหมด 397 ไอโซเลท ในป 2551 (อมพรรตน, 2552) และ 117 ไอโซเลท ทแยกไดจากตวอยางกลปงหาและฟองนา จากจงหวดสตลและจงหวดภเกต ในป 2552 รวมทงสน 514 ไอโซเลท โดยสามารถแยกแบคทเรยแกรมลบได 299 ไอโซเลท (58%) และแยกแบคทเรยแกรมบวกได 215 ไอโซเลท (42%) นาแบคทเรยทง 514 ไอโซเลท มาทาการทดสอบหาฤทธการยบยงจลนทรยกอโรค 6 สายพนธดวยวธ agar well diffusion (Lorian, 1996) พบแบคทเรยทมฤทธการยบยงจลนทรยกอโรคทงหมด 29 ไอโซเลท (5.64 %) (ตารางท 6) โดยทง 29 ไอโซเลท ทมฤทธยบยงจลนทรยกอโรค V. parahaemolyticus PSU 1681, E. coli PSU 95, S. aureus PSU 106, S. Typhimurium PSU 101, และ รา Aspergillus sp. F33, Aspergillus sp. F36 ไดอยางนอย 1 ชนด มแบคทเรย 6 ไอโซเลท ทสามารถยบยงจลนทรยกอโรคไดมากกวา 1 ชนด คอ ไอโซเลท P0268, P0576 และ P0663 สามารถยบยง S. aureus PSU 106 มคา inhibition zone อยในชวง 8.7-12.6 mm, และใหวงใสในการยบยง Aspergillus sp. F33 อยในชวง 8.6-10.8 mm, ไอโซเลท S0331 สามารถยบยงจลนทรยกอโรคได 3 สายพนธ โดยสามารถยบยง V. parahaemolyticus PSU 1681 มคา inhibition zone เทากบ 11.5 mm, S. aureus PSU 106 มคา inhibition zone เทากบ 19.9 mm และสามารถยบยง S. Typhimurium PSU 101 มคา inhibition zone เทากบ 11.3 mm, ไอโซเลท P1116 สามารถยบยงจลนทรยกอโรคได 3 สายพนธ เชนกน โดยสามารถยบยง S. aureus PSU 106 มคา inhibition zone เทากบ 14.9 mm, Aspergillus sp. F33 มคา inhibition zone เทากบ 13.3 mm และ Aspergillus sp. F36 มคา inhibition zone เทากบ 10.3 mm และ ไอโซเลท P0915 สามารถยบยงจลนทรยกอโรคไดทง 6 ชนดคอสามารถยบยง V. parahaemolyticus PSU 1681 มคา inhibition zone เทากบ 9.0 mm, E. coli PSU 95 มคา inhibition zone เทากบ 10.6 mm, S. aureus PSU 106 มคา inhibition zone เทากบ 24.2 mm, S. Thyphimurium PSU 101 มคา inhibition zone เทากบ 8.2 mm, และ รา Aspergillus sp. F33 มคา inhibition zone เทากบ 17.4 mm, Aspergillus sp. F36 มคา inhibition zone เทากบ 9.7 mm

32

จากการทดสอบดงกลาวพบวามแบคทเรยทแยก 20 ไอโซเลททสามารถยบยง Aspergillus sp. F33 มคา inhibition zone ระหวาง 8-17 mm, 14 ไอโซเลททสามารถยบยง S. aureus PSU 106 มคา inhibition zone ระหวาง 8-24 mm สวน V. parahaemolyticus PSU 1681, S. Typhimurium PSU 101 และ Aspergillus sp. F36 มแบคทเรยเชอละ 2 ไอโซเลททสามายบยงเชอกอโรคดงกลาวไดและมแบคทเรย 1 ไอโซเลทเทานนทสามารถยบยง E. coli PSU 95 ได

จากการศกษาการยบยงจลนทรยกอโรคของแบคทเรยทแยกได พบวา แบคทเรยทมฤทธยบยงจลนทรยกอโรค แยกไดจากกลปงหา 8 ตวอยาง จากตวอยางกลปงหาทงหมด 16 ตวอยาง แยกไดจากฟองนา 2 ตวอยาง จากตวอยางฟองนาทงหมด 4 ตวอยาง แยกไดจาก ปะการง 1 ตวอยาง จากปะการงทงหมด 5 ตวอยางและแยกไดจากเพรยง 1 ตวอยาง จากตวอยางเพรยงทงสน 1 ตวอยาง จาก 3 จงหวด (ตารางท 7)

เมอทาการทดสอบซา อกสามครง พบวา แบคทเรย 4 ไอโซเลทคอ P0268, P0576, P0663 และ P1116 มกจกรรมการยบยงนอยลง จนไมเกดการยบยงในทสดและอก 1 ไอโซเลท S0331 ทาการเลยงเชอใหมไมขน จากขอมลผลการทดสอบของไอโซเลท P0915 (รปท 1) ทมฤทธยบยงของเชอทหลากหลายสามารถยบยงจลนทรยททดสอบไดทง 6 สายพนธ จงทาการคดเลอกไอโซเลท P0915 เพอทาการศกษาตอไป

รปท 1 การทดสอบฤทธตาน S. aureus PSU 106 เบองตนของ

P0915 cell suspension โดยวธ agar well diffusion

33 ตารางท 6 ความสามารถในการยบยงเชอจลนทรยกอโรคของแบคทเรยทะเลทแยกได โดยวธ agar well diffusion (Lorian, 1996)

ไอโซเลท ขนาดเสนผานศนยกลางของ inhibition zone (mm)

V. p

arah

aem

olytic

us

PSU

1681

E. co

li P

SU 9

5

S. T

yphim

urium

PS

U 10

1

S. a

ureu

s PS

U 10

6

As

perg

illus

sp. F

33

As

perg

illus

sp. F

36

S0244 - - - 9.5 - - S0255 - - - 9.3 - - S0331 11.5 - 11.3 19.9 - - S0334 - - - - 8.3 - S0341 - - - - 10.9 - S0347 - - - 11.5 - - S0351 - - - 13.7 - - P0240 - - - 9.3 - - P0265 - - - - 13.2 - P0266 - - - - 12.6 - P0267 - - - - 9.0 - P0268 - - - 9.7 10.8 - P0271 - - - - 12.8 - P0381 - - - - 9.2 - P0572 - - - 8.2 - - P0575 - - - - 14.1 - P0576 - - - 8.7 9.1 - P0577 - - - 14.5 - - P0663 - - - 12.6 8.6 - P0785 - - - - 13.3 - P0861 - - - - 15.9 - P0863 - - - - 1.7 -

34 ตารางท 6 (ตอ) ความสามารถในการยบยงเชอจลนทรยกอโรคของแบคทเรยทะเลทแยก ไดโดยวธ agar well diffusion (Lorian, 1996)

ไอโซเลท ขนาดเสนผานศนยกลางของ inhibition zone (mm)

V. p

arah

aem

olytic

us

PSU

1681

E. co

li P

SU 9

5

S. T

yphim

urium

PS

U 10

1

S. a

ureu

s PS

U 10

6

As

perg

illus

sp. F

33

As

perg

illus

sp. F

36

P0871 - - - 11.5 - - P0915 9.0 10.6 8.2 24.2 17.4 9.7 P1061 - - - - 10.1 - P1062 - - - - 11.5 - P1063 - - - - 14.2 - P1116 - - - 14.9 13.3 10.3 I6-5 - - - - 8.4 - รวม 2 1 2 14 20 2

หมายเหต - หมายถง ไมสามารถยบยงจลนทรยกอโรคดงกลาวได

35 ตารางท 7 แหลงทมาของแบคทเรยทมฤทธยบยงจลนทรยทดสอบ

ตวอยาง แบคทเรยทะเลทมฤทธยบยงจลนทรยทดสอบ

ทมาของตวอยาง

กลปงหา

P0244, P0255 จงหวดสตล

S0331, S0334, S0341, S0347, S0351

จงหวดสตล

P0785 จงหวดภเกต

P0861, P0863, P0871

จงหวดภเกต

I6-5 จงหวดตรง

36 ตารางท 7 (ตอ) แหลงทมาของแบคทเรย ทมฤทธยบยงจลนทรยทดสอบ

ตวอยาง แบคทเรยทมฤทธยบยงจลนทรยทดสอบ

ทมาของตวอยาง

กลปงหา

P0572, P0575, P0576, P0577

จงหวดภเกต

P0381

จงหวดภเกต

P1116

จงหวดภเกต

ปะการง

P1061, P1062, P1063

จงหวดภเกต

เพรยง

P0915

จงหวดภเกต

37 ตารางท 7 (ตอ) แหลงทมาของแบคทเรย ทมฤทธยบยงจลนทรยทดสอบ

3.2 ผลการทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell suspension จาก

การบมทระยะเวลาตางๆ ผลการทดสอบประสทธภาพของ P0915 cell suspension จากการบมทระยะเวลาตางๆ

พบวา สามารถยบยง V. parahaemolyticus PSU 1681 และ E. coli PSU 95 ไดดทสดในการบมท 48 ชม. สวนฤทธการยบยง S. aureus PSU, Aspergillus sp. F33 และ Aspergillus sp. F36 ของ P0915 cell suspension จากการบมทระยะเวลาตางๆ พบวาไมแตกตางกนอยางมนยสาคญ สามารถยบยง S. Typhimurium PSU 101 ไดดทสดท 96 ชม. (ตารางท 8, รปท 2) จงไดทาการเลอกเวลาท 48 ชวโมงในการบมเพอการศกษาประสทธภาพอนๆตอไป 3.3 ผลการทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell free supernatant

ผลการทดสอบประสทธภาพของ P0915 cell free supernatant อาย 48 ชม. พบวา เมอนานาเลยงเซลลไอโซเลท P0915 ไปทดสอบฤทธตานจลนทรย cell free supernatant ดงกลาวมฤทธยบยงนอย สามารถยบยง S. aureus PSU 106 ให inhibition zone 7.4 mm, ยบยง S. aureus ATCC 25923 ให inhibition zone 7.7 mm สวน V. parahaemolyticus PSU 1681 ให inhibition zone 6.8 mm (ตารางท 9) ทงนอาจจะเนองมาจากความเขมขนของสารออกฤทธมนอยมากใน cell free supernatant จงมการทาใหเขมขนขนโดยการนา cell free supernatant ไปทา Freeze drying

ตวอยาง แบคทเรยทมฤทธยบยงจลนทรยทดสอบ

ทมาของตวอยาง

ฟองนา

P0240, P0265, P0266, P0267, P0268, P0271

จงหวดภเกต

P0663

จงหวดภเกต

38 3.4 ผลการทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell free supernatant เขมขน

ผลการทดสอบประสทธภาพของ P0915 Freeze dried cell free supernatant พบวา แมจะทาให cell free supernatant เขมขนขน 10 เทา ประสทธภาพในการยบยงจลนทรยกอโรคกไมไดเพมขนมากนก ซง P0915 Freeze dried cell free supernatant สามารถยบยง S. aureus PSU 106 ให inhibition zone 8.3 mm และยบยง S. aureus ATCC 25923 ให inhibition zone 8.5 mm ขณะท V. parahaemolyticus PSU 1681 ไมพบฤทธยบยงเมอทาการทดสอบกบ P0915 Freeze dried cell free supernatant (ตารางท 9) ตารางท 8 ประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell suspension จาก

การบมทระยะเวลาตางๆ

คาในตารางแสดงคาเฉลย ± คา SD ตวอกษรทแตกตางกนในแตละคอลมนแสดงถงความ

แตกตางกนอยางมนยสาคญทระดบความเชอมน 0.05 (p>0.05)

อายของไอโซเลท P0915 (ชม.)

