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Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de

Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”

Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados

CONTENIDO

Seleccione con una X la modalidad en que va a participar:

_X __ Modalidad 1.

_____ Modalidad 2.

1. Información general

Título del proyecto1: Dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la

congelabilidad del semen porcino

Nombre de la convocatoria en la cual presenta el proyecto: “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”

Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan)

Nombre del Grupo: Biología de la producción pecuaria

Facultad/Instituto/Departamento: Departamento de Producción Agropecuaria

Clasificación

__A___

Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica2: Investigación Aplicable

3:

Aplicación en curso4: Creación: Innovación Tecnológica

5:

Tipo de innovación:

Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso

Innovación organizacional

Área Estrátegica del Plan de Desarrollo

Biotecnología

Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social

Salud

Ambiental

No corresponde a ninguna de las

áreas estratégicas

INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN

(indicar el investigador responsable con un asterisco) NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA

UNIVERSIDAD DE CALDAS

DEPARTAMENTO o

PROGRAMA

ÁREA DE CONOCIMIENTO

(según COLCIENCIAS)

*Francisco Javier Henao Uribe/profesor

titular

Departamento de Producción

Agropecuaria

Agronomía, veterinaria y

afines

1 Se recomienda que no exceda 15 palabras

2 Son estudios que tienen como propósito el trabajo experimental o teórico realizado principalmente con el objeto de

generar nuevos conocimientos sobre los fundamentos de fenómenos y hechos observables, sin prever ninguna

aplicación específica inmediata 3 Son proyectos de investigación original realizada para la adquisición de nuevos conocimientos, contextualizada

dentro de fines con potencialidad de ofrecer alguna contribución práctica 4 Son proyectos de investigación original, dirigida principalmente y de manera inminente hacia un fin u objetivo

práctico, determinado y específico 5 Se refiere a aquellos proyectos que tienen como objetivo el desarrollo de nuevos productos o procesos, así como las

modificaciones tecnológicas importantes en productos o procesos

x

x

x




ESTUDIANTES DE POSTGRADO PROGRAMA ÁREA DE CONOCIMIENTO

(según COLCIENCIAS)

Julian Alonso Valencia Giraldo

Doctorado en Ciencias

Agrarias

Agronomía, veterinaria y

afines

Lugar de Ejecución del Proyecto: (Municipio/Departamento)

Ciudad: Manizales Departamento: Caldas

Presupuesto

Valor total del proyecto:

$ 103.457.480

Fuentes de financiación: Universidad de Caldas

Valor solicitado en efectivo en esta convocatoria:

$ 27.880.000

Duración total (meses):24

2. Resumen ejecutivo

El uso de semen congelado-descongelado de verraco en los programas de

inseminación en la especie porcina es mínimo, debido a la reducción de la fertilidad

de las granjas. Actualmente existen estudios prometedores en los cuales se ha

mejorado la calidad seminal después de la criopreservación, con resultados

aceptables pero poco consistentes, debido principalmente, a la alta diferencia en la

congelabilidad entre machos, lo que genera el desaprovechamiento de la mayoría

del material seminal con alta calidad genética y baja congelabilidad. En esta materia

hay diferentes enfoques como la evaluación del efecto del plasma seminal (PS) y de

proteínas contenidas en este sobre la congelabilidad de los verracos, para

esclarecer el efecto biológico de estas sobre los espermatozoides en la congelación

y para su uso como predictores moleculares de congelabilidad.

El semen obtenido de 8 verracos será congelado en tres momentos diferentes con

intervalo de 4 a 8 días entre congelación para identificar los verracos con alta y baja

congelabilidad según la prueba de espermatozoides funcionalmente competentes

(EFC).

En una segunda fase, será colectada la fracción rica de los ocho verracos, e




inmediatamente terminada la colección se tomarán tres alícuotas de 5 ml, la primera

será centrifugada a 800 g x 10 minutos para separar el PS de los espermatozoides

que serán utilizados para medición de proteínas y colesterol; y las otras dos serán

diluidas 1:1,5 con Androhep plus® y enfriadas hasta 17°C por tres horas. Luego de

este enfriamiento se realizarán dos procedimientos distintos de separación de los

espermatozoides, una alícuota será centrifugará a 800 g por 20 minutos y la otra se

dejará sedimentar; los espermatozoides obtenidos de cada procedimiento serán

congelados y se les evaluará post-congelación la población de EFC, la integridad

estructural de la membrana (IEM), la integridad funcional de la membrana (IFM), la

integridad acrosómica (IAC), la morfología y movilidad espermáticas, la

fragmentación del ADN y la fecundación in vitro según los protocolos del Laboratorio

de Biología de la Reproducción de la Universidad de Caldas.

