Introdução de tecnicas de diagnostico molecular
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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Profa. Dra. Ruscaia Dias Teixeira Prof. Dr. Paulo Queiroz
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Avaliação da estrutura dos componentes do DNA
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
É um campo emergente na área de análises clínicas laboratoriais.
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Detecta Agentes infecciosos (Ex: HPV)
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Detecta alterações genéticas do próprio organismo
Auxilia no diagnóstico e prognóstico dessas doenças
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Identifica pessoas (criminosos ou cadáveres)
• Existem sequências que se repetem no nosso genoma.
• O número de repetições pode variar de pessoa para pessoa
• Ao reconhecer sítios com pedaços de DNA com variados números de
cópias em série, podemos distinguir duas pessoas .
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Determina paternidade ou graus de parentesco.
(filhos possuem metade dos alelos maternos e metade dos alelos do pai)
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Auxilia na determinação da terapia a ser utilizada
Tratamento com GH
Mutação no gene SHOX Mutação no gene GHR
Insensibilidade ao GH
TRATAMENTO DE BAIXA ESTATURA
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DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Avalia a suscetibilidade a doença
Gene APP
Síntese de PPA em cérebros normais
Beta – amilóide – clivagens anormais da PPA
Placas amielóides
Associado ao maior risco de desenvolvimento de
Alzheimer
Alzheimer
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CONCEITOS IMPORTANTES
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GENE
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Splicing
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MUTAÇÃO GÊNICA
Gene com sua função alterada, levando ao aparecimento de doenças.
Adição ou subtração de bases
Substituição de bases
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ANEMIA FALCIFORME
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ALELOS
Forma alternativa do mesmo gene
Ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos
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cDNA
DNA sintetizado a partir de uma molécula de
mRNA, cujos íntrons já foram removidos,
numa reação catalisada pela enzima
transcriptase reversa.
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PRIMERS
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SÍTIOS DE RESTRIÇÃO
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REPETIÇÕES EM TANDEM • Sequências curtas
• Idênticas ou similares
• em tandem (agrupadas) ou dispersas pelo genoma.
• em tandem: DNAs satélite
• No repetições: variam em cada indivíduo, tornando-os únicos.
• Formam uma espécie de “impressão digital” do DNA.
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INDICAÇÃO DOS TESTES MOLECULARES
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DIAGNÓSTICO
1. Doenças infecciosas
2. Doenças genéticas
3. Câncer
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1. DOENÇAS INFECCIOSAS
• Detecção rápida de microrganismos de:
– Crescimento lento
• Mycobacterium kansaii – lesões pulmonares
– Não cultiváveis
• Treponema pallidum (bactéria agente da Sífilis)
• bacilo Mycobacterium leprae (micobactéria agente da lepra)
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1. DOENÇAS INFECCIOSAS
Determinação de resistência antimicrobiana
Streptococcus pneumoniae X penicilina
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1. DOENÇAS INFECCIOSAS
Monitoramento de doenças através da quantificação da
infecção.
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2. DOENÇAS INFECCIOSAS
TESTES MOLECULARES MAIS COMUNS:
• Avaliação de carga viral para:
– HIV
– Hepatite C
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2. GENÉTICA HUMANA
• Diagnóstico das doenças monogênicas:
– identificação do gene afetado
– mutação responsável pela doença
• Fibrose cística (gene CFTR – produção de muco e sucos gástricos)
• Síndrome de Marfan (gene Fibrilina – formação das fibras elásticas)
• Distrofia muscular de Duchene (gene distrofina – permeabilidade celular das
fibras musculares)
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2. GENÉTICA HUMANA
Identificação de portadores heterozigotos
Genótipos :
Hb AS (heterozigoto de Hb S) - traço falciforme
Hb AA (padrão normal)
Hb SS (homozigose de Hb S) – anemia falciforme
Hb SC (dupla heterozigose de Hb S e Hb C) – doença
falciforme
Doenças falciforme
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2. GENÉTICA HUMANA
Diagnóstico pré-natal
• líquido amniótico – descamações fetais
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2. GENÉTICA HUMANA
Predisposição a doenças genéticas
Três alelos do gene APOE: ε2, ε3 e ε4.
Indivíduos com uma cópia do alelo ε4: risco 2X a 3X de desenvolver Alzheimer tardia.
Homozigotos ε4ε4: risco 6X
Apolipoproteina E
VLDL
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2. GENÉTICA HUMANA
• TESTES MAIS COMUNS:
– Trombofilia hereditária (trombose)
– X Frágil (retardo mental)
– Microdeleção do Y (infertilidade masculina)
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3. CÂNCER
CARCINOMA MEDULAR DA TIREÓIDE
– Detecção de mutações no proto-
oncogene RET (regulam o ciclo celular)
em uma criança com histórico familiar
– Permite a tireoidectomia profilática
– Elimina o risco de câncer tireoidiano
que pode ser fatal.