ขนาด inhibition zone (mm)

V. p

arah

aem

olytic

us

PSU

1681

E. c

oli P

SU 9

5 S.

Typ

himur

ium

PSU

101

S. a

ureu

s PS

U 10

6

Aspe

rgillu

s sp

. F33

As

perg

illus

sp. F

36

48 14.70±0.20a1 14.07±0.38a2 13.00±0.20a3 26.80±0.20a4 17.20±0.20a5b5 17.00±0.53a6 72 10.60±0.10b1 13.70±0.20a2 9.60±0.26b3 26.90±0.20a4 17.50±0.20b5 16.80±0.20a6 96 12.70±0.20c1 13.50±0.53a2 14.00±0.26c3 26.70±0.26a4 16.70±0.20a5 16.50±0.17a6 120 11.66±0.25d1 12.40±0.10b2 11.50±0.26d3 27.00±0.17a4 17.40±0.17b5 16.60±0.26a6

39 48 ชวโมง 72 ชวโมง

96 ชวโมง 120 ชวโมง

รปท 2 การทดสอบประสทธภาพของ P0915 cell suspension จากการบมทระยะเวลา ตางๆ ในการยบยง S. aureus PSU 106 โดยวธ agar well diffusion

40 ตารางท 9 ประสทธภาพของการยบยงจลนทรยของ P0915 cell suspension, P0915 cell free supernatant และ P0915 cell free supernatant เขมขน

CS = cell suspension NT = not tested CFS = cell free supernatant - = no zone CCFS = concentrated cell free supernatant

3.5 ผลจากการทดสอบประสทธภาพในการยบยงจลนทรยกอโรคของ P0915 cell suspension โดยวธ agar well diffusion (Lorian, 1996)

ผลจากการทดสอบฤทธการยบยงจลนทรยกอโรคเพมเตมคอ S. aureus สายพนธมาตรฐาน 2 สายพนธ, MRSA 4 สายพนธ (NPRC 001R-NPRC 004R), Acinetobacter baumannii AB 045, P. aeruginosa PA 3, PA 8, PA 10 และ PA 14 หลงจากทาการทดสอบ P0915 กบ จลนทรยกอโรค ดงกลาว พบวา ไอโซเลท P0915 สามารถยบยงการเจรญของเชอทดสอบเกอบทกสายพนธท งแกรมลบและแกรมบวกโดยมคา inhibition zone อยในชวง 13.3-19.4 mm. (ตารางท 10) 3.6 ผลจากการทดสอบประสทธภาพของสารสกด ethyl acetate จากสวนตางๆทไดจาก P0915

จากผลการทดสอบขางตน จงทาการสกดสารจาก P0915 โดยใช ethyl acetate ทา การสกดจาก Freeze dried cell free supernatant, Freeze dried cell suspension, cell suspension และ whole cell pellets ซงพบวา สารสกด ethyl acetate ของ P0915 cell suspension มประสทธภาพมากทสด โดยใหวงใสในการยบยงจลนทรยตางๆ ดงน ยบยง

จลนทรยทดสอบ ขนาดเสนผานศนยกลาง inhibition zone (mm)

CS CFS CCFS V. parahaemolyticus PSU 1681 14.7 6.8 - E. coli PSU 95 14.1 - - S. Typhimurium PSU 101 13.0 - - S. aureus PSU 106 26.8 7.4 8.3 S. aureus ATCC 25923 NT 7.7 8.5 Aspergillus sp. F33 17.2 - - Aspergillus sp. F36 17.0 - -

41 V. parahaemolyticus PSU 1681 ให inhibition zone 14.3 mm, ยบยง S. Typhimurium PSU 101 ให inhibition zone 11.0 mm, ยบยง S. aureus PSU 106 ให inhibition zone 13.0 mm, ยบยง S .aureus ATCC 25923 ให inhibition zone 13.7 mm (ตารางท 11) จงคดเลอกสารสกด ethyl acetate ของ P0915 cell suspension เพอนามาหาคา MIC, MBC และ MFC

3.7 ผลการหาคา MIC ของ สารสกด ethyl acetate ของ P0915 cell suspension

โดยนาแบคทเรยกอโรคทมอาย 24 ชวโมงและรากอโรคทมอาย 3 วน มาทาการทดสอบกบสารสกดโดยวธ broth micro-dilution ผลของการหาคา MIC, MBC และ MFC

จากการหาคา MIC ของ สารสกด ethyl acetate ของ P0915 cell suspension ทมความเขมขนของสารอยในชวง 2-1,024 μg/mL พบวา สารสกดจากเชอ P0915 สามารถยบยง S. aureus ATCC 29213, MRSA NPRC 001R, MRSA NPRC 002R, B.subtilis ทคา MIC เทากบ 256 μg/mL และสารสกดจากเชอ P0915 สามารถยบยง V. parahaemolyticus PSU 1681, S. aureus PSU 106, S. aureus ATCC 25923, MRSA NPRC 003R, MRSA NPRC 004R ไดท MIC 512 μg/mL ยาตานจลนทรยมาตรฐานทใช คอ chloramphenicol ซงมคา MIC อยในชวง 2-256 μg/mL (ตารางท 12)

สารสกดจากเชอ P0915 ไมสามารถยบยงเชอ E. coli PSU 95, S. Typhimurium PSU 101, Acinetobacter baumannii AB 045, P. aeruginosa PA 3, PA 8, PA 10, PA 14, ในชวงความเขมขนสงสดของสารเทากบ 1,024 μg/mL

การสกดสารจาก P0915 ดวยตวทาลายลายอน ๆ คอ Hexane (การสกดใชวธเดยวกบการสกดดวย ethyl acetate) methanol, methanol ผสม chloroform (1:1) (ดวธการสกดใน ภาคผนวก ข. วธการสกดดวย methanol และ methanol ผสม chloroform) สารทไดจากตวทาละลายทง 3 ชนดเมอนาไปหาคา MIC พบวาสารสกดทง 3 ชนดไมสามารถยบยงจลนทรยทดสอบได แสดงวาตวทาละลายทง 3 ชนดไมสามารถแยกสารตานจลชพออกมาจากตวอยาง P0915 ได (ตารางท 12)

42 ตารางท 10 ประสทธภาพในการยบยงจลนทรยกอโรคของ P0915 cell suspension โดยวธ agar well diffusion (Lorian, 1996) ไอโซเลท ขนาดเสนผานศนยกลางของ inhibition zone (mm)

AB 0

45

PA 3

PA 8

PA 1

0

PA 1

4

BS

MRS

A1

MRS

A2

MRS

A3

MRS

A4

SA 2

5923

SA 2

9213

P0915 16.3 16.6 16.5 18.3 19.2 14.8 13.3 14.4 16.3 14.9 19.4 18.7

AB= Acinetobacter baumannii AB 045 PA 3=Pseudomonas aeruginosa PA 3

PA 8=Pseudomonas aeruginosa PA 8 PA 10= Pseudomonas aeruginosa PA 10 PA 14=Pseudomonas aeruginosa PA 14 BS =Bacillus subtilis MRSA1=Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 001R MRSA2=Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 002R MRSA3=Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 003R MRSA4= Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 004R SA 25923 =Staphylococcus aureus ATCC 25923 SA 29213=Staphylococcus aureus ATCC 29213

43 ตารางท 11 ประสทธภาพของสารสกด ethyl acetate ในการยบยงจลนทรยของ P0915 culture

หมายเหต; - = ไมมวงใส

แหลงทมาของสารสกด ขนาด inhibition zone (mm)

V. p

arah

aem

olytic

us

PSU

1681

E. c

oli P

SU 9

5 S.

Typ

himur

ium P

SU 1

01

S. a

ureu

s PSU

106

S. a

ureu

s A

TCC

2592

3

Aspe

rgillu

s sp

. F33

As

perg

illus

sp. F

36

freeze dried cell free supernatant

-

- - -

- - -

whole cell pellets -

- - 9.0

- - -

cell suspension 14.3

11.0

11.0

13.0

13.7

- -

freeze dried cell suspension 9.9

- - 9.4

1.0

- -

control DMSO

- - - - - - -

44

ตารางท 12 คา MIC, MBC และ MFC ของสารสกดจาก cell suspension ของไอโซเลท P0915 ทสกดดวยตวทาละลายตางๆ จลนทรยกอโรคทใชในการทดสอบ

คา MIC และ MBC/MFC (μg/mL) ในการยบยงเชอทดสอบ Methanol Methanol + chloroform Hexane Ethyl Acetate Chloramphenicol Amphotericin B

MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MFC

VP - - - - - - 512 - 2 8 NT NT EC - - - - - - - - 4 16 NT NT ST - - - - - - - - 4 32 NT NT SA - - - - - - 512 1,024 8 32 NT NT SA 25923 - - - - - - 512 1,024 16 32 NT NT SA 29213 - - - - - - 256 1,024 16 32 NT NT MRSA1 - - - - - - 256 1,024 256 - NT NT MRSA2 - - - - - - 256 - 256 - NT NT MRSA3 - - - - - - 512 1,024 32 - NT NT MRSA4 - - - - - - 512 1,024 32 - NT NT

VP = Vibrio parahaemolyticus PSU 1681 SA 29213 = Staphylococcus aureus ATCC 29213 EC = Escherichia coli PSU 95 MRSA1 = Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 001R ST = Salmonella Typhimurium PSU 101 MRSA2 = Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 002R

SA = Staphylococcus aureus PSU 106 MRSA3 = Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 003R SA 25923 = Staphylococcus aureus ATCC 25923 MRSA4 = Methicillin-resistant Staphylococcus aureus NPRC 004R หมายเหต; - หมายถง ไมยบยง NT หมายถง ไมไดทดสอบ

45

ตารางท 12 (ตอ) คา MIC, MBC และ MFC ของสารสกดจาก cell suspension ของไอโซเลท P0915 ทสกดดวยตวทาละลายตางๆ

จลนทรยกอโรคทใชในการทดสอบ

คา MIC และ MBC/MFC (μg/mL) ในการยบยงเชอทดสอบ Methanol Methanol + chloroform Hexane Ethyl Acetate Chloramphenicol Amphotericin B

MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MFC

AB - - - - - - - - 256 - NT NT PA 3 - - - - - - - - 256 - NT NT PA 8 - - - - - - - - 256 - NT NT PA 10 - - - - - - - - 256 - NT NT PA 14 - - - - - - - - 256 - NT NT BS - - - - - - 256 512 4 8 NT NT F33 - - - - - - - - NT NT 2 2 F36 - - - - - - - - NT NT 4 6

PA 3 = Pseudomonas aeruginosa PA 3 AB = Acinetobacter baumannii AB 045 PA 8 = Pseudomonas aeruginosa PA 8 BS = Bacillus subtilis

PA 10 = Pseudomonas aeruginosa PA 10 F33 = Aspergillus sp. F33 PA 14 = Pseudomonas aeruginosa PA 14 F36 = Aspergillus sp. F36

หมายเหต; - หมายถง ไมยบยง NT หมายถง ไมไดทดสอบ

46

จากผลการทดสอบทไดทาใหเหนวา ไอโซเลท P0915 มความสามารถในการยบยง จลนทรยไดหลากหลาย โดยเฉพาะอยางยงสามารถยบยง MRSA ซงเปนเชอกอโรคทดอยาได จงไดทาการทดสอบเพมเตมโดยการนา P0915 ไปทดสอบการยบยงรากอโรคพช และ ไซยาโน-แบคทเรย M. aeruginosa TISTR 8305 ซงมผลการทดลองดงแสดงในตารางท 13 – 15 3.8 ผลการทดสอบความสามารถในการยบยงรากอโรคพชโดยวธ agar well diffusion

ผลการทดสอบความสามารถในการยบยงรากอโรคพชโดยวธ agar well diffusion พบวา P0915 สามารถยบยง Phytophthora palmivora ซงเปนราทกอโรคในลาตนและราก เนาในทเรยนและพชอนๆ โดยม คา inhibition zone เทากบ 12.1 mm แตไมสามารถยบยงรากอโรคอนๆทนามาทดสอบเพมเตมได (ตารางท 13) ตารางท 13 ผลการยบยงรากอโรคในพชของ P0915 cell suspension โดยวธ agar well diffusion (Lorian, 1996)