A su vez serán identificadas y cuantificadas, las proteínas Nieman-pick disease type

C2 (NPC2) y AQN-1 en PS por Western Blot y ELISA indirecta, y unidas al

espermatozoide por inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos ligados a FITC.

También se medirá la proporción de colesterol en la membrana espermática y

colesterol libre en el PS por cromatografía de gases-masas. Las mediciones de las

proteínas y del colesterol serán realizadas inmediatamente terminada la colección, y

después del enfriamiento hasta 17°C en el semen centrifugado y en el semen

sedimentado.

Con esta metodología se pretende determinar la dinámica de las proteínas del

plasma seminal NPC2 y AQN-1 y el efecto sobre la congelabilidad del semen

porcino.




3. Conformación y trayectoria del equipo de investigadores

El grupo de Biología de la producción pecuaria COL0029577, categoría A, se integró en

enero de 2002, es liderado por el Dr. Francisco Javier Henao Uribe, cuenta con 13

integrantes, entre ellos, tres estudiantes de maestría y cuatro de doctorado. El grupo se

articula con otros afines para dar soporte científico a los Programas de Maestría en

Sistemas de producción Agropecuaria y de Doctorado en Ciencias Agrarias. Las líneas

de investigación del grupo son: Mejoramiento Genético y Biología de Reproducción,

Nutrición y Alimentación, Medicina Preventiva y Gestión Ambiental.

La presente investigación pertenece a la línea de Mejoramiento Genético y Biología de

la Reproducción, liderada por Francisco Javier Henao U, PhD; en esta línea, como

producto de los resultados de las investigaciones realizadas, se han publicado 14

artículos científicos en revistas nacionales y extranjeras de diferentes categorías, y un

libro. De los artículos en mención guardan relación con el proyecto los siguientes:

Marín R., C. Escobar, H. Mesa, G. Gómez, F. J. Henao. Evaluación de

semen diluido de verraco mediante la prueba de endósmosis. Porcicultura

Colombiana, 107: 33-40. 2007.

Henao U. F. J., O. Diaz, J. G. Valencia, L. Perez. Evaluación de la calidad

seminal en los porcinos. Porcicultura Colombiana, 109: 20-25. 2007.

Osorio S. R. E., Giraldo J. F., Mesa H. Germán Gómez L. G., Henao U. F. J.

Evaluación de la integridad acrosómica en semen de verraco. vet.zootec.

1(1): 41-47, 2007.




Díaz F. O., Mesa H., Gómez G., Henao U. F. J. Evaluación in vitro de la

viabilidad del semen porcino hasta 120 horas de almacenamiento en

refrigeración. vet.zootec. 1(4), 2008.

Díaz F. O., Mesa H., Valencia J. G., Gómez G., Henao U. F. J. Acrosomal

integrity and biochemical functionality assessment of the sperm plasmalemma

in boars with persistent cytoplasmic droplets. Revista Científica, FCV-LUZ,

XIX (5): 500-505, 2009.

Henao U. F. J., Valencia G. J. A., Diaz F. O., Rangel S. M. Y. Efecto de la

adición de plasma seminal sobre la eliminación de gotas citoplásmicas en

semen de sus Scrofa linnaeus, 1758. bol.cient.mus.hist.nat. 15 (2): 94-104,

2011.

Gómez G., Vélez C., Ceballos A., Henao U. F. J. Revisión sistemática de los

factores asociados a la presentación de gotas citoplásmicas en porcinos. Rev.

salud pública. 16 (6): 779-788, 2014.

En labores relacionadas con la misma línea de investigación trabajan en la

actualidad dos estudiantes de maestría; igualmente, en los últimos dos años, han

terminado trabajo de grado un estudiante de doctorado, tres estudiantes de maestría

y tres de Medicina Veterinaria y Zootecnia.

Las actividades más recientes han sido en: mejoramiento genético bovino,

inseminación artificial en bovinos y porcinos, calidad seminal en bovinos y porcinos,

y conservación seminal en bovinos y porcinos.