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3. CÂNCER
POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR
– Mutações no gene APC determinam elevadíssimo risco de desenvolvimento de tumores colorretais malignos.
– Testes deste gene indicarão: • quais indivíduos da família necessitarão de monitoragem
• quais não terão de se preocupar
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3. CÂNCER
Filha
Mãe Câncer de mama
BRCA1 mutante
50% Gene mutante 50% Gene normal
10% de risco 85% de risco
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3. CÂNCER
LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
Proteína quimérica ABL Atividade tirosina quinase
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3. CÂNCER
LLC
• Identificação de pacientes com pior prognóstico.
– Portadores de translocação do braço longo do 13 - confere prognóstico
favorável e sobrevida de 11 anos
– Alterações envolvendo braço longo do 11 – confere sobrevida de 6,6
anos
– Portadores de deleção do braço curto do 17 - sobrevida de 2,5 anos
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VANTAGENS E DESVANTAGENS DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR
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VANTAGENS
1. BAIXA CONCENTRAÇÃO DO AGENTE
Identifica, caracteriza e quantifica
concentrações extremamente pequenas de
DNA/RNA de organismos patogênicos.
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VANTAGENS
2. VERSATILIDADE DE AMOSTRAS:
• Sangue periférico
• Fluidos corporais (Líquor, derrame pleural, líquido pericárdico)
• Materiais obtidos através de punção (Medula óssea)
• Tecidos frescos
• Tecidos embebidos em parafina.
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VANTAGENS
3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO
– MOMENTO DA COLETA
• INÍCIO DA INFECÇÃO
• FASE CRÔNICA
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VANTAGENS
3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO
– CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE
• Material conservado - Temperatura ambiente
• Sob refrigeração (gelo seco ou reciclável)
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VANTAGENS
4. TEMPO CURTO DE CRESCIMENTO DE
MICROORGANISMOS
– GENOTIPAGEM
– DIAGNÓSTICO RÁPIDO
– VERIFICAÇÃO DE RESISTÊNCIA A DROGAS
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VANTAGENS
5. Alta especificidade
6. Diagnóstico rápido, abreviando e otimizando o tratamento.
7. Diagnóstico qualificado com aprimoramento no manejo da
doença.
8. Diagnóstico confiável
9. Diagnóstico com melhor reproducibilidade de resultados.
![Page 43: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/43.jpg)
DESVANTAGENS
– CONTAMINAÇÃO DA AMOSTRA
– PRESENÇA DE INIBIDORES
– VIABILIDADE DOS AGENTES RNA: RNAse
– CUSTO
– PADRONIZAÇÃO
![Page 44: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/44.jpg)
TÉCNICAS MOLECULARES
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TÉCNICAS MOLELCULARES
1. Southern blot
2. Hibridização in situ
3. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
4. PCR
5. Fingerprinting
6. Eletroforese em campo pulsado (PFGE)
7. Microarranjos
8. Sequenciamento
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1. SOUTHERN BLOT
• Emprega sondas de DNA com homologia à sequência do DNA-alvo em estudo.
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HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
• Baseia-se no emparelhamento de 2
sequencias de DNA e uma RNA marcada
com Digoxigenina.
• Permite a visualização de uma sequência
nucleotídica especifica em células e
tecidos.
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2. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
![Page 49: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/49.jpg)
Passos da Hibridação in situ
1. Coleta do material biológico
2. Fixação e desidratação
3. Hibridação
4. Detecção da sonda por imunohistoquímica
5. Revelação com um substrato de fosfatase alcalina
![Page 50: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/50.jpg)
SONDA
![Page 51: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/51.jpg)
3. RFLP
• RFLP - Polimorfismo de comprimento de
fragmentos de restrição.
• Mutações podem alterar o DNA entre um
sítio de clivagem e outro.
• Isto gera diferentes formas (polimorfismos)
do mesmo trecho de DNA.
![Page 52: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/52.jpg)
3. RFLP
• Raia 1: pessoa normal - dois fragmentos (alelos) do mesmo tamanho.
• Raia 2: Portador - um alelo sadio e o outro com a mutação.
• Raia 3: possui os dois alelos mutados.
![Page 53: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/53.jpg)
4. PCR
• PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
• É uma técnica que amplifica uma sequência
específica de DNA,
• Objetivo: tornar a sequencia de DNA
abundante e disponível para diversas
técnicas de biologia molecular.
![Page 54: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/54.jpg)
PCR Ciclos
• Desnaturação: 94°- 95°C
• Anelamento: 55°- 65°C
• Extensão: 72°
• Número de ciclos: 25-40
![Page 55: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/55.jpg)
PCR - Desnaturação
A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.