Sclerotium rolfsii กอโรค รากเนา Pythium aphanidermatum กอโรค เนาคอดนหรอเนาระดบดน Magnaporthe grisea กอโรค ไหมทคอรวงในขาว Phytophthora palmivora กอโรค ลาตนและรากเนาในทเรยนและพชอนๆ Phytophthora botryosa กอโรค ลาตนและรากเนาในทเรยนและพชอนๆ Ganoderma lucidum กอโรค ยางพารา, ชา, ปาลมนามน Rigidoporus microporus กอโรค รากขาวในยางพารา Rhizoctonia solani กอโรค โรคในพชตระกลถว

ไอโซเลท ขนาด inhibition zone (mm)

Scler

otium

rolfs

ii

Pyth

ium

apha

nider

mat

um

Mag

napo

rthe

grise

a

Phyto

phth

ora

palm

ivora

Phyto

phth

ora

botry

osa

Gano

derm

a luc

idum

Rigid

opor

us

micr

opor

us

Rhizo

ctonia

solan

i

P0915 - - - 12.1 - - - -

47 3.9 ผลการทดสอบความสามารถของ P0915 ในการยบยงไซยาโนแบคทเรย M. aeruginosa TISTR 8305 โดยวธ microdilution method

ผลทดสอบความสามารถ P0915 ในการยบยงไซยาโนแบคทเรย M. aeruginosa TISTR 8305 โดยวธ microdilution method พบวาเมอเลยงเซลลสาหรายรวมกบ P0915 เซลล M. aeruginosa TISTR 8305 มปรมาณลดลงเมอเปรยบเทยบกบ control ซงม M. aeruginosa TISTR 8305 1.15 x105 cells/mL เมอใช P0915 ทความเขมขน 10 CFU/mL นบเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ทเหลอได 2.8x104 cells/mL เซลล M. aeruginosa TISTR 8305 มแนวโนมลดลงเรอยๆ เมอเพมปรมาณเซลลของ P0915 และท 108 CFU/mL นบเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ได 1.5x103 cells/mL ซงเมอเปรยบเทยบเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ททาการทดสอบกบปรมาณเซลลของ P0915 ท 108 CFU/mL กบ control ทมเซลลอย 1.15 x105 cells/mL พบวา เซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ลดลงไป 98.69% ซงถอวา ปรมาณเซลลของ P0915 ท 108 CFU/mL (ตารางท 14) สามารถทาลายเซลลสาหรายไดเกอบทงหมด โดย M. aeruginosa TISTR 8305 มลกษณะการถกทาลายทผนงเซลลและพบเศษซากเซลลของ M. aeruginosa TISTR 8305 เปนจานวนมาก ดงแสดงในรปท 3

3.10 ผลการทดสอบความสามารถของสารสกด ethyl acetate จาก P0915 cell suspension ในการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 โดยวธ microdilution method

จากผลการทดสอบความสามารถของสารสกด ethyl acetate จาก P0915 cell suspension ในการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 ททดสอบโดยวธ microdilution method พบวา M. aeruginosa TISTR 8305 เรมตนท 2.80 x106 cells/mL เมอเตมสารสกด ethyl acetate จาก P0915 cell suspension 500 μg/mL เซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ลดลงเหลอ 4.7x104 cells/mL ซงเมอเปรยบเทยบกบ control ซงนบเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ได 1.15 x105 cells/mL แสดงวาเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ลดลงไปหนง log และทความเขมขนของสารสกดสงขน เซลล M. aeruginosa TISTR 8305 มจานวนลดลงไปเรอยๆตามความเขมขนของสารสกดทเพมขนและทความเขมขนของสารสกดเทากบ 4,500 μg/mL พบวาเซลลสาหรายเหลออย 7.0x103 cells/mL ซงเมอเปรยบเทยบเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ทความเขมขนของสารสกดเทากบ 4,500 μg/mL กบ control (ตารางท 15) พบวา เซลลสาหรายลดลงไป 93.91% และพบเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 มรปรางทผดปกตเมอสองดภายใตกลองจลทรรศน SEM ดงแสดงในรปท 3

48 ตารางท 14 ผลการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 ของไอโซเลท P0915 ท ความเขมขนตางๆ หลงเลยงรวมกนท 30oC เปนเวลา 3 วน

ปรมาณเชอ

P0915 (CFU/mL)

ปรมาณเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 คงหลอ (cells/mL)

0= ชดควบคม 1.15 x105

101 2.8x104

102 2.0x104

103 1.8x104

104 1.3x104

105 8.3x103

106 6.3x103

107 9.5x103

108 1.5x103

หมายเหต ; เซลล M. aeruginosa TISTR 8305 เรมตน 2.80 x106 cells/mL

49 ตารางท 15 ผลการทดสอบสารสกด ethyl acetate ของ cell suspension ของไอโซเลท P0915 ในการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305

ความเขมขนของสารสกด (μg/mL)

ปรมาณเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 คงหลอ ( cells/mL)

0= ชดควบคม 1.15 x105 500 4.7x104

1,500 2.0x104 2,500 1.1x104 3,500 1.9x104 4,500 7.0x103

หมายเหต ; เซลล M. aeruginosa TISTR 8305 เรมตน 2.80 x106 cells/mL

50

รปท 3 ลกษณะเซลลปกตและเซลลทเปลยนแปลงภายใตกลอง Scanning Electron Microscope (SEM) หลงจากการเลยงรวมกบไอโซเลท P0915 (108 CFU/mL) เปนเวลา 3 วนและหลงการเตมสารสกด ethyl acetate ของ cell suspension ของไอโซเลท P0915 (4,500 μg/mL) เปนเวลา 3 วน

A. เซลลปกตของไซยาโนแบคทเรยในชดควบคม (x25,000) B. เซลลไซยาโนแบคทเรยทเปลยนแปลงหลงจากการเลยงรวมกบไอโซเลท

P0915 (x25,000) C. เซลลไซยาโนแบคทเรยทเปลยนแปลงหลงการเตรยมสารสกดสารสกด ethyl acetate ของ cell suspension ของไอโซเลท P0915 (x25,000)

A

B

C

51 3.11 ผลการทดสอบความสามารถในการผลตเอนไซมของไอโซเลท P0915

การทดสอบความสามารถในการผลตเอนไซมของไอโซเลท P0915 โดยใช API ZYM Kit (by Biomerieux) พบวา ไอโซเลท P0915 สามารถผลตเอนไซม 11 ชนด จากททดสอบทงหมด 19 ชนด แบงเปน 5 กลม ไดแก phosphatase, lipase, arylamidase, trypsin, phosphohydrolase, glucosaminidase โดยทไอโซเลท P0915 สามารถผลตเอนไซมไดทง 5กลม (ตารางท 16, รปท 4)

ตารางท 16 การทดสอบการผลตเอนไซมของไอโซเลท P0915 ดวย API ZYM Kit

No. ENZYME ASSAYED FOR results

1. Control -

2. Alkaline phosphatase >5

3. Esterase (C 4) 3

4. Esterase Lipase (C 8) 2

5. Lipase (C 14) 1

6. Leucine arylamidase 5

7. Valine arylamidase 1

8. Cystine arylamidase 1

9. Trypsin 0

10. α-chymotrypsin 1

11. Acid phosphatase 5

12. Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase 5

13. α-galactosidase 0

14. ß-galactosidase 0

15. ß-glucuronidase 0

16. α-glucosidase 0

17. ß-glucosidase 0

18. N-acetyl-ß-glucosaminidase 2

19. α-mannosidase 0

20. α-fucosidase 0

หมายเหต; สามารถเทยบปรมาณเอนไซมทผลตไดจากแผนภมท 6 (ภาคผนวก ข)

52

รปท 4 แถบทดสอบเอนไซม API ZYM Kit A. ชดควบคม ทดสอบกบเชอ Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

B. ชดทดสอบกบไอโซเลท P0915 cell suspension

A:

B:

53 3.12 ผลการบงชชนดของจลนทรยทคดแยกได

การศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาเบองตนเพอบงชชนดของไอโซเลท P0915 พบวาไอโซเลท P0915 มโคโลนสเหลองบนอาหาร ASW agar และเมอสองดภายใตกลองจลทรรศนพบวาเปนแบคทเรยแกรมลบ รปแทง (รปท 5) ผลการบงชชนดของไอโซเลท P0915 โดยการวเคราะหทางชวโมเลกลดวย 16S rRNA analysis สงตรวจวเคราะหทศนยพนธวศวกรรมและเทคโนโลยชวภาพแหงชาต (National Center for Genetic Engineering and Biotechnology) พบวาลาดบเบสของ 16S rRNA gene ของ ไอโซเลท P0915 มความเหมอนกบ Pseudoalteromonas flavipulchra 99.9 % (รปท 6)

รปท 5 ลกษณะทางสณฐานวทยาของไอโซเลท P0915 บนอาหาร ASW agar และเมอสองดภายใตกลองจลทรรศน

A. ลกษณะโคโลนของไอโซเลท P0915 บนอาหาร ASW agar B. ลกษณะของไอโซเลท P0915 ภายใตกลองจลทรรศน (x100)

B A

54

รปท 6 Phylogeneic Tree แสดงตาแหนงไอโซเลท P0915 ใน genus Pseudoalteromonas ทไดทาการวเคราะหทางชวโมเลกล (16S rRNA analysis) (ภาคผนวก ค)

P0915

55

บทท 4 วจารณผลการทดลอง

จากการคดแยกแบคทเรยทงหมด 514 ไอโซเลท โดยสามารถแยกแบคทเรยแกรมลบได

299 ไอโซเลท (58%) และแยกแบคทเรยแกรมบวกได 215 ไอโซเลท (42%) ซงสอดคลองกบการศกษาของ Fenical and Jensen (1993) ซงสามารถคดแยกแบคทเรยแกรมลบไดเปนกลมหลกจากทะเล สวน Bernen et al. (1997) รายงานวา 36 % ของแบคทเรยทสามารถแยกไดเปน แกรมลบ รปแทงทสามารถผลตสารยบยงจลนทรยได จากแบคทเรยทงหมดทแยกไดจากตวอยางทตางกนไป ม 29 ไอโซเลท (5.64 %) ทมฤทธยบยงจลนทรยกอโรคแกรมบวก แกรมลบและรา ทดสอบโดยใช culture suspension ดวยวธ agar well diffusion ซงถอไดวามความใกลเคยงกบการศกษาของ Wilson et al. (2009) ทสามารถแยกแบคทเรยทะเลทยดเกาะพนผว ทมฤทธยบยงดวยวธ well diffusion โดย 9.6% ของแบคทเรยทงหมดทแยกไดมฤทธยบยง จลชพ ซงจากขอมลขางตนจะเหนไดวาเราสามารถทาการแยกแบคทเรยจากสงมชวตตางๆในทะเลไดซงนนบงบอกถงความสมพนธ ของการอยรวมกนระหวาง แบคทเรยกบ host ในทะเล สงมชวตในทะเลสวนใหญจะมแบคทเรยทมความหลากหลายยดเกาะทพนผว (Rohwer et al., 2002) ซงแบคทเรยทเกาะตดบนพนผวของสงมชวตอนจะมความสามารถในการหลงสารออกฤทธทางชวภาพไดมากกวาแบคทเรยทดารงชวตแบบอสระ (Burgess et al., 1999; Long and Azam, 2001; Lemos et al., 1985; Zheng et al., 2005) ซงอาจจะเนองมาจากการทแบคทเรยยดเกาะพวกนตองผลตสารตางๆ ออกมาเพอยบยงคแขงทจะแยงพนทในการสรางโคโลนบนตว host (Thomas et al., 2008)