4. Descripción del proyecto

4.1 Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su

justificación

La criopreservación de semen porcino es una biotecnología de gran utilidad para la

comercialización de genética de alta calidad y conservación a largo plazo. Esta

biotecnología junto con la inseminación artificial, se pueden utilizar para ampliar la

distribución de material genético a gran cantidad de hembras, obtener animales de

mejor calidad y rendimiento a más bajo costo. Sin embargo, en la especie porcina su

implementación a nivel comercial aún no es viable, debido a que la membrana de

los espermatozoides presenta alta sensibilidad al frío, lo que resulta en pérdida de

más del 50% de la viabilidad espermática y en reducción de la vida útil de los

espermatozoides en el tracto reproductor de la cerda debido a capacitación

prematura o criocapacitación. Además la alta diferencia de la congelabilidad de los

verracos conlleva a resultados poco consistentes, ya que alrededor del 26 % de los

verracos de alta calidad genética son de baja congelabilidad, por lo cual,

actualmente algunos grupos de investigación se han orientado a la búsqueda de

predictores moleculares de congelabilidad y a entender el efecto del PS y de las

proteínas presentes en el sobre la resistencia de los espermatozoides a la

congelación. Estos problemas no se presentan con semen fresco o diluido utilizado

normalmente en las granjas. Por tanto, la prevención de los efectos negativos en la

calidad seminal que ocasiona la criopreservación, es de crucial importancia para la

implementación de ésta biotecnología en las granjas.

Lo anterior hace necesario implementar técnicas moleculares y químicas de alta

resolución y especificidad, como la electroforesis en gel de poliacrilamida para




separación por peso molecular, el Western Blot para detección de proteínas

específicas, la inmunofluorescencia indirecta para detectar proteínas de membrana

y la técnica de ELISA indirecta para cuantificar concentración de proteínas

especificas en el PS y la cromatografía de gases para medición de colesterol; con el

objeto de indagar con más profundidad sobre la función de proteínas en la

congelabilidad de los espermatozoides, determinar la diferencias en

concentraciones de estas en PS procedente machos de diferente congelabilidad y

establecer si existe diferencia en la capacidad de recepción de las proteínas por

parte de los espermatozoides de machos de alta y baja congelabilidad. Esto

mostrará un panorama más amplio de la biología de este proceso y mayor

entendimiento para realizar innovaciones biotecnológicas al respecto.

4.2 Marco Teórico

La membrana plasmática del espermatozoide del cerdo es más sensible al frío en

comparación a las otras especies, debido a que su membrana celular tiene menor

cantidad de colesterol, con una relación molar colesterol a fosfolípidos de 0.26, a

diferencia de la membrana del espermatozoide del toro que posee una relación de 0.45

(Parks y Lynch, 2004); lo que produce una menor estabilidad de la membrana (Johnson

et al., 2000). Este último factor hace más sensible al espermatozoide a iniciar el

proceso de capacitación y de reacción acrosómica (Belmonte et al., 2005; Hossain et

al., 2011). La capacitación espermática, es una vía bioquímica que debe desarrollar el

espermatozoide durante el paso por el tracto reproductor de la hembra, antes de

fecundar un ovocito (Rodríguez-Martínez et al., 2005; Visconti y Kopf, 1998). Como

consecuencia la congelación de semen porcino reduce más de la mitad de la

supervivencia espermática, y la mayoría de las células que sobreviven, desarrollan

prematuramente un fenómeno parecido a la capacitación, llamado criocapacitación

(Kaneto et al., 2002; Vadnais y Althouse, 2011). Actualmente, se han desarrollado




múltiples ensayos con PS, con el fin de prevenir este fenómeno (García et al., 2010;

Rodríguez-Martínez et al., 2008; Saravia et al., 2009).

El PS es una mezcla de secreciones provenientes de la red testicular, el epidídimo y las

glándulas sexuales accesorias (Caballero et al., 2004; Centurión et al., 2003); funciona

como vehículo y medio de inmersión de los espermatozoides después de la eyaculación

(García, 2007), participa en la regulación de procesos relacionados con nutrición,

protección, maduración, movilidad (Waberski et al., 1995), y capacitación del

espermatozoide (Calvete et al., 1997).

Los componentes del PS varían entre machos (Caballero, 2007), y entre las fracciones

del eyaculado en razón de su origen (Rodríguez-Martínez et al., 2005). El PS de la

fracción pre-espermática es proveniente de las glándulas uretrales y bulbouretrales; el

plasma seminal de la fracción rica en espermatozoides es de origen prostático, contiene

secreciones del epidídimo y de las vesículas seminales; y el plasma seminal de la

fracción pobre en espermatozoides, contiene secreciones de la próstata, y de las

vesículas seminales (Rodríguez-Martínez et al., 2005; Rodríguez-Martínez et al., 2009;

Saravia et al., 2009). Los componentes del PS que mayor efecto tienen sobre la función

del espermatozoide son las proteínas (Caballero, 2007).

