INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL TÍTULO DEL TRABAJO ...
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México, D. F. a 6 de enero de 2016 PRESENTA: CONSTANTINO CASTILLO EMMANUEL QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNOLOGÍA TÍTULO DEL TRABAJO: DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE INTERACCIÓN ENTRE INSR Y LA PROTEÍNA TAU EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER. DIRIGIDA POR: DR.HERNANDES ALEJANDRO MARIO DR. LUNA MUÑOZ JOSÉ CARMEN TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN: CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
Transcript of INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL TÍTULO DEL TRABAJO ...
México, D. F. a 6 de enero de 2016
PRESENTA:
CONSTANTINO CASTILLO EMMANUEL
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO:
DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE INTERACCIÓN ENTRE INSR Y LA
PROTEÍNA TAU EN LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.
DIRIGIDA POR:
DR.HERNANDES ALEJANDRO MARIO
DR. LUNA MUÑOZ JOSÉ CARMEN
TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE
TITULACIÓN: CURRICULAR
EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
SUBDIRECCIÓN ACADÉMICA
ACTA DE TRABAJO ESCRITO
En la Ciudad de México el día 8 de enero del 2015, siendo las 15:25 se reunieron
los integrantes de la Comisión de Evaluación para Opción Curricular con el fin
de revisar el trabajo escrito titulado:DETERMINACIÓN DE LA POSIBLE
INTERACCION ENTRE INSR Y LA PROTEÍNA TAU EN LA ENFERMADAD DE
ALZHEIMER. Que presenta el alumno Constantino Castillo Emmanuel con
número de boleta 2011620182, aspirante a ingeniero biotecnología.
Después de intercambiar opiniones los integrantes de la Comisión de Evaluación
manifiestan APROBAR EL TRABAJO ESCRITO, en virtud de que satisface los
requisitos señalados por las disposiciones reglamentarias vigentes para la
opción curricular de titulación.
COMISIÓN REVISORA.
Nombre y firma Director Externo Nombre y firma Director Interno
Nombre y firma Evaluador 1 Nombre y firma Evaluador 2
________________________________________
Nombre y firma Director de Programa Académico
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA
DE BIOTECNOLOGÍA
Autorización de uso de obra
Instituto Politécnico Nacional
P r e s e n t e
Bajo protesta de decir verdad el que suscribe Emmanuel Constantino Castillo,
manifiesto ser autor (a) y titular de los derechos morales y patrimoniales de la obra
titulada Determinación de la posible interacción del INSR y la proteína Tau en la
enfermedad de Alzheimer, en adelante “La Tesis” y de la cual se adjunta copia, por lo
que por medio del presente y con fundamento en el artículo 27 fracción II, inciso b) de
la Ley Federal del Derecho de Autor, otorgo a el Instituto Politécnico Nacional, en
adelante El IPN, autorización no exclusiva para comunicar y exhibir públicamente total
o parcialmente en medios digitales, o escritos “La Tesis” por un periodo de 1 año
contado a partir de la fecha de la presente autorización, dicho periodo se renovará
automáticamente en caso de no dar aviso expreso a “El IPN” de su terminación.
En virtud de lo anterior, “El IPN” deberá reconocer en todo momento mi calidad de autor
de “La Tesis”.
Adicionalmente, y en mi calidad de autor y titular de los derechos morales y
patrimoniales de “La Tesis”, manifiesto que la misma es original y que la presente
autorización no contraviene ninguna otorgada por el suscrito respecto de “La Tesis”, por
lo que deslindo de toda responsabilidad a El IPN en caso de que el contenido de “La
Tesis” o la autorización concedida afecte o viole derechos autorales, industriales,
secretos industriales, convenios o contratos de confidencialidad o en general cualquier
derecho de propiedad intelectual de terceros y asumo las consecuencias legales y
económicas de cualquier demanda o reclamación que puedan derivarse del caso.
México, D. F., 18 de enero de 2016
Atentamente
Emmanuel Constantino Castillo
Agradecimiento:
Jamás es sido bueno para poder expresar mi agradecimiento a las personas,
ya que considero que cuando uno brinda su ayuda es desinteresadamente,
es el punto que me hace creer que todos somos capaces de poder extender
la mano a quien la necesita sin necesidad de ser reconocidos o esperar
algo a cambio, sin embargo soy fiel ante la premisa que el trabajo de
cada colaborador debe de ser apreciado y reconocido, es por ello que el
presente trabajo es un regalo a todas las personas que creen que siempre
es posible salir adelante, y que contribuir en el conocimiento y
desarrollo de nuevos descubrimientos es algo realmente sensacional.
Por este motivo reconozco la enorme participación de mi papá Francisco
Javier Constantino Vazquezz y mi mamá H. Bárbara Castillo Casales por
todo el apoyo, la libertad y confianza que me han brindado, al Dr. Mario
Hernandes Alejandro por la oportunidad brindada para la realización de
este proyecto, al Dr. José Muñoz Luna por permitirme la entrada y
colaboración en el Banco Nacional de Cerebros, al Dr. Armando Pérez
Rangel del área de biología molecular por tener la paciencia y el
conocimiento para poder guiarme en las técnicas usadas en este proyecto,
así como también a la Dra. Maricela Sarita Montaño Valdéz del
departamento de Genómica del CINVESTAV por su ayuda en las técnicas de
Dinámica molecular y su gran paciencia.
Sin olvidar a todos mis amigos, sus valiosos consejos y su gran apoyo.
“Sé que es morir de amor,
también sé que es romper una promesa,
lo único que no se, es dejar de aprender, gracias a Dios”
Gracias.
Atentamente
Emmanuel Constantino Castillo
Índice
RESUMEN: ............................................................................................................................................. 9
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 10
MARCADORES DE LA ENFERMEDAD. ...................................................................................................... 13
PLACAS SENILES ................................................................................................................................. 14
OVILLO O MARAÑA NEUROFIBRILAR ................................................................................................. 15
PROTEÍNAS INVOLUCRADAS EN LA EA .................................................................................................... 16
PROTEÍNA β-AMILOIDE ...................................................................................................................... 16
PROTEÍNA TAU ................................................................................................................................... 17
CAMBIOS MOLECULARES EN TAU .......................................................................................................... 18
FOSFORILACIÓN DE TAU Y CINASAS INVOLUCRADAS .................................................... 19
FOSFATASAS INVOLUCRADAS EN LA FOSFORILACIÓN DE TAU .......................................................... 19
TAU GLUCOSILADA ............................................................................................................................ 19
TAU UBIQUITINACIÓN ....................................................................................................................... 20
TAU POLIAMINACIÓN ........................................................................................................................ 20
TAU NITRACIÓN ................................................................................................................................. 20
TAU TRUNCAMIENTO ........................................................................................................................ 20
RUTA DE LA INSULINA ............................................................................................................................ 20
RECEPTOR DE INSULINA ......................................................................................................................... 21
SUSTRATO DEL RECEPTOR DE LA INSULINA ............................................................................................ 22
TÉCNICAS COMPUTACIONALES .............................................................................................................. 22
ANÁLISIS IN SILICO ............................................................................................................................. 22
IMPORTANCIA DEL MODELADO MOLECULAR ................................................................................... 23
¿POR QUÉ ES IMPORTANTE EL MODELADO DE UNA PROTEÍNA? ..................................................... 23
DINÁMICA MOLÉCULAR ..................................................................................................................... 23
ESQUEMA GENERAL DE UNA SIMULACIÓN POR DINÁMICA MOLECULAR ........................................ 24
ACOPLAMIENTO MOLECULAR. .......................................................................................................... 25
ANÁLISIS DE ESTRUCTURA SECUNDARIA ................................................................................................ 25
PSIPRED .............................................................................................................................................. 26
GRÁFICO DE RAMACHANDRAN .............................................................................................................. 26
JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................................... 27
EL MODELO DE CONDUCCIÓN O “STEERING” .................................................................................... 28
HIPÓTESIS .............................................................................................................................................. 28
OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 30
METODOLOGÍA .................................................................................................................................... 31
DESCRIPCION GENERAL DEL PROYECTO ................................................................................................. 31
DESCRIPCION DETALLADA DE EL PROTOCOLO Y SOLUCIONES PARA LA REALIZACION DEL PROYECTO .. 36
PREPARACION DEL HOMOGENADO DE CEREBRO .................................................................................. 36
SOLUCIONES ...................................................................................................................................... 36
TRIS-HCL 1 M...................................................................................................................................... 36
MgCl2 1 M .......................................................................................................................................... 36
MgCl2 ................................................................................................................................................. 36
STM Sacarosa 0.25 M/Tris HCl/ MgCl2............................................................................................... 36