ปญหาหลกทพบในการศกษานคอแบคทเรยทคดเลอกไดมฤทธยบยงนอยลงและทาการเลยงเชอใหมไมขน ทงนอาจจะเนองมาจากแบคทเรยเหลานทาการคดแยกมาจากทะเล จงมขอจากดในเรองสารอาหารและสภาวะแวดลอมทใชเลยง กอปรกบแบคทเรยเหลานอาศยอยกนเปนชมชนในแบบ symbiotic ระหวางแบคทเรยดวยกนหรอแบคทเรยกบ host (Friedrich et al., 1999) เมอทาการแยกใหเปนโคโลนเดยวๆ จงไมมการปฏสมพนธกนในรปแบบดงกลาวอก จงไมมความจาเปนทจะตองผลตสารยบยงออกมาและบางสายพนธอาจไมสามารถดารงชวตอยไดโดยทไมปฏสมพนธกบสายพนธหรอสงมชวตอนๆ แตกยงมแบคทเรย 1 ไอโซเลทนนคอ ไอโซเลท P0915 ทแยกไดจากเพรยงทแสดงฤทธยบยงทโดดเดนกวาไอโซเลทอนๆ ซงสามารถยบยงแบคทเรยกอโรคไดทกสายพนธทใชทดสอบทงแกรมบวก แกรมลบและรากอโรคและยงมความคงตวของฤทธยบยงอกดวย จงไดมการเพมจลนทรยทใชในการทดสอบขนโดยทาการทดสอบกบแบคทเรยดอยา เชน MRSA, Acinetobacter baumannii (สายพนธดอยา), P. aeruginosa (สายพนธดอยา) และแบคทเรยสายพนธมาตรฐาน และรากอโรคพชอกดวย ผล

56 จากการทดสอบฤทธการยบยงจลนทรยกอโรคเพมเตมดงกลาวดวยวธ agar well diffusion พบวา ไอโซเลท P0915 สามารถยบยงการเจรญของแบคทเรยทดสอบทกสายพนธท งแกรมลบและแกรมบวกและสามารถยบยงรากอโรคพชได 1 สายพนธคอ Phytophthora palmivora แตไมสามารถยบยงรากอโรคพชสายพนธอนๆ ได

ถงแมวา cell suspension ของ P0915 จะมฤทธยบยงจลนทรยไดหลากหลาย แตเมอนา cell free supernatant มาทดสอบฤทธตานจลนทรยกลบพบวา P0915 มกจกรรมลดลงมากเมอเทยบกบการทดสอบดวย cell suspension ซงเปนไปไดวา cell suspension มตวเซลล เซลลเหลานนสามารถสรางสารไดตลอดเวลาทาใหมปรมาณสารมากกวา cell free supernatant

การทดสอบฤทธตานจลนทรยแบบ agar well diffusion จดเปนการทดลองเบองตนเทานน ผลทไดอาจจะมความไมแมนยาและไมสามารถนามาเปรยบเทยบฤทธการยบยงทแทจรงได จงนาไปสการสกดสารดวยตวทาละลายอนทรยตางๆ เพอหาคา MIC, MBC และ MFC ผลการสกดสารจาก P0915 cell suspension ดวย ethyl acetate เพอนาไปทดสอบหาคา MIC, MBC และ MFC โดยวธ broth micro-dilution กบเชอทดสอบทงหมดขางตนและรากอโรคพชเนองจาก P0915 ไมสามารถยบยงได สวน Phytophthora palmivora มขนาดวงใสทแสดงถงความสามารถในการยบยงทนอย จงไมไดทาการทดสอบหาคา MIC และ MFC ซงเมอนาสารสกด ethyl acetate ทมความเขมขนระหวาง 2-1,024 μg/mL มาทดสอบกบเชอทดสอบพบวา สารสกด ethyl acetate สามารถยบยงแบคทเรยทงหมด 9 สายพนธ จากจลนทรยท งหมด 16 สายพนธ ทนามาทาการทดสอบดวยวธ broth micro-dilution โดยสามารถยบยงแบคทเรยแกรมบวกได 8 สายพนธคอ S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus PSU 106, MRSA NPRC 001R-004R, B. subtilis และสามารถยบยงแบคทเรยแกรมลบได 1 สายพนธคอ V. parahaemolyticus PSU 1681 โดยมคา MIC อยระหวาง 256-512 μg/mL สารสกด ethyl acetate จากเชอ P0915 cell suspension ไมสามารถยบยงเชอ E. coli PSU 95, S. Thyphimurium PSU 101, Acinetobacter baumannii AB 045, P. aeruginosa PA 3, PA 8, PA 10, PA 14 ในชวงความเขมขนสงสดของสารท 1,024 μg/mL ซงจะเหนไดวาการทดสอบดวยวธ broth micro-dilution ฤทธการยบยงจลนทรยบางสวนหายไปเมอเทยบกบการทดสอบดวยวธ agar well diffusion จากทงสองวธมผลสอดคลองกนในสวนของการยบยงแบคทเรย แกรมบวกซง P0915 แสดงฤทธยบยงแบคทเรยแกรมบวกไดดเมอทดสอบโดยวธ agar well diffusion และยงคงพบฤทธการยบยงแบคทเรยแกรมบวกเมอทาการทดสอบดวยวธ broth micro-dilution

ไอโซเลท P0915 เปนแบคทเรยทมโคโลนสเหลองใส เมอดภายใตกลองเปนแบคทเรยรปแทง แกรมลบ ซงเมอนาไปบงชชนดโดยการวเคราะหทางชวโมเลกล (16 rDNA analysis) พบวา ไอโซเลท P0915 มความเหมอนกบ Pseudoalteromonas flavipulchra 99.9 % ซง

57 แบคทเรยจนสนพบบอยๆวามความเกยวของกบ host ทเปนยคารโอต มกเปนพวกทตองการอากาศ มแฟลกเจลลาและเปนพวก heterotroph (Holmstrom et al., 1999) ในการศกษาของ Thomas et al. (2008) เกยวกบจโนมของแบคทเรยในจนสเดยวกนคอ Pseudoalteromonas tunicata พบวามการสรางโคโลนบนพนผว eukaryotic host เชน สตวไมมกระดกสนหลงในทะเลและสาหราย ซงเปนเรองปกตทเกดขนในทะเล ทคาดวาจะเปนการสรางแขงขนหรอเพอการปฏสมพนธกบแบคทเรยอนๆ ซง Pseudoalteromonas tunicata เปนสายพนธทแขงขนกบสายพนธอนๆ ไดด ในการครอบครองพนผวตางๆ ในทะเล เนองจากความสามารถในการผลตโมเลกลสารยบยงได จงกลายเปนสงมชวตตนแบบในการศกษากระบวนการสรางโคโลนบนพนผว eukaryotic host และการมปฏสมพนธกบ eukaryotic host จงตองทาการหาลาดบเบสและทาการวเคราะหจโนมของ Pseudoalteromonas tunicata และเปรยบเทยบกบจโนมของสายพนธทมความสมพนธกนอยางใกลชด เพอใหเขาใจถงการปรบตวทเกยวของกบการดารงชวตแบบยดเกาะบนพนผว พบวา Pseudoalteromonas tunicata มจโนมทประกอบไปดวยยนสหลายยนสและเปนยนสทมสวนรวมในการผลตสารยบยงคแขงบนพนผว คณลกษณะการตอบสนองความเครยด แบบ oxidative ของ Pseudoalteromonas tunicata การขบไอออน และแสดงการเขายดครองสารอาหาร ซงสงมชวตจะปรบตวแบบนกตอเมอมความหนาแนนของประชากรสงบนพนผว การเกาะตดบนพนผวดเหมอนวาจะมสอกลาง เชน curli, novel pili, โพลเมอรทถกปลอยออกมาขางนอกและอนๆ เชน โปรตนทผวเซลล จโนมของ Pseudoalteromonas tunicata แสดงใหเหนรปแบบการใชประโยชนจากสารโพลเมอรเพอหลกเลยงการยอยจาก host ในขณะทสารนนๆ อาจจะไปมผลตอ host ชนดอนๆ

ทผานมามผศกษาพบวาแบคทเรยหลายๆสายพนธในจนสน สามารถผลตสารออกฤทธ ทางชวภาพได (Gauthier et al., 1995; Gauthier, 1976; Gauthier and Breittmayer, 1979; Hanefeld et al., 1994; Holmstrom and Kjelleberg, 1999; James et al., 1996; McCarthy et al., 1985) แมกระทงในปจจบนมผศกษาและพบวาแบคทเรยในจนสนมความสามารถในการผลตสารออกฤทธทางชวภาพได เชน พบวาสารสกดจาก Pseudoalteromonas phenolica มฤทธยบยง S. aureus, B. subtilis, Enterococcus serolicida, V. alginolyticus, P. aeruginosa, Aspergillus fumigatus ได (Isnansetyo and Kamei, 2009) ขณะท Longeon et al. (2004) ไดทาการคดแยก Pseudoalteromonas sp. X153 ทสามารถยบยง Vibrio sp. และเชอกอโรคในมนษยได และมการแยก P. luteoviolacea ทสามารถผลตสารออกฤทธทางชวภาพทมโมเลกลใหญจากทะเลเมดเตอรเรเนยน (Gómez et al., 2008) สวน Hayashida et al. (2008) สามารถแยก P. haloplanktis ไดจากหอยเชลลซงมฤทธตานแบคทเรยทะเล 6 สายพนธ และแบคทเรยกอโรคอก 9 สายพนธ จากรายงานดงกลาวพบวามผลสอดคลองกบผลการศกษาในครงนดวยเนองจาก Pseudoalteromonas flavipulchra P0915 กสามารถยบยง

58 จลนทรยในจนสขางตนไดเชนกน และจากการศกษาของ Bowman (2007) พบวา แบคทเรยในจนส Pseudoalteromonas sp. สามารถผลตสารออกฤทธไดหลายกลมทงทมขนาดโมเลกลใหญและขนาดโมเลกลเลก เชน toxic proteins, polyanionic exopolymers, สารกลม phenolic, สารประกอบกลม alkaloids, cyclic peptides และสารประกอบ bromine เปนตน จากการศกษาของ Yu et al. (2012) พบวาสารสกด ethyl acetate ของเชอ Pseudoalteromonas flavipulchra JG1 เปนโปรตนโมเลกลเลกซงแยกสารสกดดงกลาวได 5 สวน ประกอบไปดวย p-hydroxybenzoic acid (Niu et al., 2003), trans-cinnamic acid (Yang et al., 2000) 6-bromoindo-lyl-3-acetic acid (Rasmussen et al., 1993), N-hydro-xybenzoisoxazolone (Kuberski and Gebicki, 1992) และ 29-deoxyadenosine (Shi et al., 2009) ซงกมรายงานการคนพบสารดงกลาวกอนหนานเชนกน โดยสารสกดดงกลาวท Yu et al. (2012) แยกไดนน มฤทธยบยง V. anguillarum ซงเปนไปไดวาสารสกด ethyl acetate ในการศกษาในครงนอาจจะเปนโปรตนโมเลกลเลกทมความใกลเคยงกบสารท Yu et al. (2012) แยกได เพราะสามารถยบยงเชอในจนสเดยวกน นนกคอ Vibrio sp. ซงการศกษาในครงนสามารถยบยง V.parahaemolyticus PSU 1681 ได และทมากไปกวานน ในการศกษาครงน Pseudoalteromonas flavipulchra ทแยกไดยงสามารถยบยงจลนทรยสายพนธอนๆไดดอกดวยเชน S. aureus สายพนธมาตรฐาน, S. aureus PSU 106, MRSA NPRC 001R-004R และ B. subtilis ซงเปนสงทนาสนใจเปนอยางยงสาหรบแบคทเรยทะเลชนดน