Existen reportes sobre el efecto crioprotector de las proteínas contenidas en el PS,

debido a su participación en los procesos de capacitación y supervivencia de los

espermatozoides (Calvete et al., 1997).

Las familias de proteínas del plasma seminal porcino que producen cambios en la

función espermática asociados a los procesos de congelación como la capacitación,

son las proteínas que contienen el dominio fibronectina tipo 1 y 2, las lipocalinas, las

espermadhesinas y los trasportadores de colesterol. La fibronectina tipo 1 es




considerada un marcador molecular de la congelabilidad de los machos ya que

presenta diferente concentración en machos de alta y baja congelabilidad (Vilagran et

al., 2015), está relacionada con defectos de tracto intermedio y cola del

espermatozoide, se une a la membrana plasmática mediante integrinas y es una

proteína protectora del espermatozoide; además interactúa con la albumina, lo que

reduce el estrés oxidativo (González-Cadavid et al., 2014). La fibronectina tipo 2 Se une

a la fosforilcolina de la membrana del espermatozoide lo que posiblemente evita el

movimiento de fosfolípidos y mantiene la estabilidad de la membrana, también se une a

la heparina y puede causar la salida del colesterol durante la capacitación espermática

(Caballero, 2007). Dentro de las enzimas mas importantes relacionadas con la

congelabilidad del semen porcino se reportan la lipocalina PGDS (de su nominativo en

ingles Prostaglandin D Synthase) y la ß-HEX (del inglés ß subunit of N-acetyl-b-

hexosaminidase. La PGDS fue reportada por (Flowers, 1999) como una proteína

marcadora de fertilidad, esta se une con alta afinidad al ácido retinoico (Tanaka et al.,

1997) y al ácido docosahexoico el cual interactúa con otros lípidos de la membrana

como el colesterol y puede jugar un rol importante en la estructura local y en la función

de la membrana y el ácido retinoico afecta la permeabilidad de las membranas

celulares (Stillwell y Wassall, 1990). En un estudio realizado en toros se encontró que la

adición de PGDS incrementa la unión espermatozoide-ovocito in vitro e inhibe la

fecundación in vitro (Gonçalves et al., 2008). La ß-HEX indicador fiable de la

criotolerancia del espermatozoide, se une al acrosoma y es liberado durante la reacción

acrosómica; también se ha encontrado correlación negativa de esta enzima con

movilidad e integridad de membrana plasmática post-ongelación (Wysocki et al., 2015).




La familia de proteínas con mayor presencia en el PS porcino son las espermadhesinas

que constituyen un 90% del total (Caballero, 2007) y se clasifican como AQN-1, AQN-3

y AWN que tienen capacidad de unión a la heparina y las PSP-I y PSP-II que no tienen

esta propiedad (Sanz et al., 1992). Una proteína de igual importancia, con diferente

estructura pero que interactúa con las espermadhesinas es la proteína DQH, que forma

un complejo proteico con las proteínas AQN y AWN que afecta a función del

espermatozoide (González-Cadavid et al., 2014).

Las espermadhesinas AQN I, II y III están relacionadas con la unión del espermatozoide

con el epitelio del útero en el reservorio ubicado en la unión utero-tubal (Ekhlasi-

Hundrieser et al., 2005), se unen a la membrana del acrosoma y del 50 al 75% se

desprenden durante la capacitación lo que hace pensar en un efecto decapacitante;

luego las que permanecen adheridas participan en la formación del reservorio

espermático (Dostátlová et al., 1994), en la unión de gametos, principalmente ala AQN I

que tiene capacidad de unión a diferentes ligandos entre ellos la manosa (Caballero,

2007). Esta proteína también tiene alta afinidad por el colesterol y en el momento en

que esta se desprende, funciona como liberadora y aceptora de esta molécula

(Jonáková et al., 2000).