INHIBIDORES ...................................................................................................................................... 37
DETERMINACIÓN DE CONTENIDO DE PROTEÍNAS (MÉTODO DE BRADFORT) ........................................ 37
ELECTROFORESIS (SDS-PAGE) ................................................................................................................. 37
PREPARACIÓN DE MUESTRAS ................................................................................................................ 37
MONTAJE DE LAS PLACAS DE VIDRIO ................................................................................................ 37
PREPARACIÓN DEL GEL ...................................................................................................................... 38
MONTAJE DE LA CÁMARA DE ELECTROFORESIS ................................................................................ 38
TINCIÓN DEL GEL ............................................................................................................................... 38
SECADO DEL GEL ................................................................................................................................ 39
SOLUCIONES ...................................................................................................................................... 39
BUFFER DE CORRIDA 10X ................................................................................................................... 40
BUFFER DE MUESTRA 2X ................................................................................................................... 41
BUFFER DE MUESTRA 4X ................................................................................................................... 41
AZUL DE COOMASSIE ......................................................................................................................... 42
SOL. DESTEÑIDORA ............................................................................................................................ 42
GEL SEPARADOR ................................................................................................................................ 42
GEL CONCENTRADOR ......................................................................................................................... 43
WESTER BLOT ......................................................................................................................................... 43
SISTEMA SEMISECO ........................................................................................................................... 43
REVELADO POR QUIMIOLUMINISCENCIA .......................................................................................... 44
SOLUCIONES ...................................................................................................................................... 45
SECUENCIA DE LA PROTEÍNA TAU .......................................................................................................... 46
ESTRUCTURA SECUNDARIA ................................................................................................................ 46
I-TASSER ................................................................................................................................................. 46
¿CÓMO FUNCIONA I-TASSER? ........................................................................................................... 46
¿POR QUÉ I-TASSER?.......................................................................................................................... 48
GRÁFICO DE RAMACHANDRAN ......................................................................................................... 48
DINÁMICA MOLÉCULAR ......................................................................................................................... 48
ANÁLISIS DE LA TRAYECTORIA DE DM ............................................................................................... 49
ACOPLAMIENTO MOLECULAR ........................................................................................................... 49
RESULTADOS........................................................................................................................................ 50
ANÁLISIS IN SILICO .................................................................................................................................. 50
RELACIÓN ENTRE PROTEÍNAS ............................................................................................................ 50
ESTRUCTURA PRIMARIA .................................................................................................................... 53
ESTRUCTURA SECUNDARIA ................................................................................................................ 54
GRÁFICO DE RAMACHANDRAN ......................................................................................................... 55
MODELO DE TAU ............................................................................................................................... 57
ESTUDIO PRÁCTICO ................................................................................................................................ 58
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD .................................................. 58
CORRIDA EN GEL AL 12% EN BIS-POLIACRILAMIDA. .......................................................................... 58
INMUNOBLOT .................................................................................................................................... 59
DISCUSIÓN ........................................................................................................................................... 61
CONCLUSIÓN ....................................................................................................................................... 62
RECOMENDACIONES ............................................................................................................................ 62
ANEXOS ............................................................................................................................................... 65
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 Hipocampo tomado de Psicoactiva.com atlas visual del cerebro. 11
Figura 2 Células que conforman la Neuroglia. Tomado de W.B. Saunders Company 12
Figura 3 Tipos de neuronas y sus partes generales. Tomado de W.B. Saunders Company 13
Figura 4 Placa senil tomada de (Luna y col., 2013). 13
Figura 5. Ovillo o maraña neurofibrilar tomado de (López y col., 1994). 14
Figura 6 Síntesis del β-amiloide 14
Figura 7 Proceso de formación de MNFs Modificado de (Martin y col., 2011). 15
Figura 8 Isoformas de Tau 17
Figura 9 Regiones de la proteína Tau 18
Figura 10 Esquema general de una simulación por dinámica molecular modificada de (Yip y col., 2002).
24
Figura 11 Gráfico de Ramachandran 26
Figura 12 Imágenes de inmunofluorescencia ISR1 y BA con Tau 29
Figura 13 Esquema general de proceso del proyecto 31
Figura 14 Pasos de I_TASSER para generar la estructura 3D 48
Figura 15 Proteínas relacionadas con Tau tomado de STRING 10 50
Figura 16 Proteínas relacionadas con ISR1 tomado de STRING 10 51
Figura 17 Proteínas relacionas con el INSR tomado de STRING 10 52
Figura 18 Formato FASTA de Tau isoforma 2 Homo Sapiens tomado de NCBI NP_005901.2 53
Figura 19 Análisis de la estructura secundaria de Tau isoforma 2 tomado de PSIPRED 54
Figura 20 Gráfico de Ramachandran tomado de RAMPAGE 55
Figura 21 Gráfico General de Ramachandran 56
Figura 22 Estructura 3D de la proteína Tau modelada en VMD 57
Figura 23 Corrida en gel de bis-poliacrilamida 12% a 100 V por 2.5 h 59
Figura 24 Inmunoblot con anti actina 60
Figura 25 Inmunoblot con anticuerpo TG3, detección de Tau 60
Figura 26 Inmunoblot con anticuerpo de receptor de insulina 60
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Proteínas y código de acceso 32
Tabla 2 Lomets para generar la estructura 3D de la proteína Tau 32
Tabla 3 anticuerpos utilizados 35
Tabla 4 Muestra las interacciones que tienen Tau con las distintas proteínas 50
Tabla 5 Proteínas con interacción a IRS1 51
Tabla 6 Interacción de proteínas con INSR 52
Tabla 7 Porcentaje de residuos permitidos, no permitidos dentro del gráfico de Ramachandran 55
Tabla 8 Cuantificación de proteínas método de Bradford 58
Tabla 9 Orden de carga en el gel de bis-poliacrilamida 58
9
RESUMEN:
Uno de los eventos de estudio implicados en la enfermedad de Alzheimer (EA) está
relacionado con la polimerización de la proteína Tau y su interacción con otras proteínas
durante la formación de los filamentos helicoidales apareados, poco se sabe acerca de
proteínas que se unen a tau y que tengan una participación relevante en la integración
de tau en los filamentos.
Como se conoce, los marcadores principales de esta enfermedad son las
llamadas placas seniles; que están íntimamente relacionadas con la proteína β-amiloide.
Esta proteína sufre un proceso proteolítico que genera péptidos de 42 aminoácidos
residuales, los cuales son eliminados extracelularmente y eventualmente forman las
denominadas placas seniles. Otro de los marcadores de la enfermedad son los ovillos
o marañas neurofibrilares, producto de la polimerización de la proteína Tau sobre la
membrana celular, se sabe que el acúmulo elevado de esta proteína anormal genera
inhibición de los procesos celulares y por consecuencia la muerte de la neurona. En
esta enfermedad, la proteína Tau tiene marcados cambios moleculares entre los que se
han definidos se encuentran la fosforilación, glicosilación, ubiquitinación, poliaminación,
nitración, y el denominado truncamiento espontáneo en los aminoácidos Glutámico 391
(E391) y Aspártico 421 (D421). Todos los estudios realizados en esta proteína indican
que estos eventos inducen la polimerización de esta. Para determinar que otras
proteínas favorecen la polimerización de la proteína tau y su integración en los
filamentos se realizó un estudio in silico, un análisis bioinformático realizado mediante
simulación por computadora. En la cual se buscó encontrar relación entre el receptor de
insulina1 (ISR-1) y el sustrato del receptor de insulina (INSR) con la proteína TAU tanto
en procesos de unión, transducción y/o reacción celular. Posterior a este análisis se
realizó una dinámica molecular o docking, en una plataforma virtual pusimos a
interaccionar estas biomoleculas para ver la posible unión e interacción de estas en un
ambiente semejante al celular. Esto se realizó por medio de digitalización de la
estructura 3D de las proteínas (TAU, ISR-1 e INSR). Los primeros estudios indican que
la unión entre estas dos proteínas se genera debido a una interacción cruzada; es
decir, que la unión de estas moléculas no se genera linealmente. Todo indica que dicha
unión es debida al el reclutamiento lejano de dominios característicos en ambas
proteínas, los cuales muestran afinidad y por lo tanto interacción entre las moléculas.