จากผลของคา MIC ทสงในชวง 256-512 μg/mL จงไดมการทดสอบสกด P0915 cell suspension เพมเตม โดยใชตวทาละลายอนๆ ทมข วแตกตางกน คอ hexane, methanol และ methanol ผสม chloroform (1:1) เพอแยกสารตานจลนทรยตางกลมกนจาก cell culture เมอนามาหาคา MIC พบวา สารสกดทมความเขมขนของสารอยในชวง 2-1,024 μg/mL ทสกดดวยตวทาละลายทง 3 ชนดไมมฤทธยบยงเชอกอโรค ดงนนจงมเพยง ethyl acetate เพยงชนดเดยวทสามารถแยกสารตานจลนทรยออกมาจากนาเลยงเซลลได นอกจากนมการนาสารสกด ethyl acetate ของ P0915 cell suspension และตวเชอ P0915 มาทาการทดสอบเพอหาฤทธ ยบยงไซยาโนแบคทเรย เพราะถงแมวาการควบคมการเพมจานวนของไซยาโนแบคทเรย โดยวธการทางเคมและทางกายภาพจะไดผลด แตกถอไดวาเปนวธทอนตราย ซงสารเคมอาจจะกอใหเกดผลรายแรงตอสงมชวตหลายชนดในนา ทาใหระบบนเวศในนาเปลยนแปลง และสงผลกระทบตอธรรมชาตในทสด (Jeong et al., 2003) ตวแทนทางชวภาพซงประกอบไปดวย แบคทเรย (Mayali and Azam, 2004) ไวรส (Nagasaki et al., 2004) โปรโตซว (Jeong et al., 2003) และ macrophyte (Jin and Dong, 2003; Nakai et al., 1999) ซงสงมชวตเหลานถอเปน suppressors ทมศกยภาพในการควบคมการระบาดของไซยาโนแบคทเรยได จงมความสนใจทจะนา ไอโซเลท P0915 มาทาการยบยงไซยาโนแบคทเรย เนองจากมความเปนไปไดสงทจะ

59 นาไปประยกตใชตอไปไดเพราะแบคทเรยสายพนธดงกลาวแยกมาไดจากทะเล ซงเปนสงแวดลอมปกตทจะเกดปญหาการแพรกระจายของไซยาโนแบคทเรยขน ไซยาโนแบคทเรย ทใชในการทดสอบครงนคอ ไซยาโนแบคทเรยสายพนธ M. aeruginosa TISTR 8305 ซง M. aeruginosa เปนไซยาโนแบคทเรยสายพนธทโดดเดนทเกดการแพรกระจายเพมปรมาณขนทงในนาจดและนาเคม เชน ในทะเลสาบไท ประเทศจน ซงสงผลไปถงนาดม นาประปาและสงผลกระทบตอสขภาพของมนษยเนองจาก M. aeruginosa กอใหเกดสารพษประเภท hepatotoxins เชน microcystins (MCs) ซงสารดงกลาวจะถกปลอยออกมาสธรรมชาตหลงจากเซลล M. aeruginosa แตกแลว (Dai et al., 2008; Ross et al., 2006; Zurawell et al., 2005) ผลการทดสอบพบวา สารสกด ethyl acetate ของ P0915 และตวเชอ P0915 สามารถยบยง ไซยาโนแบคทเรยดงกลาวได ซงกอนหนานมรายงานแบคทเรยทสามารถยบยงไซยาโนแบคทเรยมกพบวาอยในกลม Myxobacteria, Flavobacterium, Bacteroidetes, Cytophaga, Sphingomonas, Bacillus, Achromobacter, Alteromonas, Arthrobacter, Pseudoalteromonas, Vibrio และ Pseudomonas ในอดตมกพบกลมแบคทเรยเหลานแพรหลายอยในกลมแบคทเรยทะเลและนาจด (Kang et al., 2008; Kim et al., 2007; Mu et al., 2007; Roth et al., 2008; Su et al., 2007) ซงโดยทวไปแบคทเรยจะยบยงการเจรญหรอฆาสาหรายได โดยทางตรงและทางออม แตสวนใหญแบคทเรยเหลานจะยบยงสาหรายโดยการตอตานการเจรญหรอทาใหเซลลสาหรายแตก โดยเกดจากการทแบคทเรยจะปลอยสารประกอบบางอยางออกมา ซงจะเปนพษตอเซลลสาหราย สารประกอบเหลานนอาจจะเปน โปรตน (Lee et al., 2000; Mitsutani et al., 2001), เปปไทด (Banin et al., 2001; Imamura et al., 2001; Yamamoto et al., 1998), อะมโนแอซต (Yoshikawa et al., 2000), สารปฏชวนะ (Dakhama et al., 1993), ไบโอเซอแฟกแตนท (Gustafsson et al., 2009; Wang et al., 2005), bacillamide (Jeong et al., 2003), hydroxylamine (Paul et al., 1979), lipid peroxidation (Wang et al., 2008) และอนๆ มเพยง Shi et al. (2006) เทานนทรายงานวามแบคทเรยทยบยงการเจรญของไซยาโนแบคทเรยผานการสมผสกบเซลลไซยาโนแบคทเรยโดยตรงหรอการเจาะเขาสเซลลไซยาโนแบคทเรย จากผลการทดสอบการผลตเอนไซมของ P0915 พบวา P0915 สามารถผลตเอนไซมในกลม phosphatase, lipase, arylamidase, trypsin, phosphohydrolase และ glucosaminidase ซงความสามารถในการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 อาจเกดจากการผลตเอนไซมดงกลาวได เนองจากไซยาโนแบคทเรยสวนใหญมลกษณะผนงเซลลเหมอนกบทงแบคทเรยแกรมบวกและแกรมลบซงประกอบดวย cytoplasmic membrane, serrated external layer, outer membrane, peptidoglycan layer และยงม cyanobacterial porins ซงเปนโปรตนทหอหมอยช นนอกอกดวย (Hoiczyk and Hansel, 2000) เอนไซมท P0915 ผลตไดซงประกอบไปดวยกลม phosphatase, lipase, arylamidase, trypsin,

60 phosphohydrolase, glucosaminidase ซงสามารถใชสวนของผนงเซลลเหลานเปน substrate ได จงอาจไปมผลทาลายองคประกอบบางสวนของผนงเซลลของ M. aeruginosa TISTR 8305 ทาใหการควบคมการไหลเขาออกสารของเซลลเสยไปไซยาโนแบคทเรยจงตายในทสด จากการสงเกตภายใตกลองจลทรรศน พบวาหลงจากการเลยง M. aeruginosa TISTR 8305 รวมกบ P0915 เซลลเกดการเปลยนแปลงอยางชดเจน เมอทาการศกษาเซลล M. aeruginosa TISTR 8305 ภายใตกลองจลทรรศนแบบสองกราด (scanning electron microscope หรอ SEM) เหนไดชดเจนวาผนงเซลลของ M. aeruginosa TISTR 8305 ถกทาลาย

61

บทท 5 สรปผลการทดลอง

งานวจยนจดทาขน เนองจากตระหนกถงปญหาโรคตดเชอและการดอยาของ

จลนทรยกอโรค จงไดทาการคนหาสารออกฤทธทางชวภาพใหมๆจากแบคทเรยทมความสามารถผลตสารออกฤทธทางชวภาพ โดยมงเนนการคนควาไปททรพยากรทางทะเล ซงตวอยางทใชในการคดแยกแบคทเรยในครงนประกอบไปดวย กลปงหา, ฟองนา, ปะการง, เพรยง รวมทงสน 26 ตวอยาง ใน 4 จงหวด ไดแก จงหวดภเกต, จงหวดกระบ, จงหวดตรง, จงหวดสตล ซงเปนจงหวดทต งอยในแถบชายฝ งทะเลอนดามนของประเทศไทย โดยสามารถแยกแบคทเรยไดทงหมด 514 ไอโซเลท พบแบคทเรยทมฤทธการยบยงจลนทรยกอโรคทงหมด 29 ไอโซเลท (5.64 %) และทาการแยกได ไอโซเลท P0915 ซงสารสกด ethyl acetate ของ P0915 cell suspension สามารถยบยงแบคทเรยแกรมบวกได 8 สายพนธ คอ S. aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, S. aureus PSU 106, MRSA NPRC 001R-004R, B. subtilis และสามารถยบยงแบคทเรยแกรมลบได 1 สายพนธคอ V. parahaemolyticus PSU 1681 โดยมคา MIC อยระหวาง 256-512 μg/mL และมคา MBC อยระหวาง 512-1,024 μg/mL และยงสามารถยบยงไซยาโนแบคทเรย M. aeruginosa TISTR 8305 ได 93.91 % ทความเขมขนสาร 4,500 μg/mL

ผลการบงชชนดของไอโซเลท P0915 โดยการวเคราะหทางชวโมเลกล (16 rDNA analysis) สามารถจาแนกชนดของไอโซเลท P0915 ไดเปน Pseudoalteromonas flavipulchra

ปญหาและขอเสนอแนะ

1. ควรมการศกษาโครงสรางสารออกฤทธ ของ P0915 เพมเตม หากโครงสรางสวนทออกฤทธเปนสารตวใหม อาจจะนาไปปรบเปลยนโครงสรางเพอลดคา MIC ลงได

2. ควรมการสกด pigment ของ P0915 เพอทดสอบฤทธยบยง เนองจากมรายงานวา pigment ของแบคทเรย มความเกยวของกบการออกฤทธในการยบยง จลนทรย

3. ในการทดสอบฤทธในการยบยงไซยาโนแบคทเรยของ P0915 ควรใชสารอนเชน peptone water ในการเจอจางจลนทรยทดสอบแทน NSS เนองจาก M. aeruginosa TISTR 8305 เปนไซยาโนแบคทเรยนาจดไมทนตอ NaCl จงทาใหผลของชดควบคมมไซยาโนแบคทเรยลดลงกวาไซยาโนแบคทเรยเรมตน

62

4. ในขนตอนการนาไปใชจรง ควรมการศกษาวธการเพอลดผลกระทบจากสารพษท M. aeruginosa TISTR 8305 ปลอยออกมา เนองจาก P0915 มกลไกในการยบยง M. aeruginosa TISTR 8305 โดยการทาใหเซลลเกดร

5. แบคทเรยทะเลทคดแยกไดสวนใหญไมสามารถดารงชวตอยไดโดยการเพาะเลยงในหองปฏบตการและบางไอโซเลทสามารถเพาะเลยงตอไดแตมฤทธการยบยงทนอยลง ทงนอาจจะเนองมาจากสภาวะทใชเลยงในหองปฏบตการกบสภาวะในทะเลมความแตกตางกน กอปรกบความสมพนธของแบคทเรยทะเลสวนใหญจะอยรวมกนเปนชมชน เมอแยกออกเปนโคโลนเดยวๆ แบคทเรยจงสญเสยความสมพนธในรปแบบดงกลาวไป บางสวนจงไมสามรถดารงชวตอยได และ บางสวนทสามารถดารงชวตอยไดเมอไมมการปฏสมพนธกบสายพนธอนจงไมมความจาเปนตองการผลตสารบางอยางทมความจาเปนจะตองใชในการอยรวมกนเปนชมชน

63

เอกสารอางอง

ศกดอนนต ปลาทอง, ศภะสทธ, บญเพยรผล และพงศธระ บวเพชร. ชววทยาและการฟนฟกลปงหาทไดรบผลกระทบจากคลนสนาม. สบคนจาก http://www.sc.psu.ac.th/ units/cbipt/ Document/crab%20paper /Re-reef.doc; 4 February, 2010.