La proteína NPC2 (de su nombre en inglés Nieman-pick disease type C2) es una de las

proteínas con mayor afinidad al colesterol y esta involucrada en la regulación de la

composición lipídica de la membrana plasmática, principalmente como acarreadora de

colesterol (Dacheux et al., 2006; Okamura et al., 1999); al parecer alta presencia de

colesterol en la membrana plasmática de espermatozoides de humano corresponde con

alta concentración de esta proteína en le PS (Légaré et al., 2006), debido a que tiene la

función de mantener altos niveles de colesterol en la membrana plasmática y en el




acrosoma (Kirchhoff et al., 1996) por lo que se considera un factor decapacitante

(Lasserre et al., 2001). Como es mencionado anteriormente las proteínas NPC2 y AQN-

1 presentan interacción con el colesterol (Okamura et al., 1999, Jonáková et al., 2000)

lo que sugiere un rol en el mantenimiento o en la liberación de esta molécula, hechos

que son determinantes para el inicio de la capacitación o para la prevención de la

criocapacitación, por lo cual el enfoque de adición de PS se debe centrar en este punto

(Lehay y Gadella, 2011).

4.3 Objetivos

Objetivo general:

Determinar la dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la

congelabilidad del semen porcino.

Objetivos específicos:

Determinar la congelabilidad de los machos porcinos mediante la prueba de

espermatozoides funcionalmente competentes en semen congelado-

descongelado.

Evaluar el efecto de las proteínas NPC2 y AQN-1 del plasma seminal sobre la

población de espermatozoides funcionalmente competentes, la capacidad

fecundante, la fragmentación del ADN y la calidad seminal según los protocolos

del Laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad de Caldas en

semen congelado-descongelado de verracos de alta y baja congelabilidad.

Evaluar el efecto de la proporción de colesterol en la membrana espermática

sobre la población de espermatozoides funcionalmente competentes, la




capacidad fecundante, la fragmentación del ADN y la calidad seminal según los

protocolos del Laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad de

Caldas en semen congelado-descongelado de verracos de alta y baja

congelabilidad.

Establecer la asociación entre las proteínas NPC2 y AQN-1 con la proporción de

colesterol en la membrana espermática en semen de verracos de alta y baja

congelabilidad.

4.4 Metodología propuesta

Serán utilizados ocho verracos, alojados en corrales individuales, alimentados con

2kg/animal/día de un balanceado comercial, agua a disposición, eyaculados con una

frecuencia de cuatro a ocho días y con fertilidad por encima del 85% monitoreada 6

meses previos al estudio.

El semen de los ocho machos será colectado y congelado en tres momentos diferentes

con intervalo de 4 a 8 días, para determinar congelabilidad mediante la prueba de

espermatozoides funcionalmente competentes (EFC) y el análisis seminal de rutina del

Laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad de Caldas.

En una segunda fase, se colectará la fracción rica de cada macho, e inmediatamente

terminada la colección se tomarán tres alícuotas de 5 ml, la primera será centrifugada a

800 g x 10 minutos para separar el PS de los espermatozoides y realizar medición de

concentración de colesterol y cuantificación de proteínas; y las otras dos serán diluidas

1:1,5 con Androhep plus® y enfriadas hasta 17°C por tres horas.

Luego del enfriamiento se realizarán dos procedimientos distintos de separación de los

espermatozoides, una alícuota será centrifugará a 800 g por 20 minutos y la otra se




dejará sedimentar; los espermatozoides obtenidos de cada procedimiento serán

congelados y evaluados post-congelación mediante la prueba de EFC, el análisis

seminal de rutina, el test de fragmentación del ADN y una prueba de fecundación in

vitro.

A su vez serán medidas la concentración en PS de dos proteínas: la NPC2 y la AQN-1

y la concentración de colesterol en espermatozoides y en PS. Estas mediciones se

realizarán inmediatamente terminada la colección (utilizando la primera alícuota de 5

ml), en el semen centrifugado y en el semen sedimentado.

La congelación se realizará según protocolo comercial de minitub® con Androstar

Cryoplus®.

Evaluación seminal

- La prueba de EFC mediante prueba combinada sHOST con viabilidad (Perez-Llano et

al., 2009), fijación con glutaraldehido al 2% en BTS (Pursel y Johnson, 1974) y

evaluación en microscopio Nikon Eclipse-80i de contraste de interferencia con

epifluorescencia (filtro B-2A) a 1000 X. El resultado de la prueba consistirá en expresar

el porcentaje de células vivas, morfológicamente normales, HOST+ y con acrosoma

íntegro; ajustado por los valores previos de aglutinación y formas redondas de cola.

- IEM con el Kit LIVE/DEAD® (Garner y Johnson, 1995).

- IFM (Perez-Llano et al., 2001).

- IAC (Pursel et al., 1974).

- Morfología espermática.

- Movilidad espermática en sistema CASA (computer assisted semen analysis).