Esto se ha demostrado en otras patologías y situaciones (Dehesa y col., 2003), dichos
trabajos muestran afinidad e interacción de estos tipos de dominios característicos en
estas y otra proteínas. Otro estudio de interés muestra la estrecha relación entre ISR1
y TAU (Mark Yarchoan y col., 2014), por estudios de inmunofluorescencia y microscopía
10
confocal sugieren que ISR1 funciona como molécula activadora para INSR y también
como proteína de transporte para Tau.
Para comprobar de manera experimental la interacción entre estas dos proteínas
realizamos técnicas de electroforesis y Western-blot. Se utilizaron muestras de tejido
cerebral proporcionado por el Banco Nacional de Cerebros “Raúl Mena López” del
CINVESTAV- IPN. En las diferentes muestras con la enfermedad de Alzheimer se
identificó la presencia del receptor de insulina 1 y de la proteína tau. En esta fase del
proyecto consistió en la estandarización de las técnicas y caracterización patológica de
los casos de estudios. En todos los casos con la EA determinamos presencia de
proteína tau anormal (fosforilada). Así mismo, determinamos niveles elevados del INSR
en cerebros con la EA y bajos niveles de ésta en controles sanos. Estos resultados
sugieren una participación importante de ISR-1 en los diferentes cambios moleculares
presentes en la proteína tau durante el desarrollo de la EA en una neurona.
INTRODUCCIÓN
Una de las estructuras más importantes del Sistema Nervioso Central (SNC) es
el cerebro cuyas funciones están íntimamente ligadas con los procesos cognitivos y
emocionales, también se relacionan con procesos como el pensamiento, la intuición, la
imaginación, la acción, la escritura, la emoción, la conciencia y la memoria. Pero, ¿Qué
es la memoria?; Es un mecanismo de grabación, archivo y clasificación de información,
haciendo posible su recuperación posterior, en la actualidad, muchos científicos
coinciden que esta no debe concebirse como una entidad única, sino como un sistema
de módulos que interactúan sistemáticamente y a través de los cuales la información se
asocia a los canales de acceso del cerebro; por ello, se habla de “la memoria visual,
auditiva y sensorial o cinética” según el órgano de los sentidos que preferencialmente
sirva para grabar o retener hechos y conocimientos. En el SNC se encuentra ubicado
el hipocampo (Fig.1) que es el responsable de la memoria. El hipocampo es un área
relacionada con la corteza cerebral que se ubica al interior del lóbulo temporal. Mide
aproximadamente 3,5 a 4 cm. de longitud (Papez Wenceslas y col., 2013).
11
Figura 1 Hipocampo tomado de Psicoactiva.com atlas visual del cerebro.
La enfermedad de Alzheimer, también se relaciona con esta área, ya que consiste
en una degeneración y muerte de neuronas hipocámpicas, se manifiesta clínicamente
como una pérdida de la memoria de corto plazo, desorientación espacio-temporal que
en el curso evolutivo será el más eminente, ya desde el inicio la memoria reciente se
afecta más que la remota. Paulatinamente se alteran otras funciones cognitivas –
funciones nerviosas superiores– y sobreviene apraxia primeramente constructiva, luego
motriz e idearía, afasia nominal y posteriormente afasia sensorial, discalculia, disgrafía
e incapacidad para el pensamiento abstracto.
En fases más avanzadas aparecen otros trastornos, como la pérdida del juicio crítico,
el habla, no comprende ninguna orden y pierde sus capacidades motrices; asimismo, él
paciente es incapaz de controlar sus funciones fisiológicas más elementales, entre otros.
Finalmente, el enfermo pierde su autonomía para las actividades más elementales de la
vida diaria y es dependiente de otra persona. La enfermedad conduce, en general, al
fallecimiento al cabo de 9 a 12 años, en función de la rapidez evolutiva de cada caso y
de los cuidados generales de la fase terminal. El diagnóstico se basa en el perfil
clinicoevolutivo detallado en el anexo 1 (Peña Casanova y col., 2002).
La muerte neuronal se relaciona por procesos celulares que se regulan por la
concentración del Ca+2, dentro de la homeostasis celular, que se ve influenciada por la
proteína precursora el amiloide beta (PPA) en la formación del β-amiloide en la
enfermedad de Alzheimer, y en procesos de envejecimiento prematuro activando el
sistema lisosómico y sus constituyentes, las hidrolasas, son activados en diferentes
estados neuropatológicos como iniciadores o agentes directos de la muerte celular,
reparación, efectores de la etapa final de la disolución celular o como “basureros “ de
los detritos celulares. (Pardal y col., 1996).
Dentro de las células encargadas de la fagocitosis se encuentran un grupo, en el
que la microglía, astrocitos, oligodendrocitos son las responsables de esta función
(Fig. 2), las células nerviosas se encuentran en estrecha relación con las células de la
Glía (aislamientos en los nervios), que además ayudan a asegurar un medio extracelular
12
con una determinada concentración de iones para generar los campos eléctricos que
forman las conexiones sinápticas entre las neuronas, estas tienen morfologías muy
variadas. En general, en ellas se pueden distinguir un cuerpo o soma, donde se cumple
la mayor parte de las funciones de nutrición, y una serie de arborizaciones que se
conoce como dendritas que permiten poner en contacto una neurona con otras,
ofreciéndoles, por así decirlo, una superficie receptiva que se ve modificada por el influjo
de la actividad de las terminales nerviosas que llegan hasta ellas. Del soma sale también
una fibra única cuya extensión puede ser muy grande y que recibe el nombre de axón,
este se ramifica en su parte terminal, lo que permite un contacto mayor con la periferia.
En la punta de cada una de las ramas del axón se forma un abultamiento que se conoce
como botón terminal (Fig.3). De acuerdo con los rasgos estructurales similares que
presentan, se encuentran neuronas unipolares, bipolares y multipolares este último caso
asociadas a las neuronas hipocámpicas teniendo árboles dendríticos muy ramificados.
(Romero y col., 2001).
Figura 2 Células que conforman la Neuroglia. Tomado de W.B. Saunders Company
13
Figura 3 Tipos de neuronas y sus partes generales. Tomado de W.B. Saunders Company
MARCADORES DE LA ENFERMEDAD.
En la enfermedad de Alzheimer (EA), encontramos la patología descrita por él
médico alemán Alois Alzheimer (a quien se debe su nombre) quien en 1907 publicó en
una revista médica el caso de una mujer de 51 años de edad que había muerto después
de cuatro años de padecer una demencia muy grave.
El estudio patológico del cerebro de esta paciente, evidenció una marcada atrofia
de la corteza con el ensanchamiento correspondiente de las cisternas. Los cortes
histológicos que habían sido teñidos con técnicas argénticas en las cuales se usan sales
de plata mostraron en el parénquima (tejido cerebral) una abundante y masiva
degeneración en la cual se destacaba dos tipos de estructuras particulares. Una de ella
tenía forma de mancha por lo que fue nombrada PLACA SENIL (figura 4) y la otra se
caracterizaba por su forma de “flama”. Esta lesión fue denominada como OVILLO O
MARAÑA NEUROFIBRILAR (Fig. 5) (López y col., 1994).
Figura 4 Placa senil tomada de (Luna y col., 2013).
14
Figura 5. Ovillo o maraña neurofibrilar tomado de (López y col., 1994).
PLACAS SENILES
La formación de las placas seniles se debe a la proteína precursora del β-amiloide
que se encuentra en el gen de la PPA, en la cual existen 2 rutas descritas una la
amiloidogénica y otra no amiloidogénica, la segunda generando un péptido que tiene
una solubilidad limitada y forma autoagregados que constituyen las fibrillas insolubles
que se encuentran en las placas seniles.
En ambos casos el primer paso de la proteólisis de la PPAß ocurre en su extremo amino
por la acción de una ß secretasa. En el proceso amiolodogénico el segundo paso de
proteólisis implica la acción de la γ secretasa que forma péptidos ß de varias longitudes
de los cuales los más importantes son 40 y 42 aminoácidos. La α secretasa participa en
la llamada proteólisis no amiloidogénica de la PPAß. Esta enzima corta entre los
residuos 16 y 17 de la secuencia del amiloide ß evitando su formación. La identidad de
las secretasas involucradas en el procesamiento de la PPAß ha sido definida para la ß
secretasa la cual corresponde a una asparto-proteasa transmembranal, llamada Asp-2;
y la γ secretasa parece ser la presenilina 1 y la α secretasa, una metalo-proteinasa y
desintegrina de la familia de las ADAM llamada ADAM10 (Fig. 6)(López y col., 1994).
