Interacción Primaria

Comisión 4 – Año 2013

Enzimoinmunoanálisis (EIA)

Radioinmunoensayo (RIA)

Inmunofluorescencia (IFI, IFD)

Interacciónprimaria

Interacción secundaria

Características Interacción simple Ag-Ac

NO VISUALIZABLE

Formación de complejos macromoleculares

VISIBLES MACROSCOPICAMENTE

Factores que la condicionan

POCA INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO

DEPENDEN DE TEMP Y FZA IONICA (cc de sales)

Tipo de Ag y Ac involucrado

Ag y Ac monovalentes o polivalentes

NO IMP VALENCIA

Ac MINIMO bivalente Ag polivalente/particulado

VALENCIA > o = 2

Sensibilidad MAYOR MENOR

Interacción primaria

Es la unión entre un epítope y un paratope.

Ac + Hp AcHpk1

k-1

Es una reacción de equilibrio Cuanto más ac agregue a mi muestra mas complejo se formará y más

podré detectar

Esta interacción está principalmente influenciada por la temperaturaA mayor T°, menor tpo preciso

La interacción entre el epitope y el paratope obedece a la ley de acción

de masas.

Parámetros de la Interacción PrimariaAfinidad- Avidez

Afinidad: es la fuerza de unión o reacción entre un solo sitio de combinación del anticuerpo (paratope) con un solo determinante antigénico (epitope). Es la sumatoria de fuerzas de atracción y repulsión entre ellos.

Avidez: es la fuerza total de unión de antígenos multivalentes con anticuerpos multivalentes.

EIA Componentes de los EIA (Enzimoinmunoensayos)

• Componente Incógnita (puede ser Ac o Ag)• Componente que se una al incógnita (puede ser Ac o Ag)

• Componente que revele dicha interacción (en los EIA se une una Enzima, se le agrega el

sustrato y da un producto CROMOGENICO)

• Se mide el color por Densidad Óptica

Interacción

Primaria

Clasificación de los EIA

HomogéneosEn fase líquida

Heterogéneosempleando un soporte en

fase sólida para inmovilizar uno de los inmunoreactantes.

Ej: ELISAELISA

De amplificación de actividadNO COMPETITIVOS

De modulación de actividadCOMPETITIVOS

EIA (Enzimoinmunoensayo)

• Se basan en:- La elevada especificidad de los Ac- La alta actividad de algunas enzimas lo que

permite la señal generada por la muestra.

- Dos etapas grales:- La rx de un inmunoreactante con un ag o un ac- La detección de ese inmunoreactante mediante

la utilización de un conjugado enzimático.

EIA homogéneo

Hp Hp

Do

título

HpHp

Do

Cc de Ag.

1er Caso

2do Caso

EIA homogéneo

• En el 1er caso, el Hp está conjugado con la enzima. El OBJETIVO es determinar el titulo de un Ac específico. La presencia del mismo en la muestra al unirse al Hp, inhibirá la actividad de la enzima. Por tanto, disminuirá la DO cuanto mayor sea el título.

• Como obtengo el título?

EIA homogéneoNo es necesario separar los complejos Ag-Ac del antígeno

libre.

• Importante! El Ac debe cambiar la actividad de la enzima. • Como el ag marcado y la muestra se incuban juntos, esta última no puede contener isoenzimas, sustratos o inhibidores enzimáticos.• Los Hp deben ser de tamaño pequeño, asi la interacción enzima-Ac no son afectadas por el ag.

Usos: Ej - cuantificación de T4

EIA homogéneo

Hp

HpMuestra incógnita

HpHp Hp

HpHp

Hp

Variante competitiva

Do

Cc. de Ag

Por que no usar la variante anterior para cuantificar hapteno?

Porque no tengo Ac específico marcado con enzima.

Clasificación de los EIA

HomogéneosEn fase líquida

Heterogéneosempleando un soporte en

fase sólida para inmovilizar uno de los inmunoreactantes.

Ej: ELISAELISA

De amplificación de actividadNO COMPETITIVOS

De modulación de actividadCOMPETITIVOS

Competitivo…

S

P

Ag sensibilizante

Ac conjugado

Suero problema Do

título

En el 1er caso, el OBJETIVO es determinar el título de un Ac específico.

Para esto se sensibiliza una placa y se incuba la muestra incógnita con un Ac específico marcado.

Cuanto mayor sea la señal, menos Ac en la muestra.

Competitivo…

Ac captura

Ag a determinar

Ag conjugadoS

P

En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag.

Entonces, se sensibiliza la placa con un Ac de captura y compite el ag marcado con enzima y el ag sin marcar de mi muestra incógnita.

Cuanto mayor sea la señal, menor cantidad de dicho ag en la muestra.