- Integridad del ADN con el Kit Halotech® (Enciso et al., 2006).

- fecundación in vitro ( Abeydeera y Day, 1997).




Electroforesis vertical y Western Blot

El PS obtenido será transportado al laboratorio en una cava con hielo, filtrado a través

de 1 y 0,22 micras y almacenado a -20°C.

La concentración de proteína total será medida con el método de Bradford a 595 nm en

espectrofotómetro. Se usará SDS-PAGE discontinua, resolución al 16% y apilamiento al

7% (12-21 KDa). El PS será diluido 1:3 en solución desnaturalizante (62.5 mM de Tris-

HCl, pH 6.8, 25% de glicerol, 2% de SDS y 0.01%de azul bromofenol).

El corrido se realizará a 50 V por 20 minutos y luego a 100 V por 3 horas en buffer

TRIS-Glicina y la transferencia toda la noche a corriente constante de 25 mA en

membranas de PVDF previamente tratadas con metanol. Las membranas transferidas

serán lavadas una vez con tween-20 al 0,1 % en PBS (PBST) por 20 minutos y dos

veces con PBS por 10 minutos cada una y bloqueadas con ASB al 3% en PBST

durante 12 horas a 4°C. Después de lavarlas será agregado el anticuerpo primario

contra cada proteína (producido en conejo) diluido según recomendación de fábrica,

para incubar durante 12 horas a 4°C; se lavará nuevamente para adicionar el

anticuerpo secundario conjugado a enzima peroxidasa de rábano (cabra anti-conejo) a

1:50000, e incubar por 2 horas a temperatura ambiente.

La reacción enzima-sustrato será realizada con el Kit Opti-4CN de BIO-RAD® por 20

minutos a temperatura ambiente y se visualizará con documentador de geles y el

software Image Lab-4 de BIO-RAD®.

Inmunofluorescencia indirecta

Esta técnica será realizada según por Ekhlasi-Hundrieser et al.,(2005) y Manásková y

Jonáková (2008). Los espermatozoides serán incubados por separado con los

anticuerpos primarios para las dos proteínas. Serán probadas diferentes diluciones del




anticuerpo en PBS tomando como base un rango entre 1:50 y 1:500. Luego se realizará

un lavado de tres centrifugaciones a 150 g de tres minutos cada una, para incubar por 1

hora a 37°C con anticuerpo secundario (anti-conejo) ligado a FITC (SIGMA-ALDRICH,

Cat. F9887), diluido 1:160 en PBS. Después de lavar por centrifugación será realizado

un extendido en portaobjetos que se cubrirá con 1,5 µg/ml de VectaShield por 15

minutos. La visualización será realizada en microscopio Eclipse 80i Nikon con

epifluorescencia (filtro B-2A).a 40 X.

ELISA indirecta

El PS será diluido en buffer NaHCO3 a 0.05M (pH 9.6) a 2 µg/µl y se incubarán 100

µl/poso por 2 horas a 37°C para fijar el antígeno; también serán incubados 100 µl con

20 µg por poso del antígeno sintético como control positivo. Después de remover la

muestra no fijada se realizará un lavado con 200 µl/poso de PBST para bloquear con

200 µl/poso de ASB al 2,5% en PBS durante la noche a 4°C. Serán ensayadas

diferentes diluciones del anticuerpo primario contra cada proteína (producido en

conejos) con base en las recomendaciones de la casa comercial (dilución 1:10.000),

para incubar por 2 horas a 37°C. Después de lavar con PBST serán agregados 200

µl/poso del anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa (anti-conejo) (Sigma, Cat.

A0545) diluido 1:500 en PBS para incubar por 1 hora a 37°C. La reacción enzimática

será realizada según las especificaciones del Kit HRP-Substrate Kit (Cat. 1721064 de

BIO-RAD®).




La medición de colesterol será realizada por cromatografía de gases con detector

selectivo de masas, la preparación de las muestras de PS y espermatozoides se

realizará por microextracción en fase líquida. Será usada una columna Rxi®-1ms (30m,

0,25mm ID, 0,25µm), temperatura inj. 250°C y gas helio con flujo de 1 ml/min.

4.5 Resultados esperados

- Conocimiento de la dinámica y función de las proteínas NPC2 y AQN-1 y el efecto

sobre el movimiento de colesterol en la membrana espermática y la congelabilidad

del semen porcino.

- Claridad sobre el efecto del plasma seminal en la congelabilidad del semen y sobre

que proteínas en específico están involucradas.