ศรนช ดวงสข. 2550. การคดเลอกแบคทเรยทยบยงเชอราทปนเปอนบนแผนยางพารา. ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร สงขลา. สตา ปรดานนท. 2551. การคดเลอกและการจาแนกชนดของเชอราทสรางสารตานจลนทรยจาก กลปงหา. วทยานพนธวทยาศาสตรมหาบณฑต. ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร สงขลา. สเมตต ปจฉาการ, สชา มนคงสมบรณ, ธดารตน นอยรกษา, พชย สนแจง. 2547. ก า ร ศ ก ษ า ความหลากหลายของชนดสตวทะเลในแนวปะการงในภาคตะวนออก (จงหวดชลบร). หนวยวจยความหลากหลายทางชวภาพ สถาบนวทยาศาสตรทางทะเล มหาวทยาลย บรพา. อมพรรตน ประไพวงศ. 2551. การคดแยกแบคทเรยทสามารถผลตสารตานเชอราและเอนไซม เซลลเลสจากกลปงหาและปะการง. ภาควชาจลชววทยา คณะวทยาศาสตร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

Aceret, J.C., Coll, Y.U. and Paul, W.S. 1998. Antimicrobial activity of the diterpenes flexibilide and sinulariolide derived from Sinularia flexibilis Quoy and Gaimard 1833 (Coelenterata: Alcyonacea, Octocorallia). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C 120: 121–126. Alker, A.P., Smith, G.W. and Kim, K. 2001. Characterization of Aspergillus sydowii (Thom et Church), a fungal pathogen of Caribbean sea fan coral. Hydrobiology.

460: 105-111.

64 Al-Zereini, W. 2006. Natural products from marine bacteria. Ph.D thesis, Universität

Kaiserslautern Alemania. Anand, T., Abdul, W.B., Yogesh, S., Shouche, U.R., Jay, S. and Siddhartha, P.S., 2005. Antimicrobial activity of marine bacteria associated with sponges from the waters off the coast of South East India. Microbiological Research. 16: 252-262. Banin, E., Khare, S.K., Naider, F. and Rosenberg, E. 2001. Proline-rich peptide from the

coral pathogen Vibrio shiloi that inhibits photosynthesis of Zooxanthellae. Applied and Environmental Microbiology. 67: 1536–1541.

Bernen, V.S., Greenstein, M. and Maiese, W.M., 1997. Marine microorganisms as a

source of new natural products. Advances in Applied Microbiology, vol. 43. Academic Press, New York, pp. 57–90.

Bowman, J.P. 2007. Bioactive compound synthetic capacity and ecological significance of marine bacterial genus Pseudoalteromonas. Marine Drugs. 5: 220–41. Brosius, J., Dull, T.J., Sleeter, D.D. and Noller, H.F. 1981. Gene organization and primary structure of a ribosomal RNA operon from Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 148: 107-127.

Blunt, J.W., Copp, B.R.M., Munro, M.H.G., Northcote, P.T. and Prinsep, M.R. 2004. Marine natural products. Natural Product Reports. 21: 1-49. Burgess, J.G., Jordan, E.M., Bregu M., Mearns-Spragg, A. and Boyd, K.G. 1999.

Microbial antagonism: a neglected avenue of natural products research. Journal of Biotechnology. 70: 27–32.

Chelossi, E., Milanese, M., Milano, A., Pronzato, R. and Riccardi, G. 2004.

65 Characterisation and antimicrobial activity of epibiotic bacteria from Petrosia ficiformis (Porifera, Demospongiae). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 309: 21-33. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2002. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi: Approved standard. CLSI documents M38-A. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pa. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 2009. Methods for Dilution

Antimicrobial Susceptibility Teste for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-Eighth Edition. CLSI documents M07-A8. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, Pa. Colwell, R.R. 2002. Fulfilling the promise of biotechnology. Biotechnology Advances. 20: 215-228. Dakhama, A., Delanou, E.J. and Lavoie, M.C. 1993. Isolation and identification of antialgal substances produced by Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied

Phycology. 5: 297–306. Dai, R., Liu, H., Qu, J., Ru, J. and Hou, Y. 2008. Cyanobacteria and their toxins in

Guanting Reservoir of Beijing, China. Journal of Hazardous Materials. 153(1–2): 470–477.

Donia, M. and Hamann, M.T. 2003. Marine natural product and their potential applications as anti-infective agents. Lancet Oncology. 3: 338–348. Ely, R., Supriya, T. and Naik, C.G. 2004. Antimicrobial activity of marine organisms collected off the coast of South East India. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 309: 121– 127.

66 Fenical, W. and Jensen, P.R. 1993. Marine microorganisms: A new Biomedical

Resource. In: Attaway, D.H. and Zaborsky, O.R. (Eds.), Marine Biotechnology, Vol. l. Pharmaceutical and bioactive natural products, Plenum press, New York, pp. 500.

Friedrich, A.B., Merkert, H., Fendert, T., Hacker, J., Proksch, P. and Hentschel, U.

1999. Microbial diversity in the marine sponge Aplysina caverniucola (formerly Verongia cavernicola) analyzed by fluorescence in situ hybridization (FISH). Marine Biology. 134: 461–470.

Galeno, E. and Martínez, A. 2006. Antimicrobial activity of marine sponges from Urabá

Gulf, Columbain Caribbean region Activite natimicrobienne des éponges marines du Golfe d’Urá, region des Caraïbes Colombiennes. Journal of Medical Mycology. 17: 21-14.

Gandhimathi, M., Arunkumar, J., Selvin, T., Thangavelu, S., Sivaramakrishnan, G.S., Kiran, S. and Shanmughapriya, K.N. 2008. Antimicrobial potential of sponge associated marine actinomycetes. Journal of Medical Mycology. 18: 16-22. Gauthier, G., Gauthier, M. and Christen, R. 1995. Phylogenetic analysis of the genera

Alteromonas, Shewanella, and Moritella using genes coding for small-subunit rRNA sequence and division of the genus Alteromonas into two genera, Alteromonas (emended) and Pseudoalteromonas gen. nov., and proposal of twelve new species combination. International Journal of Systematic Bacteriology. 45: 755–761.

Gauthier, M. J. 1976. Alteromonas rubra sp. nov., a new marine antibiotic producing bacterium. International Journal of Systematic Bacteriology. 26: 459-466.

Gauthier, M. J. and Breittmayer, V. A. 1979. A new antibiotic-producing bacterium from seawater: Alteromonas aurentia sp. nov. International Journal of Systematic

67

Bacteriology. 29: 366–372.

Groombridge, B. (Ed.). 1992. Global Biodiversity: status of the Earth’s living resources. A report compiled by the World Conservation Monitoring Centre, Chapman and Hall.

Gómez, D., Espinosa, E., Bertazzo, M., Lucas, G.P., Solano, F. and Sanchez, A.A.

2008. The macromolecule with antimicrobial activity synthesized by Pseudoalteromonas luteoviolaceastrains is an L-amino acid oxidase. Applied Microbiology and Biotechnology. 79: 925–930.

Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R.I. and Rengefors, K. 2009. On the control of

HAB species using low biosurfactant concentrations. Harmful Algae. 8: 857-863. Hanefeld, U., Floss, H.G. and Laatsch, H. 1994. Biosynthesis of the marine antibiotic

pentabromopseudilin. 1. The benzene ring. Journal of Organic Chemistry. 59: 3604–3608.

Hayashida, K., Sano, M., Ohsawa, I., Shinmura, K., Tamaki, K., Kimura, K., Endo, J., Katayama, T., Kawamura, A., Kohsaka, S., Makino, S., Ohta, S., Ogawa, S. and Fukuda, K. 2008. Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 373(1): 30-35

Hoiczyk, E. and Hansel, A. 2000. Cyanobacterial cell walls: news from an unusual prokaryotic envelope. Journal of Bacteriology. 182(5): 1191-1199.

Holmstrom, C. and Kjelleberg, S. 1999. Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents. FEMS Microbiology Ecology. 30: 285–293.

Imamura, O., Fujita, K., Shimamoto, A., Tanabe, H., Takeda, S., Furuichi, Y. and

68

Matsumoto, T. 2001. Oncogene, 20, 1143–1151. Isnansetyo, A. and Kamei, Y. 2009. Anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus

(MRSA) activity of MC21-B, an antibacterial compound produced by the marine bacterium Pseudoalteromonas phenolica O-BC30T. International Journal of Antimicrobial Agents. 34: 131-135.

James, S., Holsmstro, C.M. and Kjelleberg, S. 1996. Purification and characterization of a novel antibacterial protein from the marine bacterium D2. Applied and Environmental Microbiology. 62: 2783–2788.

Jeong, S.Y., Ishida, K., Ito, Y., Okada, S. and Murakami, M. 2003. Bacillamide, a novel algicide from the marine bacterium, Bacillus sp. SY-1, against the harmful dinoflagellate, Cochlodinium polykrikoides. Tetrahedron Letters. 44: 8005–8007.

Jin, Q. and Dong, S. 2003. Comparative studies on the allelopathic effects of two

different strains of Ulva pertusa on Heterosigma akashiwo and Alexandrium tamarense. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 293: 41–55.

Kang, Y.K., Cho, S.Y., Kang, Y.H., Katano, T., Jin, E.S., Kong, D.S. and Han, M.S. 2008 Isolation, identification and characterization of algicidal bacteria against Stephanodiscus hantzschii and Peridinium bipes for the control of freshwater winter algal blooms. Journal of Applied Phycology. 20: 375–386.

Kelecom, A. 2002. Secondary metabolites from marine microorganisms. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 74(1): 151-170. Kim, Y.S., Lee, D.S., Jeong, S.Y., Lee, W.J. and Lee, M.S. 2009. Isolation and

characterization of a marine algicidal bacterium against the harmful raphidophyceae Chattonella marina. The Journal of Microbiology. 47(1): 9-18.

Kim, J.D., Kim, B. and Lee, C.G. 2007. Alga-lytic activity of Pseudomonas fluorescens

69

against the red tide causing marine alga Heterosigma akashiwo (Raphidophyceae). Biological Control. 41: 296–303.

Kobayashi, M. and Kitagawa, I. 1994. Bioactive substances isolated from marine sponge, a miniature conglomerate of various organisms. Pure and Applied Chemistry. 66(4): 819-826. Kuberski, S. and Gebicki, J. 1992. Evidence for a ketene intermediate in the photochemical transformation of matrix-isolated o-nitroben-zaldehyde. Journal of

Molecular Structure. 275: 105–110. Lee, S.O., Kato, J., Takiguchi, N., Kuroda, A., Ikeda, T., Mitsutani, A. and Ohtake, H.

2000. Involvement of an extracellular protease in algicidal activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. strain A28. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10): 4334–4339.

Lemos, M.L., Toranzo, A.E. and Barja, J.L. 1985. Antibiotic activity of epiphytic bacteria isolated from intertidal seaweeds. Microbial Ecology. 11(2): 149–63.

Li, Y.Z., He, L.M., Wu, J. and Jiang. Q. 2005. Bacterial community diversity associated with four marine sponges from the South China sea based on 16S rDNA-DGGE fingerprinting. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 329: 75-85.

Lie, J. and Zhou, J. 2002. A marine natural product database. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 42 (3): 742–748. Long, R,A. and Azam, F. 2001. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 67(11): 4975–4983. Longeon, A., Peduzzi, J., Barthelemy, M., Corre, S., Nicolas, J.L. and Guyot, M. 2004.

Purification and partial identification of novel antimicrobial protein from marine bacterium Pseudoalteromonas species strain X153. Marine Biotechnology. 6: 633–641.

70 Lorian, V. 1996. Antibiotics in Laboratory Medicine. 4th Ed. Williams & Wilkins.

Baltimore. pp. 28-32, 57-58. สบคนจาก สตา ปรดานนท. 2551. การคดเลอกและการจาแนกชนดของเชอราทสรางสารตานจลนทรยจากกลปงหา. ภาควชาจลชววทยาคณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร สงขลา.

Malakoff, D. 1997. Extinction on the high seas. Science. 277: 486-488. Mangano, S., Luigi, M., Consolazione, C., Matteo, B., Vivia, B., Renato, F. and Angelina, L.G. 2009. Antagonistic interactions between psychrotrophic cultivable bacteria isolated from Antarctic sponges: a preliminary analysis. Research in Microbiology. 160: 27-37. Mayali, X. and Azam, F. 2004. Algicidal bacteria in the sea and their impact on algal

blooms. Journal of Eukaryotic Microbiology. 51: 139 –144.

