Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1
-
Upload
hugo-sousa -
Category
Documents
-
view
3.277 -
download
3
Transcript of Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1
![Page 1: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/1.jpg)
VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte I
![Page 2: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/2.jpg)
Testes imunológicos
Baseiam-se em reacções antigénio-anticorpo:
Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante
a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar
especificamente a um epítopo de um antigénio.
Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de
induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar
através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 2
![Page 3: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/3.jpg)
Anticorpo
Cadeias de glicoproteícas :
Cadeias leves
Cadeias pesadas
Região constante – local de activaçãode outros elementos dos S. Imune;
Região variável – local de ligação aoantigénio
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 3
![Page 4: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/4.jpg)
Anticorpo
Tipos de anticorpos
PoliclonaisObtidos a partir de diferentesclones de células;
MonoclonaisObtidos a partir de um únicoclone de plasmócitos
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 4
![Page 5: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/5.jpg)
Classes de anticorpos no Homem
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 5
Imunoglobulinas Características
IgG Principal Ig séricaEnvolvida na activação do complemento e na opsonisação
IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados
IgA Presente no soro, secreções e mucosasTem funções de opsonização.
IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando comoreceptor de antigénios.Funções pouco definidas.
IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos eeosinófilos.Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.
![Page 6: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/6.jpg)
Antigénio
Epítopo
Região do antigénio que reage com o anticorpo
Possibilidade de reacções cruzadas
Pequenas alterações na estrutura do antigénio,
entre outras factores, podem afectar
profundamente a ligação com o anticorpo
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 6
![Page 7: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/7.jpg)
Aplicabilidade
Papel importante:
Tipo de amostra varia consoante o
que estamos a pesquisar
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 7
Diagnóstico
Monitorização
Tratamento
![Page 8: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/8.jpg)
Técnicas de Imunologia
Reacções Imunoenzimáticas
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)
ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)
Imunoflurescência
Imunocromatografia
ImunoHisto/Citoquímica
Análise Proteínas: Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 8
![Page 9: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/9.jpg)
Reacções Imunoenzimáticas
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 9
![Page 10: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/10.jpg)
ELISA
Permite determinar a concentraçãodo analito
Calcular curva de calibração –interpolar a concentração damolécula a quantificar
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 10
Baseia-se numa reacção imunoenzimatica com detecção final emespectrofotometria
![Page 11: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/11.jpg)
Tipos de ELISA
Sandwich
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 11
1. Poços revestidos com anticorpo especifico
2. Formação de complexos
3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
![Page 12: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/12.jpg)
Tipos de ELISA
Indirecto
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 12
1. Poços revestidos com antigénio especifico
2. Formação de complexos
3. Ac conjugado com enzima
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
![Page 13: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/13.jpg)
Tipos de ELISA
Competitivo
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 13
1. Ac especificos incubam com a amostra
2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag
3. Ac secundário
4. Adição do substrato
5. Medição por espectofotometria
Quantomaior aconcentração de analitomenor aabsorvância
![Page 14: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/14.jpg)
ELISA
Método automatizado
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 14
![Page 15: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/15.jpg)
ELFA
Permite fazer um análise quantitativa
Curva de calibração
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 15
Reacção imunoenzimatica com detecção final em fluorescência.
![Page 16: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/16.jpg)
ELFA
Teste, geralmente, automatizado onde é
necessário:
Um cone sensibilizado com Ag,
serve, tanto de fase sólida como
sistema de pipetagem
Uma barrete que contem os
reagentes necessários para a
realização da técnica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 16
![Page 17: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/17.jpg)
Imunoflurescência
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 17
![Page 18: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/18.jpg)
Imunoflurescência
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 18
Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos
O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência
A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência
Fluorocromos mais usados
Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC)
Rodamina
![Page 19: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/19.jpg)
Imunoflurescência
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 19
Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi-
quantitativa
Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.
Tipos de Imunoflourecênca
Directa
Indirecta
Anti-complemento
![Page 20: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/20.jpg)
Imunoflurescência Indirecta
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 20
Etapas
▫ Fixação (quando queremos
pesquisar Ac as laminas vêm
revestidas com o respectivo Ag);
▫ Ac primário
▫ Ac Secundário (marcado com um
fluorocromo);
▫ Reagente de contraste
![Page 21: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/21.jpg)
Imunofluorescência anti-complemento
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 21
Etapas
▫ Inactivação do complemento endógeno
▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo
▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado
▫ Ac conjugado que se liga ao complemento
▫ Detecção por microscopia de fluorescência
![Page 22: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/22.jpg)
Imunofluorescência
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 22
Resultados
Permite localizar o analito
EX: Membrana celular
Análise com o corante de contraste
![Page 23: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/23.jpg)
Imunofluorescência
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 23
Resultados
Pesquisa de anticorpos: resultado positivo
(fluorescência verde)
Pesquisa de anticorpos: resultado negativo
![Page 24: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/24.jpg)
Imunocromatografia
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 24
![Page 25: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/25.jpg)
Imunocromatografia
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 25
Teste qualitativo
Detecção antigénios virais ou anticorpos
Rápido e simples
Fase móvel: amostra diluida
Fase sólida: membrana revestida
![Page 26: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/26.jpg)
Imunocromatografia
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 26
Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C
Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex
Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveisdevido às partículas de látex
![Page 27: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/27.jpg)
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 27
![Page 28: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/28.jpg)
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 28
Imunologia e citologia ou histologia
Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais,proteínas)
Diferenças de expressão de proteínas
Localização celular do antigénio
Método qualitativo (maior parte dos casos)
Quantificação relativa
![Page 29: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/29.jpg)
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 29
Método directo
Ac primário marcado enzimaticamente reage directamentecom o antigénio
Método Indirecto
Ac primário que se liga ao antigénio
Ac secundário marcado enzimaticamente
Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)
![Page 30: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/30.jpg)
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 30
Principio do método
PO+ H2O2+ Dador de electrões PO+ H2O2+ precipitado
![Page 31: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/31.jpg)
ImunoHisto/Citoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 31
Passos importantes
Fixação (sol. Alcoólica)
Permeabilizar (detergente)
Ac primário
Ac secundário conjugado
Substrato com agente cromogénio
Corante de contraste
![Page 32: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/32.jpg)
Imunohistoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 32
Imunohistoquímica
![Page 33: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/33.jpg)
Imunocitoquímica
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 33
Imunocitoquímica
![Page 34: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/34.jpg)
Análise Proteínas
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 34
![Page 35: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/35.jpg)
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 35
SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
![Page 36: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/36.jpg)
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 36
Blotting
![Page 37: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/37.jpg)
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 37
Detecção
1. Bloqueio da
membrana
2. Ac primário
3. Ac secundário
conjugado
4. Detecção
![Page 38: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/38.jpg)
Western Blot
Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 38
Aplicação
![Page 39: Aula02 tecnicas diagnostico virologia parte 1](https://reader033.fdocument.pub/reader033/viewer/2022060201/5599c1df1a28abf3168b45e4/html5/thumbnails/39.jpg)
VirologiaAno Lectivo 2010/11
Técnicas DiagnósticoVirologia – Parte I