- Definición de criterios prácticos para la evaluación de la congelabilidad del semen

porcino para Colombia.

- Identificación de proteínas específicas relacionadas con la congelabilidad de los

machos, para una selección más acertada de estos con propósitos de congelación.

4.6 Impactos esperados a partir del uso de los resultados

El conocimiento de la participación de proteínas específicas en la incorporación de

colesterol a la membrana y en la función espermática, aportará información relevante

en cuanto a la prevención de la criocapacitación y de los daños en la calidad seminal

ocasionados por la congelación, además suministrará información para posteriores

ensayos de congelabilidad del semen porcino y para la clasificación de machos

mediante marcadores moleculares de congelabilidad.




La relación entre proteínas plasmáticas y el semen de alta congelabilidad ciertos

machos, puede abrir nuevos caminos para establecer los marcadores biológicos de la

eficiencia en la conservación de gametas porcinas, y aporta fundamentos para realizar

innovación biotecnológica en el campo de la criopreservación, la inseminación artificial y

el control de la reproducción animal.

Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de

Caldas 2015”


4.7 Cronograma de actividades:

Actividades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Revisión de literatura x x x x x x x x x x x x

Seguimiento de la fertilidad de los machos

x x x x x x x x

Compra e importación de reactivos x x x x x x x

Validación de las pruebas de EFC y FIV para congelabilidad

x x x

Adaptación de un protocolo de ELISA indirecta para cuantificación de proteínas

x x x x x

Adaptación de un protocolo de inmunofluorescencia indirecta para identificación de proteínas

x x x x x

Adaptación de un protocolo para medición de colesterol por cromatografía

x x x x x x

Realización de pruebas de congelabilidad

x x x

Identificación y cuantificación de proteínas

x x x

Medición de colesterol en membrana espermática y en PS

x x x

Análisis de resultados y preparación de informe final

x x x x x x

Preparación de artículos para publicación

x x x x




5. Compromisos

Los resultados de esta investigación generarán mínimo una publicación en una

revista A1 indexada u homologada por COLCIENCIAS. Se presentará un informe

técnico al final del proyecto, al igual que el acta de sustentación de trabajo de grado.

6. Bibliografía

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7. Presupuesto

PRESUPUESTO TOTAL *

Nombre del proyecto: Dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la


RUBROS

FUENTES

TOTAL

UNIVERSIDAD DE

CALDAS

FINANCIACIÓN

EXTERNA

RECURRENTE

[1]