Figura 6 Síntesis del β-amiloide
15
OVILLO O MARAÑA NEUROFIBRILAR
A nivel ultraestructural las marañas neurofibrilares (MNFs) son densas
acumulaciones de polímeros conocidos como filamentos helicoidales apareados
(FHAs), los cuales se distribuyen principalmente en la zona perinuclear de la neurona y
sus procesos proximales (Fig. 7). Desde 1988 se descubrió que la proteína tau es el
principal constituyente estructural de los FHA y se sabe ahora que representa la
subunidad misma del filamento.
Figura 7 Proceso de formación de MNFs Modificado de (Martin y col., 2011).
Sin embargo estos marcadores como ya se mencionó están ligados a ciertas
proteínas que se encuentran caracterizadas y a continuación se hace mención de sus
funciones y procesos más significativos. Se tratara primero la proteína β-amiloide,
16
responsable de las placas seniles y la proteína Tau responsable de la formación de las
MNFs.
PROTEÍNAS INVOLUCRADAS EN LA EA
PROTEÍNA β-AMILOIDE
El ßA, péptido de longitud variable (de 39-43 aminoácidos) y un tamaño de 4-6
kDa, es un producto natural del metabolismo de la proteína precursora del amiloide
(PPA). La PPA es codificada por un gen localizado en el cromosoma 21, en la región
21q 11.2-q21.1, y tiene las características estructurales de las proteínas de membrana,
un largo segmento extracelular amino terminal y un corto segmento intracelular
carboxilo terminal. El gen de la PPA contiene 18 exones y probablemente origina una
familia de al menos 8 isoformas transmembranales diferentes, las cuales se diferencian
por la presencia o ausencia de los exones 7, 8, 9 y 15. Las isoformas, que se expresan
en las neuronas (isoforma de PPA con 695, 714, 751 y 770 a. a) que contienen el exón
15 son más amiloidogénicas y liberan mucho más péptido ßA (42) que las isoformas no
neuronales. La PPA se expresa en numerosas células y tejidos del organismo, incluidas
las neuronas, las células musculares lisas de la pared vascular y las plaquetas. A pesar
del tiempo que se lleva estudiando, aún se desconoce la función de la PPA en la célula.
Se piensa que interviene como un receptor ligado a proteínas G de membrana, por
medio de las cuales envía señales químicas al interior de la célula. También se sabe
que su expresión se ve aumentada durante fenómenos de estrés celular, aunque se
desconocen los mecanismos que inducen este aumento o su relación con el desarrollo
de la enfermedad.
El ßA, no la forma monomérica o soluble del péptido ß, es tóxico para las
neuronas, al tiempo que ejerce efectos tróficos sobre las células gliales.
Numerosas evidencias sugieren que los depósitos de ßA desencadenan la respuesta
inflamatoria y no que son subproductos de esta. Sin embargo, la liberación de citoquinas
durante la etapa inicial de esta respuesta conduciría a una mayor acumulación de ßA.
Ha sido demostrado por varias observaciones in situ e in vitro, que el ßA desencadena
la reacción inflamatoria en el cerebro de pacientes con EA. Estas incluyen:
La unión específica del ßA a proteínas de fase aguda.
La capacidad del ßA para activar la cascada del complemento.
La inducción de respuesta en las células gliales en ausencia de pérdida
neuronal.
La secreción y regulación de varios factores y citoquinas por células reactivas
estimuladas por el ßA.
La detección de anticuerpos circulantes que se producen en respuesta a los
acúmulos cerebrales de ßA (Menéndez y col., 2002).
17
PROTEÍNA TAU
La proteína tau, con un peso molecular aproximado de 50-64 kDa. Poseen una
longitud promedio de 352-441 aminoácidos, en función de la presencia o ausencia de
tres secuencias inserto. En dirección del extremo carboxilo, en todas las isoformas de
tau, se presentan tres o cuatro segmentos repetidos los cuales constituyen la parte más
importante de la molécula ya que es la región que tiene afinidad por la tubulina (Martin
y col., 2011).
Tau tiene como función el facilitar la polimerización de la tubulina en la célula, de
manera que se formen los microtúbulos. El gen que codifica para la proteína Tau se
encuentra en el cromosoma 17 y produce un ARNm que se procesa dando lugar hasta
6 isoformas diferentes. Estas isoformas se diferencian entre sí en la presencia o la
ausencia de los exones 2, 3 y 10 (Fig. 8); las combinaciones de estos exones son las
que originan las 6 isoformas (Menéndez y col., 2002).
Figura 8 Isoformas de Tau
La molécula de tau comprende cuatro dominios: región aminoterminal, dominio
rico en prolina, región unida a los microtúbulos (tubulina) y dominio carboxiterminal (Fig.
9).
La región aminoterminal contiene secuencias ácidas y su tamaño es variable.
Esta región se encuentra implicada en la unión a cationes (metales). Contiene
un motivo KKXK, que se ha propuesto como sitio de unión a la heparina.
La región rica en prolina, contiene una gran cantidad de residuos con capacidad
para ser fosforilados, algunos de ellos seguidos de un residuo de prolina y otros
dentro de los motivos PPXXP y PXXP, que son secuencias relacionadas con las
18
interacciones de tau y proteínas con dominios SH3. Esta región rica en prolina
desempeña una misión importante de unión a los microtúbulos.
La región de unión a los microtúbulos contiene copias de una repetición de 31-
32 residuos similares, pero no idénticos, que contiene una secuencia conservada
de 18 aminoácidos ácidicos y una menos conservada de 13-14 residuos,
conocida como la región inter repeticiones. Esta región posee un sitio adicional
de unión a la heparina, y se ha identificado un motivo presente en la proteína
serpina. La proteína tau muestra una estructura plegada al azar con una forma
terciaria no globular. Sin embargo, se ha propuesto una estructura en lámina
beta en la región de unión a los microtúbulos.
Finalmente, la región carboxiterminal de la proteína tau presenta también una
región rica en prolina con residuos que pueden fosforilarse y una región ácida
hacia el COOH terminal. Además, esta región contiene un motivo parecido al de
la subunidad β de la piruvato deshidrogenasa (VVSPWNS) (Sánchez y col.,
2001).
Figura 9 Regiones de la proteína Tau
CAMBIOS MOLECULARES EN TAU
Los cambios en la conformación de Tau pueden ser ocasionados por diferencias
en la estructura primaria de esta proteína y/o por modificaciones postraduccionales. Tau
19
es modificada por fosforilación, glucosilación, ubiquitinización, poliaminación, nitración
y truncación en las posiciones Glu391 y Ser421.
FOSFORILACIÓN DE TAU Y CINASAS INVOLUCRADAS
Tau es una fosfoproteína con un contenido normal de 3 moles de fosfato por mol
de Tau, que en la EA se incrementa a 7-10 moles de fosfato por mol de proteína. En la
EA, esta fosforilación anormal de Tau precede a la aparición de ovillos de filamentos. El
aumento en la estequiometría de fosforilación se debe a la aparición de nuevos sitios de
fosforilación. Se han descrito por lo menos 30 sitios de fosforilación anormal, los cuales
son mayoritariamente Ser o Thr, y el 50% de ellos son sitios canónicos (Ser/Pro,
Thr/Pro) para cinasas dependientes de prolina. La otra mitad de los sitios son
fosforilados por cinasas no-dependientes de prolina.
Las cinasas capaces de fosforilar tau son GSK-3, cdk5, proteincinasa A (PKA),
CaM-cinasa II, proteincinasa C, cinasa activada por mitógenos y cinasa dependiente de
ciclinas 211.
La fosforilación de Tau disminuye su interacción con microtúbulos, y en algunos sitios
—como Ser214, Thr231, Ser235 y Ser262— la fosforilación interfiere en la asociación
de Tau a microtúbulos. Más aún, la fosforilación de tau en ciertos sitios induce la
fosforilación en otros.
FOSFATASAS INVOLUCRADAS EN LA FOSFORILACIÓN DE TAU
El estado de fosforilación de Tau es regulado por fosfatasas. Las fosfatasas PP1,
PP2A, PP2B y PP5 pueden desfosforilar Tau aislada de cerebros de pacientes con EA.