![Page 56: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/56.jpg)
PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.
![Page 57: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/57.jpg)
PCR Primers
Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da sequência-alvo.
![Page 58: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/58.jpg)
PCR Taq DNA Polimerase
Amplifica o DNA a partir do anelamento com os
primers, na presença de Mg, a altas
temperaturas.
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PCR Ciclos
![Page 60: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/60.jpg)
PCR Requerimentos
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM • Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo: 1 µg
![Page 61: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/61.jpg)
![Page 62: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/62.jpg)
Variações da PCR
a. RT-PCR,
b. nested PCR,
c. multiplex PCR,
d. RAPD-PCR
e. PCR real time.
µmicra
![Page 63: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/63.jpg)
RT-PCR
• Utiliza uma enzima chamada transcriptase
reversa para converter uma amostra de
RNA em cDNA .
• Antes da etapa de amplificação por PCR,
• Permitindo estudo de vírus de RNA e
análises de expressão gênica.
![Page 64: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/64.jpg)
Nested-PCR
É uma técnica na qual são realizados diversos ciclos de
amplificação com um grupo de primers
O produto dessa amplificação é re-amplificado, utilizando-se
outro grupo de primers dirigidos para uma seqüência que se
encontra dentro da seqüência amplificada pelo primeiro grupo
de primers.
Atualmente, raros são os estudos realizados utilizando esta
técnica.
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MULTIPLEX PCR
• É uma reação de amplificação
• Detecta múltiplas sequências-alvo numa
mesma amostra.
• Vários pares de primers
• Desenvolvida para detecção simultânea de
vários patógenos.
![Page 66: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/66.jpg)
Multiplex-PCR
• Vantagens :
– Diminuição da intensidade e do período de
trabalho laboratorial
– Redução do número de reagentes
– Redução dos custos
![Page 67: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/67.jpg)
Multiplex-PCR
• Desvantagens desta técnica em relação ao PCR:
– Redução da sensibilidade de detecção
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RAPD-PCR
“Random Amplified Polymorphic DNA”
Primer único e pequeno (usualmente de 10 a
15 bases), aleatório
Amplificação do DNA genômico em condições
de baixa estringência
Não sendo necessário o conhecimento prévio
da região de ligação do primer.
![Page 69: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/69.jpg)
RAPD-PCR
• Quando submetidos à PCR, estes iniciadores arbitrários resultarão na amplificação de uma ou mais seqüências de DNA
• Gerando conjuntos de fragmentos que funcionam como marcadores genéticos
• O número e o tamanho destes fragmentos são à base de tipagem de um isolado bacteriano (DESTRO, 1995).
![Page 70: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/70.jpg)
RAPD-PCR
• A principal vantagem do RAPD sobre o PCR tradicional é a possibilidade de detectar polimorfismos do DNA sem a necessidade de conhecimento prévio da seqüência de nucleotídeos de um gene relevante ou do DNA alvo (MASLOW et al, 1993).
![Page 71: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/71.jpg)
PCR EM TEMPO REAL
• Permite que a amplificação e a detecção ocorram simultaneamente, num sistema fechado,
• Termociclador que possua sistema de monitoramento de emissão de fluorescência.
• Esta técnica é empregada para quantificação de amostras, como para testes de carga viral e monitoramento de doença residual mínima.
![Page 72: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/72.jpg)
PCR em Tempo Real
Possui sistema tubular para detectar o acúmulo de
produtos de PCR
Composto de um termociclador com câmeras detectoras
refrigeradas para detecção de luz fluorescente, em que a
ressonância emitida é diretamente proporcional à
intensidade de fluorescência e por sua vez ao número de
produtos amplificados.
![Page 73: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/73.jpg)
TÉCNICAS PARA DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES
• Existem várias técnicas que usam o PCR.
• Algumas destas técnicas baseiam-se nas diferenças de mobilidade eletroforética de fragmentos com sequências de DNA selvagens e mutantes.
![Page 74: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/74.jpg)
TÉCNICAS PARA DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES
• Existem ainda outras técnicas que se baseiam na
clivagem de bases não pareadas em
heteroduplexes.
• Técnicas que utilizam a detecção de alterações na
proteína transcrita por um determinado
fragmento de DNA.
![Page 75: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/75.jpg)
APLICAÇÕES DO PCR
1. Rápida amplificação de um gene específico ou de um
exon de um determinado gene como a primeira etapa
para rastreamento de mutações não caracterizadas:
– PCR para amplificações de exons específicos do DNA genômico
– RT-PCR para análise de transcritos
![Page 76: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/76.jpg)
APLICAÇÕES DO PCR
2. Rápida genotipagem de regiões dos genes
que são polimórficas:
I. Digestão da região polimórfica com enzimas de restrição sítio
específica.