Solicitado a

V.I.P RECURRENTE

RECURSOS

FRESCOS

1. SERVICIOS PERSONALES 75.577.480 0 0 0 75.577.480

1.1. Investigadores 75.577.480 0 0 0 75.577.480

1.2. Auxiliares 0 0 0 0 0

1.3. Consultores 0 0 0 0 0

1.4. Asesores 0 0 0 0 0

2. GASTOS GENERALES 0 27.880.000 0 0 27.880.000

2.1. Servicios técnicos 0 7.200.000 0 0 7.200.000

2.1.1. Exámenes 0 0 0 0 0

2.1.2. Pruebas técnicas 0 7.200.000 0 0 7.200.000

2.1.3. Servicios de encuestas 0 0 0 0 0

2.2. Materiales e insumos 0 20.680.000 0 0 20.680.000

2.2.1. De campo 0 0 0 0 0

2.2.2. De oficina (papel, tinta,

fotocopias) 0 0 0 0 0

2.2.3. De laboratorio 0 20.680.000 0 0 20.680.000

2.3. Apoyo económico para gastos de

viaje 0 0 0 0 0

2.3.1. Tiquetes aéreos 0 0 0 0 0

2.3.2. Pasajes terrestres 0 0 0 0 0

2.3.3. Gastos de viaje (gasolina y

peajes) 0 0 0 0 0

2.3.4. Auxilio para viaje 0 0 0 0 0

2.3.5. Apoyo económico para

alojamiento y alimentación [2] 0 0 0 0 0

2.4. Gastos para uso de equipos 0 0 0 0 0

2.4.1. Pago de alquiler de equipos 0 0 0 0 0

3. INVERSIÓN 0 0 0 0 0

3.1. En equipos 0 0 0 0 0

3.1.1. Para compra de equipos 0 0 0 0 0

3.1.2. Equipos propios 0 0 0 0 0

3.2. En planta física 0 0 0 0 0

3.2.1. Adecuaciones 0 0 0 0 0

3.2.2. Alquiler de planta física 0 0 0 0 0

3.3. En material bibliográfico

necesario para esta investigación 0 0 0 0 0




3.3.1. Para comprar 0 0 0 0 0

3.4. En software necesario para esta

investigación 0 0 0 0 0

3.4.1. Para comprar 0 0 0 0 0

3.4.2. Propio 0 0 0 0 0

SUB-TOTAL 75.577.480 27.880.000 0 0 103.457.480

ADMINISTRACIÓN, 20% 0 0 0 0 0

TOTAL 75.577.480 27.880.000 0 0 103.457.480

PORCENTAJE DE FUENTES 73,1% 26,9% 0,0% 0,0% 100,0%

PRESUPUESTO *

AÑO 1



RUBROS

FUENTES

TOTAL

UNIVERSIDAD DE

CALDAS

FINANCIACIÓN

EXTERNA

RECURRENTE

[1]

Solicitado a

V.I.P RECURRENTE

RECURSOS

FRESCOS


1.1. Investigadores 37.788.740 0 37.788.740

1.2. Auxiliares 0 0

1.3. Consultores 0

2. GASTOS GENERALES 0 27.880.000 0 0 27.880.000

2.1. Servicios técnicos 0 7.200.000 0 0 7.200.000

2.1.1. Exámenes 0

2.1.2. Pruebas técnicas 7.200.000 7.200.000

2.1.3. Servicios de encuestas 0

2.2. Materiales e insumos 0 20.680.000 0 0 20.680.000

2.2.1. De campo 0


fotocopias) 0

2.2.3. De laboratorio 20.680.000 20.680.000


viaje 0 0 0 0 0

2.3.1. Tiquetes aéreos 0 0

2.3.2. Pasajes terrestres 0 0


peajes) 0 0

2.3.4. Auxilio para viaje 0 0


alojamiento y alimentación [2] 0 0


2.4.1. Pago de alquiler de equipos 0 0





3.1. En equipos 0 0 0 0 0

3.1.1. Para compra de equipos 0 0

3.1.2. Equipos propios 0 0


3.2.1. Adecuaciones 0 0

3.2.2. Alquiler de planta física 0 0



3.3.1. Para comprar 0 0




3.4.2. Propio 0 0

SUB-TOTAL 37.788.740 27.880.000 0 0 65.668.740


TOTAL 37.788.740 27.880.000 0 0 65.668.740


PRESUPUESTO * AÑO 2



RUBROS

FUENTES

TOTAL

UNIVERSIDAD DE

CALDAS

FINANCIACIÓN

EXTERNA

RECURRENTE

[1]

Solicitado a

V.I.P RECURRENTE

RECURSOS

FRESCOS


1.1. Investigadores 37.788.740 0 37.788.740

1.2. Auxiliares 0 0

1.3. Consultores 0

2. GASTOS GENERALES 0 0 0 0 0

2.1. Servicios técnicos 0 0 0 0 0

2.1.1. Exámenes 0

2.1.2. Pruebas técnicas 0

2.1.3. Servicios de encuestas 0

2.2. Materiales e insumos 0 0 0 0 0

2.2.1. De campo 0


fotocopias) 0

2.2.3. De laboratorio 0


viaje 0 0 0 0 0

2.3.1. Tiquetes aéreos 0 0




2.3.2. Pasajes terrestres 0 0


peajes) 0 0

2.3.4. Auxilio para viaje 0 0


alojamiento y alimentación [2] 0 0


2.4.1. Pago de alquiler de equipos 0 0


3.1. En equipos 0 0 0 0 0

3.1.1. Para compra de equipos 0 0

3.1.2. Equipos propios 0 0


3.2.1. Adecuaciones 0 0

3.2.2. Alquiler de planta física 0 0







3.4.2. Propio 0 0

SUB-TOTAL 37.788.740 0 0 0 37.788.740


TOTAL 37.788.740 0 0 0 37.788.740





TABLAS DE ANEXO AL PRESUPUESTO

Descripción de los gastos de personal Nombre de los

investigadores

Formación

Académica

Función dentro

del proyecto

Institución o

Empresa

Tipo de

vinculación

Dedicación

(horas/sem)

Fuentes Total

Efectivo Recurrente

Francisco Javier

Henao Uribe PhD Director

Universidad

de Caldas Profesor titular 5 x 42.577.480

Julian Alonso

Valencia Giraldo

Profesional

universitario

Estudiante de

doctorado

Universidad

de Caldas Estudiante 20

33.000.000

Totales 75.577.480

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