In vivo, el papel de las diferentes fosfatasas no está muy claro. En el cerebro humano,
las fosfatasas más abundantes son PP2A y PP117. La PP2A interactúa con tau y su
inhibición conduce a la generación de Tau hiperfosforilada, la disrupción de
microtúbulos, modificación de la estructura sináptica y la neurodegeneración. Se ha
observado que la actividad de PP2A está reducida en los cerebros de pacientes con EA.
Por lo tanto, Tau hiperfosforilada en la EA y otras taupatías podría causar una deficiencia
en la actividad de fosfatasas, que, a su vez, genera una transiente activación de cinasas,
ya que PP2A regula la actividad de varias cinasas, entre ellas CaM-cinasa II, PKA y
ERK1/2.
TAU GLUCOSILADA
Se ha descrito que EA Tau está aberrantemente N-glucosilada, y que esta
modificación anormal promueve la fosforilación. Tau también es sustrato de O-
glucosilación, la cual es similar en dinámica a la fosforilación en Ser y Thr y es recíproca.
OGlcNAc glucosilación regula negativamente la fosforilación, y los niveles están
disminuidos en la EA. (Alonso y col., 2009).
20
TAU UBIQUITINACIÓN
La ubiquitina es una proteína de 76 aminoácidos que está asociada con proteínas
degradantes dependientes de ATP. Tau puede ser ubiquitinada, sin embargo la
ubiquitinación se ha encontrado en agregaciones aberrantes dentro de cuerpos de
inclusión encontrados en enfermedades como Pick´s o Parkinson, y estas
ubiquitinaciones son encontradas en los FHAs en la enfermedad de Alzheimer como
medida de marcaje para su posterior eliminación. (AVILA y col., 2004).
TAU POLIAMINACIÓN
La reacción de poliaminación por transglutaminasas (TG) Implica una glutamina
(Q) como donador de acilo y una lisina (K) como acilo aceptador. Se genera un enlace
isopeptídico g-glutamil-e-lisina y provoca entrecruzamiento. La zona donante
predominante es Q424 y la región principal receptor se encuentra entre K163 residuos
y K240 (Martin y col., 2011).
TAU NITRACIÓN
La nitración es la adición de dióxido de nitrógeno en la tirosina de una molécula
orgánica. La Nitración en Tau se produce en 4 sitios. La nitración de Tau se sugirió a
ser involucrada en la agregación de esta. La nitración se produce indiscriminadamente
tanto en Tau soluble y Tau insoluble y se encuentra en FHAs. Por lo tanto, la nitración
se propuso para disminuir la capacidad para promover el ensamblaje de la tubulina
Estas datos indican que la nitración de Tau podría facilitar la agregación de esta (Martin
y col., 2011).
TAU TRUNCAMIENTO
Truncamiento de la proteína Tau se produce en cerebros de pacientes con EA
en D13, E391 y D421. Estos truncamientos aumentan la capacidad de Tau para agregar
y contribuir a la ejecución de la apoptosis. La Caspasa-3 realiza una escisión de tau en
D421 conduce a la formación de fragmentos con el peso molecular de 46 y 20 kDa,
mientras que la calpaina mediante su escisión genera un producto de 17 kDa que se
pudiera derivar de la división N-terminal, ya sea los residuos 45 o 230. La agregación
de la proteína tau truncada en E391 y D421 ha sido detectada en cerebros con EA y no
en el control (Martin y col., 2011).
RUTA DE LA INSULINA
El evento inicial para el control de la glucosa principia con la unión de la insulina
a su receptor. Como resultado de esta interacción, las cadenas α y β sufren cambios
conformacionales y autofosforilación en la parte carboxilo terminal de la cadena β. Sólo
21
en estas condiciones es posible que el sustrato del receptor de la insulina (IRS) se adose
a la cadena β para fosforilarse.
La activación del IRS permite que la PI 3-cinasa inicie otra serie de activaciones
y asociaciones de proteínas que rodean a las vesículas que contienen a los
transportadores de glucosa (GLUT). En la translocación del GLUT participan proteínas
que se asocian a las vesículas y proteínas asociadas en la cara interna de la membrana
plasmática. Lo anterior implica no solamente asociación, sino también movilización,
participación de la red del citoesqueleto y fusión de las membranas. En el metabolismo
de la glucosa participan enzimas que convierten la glucosa en energía o la almacenan
en forma de glucógeno (Cruz y col., 2001).
RECEPTOR DE INSULINA
El receptor de la insulina, se clasifica dentro de aquellos receptores con actividad
de tirosina
Cinasas. El gen del receptor de la insulina está localizado en el brazo corto del
cromosoma humano y está constituido por 22 exones distribuidos a lo largo de 150 kb.
Su transcripción da lugar a una proteína precursora que al ser procesada origina dos
cadenas y se generan dos cadenas en el receptor de la insulina solamente se expresa
en músculo, tejido adiposo, hígado y páncreas como un tetrámero, donde las dos
cadenas (135 kDa) ricas en cisteínas y glicinas interactúan con la insulina. Estas
cadenas se unen por puentes disulfuro a dos cadenas (95 kDa) que atraviesan la
membrana plasmática y cerca de la región carboxilo terminal se encuentran los residuos
de tirosinas. La incorporación de la glucosa a las células se hace por mecanismos
diferentes dependiendo del tejido. La insulina ejerce su acción para el control de la
glucosa de manera indirecta a través del receptor de la insulina. El primer evento
específico es la unión de la insulina a las cadenas del receptor. La interacción de la
insulina provoca un cambio conformacional en las cadenas y autofosforilación de las
cadenas Mediante el análisis mutacional de la región intracitoplásmica de la cadena, se
ha podido conocer cuántos residuos de tirosina contiene el receptor y cuál es su función.
Las tirosinas en las posiciones 1158, 1162 y 1163 son esenciales como mediadoras de
la actividad de las tirosina cinasas, la tirosina 960 como sitio de regulación y la tirosina
972 para el anclaje y fosforilación del sustrato del receptor de la insulina (IRS), dentro
de esa región del receptor se encuentran las tirosinas 1328 y 1334 que sirven para
activar a otras proteínas involucradas en la proliferación celular. Las tirosinas 1146, 1150
y 1151 participan en la internalización dependiente del ligando-receptor.12 Además, se
ha demostrado la presencia de residuos de serinas y treoninas que modulan la actividad
de las tirosina cinasas y los sitios para la unión del ATP (Cruz y col., 2001).
22
SUSTRATO DEL RECEPTOR DE LA INSULINA
Después de la autofosforilación del receptor, se inicia la activación de las tirosina
cinasas de los IRSs. Se han identificado cuatro proteínas de IRS (del 1 al 4), siendo el
IRS-1 e IRS-2 (185 y 195 kDa, respectivamente) responsables del control de la glucosa.
El IRS-1 es codificado por un único exón en el cromosoma 2q36-37 y el IRS-2 por el
cromosoma13q34.1 humano.El papel de IRS- 3 e IRS-4 no es del todo claro,
experimentos de sobreexpresión de estas proteínas en adipocitos, muestran un ligero
mimetismo con la acción de la insulina. Las proteínas IRS contienen en su región
Nterminal un grupo homólogo a pleckstrina (PH) que se asocia con fosfolípidos de
membrana y/o proteínas intracelulares, seguido de una proteína de unión a fosfotirosina
(PTB) la cual interactúa con la tirosina 960 en el motivo NPXY del receptor de la insulina.
Otra región conservada es el motivo YXXM que se une al dominio SH12 de la subunidad
p85 de Pl 3-cinasa. En la región carboxilo terminal, la única similitud entre los IRSs
son los sitios de fosforilación. Por ejemplo, IRS-1 e IRS-2 tienen un 35% de homología
en regiones para la interacción de lípido-proteína o proteína-proteína. Además, estas
proteínas a través de los residuos de tirosinas tienen la capacidad de unirse a proteínas
que presentan los dominios SH2 (homólogas al Sre-2) y los dominios SH3 (homólogas
al Sre-3) que se unen a secuencias ricas en prolinas. Otras proteínas también contienen
dominios SH2/SH3 (Cruz y col., 2001).
TÉCNICAS COMPUTACIONALES
ANÁLISIS IN SILICO
En biología existen distintos términos para describir como se realiza un
experimento, como in vivo, in vitro e in situ para describir experimentos realizados en
organismos vivos, fuera del organismo y en el lugar donde se encuentren estos
organismos en la naturaleza, respectivamente. El termino in silico surgió como analogía
a estos para describir un análisis realizado en computadora o experimento realizado
mediante una simulación por computadora.