II. Flanqueamento de primers ao sítio de restrição polimórfico,
III. Amplificação da região do polimorfismo
![Page 77: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/77.jpg)
APLICAÇÕES DO PCR
3. Diagnóstico de mutações conhecidas através
da discriminação alélica pelo tamanho
• Pequenas deleções ou inserções em alelos podem ser
detectadas por PCR.
• Exemplo: deleções no alelo mais comum que causa a fibrose
cística (DF508)
![Page 78: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/78.jpg)
APLICAÇÕES DO PCR
4. Diagnóstico de mutações conhecidas através
da susceptibilidade a enzima de restrição:
• Mutações que mudam um sítio de restrição podem ser
detectadas, pela digestão do produto de PCR com a enzima
de restrição específica
![Page 79: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/79.jpg)
5. Fingerprinting
• O “fingerprinting” é um método para caracterização e discriminação de microrganismos de origem alimentar (JAY,
2005).
• Cada vez mais utilizado para fazer inferências sobre níveis de variação genética dentro e entre populações naturais (LYNCH, 1990);
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6. PFGE
• Eletroforese em Gel de Campo Pulsado
• Uma das técnicas mais utilizadas para análise epidemiológica da maioria das bactérias patogênicas.
• É um método derivado da eletroforese convencional do DNA, em gel de agarose, sendo a principal diferença a mudança repetida da orientação do campo elétrico.
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PFGE
Imagem: http://pcrfilme.vilabol.uol.com.br/
![Page 82: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/82.jpg)
PFGE
• Esta mudança provoca o re-arranjo da estrutura conformacional da molécula, permitindo a sua migração no gel.
• A técnica de PFGE revelou-se capaz de diferenciar cepas da bactéria obtidas a partir de diferentes municípios.
![Page 83: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/83.jpg)
7. MICROARRANJOS
• São lâminas com uma alta densidade de
seqüências de DNA
• Permitem estudos de expressão gênica,
• Analisa uma grande quantidade de genes
ao mesmo tempo, utilizando sondas de
cDNA.
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![Page 85: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/85.jpg)
8. SEQUENCIAMENTO
• Detecta mutações em genes conhecidos.
• Permite analisar cada uma das bases de determinada sequência de DNA.
![Page 86: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/86.jpg)
8. SEQUENCIAMENTO
Uso de algumas técnicas que buscam alterações
Após a identificação da região gênica que apresenta alguma alteração
Tal região é submetida ao sequenciamento para confirmação e determinação da mutação.
![Page 87: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/87.jpg)
CONSIDERAÇÕES FINAIS
• Possibilitou uma grande evolução nas análises de rotina de laboratórios clínicos e industriais.
• Organismos de cultivo difícil ou impossível tornaram-se passíveis de serem analisados.
• Exames citogenéticos convencionais estão sendo substituídos pela ferramenta molecular.
• Determinação de predisposição para certos tipos de câncer e doenças cardiovasculares têm se tornado realidade.
• Revolucionou a ciência e a prática da medicina e áreas correlatas
![Page 88: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/88.jpg)
DESAFIOS
• Tornar as variadas técnicas de biologia
molecular, uma alternativa viável à rotina
laboratorial, principalmente em relação ao
custo e recursos humanos.
![Page 89: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/89.jpg)
HISTÓRICO DA BIOLOGIA MOLECULAR
![Page 90: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/90.jpg)
1953 Watson e Crick propuseram a
estrutura de dupla-hélice do DNA
1957 Arthur Kornberg isolou a
DNA polimerase 1958 Matthew Meselson &
Franklin Stahl: Replicação semi-conservativa do DNA
![Page 91: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/91.jpg)
1971 David Baltimore & Howard
Temin demonstram a presença da RT em vírus
capaz de sintetizar DNAfd a partir de RNAfs
1975 Fred Sanger: Seqüenciamento de DNA baseado em terminação de cadeia por
incorporação de ddNTPs
1985 Kary Mullis: Permite obter (in vitro)
grandes quantidades de uma sequência
específica de DNA
![Page 92: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/92.jpg)
1989 Descoberta da Taq
polimerase termoestável no
lago do “Yellowstone National Park”
1995 Haemophilus influenzae:
primeiro genoma seqüenciado 1998
C. elegans: Primeiro genoma completo
de um animal
2000 Rascunho do Genoma Humano
Imagens: Paola Cardarelli - XVI ENAAL
![Page 93: Introdução de tecnicas de diagnostico molecular](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022051212/556bbbbed8b42ac32e8b5004/html5/thumbnails/93.jpg)
OBRIGADO!