Menezes, C.B., Bonugli-Santos, R.C., Miqueletto, P.B., Passarini, M.R., Silva, C.H., Justo, M.R., Leal, R.R., Garboggini, F.F., Oliveira, V.M., Berlinck, R.G. and Sette, L.D. 2010. Microbial diversity associated with algae, ascidians

and sponges from the north coast of Sao Paulo state, Brazil. Microbiological Research. 165: 466-482

Mitsutani, A., Yamasaki, I., Kitaguchi, H., Kato, J., Ueno, S., and Ishida, Y. 2001.

Analysis of algicidal proteins of a diatom-lytic marine bacterium Pseudoalteromonas sp. strain A25 by two-dimensional electrophoresis. Phycologia. 40(3): 286–291.

McCarthy, S.A., Johnson, R.M., Kakimoto, D. and Sakata, T. 1985. Effects of various agents on the pigment (violacein) and antibiotic production of Alteromonas luteoviolacea. Bulletin of the Japanese Society for the Science of Fish. 51: 1115–1121.

71 Monks, N.R., Lerner, C., Henriques, A.T., Farias, F.M., Schapoval, E.E.S., Suyenaga, E.S., Rocha, A.B.D., Schwartsman, G. and Mother, B. 2002. Anticancer, antichemotactic and antimicrobial activity of marine sponges collected off the coast of Santa Catarina, southern Brazil. Journal of Experimental Marine Biology

and Ecology. 281: 1-12. Munro, L. and Munro, C. 2003. Climate impacts on sea fan populations. Reef Research.

08: 1-9. Mu, R.M., Fan, Z.Q., Pei, H.Y., Yuan, X.L., Liu, S.X. and Wang, X.R. 2007. Isolation

and algae-lysing characteristics of the algicidal bacterium B5. Journal of Environmental Sciences. 19: 1336-1340.

Nagasaki, K., Tomaru, Y., Katanozaka, N., Shirai, Y., Nishida, K., Itakura, S. and Yamaguchi, M. 2004. Isolation and characterization of a novel single stranded RNA virus infecting the bloom-forming diatom Rhizosolenia setigera. Applied and Environmental Microbiology. 70: 704-711.

Nakai, S., Inoue, Y., Hosomi, M. and Murakami, A. 1999. Growth inhibition of blue

green algae by allelopathic effects of macrophyte. Water Science and Technology. 39: 47–53.

Niu, X.M., Li, S.H., Na, Z., Mei, S.X., Zhao, Q.S. and Sun, H.D. 2003. Studies on Chemical constituents of Isodon eriocalyx var. laxiflora. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 34: 300–303.

Paul, S.B., Jinnque, R. and Haim, B.G. 1979. Bacterial suppression of Qhlorella by hydrozylamine production. Water Research. 13(1): 267–273.

Phongpaichit, S., Preedanan, S., Rungjindama, N., Sakayaroj, J., Benzies, C., Chuaypat, J. and Plathong, S. 2006. Aspergillosis of gorgonian seafan

72 Annella sp. after the tsunami at Mu Ko Similan Nationnal park, Andaman Sea, Thailand. Coral Reefs. 25(2): 296-296.

Pomponi, S.A. 1999. The bioprocess-technological potential of the sea. Journal of Biotechnology. 70: 5-13. Proksch, P., Edrada, R.A. and Ebel, R. 2002. Drugs from the sea-current status and microbiological implications. Applied Microbiology and Biotechnology. 59: 125– 134. Purushothaman A. and Jayalakshmi S. 2010. International Training Course on

Mangrove Biodiversity and Ecosystems. Centre of Advanced Studies in Marine Biology Annamalai University.

Rafai, S., Fassouane, A., EI-Abbouyi, A., Wardani, A., Kijjoa, A. and Sorst, R.V.

2004. Screening of antimicrobial activity of marine sponge extracts. Journal of Medical Mycology. 15: 33-38.

Rasmussen, T., Jensen, J., Anthoni, U., Christophersen, C. and Nielsen, P. 1993.

Structure and synthesis of bromoindoles from the marine sponge Pseudosuberites hyalinus. Journal of Natural Products. 56: 1553–1558.

Rohwer, F., Seguritan, V., Azam, F. and Knowlton, N. 2002. Diversity and distribution of

coral-associated bacteria. Marine Ecology Progress Series. 243: 1–10. Ross, C., Vazquez, L.S. and Paul, V. 2006. Toxin release in response to oxidative

stress and programmed cell death in the cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Aquatic Toxicology. 78: 66–73.

Roth, P.B., Twiner, M.J., Mikulski, C.M., Barnhorst, A.B. and Doucette, G.J. 2008.

Comparative analysis of two algicidal bacteria active against the red tide dinofiagellate Karenia brevis. Harmful Algae. 7: 682–691.

73 Shi, S.Y., Liu, Y.D. and Shen, Y.W. 2006. Lysis of Aphanizomenon xosaquae

(Cyanobacterium) by a bacterium Bacillus cereus. Biological Control. 39: 345–351.

Shi, X., Tang, X., Li, G., Wang, C. and Guan, H. 2009. Studies on chemical constituents

of gorgonian Muriceides collaris from the South China Sea. Chinese Journal of Marine Drugs. 28: 18–21.

Sponga, F., Cavaletti, L., Lazzarini, A., Borghi, A., Ciciliato, I., Losi, D. and Marinelli, F. 1999. Biodiversity and potentials of marine-derived microorganisms. Journal of Biotechnology. 70: 65-69. Su, J.Q., Yang, X.R., Zheng, T.L., Tian, Y., Jiao, N.Z., Cai, L.Z. and Hong, H.S. 2007.

Isolation and characterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinofiagellate Alexandrium tamarense. Harmful Algae. 6: 799–810.

Tadesses, M., Gulliiksen, B., storm, B.M., Styrvold, O.V. and Haug, T. 2008. Screening for anbtimicrobial and antifungal activities in marine benthic inverterbrates from northern Norway. Journal of Invertebrate Pathology. 128: 488-498. Thiel, V. and Imhoff, J.F. 2003. Phylogenetic identification of bacteria with antimicrobial

activities isolated from Mediterranean sponges. Biomolecular Engineering. 20: 421-423.

Thomas, T., Evans, F.F., Schleheck, D., Mai-Prochnow, A., Burke, C., Penesyan, A.,

Dalisay, S.D., Braid, S.S., Saunders, N., Johnson, J., Ferriera, S., Kjelleberg, S. and Egan, S. 2008. Analysis of the Pseudoalteromonas tunicata genome reveals properties of a surface-associated life style in the marine environment. Public Library of Science ONE. 3(9):e3252. doi:10.1371/ journal.pone. 0003252.

74 Touati, I., Chaieb, K., Bakhrouf, A. and Gaddour, K. 2007. Screening of antimicrobial activity of marine sponge extracts collected from Tunisian coast. Journal of Medical Mycology. 17: 183-187. Wang, X.L., Gong, L.Y., Liang, S.K., Han, X.R., Zhu, C.J. and Li, Y.B. 2005. Algicidal

activity of rhamnolipid biosurfactants produced by Pseudomonas aeruginosa. Harmful Algae. 4: 433–443.

Wang, H., Liu, Z.P., Mehta, S.K. and Zhao, G.M. 2008. Algicidal activity of

Achromobacter sp. (strain YZ) isolated from yellow sea: An assessment with bloom causing cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Journal of Biotechnology. 136(S1): S563.

Wilson, G.S., Rftos, D.A., Corrigan, S.L. and Nair, S.V. 2009. Diversity and antimicrobial

activities of surface-attached marine bacteria from Sydney Harbour, Australia. Microbiological Research. 165: 300—311.

Winton, J.E. 1988. The systematists’ perspective. In: Fautin DG (ed) Biomedical importance of marine organisms. California Academy of Science, San Francisco.

pp 1-6.

Woese, C.R. and Fox, G.E. 1977. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain. The primary kingdoms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74: 5088.

Wright, A.E. 1998. Isolation of marine natural products. In: Cannell, R.J.P. (Ed.), Methods in Biotechnology, vol. 4. Humana Press, New Jersey, USA. pp. 365-408. Yamamoto, Y., Kouchiwa, T. and Hodoki, Y. 1998. Distribution and identification of

actinomycetes lysing cyanobacteria in a eutrotrophic lake. Journal of Applied Phycology. 10(2): 391–397.

75 Yang, H., Hou, A., Jiang, B., Lin, Z. and Sun, H. 2000. Serratumin A, a novel compound

from Clerodendrum serratum. Acta Botanica Yunnanica. 22: 75–80.

Yoshikawa, K., Adachi, K., Nishijima, M., Takadera, T., Tamaki, S., Harada, K.,Mochida, K. and Sano, H. 2000. b-Cyanoalanine production by marine bacteria on cyanide free medium and its specific inhibitory activity toward cyanobacter. Applied and Environmental Microbiology. 66(2): 718–722.

Yu, M., Wang, J., Tang, K., Shi, X., Wang, S., Zhu, W.M. and Zhang, X.H. 2012.

Purification and characterization of antibacterial compounds of Pseudoalteromonas flavipulchra JG1. Physiology and Biochemistry. DOI 10.1099/mic.0.055970-0.

Zheng, L., Han, X., Chen, H., Lin, W. and Yan, X. 2005. Marine bacteria associated

with Marine microorganisms: the potential antimicrobial resources. Annals of Microbiology. 55(2): 119–24.

Zurawell, R.W., Chen, H., Burke, J.M. and Prepas, E.E. 2005. Hepatotoxic

cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health: Part B: Critical Reviews. 8: 1–37

http://www.dnp.go.th/npo/html/Research/Coralreef/Coralreef.html; January 7, 2009 http://www.lib.kmutt.ac.th/st4kid/nonFlash/services/getText.jsp?id=142; March 3, 2010 http://www.ncbi.nlm.nih.gov; March 1,2010 http://www.scitour.most.go.th; April 20,2012 http://www.smcrrc.go.th/kokra_spong.html; March 1, 2010 http://www.TalayThai.com; January 7, 2009 http://th.wikipedia.org/wiki; January 7, 2009

76

ภาคผนวก

77

ภาคผนวก ก.

การเตรยมอาหารเลยงเชอ, ยาและสารเคมและการทดสอบสณฐานวทยาเบองตนของแบคทเรย

อาหารเลยงเชอ Artificial sea water

Sodium chloride 24.60 g Potassium chloride 0.67 g Calcium chloride 1.36 g Magnesium chloride 4.66 g Magnesium sulfate 6.29 g Sodium bicarbonate 0.18 g ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน โดยเตมสารเคมตามลาดบ

นาเขา Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท Artificial sea water agar

Sodium chloride 24.60 g Potassium chloride 0.67 g Calcium chloride 1.36 g Magnesium chloride 4.66 g Magnesium sulfate 6.29 g Sodium bicarbonate 0.18 g Peptone 4.00 g Yeas extract 2.00 g Potassium hydrogen phosphate 1.00 g Agar 15.00 g ชงอาหาร ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา

Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท รออณหภมลดลง 45-50 oC เทใสจานเลยงเชอจานละประมาณ 15-20 ml. รอใหวนแขง

78 Artificial sea water broth

Sodium chloride 24.60 g Potassium chloride 0.67 g Calcium chloride 1.36 g Magnesium chloride 4.66 g Magnesium sulfate 6.29 g Sodium bicarbonate 0.18 g Peptone 4.00 g Yeas extract 2.00 g Potassium hydrogen phosphate 1.00 g Agar 15.00 g ชงอาหาร ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา

Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท

Marine agar Peptic digest of animal tissue 5.00 g Yeast extract 1.00 g Ferric citrate 0.10 g Magnesium chloride 8.80 g Sodium chloride 19.45 g Calcium chloride 1.80 g Sodium sulfate 3.24 g Potassium chloride 0.55 g Sodium bicarbonate 0.16 g Potassium bromide 0.08 g Stontium chloride 0.034 g Borric acid 0.022 g Sodium silicate 0.004 g Sodium fluorate 0.0024 g Ammonium nitrate 0.0016 g Disodium phosphate 0.008 g Agar 15.00 g