La bioinformática es el área interdisciplinaria que surgió a partir de la necesidad
de almacenar, consultar, organizar y analizar información biológica. La constante
generación de datos ha llevado a que muchos de los retos en biología sean ahora retos
para la computación. La bioinformática es la aplicación en gran escala de técnicas
computacionales para analizar la información asociada con biomoleculas. Se ha
establecido firmemente como una disciplina dentro de la biología molecular y comprende
un amplio rango de áreas, desde biología estructural y genómica hasta el estudio de la
expresión de genes. Hoy en día, es una parte importante del trabajo de muchos
científicos de las áreas biológicas (Luscombe y col., 2001).
23
IMPORTANCIA DEL MODELADO MOLECULAR
Los modelos moleculares proporcionar el último detalle relativo al movimientos
individual de las partículas como una función del tiempo. Por lo tanto, se pueden utilizar
para hacer frente a preguntas específicas acerca de las propiedades de un sistema o
modelo, a menudo más fácilmente que los experimentos de un sistema real. Claro los
experimentos juegan un papel esencial en la validación de la simulación. Las
comparaciones de la simulación y los datos experimentales sirven para probar la
exactitud de los resultados calculados y para proporcionar criterios para la mejora de la
metodología. Esto es particularmente importante porque las estimaciones teóricas de
errores sistemáticos inherentes en las simulaciones no pueden ser cuantificadas, esto
es, que los errores del modelo empírico son difíciles de calcular (Yip y col., 2002).
¿POR QUÉ ES IMPORTANTE EL MODELADO DE UNA PROTEÍNA?
Las proteínas son dispositivos moleculares, en la escala nanométrica, donde se
ejerce la función biológica. Ellos son los bloques de construcción de todas las células
de nuestro cuerpo y en todos los seres vivos de todos los reinos. Aunque la información
necesaria para que siga la vida esta codificada por la molécula de ADN, el proceso
dinámico de mantenimiento de la vida, la replicación, la defensa y la reproducción se
llevan a cabo por las proteínas (Lesk y col., 2001).
Hay veinte aminoácidos naturales, cuya frecuencia es más alta que otras, con
funciones particulares. Estos veinte aminoácidos se pueden agrupar formando cadenas
de polipéptidos, o proteínas, en diferentes formas determinadas por el código genético
y limitados por las propiedades estereoquímicas. Estas proteínas pueden tener una
expresión constitutiva o transitoria de células en lo que respecta a sus funciones (Xie J.
y col., 2005).
Estos son sólo algunos ejemplos de la función de proteínas. Un hecho notable es que
todas las tareas que pueden realizar se basan en un principio común, los veinte
aminoácidos que pueden formar una proteína. Esa es la razón por la cual las proteínas
se estudian, su composición, estructura, dinámica y función, es tan importante.
Debemos entender cómo estas moléculas se pliegan, cómo se ensamblan para formar
complejos, cómo funcionan, si queremos responder a preguntas como, ¿por qué
tenemos Alzheimer?, ¿por qué nos hacemos viejos?, ¿por qué nos enfermamos?,
¿cómo podemos encontrar curas para muchas enfermedades?
DINÁMICA MOLÉCULAR
La dinámica molecular (DM) es una de las principales herramientas para el
estudio de biomoleculas. Las simulaciones de DM permiten el estudio de procesos
dinámicos complejos de los sistemas biológicos tales como: estabilidad de proteínas,
24
cambios conformacionales, reconocimiento molecular de biomoleculas, transporte de
iones, etc. Es una herramienta teórica clave en el desarrollo de nuevos medicamentos
y como ayuda en la determinación estructural de rayos x y RMN (Yip y col., 2002).
La DM se basa en la segunda ley del movimiento de Newton, 𝐹 = 𝑚𝑎, donde la F
es la fuerza ejercida sobre una partícula, m es su masa y a su aceleración en el sistema.
La integración de las ecuaciones del movimiento, producirá entonces una trayectoria
que describen las posiciones, velocidades y aceleraciones de las partículas en función
del tiempo. A partir de esa trayectoria, se pueden determinar los valores promedio de
las propiedades del sistema. El método es determinístico: una vez que se conocen las
posiciones y velocidades de cada átomo, se puede predecir el estado del sistema para
cualquier valor del tiempo (Vaderrama y col., 2009).
ESQUEMA GENERAL DE UNA SIMULACIÓN POR DINÁMICA MOLECULAR
Las diferentes etapas de una simulación por dinámica molecular se pueden resumir en
el siguiente esquema (Fig. 10):
Figura 10 Esquema general de una simulación por dinámica molecular modificada de (Yip y col., 2002).
Preparación del sistema. Se establece o elige la configuración inicial (CI) a
utilizar compuesta de N átomos y se definen las condiciones de equilibrio (CE).
Equilibramiento. Mediante diferentes esquemas o ensambles de simulación
(microcanónico, canónico, isotérmico-isobárico), se lleva el sistema al equilibrio
donde la energía permanece casi constante. Dependiendo del esquema a
utilizar, se pueden definir condiciones constantes de energía, presión (P) y/o
temperatura (T).
Simulación MD. Se define el tiempo de ejecución (L pasos de ejecución -runs-)
y se corre la dinámica molecular. Este es el paso que requiere el mayor tiempo,
pues puede ir de pocos picosegundos a nanosegundos (horas a semanas). Se
realiza el cálculo de fuerzas del sistema con lo que se pueden obtener las
propiedades fisicoquímicas de interés.
Resultados. Finalmente, se analizan los resultados y se obtiene la información
deseada. Dependiendo del paquete utilizado, se puede hacer el cálculo de un
muchos parámetros, además, se puede analizar la trayectoria o comportamiento
del sistema (animación o película) por medio de visualizadores moleculares con
interface gráfica (Yip y col., 2002).
25
ACOPLAMIENTO MOLECULAR.
El reconocimiento molecular juega un papel clave en los eventos biomoleculares,
como interacciones enzima-sustrato, proteína-inhibidor, proteína-proteína y ácido
nucléico-inhibidor (Bello y col., 2013). El docking molecular es un procedimiento de
química in silico (Ekins y col., 2007)., utilizado para predecir los posibles complejos
ligando-receptor, siendo generalmente el receptor una proteína o un oligómero y el
ligando una molécula de menor tamaño u otra proteína (Brooijmans y col., 2003). El
proceso por el cual una proteína se une a su ligando está influenciado por diversos
factores entrópicos y entálpicos. Además, tanto la movilidad del ligando como la del
receptor, así como el efecto de la proteína sobre la distribución de cargas del ligando y
sus interacciones con las moléculas de agua, complica la descripción cualitativa del
proceso (Brooijmans y col., 2003).
Hay una gran variedad de métodos de acoplamiento computacional, debido a que
utilizan diferentes algoritmos. El procedimiento general iterativo es generar una postura,
puntuarla y compararla con las demás posturas posibles, entonces la actual posición
será evaluada de acuerdo a la puntuación que se obtenga. Los protocolos de docking
se pueden describir como una combinación de dos componentes, estrategia de
búsqueda y función de puntuación o scoring. Un algoritmo de búsqueda riguroso debe
elucidar exhaustivamente todos los modos posibles de unión entre el ligando y el
receptor. Se deben explorar los seis grados de libertad traslaciones y rotacionales del
ligando, junto con los grados de libertad de la conformación interna, tanto del ligando
como del receptor. La solución ideal sería combinar los mejores algoritmos de búsqueda
con las mejores funciones de puntuación, pero en la práctica es inviable debido al
tamaño del espacio de la búsqueda (Taylor y col., 2000).
ANÁLISIS DE ESTRUCTURA SECUNDARIA
El análisis se realizó en el programa PSIPRED, que pertenece a la tercera
generación de algoritmos de predicción que también hace uso de redes neuronales
para analizar patrones de substitución en alineamientos de múltiples secuencias.
Son la tercera generación de métodos (finales de 1990s) y emplean información
evolutiva
Combinan métodos ab initio (de la nada) para predicción de la estructura
secundaria de secuencias individuales e información de alineamiento múltiple de
secuencias homologas (identidad > 35%)
La idea detrás de este enfoque es que proteínas homologas adoptan la misma
estructura secundaria y terciaria Este tipo de métodos han ayudado a mejorar la
26
precisión de predicción en 10% con respecto a los métodos de segunda
generación (Rodriguez, 2013).