Do

Cc ag

No competitivo…

Do

título

S

P

Ac conjugado

Suero problema

Ag sensibilizante

IndirectoIndirecto

En el 1er caso, el OBJETIVO es determinarr un Ac específico en una suero problema.

Entonces sensibilizamos una placa con ag específico, incubo con la muestra, lavo, agrego el conjugado.

No competitivo…

S

PAc conjugado

Ac captura

Do

cc del Ag

Ag a determinar

SandwichSandwich

En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag.

Asi sensibilizo la placa con un Ac específico, incubo con la muestra, lavo, agrego el conjugado. Mejor si ambos Ac son de la misma especie para evitar reactividad cruzada.Addemás tener en cuenta que sean específicos para distinto epitope, sino no se va a unir el congujado porque va a estar unido al sensibilizante.

Como obtengo la curva?? Con diluciones seriadas de un ag de concentración conocida y los demás componentes del sistema constantes

Do

Cc del Ag

Do

Cc ag

COMPETITIVO NO

COMPETITIVO

Entonces…ELISA no competitivo ELISA competitivo

InmovilizaciónInmovilización del inmunoreactante (Ag o Ac) a la fase sólida

Bloqueo

IncubaciónIncubación con el patrón y/o la muestra

IncubaciónIncubación con el ag marcado así como con el patrón y/o la muestra

Incubación con el Ac de detección

ReveladoRevelado (reacción colorimétrica)

Puesta a punto de la técnica…

Sensibilización de la placa

Materiales más usados (PVC y poliestireno).

Que ag? ADN, proteínas y oligopéptidos, células enteras

Bloqueo

Lavados

• Se eliminan componentes libres o unidos de manera no específica al inmunoreactante inmovilizado en la placa.

• Se utilizan soluciones salinas isotónicas (misma cc de solutos afuera que adentro de las celulas, ej.PBS) suplementadas con detergente (para impedir interacciones hidrofobicas inespecificas , ej.Tween 20).

Titulación del conjugado

Dil conj

suero

1/400 1/800 1/1600 1/3200

Positivo fuerte ++++ +++ ++ ++

Positivo débil +++ ++ + +/-

negativo ++ + - -

Cc óptima de conjugado

ReveladoSe pueden emplear:

• Peroxidasa de rábano (Oxidación)

2 DH + H2O2 2H2O + 2D- COLOR!!

Donante de H: OPD (490nm)

• Fosfatasa alcalina (Desforforilacion)

sustrato: p-nitro fenil fosfato p-nitro fenol (405nm) COLOR!!

Controles

Control Negativo

Suero no inmune

Control Positivo

Suero especifico

Control de inespecífico: Blanco:

OPD++

Aplicaciones • Cualitativas:

– Determinar la presencia de Ac específicos– Determinar la presencia de ag en una

muestra

• Semicuantitativas:– Titulación de Ac específicos

• Cuantitativas:– Determinar la cc de un antígeno en una

muestra

Procesamiento de datos y

expresión de resultados en ensayos inmunoenzimáticos

SENSIBILIDADEs la medida de la habilidad del ensayo de mostrar como positiva a una muestra que

realmente lo es aun cuando esta presente bajas cantidades del componente incógnita.

La capacidad de no producir falsos negativos.

ESPECIFICIDADEs la medida de la habilidad del ensayo de mostrar como negativa a una muestra que

realmente es negativa.

La capacidad de no producir falsos positivos.

Cálculo del valor de corte (cut off)Se construyen curvas para un gran número de sueros negativos y se grafica frecuencia (f) vs DO.

Se calcula

la media y

el DS:

f

DO

xMtras

(-)Mtras

(+)

2SD3SD

Cut offCut off

X+3DS X+3DS si la DO es menor a este valor el suero es negativo con un 99 % de certeza (van a haber falsos negativos) alta especificidad

X+2DS X+2DS cut off si la DO es menor a este valor el suero es negativo con un 95 % de certeza (van a haber falsos

positivos) alta sensibilidad

Ensayo cualitativo (detección de Ac)

Se pone una única dilución del suero y se mide la absorbancia, se informa como positivo si cae por encima del cut off.

Ejemplo:

Abs 1: 0,208

Abs 2: 1,034 Cut off: 1,090

Abs 3: 2,023

Ensayo semicuantitativo

Se hacen diluciones seriadas del suero a valorar y se grafica DO vs dil suero. El título es la inversa de la última dilución que desarrolla una DO mayor al cut off

Frec

DOx

Mtras(-)

Mtras(+)

DO

Dil suero Cutoff

Titulo

Ensayo cuantitativoSe determina la cc de ag por comparación con una curva patrón.

cc antígeno patrón

ccmuestra

DO

DO incógnita