79 ชงอาหาร ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท รออณหภมลดลง 45-50 oC เทใสจานเลยงเชอจานละประมาณ 15-20 mL. รอใหวนแขง Mueller-Hinton agar (MHA), Difco Meat infusion 2.0 g Cesein hydrolysate 17.5 g Starch 1.5 g Agar 15.0 g

ชงอาหาร ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท รออณหภมลดลง 45-50 oC เทใสจานเลยงเชอจานละประมาณ 15-20 mL. รอใหวนแขง

Nutrient agar + 1%NaCl

Nutrient agar 23 g Sodium chloride 10 g ชงอาหาร ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา

Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท รออณหภมลดลง 45-50 oC เทใสจานเลยงเชอจานละประมาณ 15-20 mL. รอใหวนแขง

Potato dextrose agar (PDA), Difco

Potato infusion 200 g Bacto dextrose 20 g Agar 15 g ชงอาหาร ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา

Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท รออณหภมลดลง 45-50 oC เทใสจานเลยงเชอจานละประมาณ 15-20 mL. รอใหวนแขง

Sabouraud dextrose broth (SDB), Difco

Peptone 10 g D(+) glucose 40 g

80

ชงอาหาร ละลายสวนประกอบดวยนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท Ttyptic Soy Agar (TSA)

Pancreatic Digest of Casein 15 g Enzymatic Digest of Soybean Meal 15 g Sodium Chloride 5 g Distilled water 1000 mL pH 7.3±0.2 ชงอาหาร 40 g ละลายในนากลน 1000 mL. ใหเขากน ตมใหละลาย นาเขา Autoclave

ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท รออณหภมลดลง 45-50 oC เทใสจานเลยงเชอจานละประมาณ 15-20 mL. รอใหวนแขง

Soft agar Agar 0.75% (7.5 g)+ Luria-Bertani 20 ml ในนากลน 1000 mL แบงเปนหลอด หลอดละ 4 mL นาเขา Autoclave ท 121 oC ความดน 15 ปอนดตอตารางนว เปนเวลา 15 นาท เกบไวใน water bath อณหภม 45-50 oC

ยาและสารเคม การเตรยมยา

amphotericin B 10 mg/mL ชงยา amphotericin B 20 mg ดวยเครองชง 4 ตาแหนง หลงจากนนละลายยาโดยใช10% DMSO ปรมาตร 2 mL แลวแบงใสหลอด eppendorf เกบไวเปน stock solution ทอณหภม 4 oC chloramphenicol 10 mg/mL ชงยา chloramphenicol 20 mg ดวยเครองชง 4 ตาแหนง หลงจากนนละลายยาโดยใช 10% DMSO ปรมาตร 2 mL แลวแบงใสหลอด eppendorf เกบไวเปน stock solution ทอณหภม 4 oC

81 การเตรยมส resazurin เตรยม 1.8 % resazurin โดยใชนากลนในการละลายและกรองดวยกระดาษกรองขนาด 0.45 μm เกบไวในหลอด eppendorf และหอดวย aluminium foil เพอปองกนแสง เกบเปน stock solution ทอณหภม 4 oC เมอตองการใชนามาเจอจาง 1:10 ดวยนากลนปราศจากเชอ ส

- Crystal violet - Iodine - Safranin - Resazurin

ตวทาละลาย - Ethyl acetate - Hexane - Methanol - Methanol:chloroform (1:1)

Kit - API ZYM Kit (by Biomerieux)

สารเคมอนๆ

- 70% และ 95% (Ethyl alcohol) - 20% Glycerol

- 1%Tween-80 - Artificial Sea Water (ASW) - Sterile normal saline solution (0.85% NaCl) - Sodium sulfate anhydrous (Na2SO4) - 1% tetramethyl- p-phenylenediamine dihydrochloride - 3% H2O2

82 ทดสอบลกษณะพนฐานของแบคทเรย การยอมสแกรม หยดนากลน sterile ลงบนสไลด ประมาณ 1 หยด ใชลป (loop) เขยเชอแลวเกลยเชอ (smear) บนสไลดใหกระจายเปนแผนฟลมบางๆไมใหหนาแนนมากจนเกนไปและปลอยใหแหงในอากาศ (air dry) ตรงเชอ (fix) โดยการนาสไลดผานไฟอยางรวดเรว 2-3 ครง หยดส ครสตอลไวโอเลต (crystal violet) บรเวณทเกลยเชอไวใหทวม ทงไว 1 นาท แลวลางออก หยดสารละลายไอโอดน (iodine) บรเวณทเกลยเชอ ทงไว 1 นาท แลวลางออก หยดเอทธลแอลกอฮอล 95 % (ethyl alcohol) บรเวณทเกลยเชอ ทงไวประมาณ 5-10 วนาท แลวลางออกดวยนา หยดสซาฟรานน (safranin) บรเวณทเกลยเชอ ทงไวประมาณ 30 วนาท ลางดวยนากลน ซบใหแหงแลวนาไปตรวจดดวยกลองจลทรรศน

83

ภาคผนวก ข. แผนภมท 1

Overlay ทบดวย Soft agar+ เชอกอโรค

Artificial seawater agar plate P0915 cell suspension ทชม.ตางๆ เจาะหลมบนอาหาร นา cell suspension ปรมาตร 80 μL หยอดลงในหลมของ บมท 30 oC เปนเวลา แตละ plate ทเตรยมไว 1-3 วน วดขนาด Inhibition zone แผนภมท 1 การทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell suspension จากการ

บมทระยะเวลาตางๆ

84

แผนภมท 2

Overlay ทบดวย Soft agar+ เชอกอโรค

Artificial seawater agar plate P0915 cell suspension -หมนเหวยงท 10,000 rpm เจาะหลมบนอาหาร supernatant

-กรองผาน 0.45 ไมโครเมตร cell free supernatant นา cell free supernatant ปรมาตร 80 μL หยอดลงในหลมของ บมท 30 oC เปนเวลา แตละ plate ทเตรยมไว 1-3 วน วดขนาด Inhibition zone

แผนภมท 2 การทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell free supernatant

85

แผนภมท 3

Overlay ทบดวย Soft agar+ เชอกอโรค

Artificial seawater agar plate สารละลาย Freeze died P0915 cell free supernatant เจาะหลมบนอาหาร นาสารละลาย Freeze died P0915 cell free supernatant ปรมาตร 80 μL หยอดลงในหลมของ บมท 30 oC เปนเวลา แตละ plate ทเตรยมไว 1-3 วน วดขนาด Inhibition zone แผนภมท 3 การทดสอบประสทธภาพการยบยงจลนทรยของ P0915 cell free supernatant เขมขน

86

แผนภมท 4 ขนตอนการสกด

ขนตอนการสกดสารตานจลนทรย ดวย EtOAc

P0915 cell suspension 200 mL

สกดดวย EtOAc 100 mL (สกดครงท 1)

เขยา 10 ครง ครงละ 10 ครง จากนนรอจนชนของนา EtOAc

แยกออกจากกนอยางสมบรณ (สงเกตชน EtOAc จะใส) ระหวางทรอนน

ใหปดฝากรวยแยกดวย เพอปองกนการระเหยของ EtOAc

ชนของนา ชนของ EtOAc (เกบเปนสวนท 1 )

สกดดวย EtOAc อกครง 100 mL (โดยนา flask ทเกบชนนาเทใสในกรวยแยก)

ชนของนา ชนของ EtOAc (เกบเปนสวนท 2 )

สกดดวย EtOAc อกครง 100 mL

ชนของนา (เกบไวเปนชนนาสวนท 1)

ชนของ EtOAc (เกบเปนสวนท 3 )

เอา EtOAc ทง 3 flasks มารวมกนโดย เท

นากลนใสกรวยแยกเลกนอย แลวจงเท EtOAc จากสวนท 1 ลงไปในกรวยแยก ตามดวยสวนท 2 และ 3

87

แผนภมท 4 แสดงขนตอนการสกดสารตวอยางดวย Ethyl Acetate (EtOAc) ดดแปลงมาจากวธ

ของ Al-Zereini (2006)

ชนของนา (นาไปรวมกบชนนาสวนท 1)

ชนของ EtOAc เกบสวนนใส flask ท 1 หรอ บกเกอร 500 mL ปดดวยฟลอยด

เตม sodium sulfate anhydrous ลงไปเพอเอานาทปนอยออก โดยเตมทละนอยแลวเขยา

กรองเอา Na2SO4 ออก โดยใชกรวยกรอง ทมช นกรองเปนสาลทผานการลางดวย organic solvent แลว

EtOAc สวนท 4

* ในสวนของชนนานามาวดปรมาตรและนามาหาฤทธในการตานจลนทรยกอโรค

สารสกด

นาไประเหยเอา EtOAc ออกท 30 OC

88

แผนภมท 5

ตารางแสดงวธการหาคา MIC

สงทใส/หลม 1

Control อาหาร

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12 Control DMSO

สารสกด (μL) -

20

20

20

20

20

20

20

20

20

20

-

DMSO (μL) 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

MHB(μL) 180 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 180 อาหาร+เชอกอโรค

(μL) - 100

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

ความเขมขนสดทายของ

สารสกด (μg/mL)

-

1,024

512

256

128

64

32

16

8

4

2

-

ดดทง

89

แผนภมท 6

แถบสเปรยบเทยบปรมาณเอนไซม

**หมายเหต เนองจากปฏกรยาไวตอแสงทาใหผลลบมสไดในตอนแรกทถกแสง แตสจะหายไปในทสด สวนผลบวกจะใหสทถาวร เทยบปรมาณเอนไซมคราวๆ ไดจากแถบสมาตรฐานโดยมชวงความเขมสตงแต 0-5 เมอ 0 = ไมมส, 5 = สเขมทสด ทมา: http://www.didier-pol.net/2apizym.html

90 วธสกดสารดวย Methanol และ Methanol ผสม chloroform (ดดแปลงมาจากวธของ

Isnansetyo, A. และ Kamei, Y. (2003))

นาโคโลน P0915 ทมอาย 48 ชม. ปรบความเขมขนของเชอใหได 0.5 McFarland (1.5x108 CFU/mL) ใน NSS ดดเชอ 1 mL spread ลงบน ASW agar บมทอณหภม 30 oC เปนเวลา 48 ชม. ขดโคโลนเชอจาก plate ทเลยงไวใสกรวยแยก 5 g เตมตวทาละลายลงไป 200 mL ปดฝากรวย คลายกรวย เขยาแลวคลายกรวย จนกวาแรงดนในกรวยจะเหลอนอยลง หนบกรวยไวกบขาตง รอซก 10-15 นาท เทตวทาละลายทมเชออยใส ขวดเพอทาการหมนเหวยง 6,000 rpm ทอณหภม 4 oC เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนเทตวทาละลายเกบไว นาตะกอนทไดไปทาการสกดตอดวยตวทาละลายเดม ทาเชนน 3 ครง แลวนาตวทาละลายทง 3 สวนมารวมกน แลวทาการระเหยตวทาละลายออกดวยเครอง Evaporator

91

ภาคผนวก ค.

เอกสารอางอง เอกสารอางองการจดจาแนกจลนทรย

92

93

94

95

P0915

96 เอกสารอางองการทดสอบเอนไซมโดย API ZYM Kit (by Biomerieux)

97

98

99

ประวตผเขยน

ชอ สกล นางสาวอมพรรตน ประไพวงศ รหสประจาตวนกศกษา 5210220111 วฒการศกษา วฒ ชอสถาบน ปทสาเรจการศกษา วทยาศาสตรบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร 2551 (จลชววทยา) การตพมพเผยแพรผลงาน

Prapaiwong, A. and Umsakul, K. 2010. Screening of bacteria with antimicrobial activity from marine macro-organisms. Proceeding of 2nd Graduate Reserch Conference. Chiangmai University, November 26th 2010.