PSIPRED
Es un método de predicción de estructura secundaria sencilla y precisa, la
incorporación de dos redes neuronales feed-forward que realizan un análisis sobre la
producción obtenida de PSI-BLAST (Posición Específica Iterado - BLAST).
GRÁFICO DE RAMACHANDRAN
Indica las conformaciones permitidas de polipeptidos. Es factible calcular los
valores de y estéricamente permitido. A si como los no permitidos todos
correspondientes a los radios de distancia de Van der Waals (Donaldy col., 2009). (Fig.
11)
Figura 11 Gráfico de Ramachandran
En el diagrama anterior las zonas blancas corresponden a conformaciones donde
los átomos del polipéptido están más cercanos que sus radios de van der Waals. Estas
regiones son estéricamente no permitidas para todos los aminoácidos, excepto para
Glicina, el cual es el único aminoácido que no presenta cadena lateral. Las regiones
rojas corresponden a conformaciones donde no hay impedimentos estéricos, es decir
estas son zonas permitidas llamadas conformaciones a-hélices y Hojas-b. Las zonas
amarillas muestran las regiones permitidas sí en los cálculos se usan radios van der
Waals ligeramente más pequeños, es decir se permite que los átomos puedan estar un
poco más cercanos. Esto origina una nueva región que corresponde a una hélice con
giro hacia la izquierda. Los L-aminoácidos no pueden formar una hélice con giro a la
izquierda pero ocasionalmente residuos individuales pueden adoptar esta conformación.
Estos residuos generalmente son glicina pero también pueden ser asparragina y acido
aspártico en los que la cadena lateral forma un puente hidrógeno con la cadena principal
27
y así estabiliza esta conformación desfavorable. La hélice 310 se presenta en el extremo
superior-derecho de la región helicoidal y está en el extremo de la región permitida lo
que indica su baja estabilidad
Las regiones no permitidas generalmente involucran impedimentos estéricos
entre el carbono metilénico de la cadena lateral y los átomos de la cadena principal. La
Glicina no tiene cadena lateral y por lo tanto puede adoptar ángulos phi y psi en los
cuatro cuadrantes del gráfico de Ramachandran. Por esto ellas aparecen en regiones
de vueltas de la proteína donde cualquier otro residuo estaría estéricamente impedido
(Oyanedel y col., 2013).
JUSTIFICACIÓN
El presente trabajo se elabora por el creciente número de casos de la EA, en
México. Para poder descubrir nuevos conocimientos de utilidad, obtener mejoras en los
tratamientos actuales, conociendo las bases moleculares de la enfermedad, para poder
actuar y encontrar indicadores tempranos con los cuales la EA será más fácil su
detección; y así, evitar que el desorden neurodegenerativo típico de esta patología, sea
tan agresivo.
En México más de 350,000 personas están afectadas por la enfermedad de
Alzheimer y mueren por ella anualmente 2,030 pacientes. En Estados Unidos hay 4
millones y mueren anualmente más de 100,000, convirtiendo a la enfermedad de
Alzheimer en la cuarta causa de muerte entre adultos. Se estima que uno de cada tres
de nosotros enfrentará esta enfermedad en algún ser querido o en un familiar (Instituto
Nacional de Neurología y Neurocirugía, 2010).
No existe tratamiento o cura para detener o invertir el deterioro mental de la
enfermedad. Sin embargo, los resultados de investigaciones recientes son alentadores.
Varios medicamentos que se utilizan para aliviar los síntomas se encuentran en etapa
de pruebas clínica. Existen otras medicinas disponibles que ayudan a controlar las
alteraciones conductuales (Instituto Nacional de Neurología y Neurocirugía, 2010).
La solución a esta problemática es desarrollar y generar el conocimiento necesario
que nos indique todas las posibles relaciones de desarrollo de la EA.
Este trabajo es realizado, para identificar que proteínas están relacionadas en la
patología de cambios transduccionales en Tau así como las posibles interacciones de
esta proteína y cambios en las rutas por formación de transducisomas, nuestro enfoque
está asociado entre el receptor de insulina y la proteína Tau, el complejo formado entre
Tau, el sustrato del receptor de insulina tipo 1 y el receptor de insulina, así como la
28
posible interacción entre estas rutas tan distantes como son la cadena de la glucolisis y
la EA.
Tomando como premisa esta nueva idea tenemos; que la descripción clásica de
una vía de transducción de señales intracelulares muestra una secuencia lineal de
eventos, en la que los diferentes componentes: receptores, proteínas acopladoras,
amplificadoras y efectoras se encuentran distantes entre sí activándose de manera
sucesiva. Todo esto termina en la activación de efectores que modifican el
comportamiento celular, como ocurre con factores de transcripción que modulan la
expresión de genes específicos que producen respuestas celulares específicas al
estímulo inicial. Sin embargo, este concepto está cambiando (Dehesa y col., 2003).
EL MODELO DE CONDUCCIÓN O “STEERING”
Actualmente, se considera que la transducción de señales no ocurre de manera
lineal, y que las diferentes moléculas que participan no se reclutan individualmente. En
esta nueva visión se considera que se requiere de la formación de complejos
multiproteicos (caso de tau y otras proteínas involucradas en la neurodegeneración)
para que se puedan transmitir las señales. A estas agrupaciones o módulos
multiproteicos se les ha denominado transducisomas, pudiendo requerirse de más de
uno de estos transducisomas en diferentes etapas de un mismo proceso de
señalización. En muchos casos, los elementos implicados en la señalización se
encuentran anclados entre sí por medio de proteínas que funcionan como adaptadoras
o andamios. El estudio de estos complejos multiproteicos ha permitido comprender con
mayor claridad cómo ocurre la integración de distintas vías de comunicación intracelular,
un concepto conocido desde hace mucho tiempo como interacción cruzada (“cross-
talk”). (Dehesa, 2003)
HIPÓTESIS
Esto nos permite sugerir que la primer interacción entre estos complejos fue
reportado por (Mark Yarchoan y col., 2014) en la cual se obtuvo por medio de ensayos
de inmunofluorescencia y ensayos con inmunoblot que el ISR1 y Tau estaban en
asociación y co-localización (Fig. 11), la siguiente idea a tratar se refiere si Tau y INSR
puedan estar presentes en algún complejo.
29
Figura 12 Imágenes de inmunofluorescencia ISR1 y BA con Tau
Formando la primera idea de interacción de acuerdo al modelo de steering,
Dentro de las fosforilaciones se encuentra una fosforilación que se da para mediar el
complejo del sustrato del receptor de insulina para poder actuar en la ruta pleiotrópicas
de insulina, que promueve la migración de esta molécula hasta la membrana celular,
¿pero esto nos sugiere la idea? Siguiendo el concepto de cross-talk que esta posible
relación entre ISR1 y Tau genera la migración de esta molécula hacia la membrana
celular ya que el ISR1 y INSR formando un complejo que activa la ruta de glucolisis, sin
olvidarnos que la interacción de ISR1-Tau forma parte de este complejo a su vez este
permitiría la agregación de tau en la membrana celular. Como ya se mencionó fue
demostrado por (Mark Yarchoan y col., 2014). Ahora recordando que tau posee una
regio rica en prolina en la que se encuentra ubicado un dominio SH3 relacionado con
regiones que son capaces de unirse e interactuar con distintas proteínas, nos surge la
idea que Tau e INSR se encuentran en concomitancia y se acrecienta su expresión en
la EA, siendo ahora un complejo en el cual la ruta pleiotrópica de la insulina se ve
bloqueada generando la interacción entre estas rutas tan distantes. Favoreciendo la
polimerización de Tau en la membrana celular, haciendo posible la relación entre estas
tres biomoleculas; ISR1-Tau-INSR retrasando las rutas pleiotrópicas de insulina y a su
vez favoreciendo la glucosilación de Tau, desencadenando otro de sus cambios
postraduccionales hasta la formación de los FHAs y posteriormente la formación de las
MNFs”. Esta idea relaciona la posible interacción de estas proteínas.
La interacción de la proteína Tau y el receptor de insulina no se encuentran
reportado, es por ello que por medio de una dinámica molecular se determinara la
posible relación entre estas dos moléculas. La siguiente pretensión del trabajo es
identificar por medio de técnicas de inmunoblot que INSR se encuentra presentes en
mayor expresión en casos de Alzheimer, ya que ISR1 se ha demostrado presente en
casos de EA de acuerdo con (Mark Yarchoan y col., 2014). y que la idea de interrelación
entre estas proteínas es factible.
Es por esta razón que los objetivos planteados para este trabajo son los siguientes:
30
OBJETIVOS
Realizar un análisis interactivo con el programa STRING 10 para conocer las
posibles proteínas relacionadas con ISR1,ISNR Y TAU
Realizar el modelo 3D de la proteína Tau isoforma 2, así como su refinamiento.
Realizar un docking molecular para ver en que parte de tau existe interacción
de Tau e INSR
Realizar pruebas de electroforesis y western blot para identificar la presencia
de Tau e INSR en homogenado de cerebro de pacientes con la enfermedad
de Alzheimer
Proponer una hipótesis de la relación Tau-ISR1-INSR
31
METODOLOGÍA
DESCRIPCION GENERAL DEL PROYECTO
Figura 13 Esquema general de proceso del proyecto
32
DESCRIPCIÓN DEL ESQUEMA GENERAL DEL PROCESO
ESTUDIO DE BIOINFORMÁTICA
Se realizó un análisis in silico de las proteínas con el software STRING 10, para
obtener los parámetros de confianza, evidencia, acción, e interactividad entre las
distintas proteínas que guardan relación con Tau, INSR y IRS1(mostrados en
resultados Fig. 15,16 y 17)
En el cual nos centramos en las proteínas de interés que muestran una posible relación
entre ellas.
El siguiente paso fue obtener las secuencias de aminoácidos de nuestras proteínas
mediante el banco de datos que se encuentra disponible en la plataforma virtual de la
National Center for Biotechnology Information (NCBI, por sus siglas en inglés) con los
códigos de acceso correspondientes mostrados en la tabla 1
Tabla 1 Proteínas y código de acceso
Proteína Código de acceso
Tau (MAP) NP_005901.2
INSR AAI17173.1
IRS1 NP_005535.1
Después en la plataforma virtual de I-TASSER se cargaron las secuencias en
FASTA de la proteína Tau para poder obtener su estructura terciaria, este proceso dura
alrededor de 3 días dependiendo del tamaño de la proteína. (Fig. 22 mostrada en
resultados), para poder crear la estructura de la proteína I-TASSER se basa en la
construcción de plantillas en base a la estructura de los aminoácidos, estas plantillas
son seleccionas por medio de homología para poder conseguir un prototipo que se
denominan LOMETS y son mostrados en la tabla 2, después son generados 5 posibles
modelos.
Tabla 2 Lomets para generar la estructura 3D de la proteína Tau
LOMETS CADENA ORGANISMO AMINOÁCIDOS QUE
CORRESPONDEN
1WSO A HOMO SAPIENS 1-412
33
3ZUE A ENFERMEDAD HEMORRÁGICA
DEL CONEJO VIRUS ( RHDV )
PROTEÍNA DE LA CÁPSIDE
2-430, 433-441
2QZV A Rattus norvegicus 1-441
4V6U Pyrococcus furiosus 257-284,314-345,
358-409,
4KA3 B Mus musculus | Homo sapiens 430-438
1WOR A HOMO SAPIENS 1-190, 190-223,
2KJF A Carnobacterium maltaromaticum 14-20, 343-365,410-
416, 420-440
4DUR A HOMO SAPIENS 1-441
1WSO A HOMO SAPIENS 419,439-441
1ZIW A 3-4,5-330,334-441
Dentro de los datos que son arrojados por I-TASSER se selecciona la estructura
secundaria para su posterior análisis en el programa PSIPRED que analizara las
láminas u hojas que se encuentran en su estructura (figura 19 mostrada en resultados)
para poder ser corroborados en la estructura terciaria que obtuvimos primeros.
Después el archivo pdb, que nos da el programa I-TASSER se ilustra, con el
gráfico de Ramachandran para poder ver que estructuras son permitidas y el tipo de giro
y estabilidad de la proteína (Fig. 20 y 21 mostradas en resultados).
Después el archivo que generamos de la estructura 3D lo cargamos en el
programa VMD para iniciar la dinámica molecular.
ESTUDIO PRÁCTICO DEL CASO
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS PROTEÍCOS DE MUESTRAS CON LA EA
Primero en una balanza analítica se pesaron 500 mg de tejido cerebral un control
negativo, parte de lóbulo temporal, y lóbulo frontal izquierdo de casos con Alzheimer,
los cuales se encontraban congelados y conservados en solución STE a pH 7, después
de ser pesados se realizaron 3 lavados con solución STM c/inhibidores, para evitar
cualquier rastro de sangre que se encontrara, en el homogeneizador de potter elvehjem
se colocó cada muestra con 5 mL de solución STM c/inhibidores de proteasas. La
muestra se maceró hasta el punto que todo formó una mezcla sin partículas sólidas
apreciables, a continuación se refrigeró y se continuó el mismo procedimiento con las
demás muestras, al finalizar se etiquetaron de la siguiente forma:
34
Control 01
Lóbulo frontal izquierdo 02
Lóbulo temporal 03
Los 5 mL de muestra fueron dividas cada uno en 3 tubos eppendorf a cantidades
iguales. Todas las muestras fueron centrifugadas a 13 000 rpm a 4°C, excepto un tubo
de cada muestra que se denominó extracto total, el sobrenadante fue retirado, y se
resuspendio el pellet en 5 mL de solución STM c/inhibidores, y se repitió el proceso y
fue retirado el sobrenadante y resuspendido el pellet.
Cada una de las muestras pellet, extracto total y sobrenadante fueron etiquetados de la
siguiente forma:
Pellet #
Sobrenadante SS
Extracto Total TT
Cada muestra fue tratada con isopropanol 1:1 mezclado, y después se centrifugó a 12
000 rpm por 5 min, el isopropanol fue decantado y las muestras re homogenizadas para
medir la concentración de proteínas por el método de Bradford. (Tabla 8 mostrada en
resultados)
Cada muestra fue medida en dos ocasiones para cerciorarnos de la concentración.
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS POR ELECTROFORESIS E IDENTIFICACIÓN POR
WESTERN-BLOT
El procedimiento para preparar las muestras para la SDS-PAGE (mostrada en
descripción del protocolo) se realizó y se prepararon los geles de
Acrilamida/Bisacrilamida al 12% para realizar la electroforesis, cada carril fue cargado
con 20 µg de proteína total por carril. Posteriormente se realizó el corrimiento
electroforético que duro cerca de 4 horas a 80 volts. Se destinó cada gel para lo
siguiente: uno para tinción con colorante azul de Coomassie y otro para
electrotransferencia e inmnodeteción por Western-blot.
Para la tinción del gel se utilizó azul de Coomassie y se puso en agitación por una hora,
después en solución Desteñidora se realizaron 5 lavados, hasta que ya no se teñía la
solución. (Fig. 23 Gel mostrado en resultados)
35
Los siguientes geles fueron transferidos por la técnica de transferencia semiseco
explicada en el protocolo, y fueron incubados los siguientes anticuerpos INSR y TG3,
marcador de actina y cada uno fue puesto en contacto con su anticuerpo secundario
respectivo de acuerdo a la tabla 3
Tabla 3 anticuerpos utilizados
Anticuerpo Anticuerpo secundario Reconoce
INSR Anti mouse IGG Receptor de insulina
TG3 Anti rabbit IGM Tau
Actina Anti IGG Se usa como control de
carga
Posteriormente al tratamiento con los anticuerpos se realizaron los lavados
pertinentes, y se llevaron a revelar y fijar por la técnica de quimioluminiscencia (Fig. 24,
25 y 26 en resultados)
36
DESCRIPCION DETALLADA DE EL PROTOCOLO Y SOLUCIONES PARA LA
REALIZACION DEL PROYECTO
PREPARACION DEL HOMOGENADO DE CEREBRO
1. Se pesaron 500 mg de tejido cerebral, en congelación a -70°C
2. Se lavaron 3 veces en solución STM c/inhibidores
3. En el homogeneizador se re suspendieron con 5 mL de STM c/inhibidores y se
maceraron hasta formar una mezcla homogénea.
4. Se transfirió el homogenado en 3 tubos eppendorf de 2 mL en partes iguales y
se centrifugaron por 3 minutos a 13000 RPM a 4°C
5. El sobrenadante fue retirado y se conservó.
6. Se re suspendió el pellet en 5 mL de STM c/inhibidores y se centrifugo a 13 000
RPM por 3 minutos a 4°C
7. Se recuperó el segundo sobrenadante y se convino con el primero.
8. Se re suspendió el pellet en 5mL de STM c/inhibidores
9. El pellet y el sobrenadante fueron combinados con isopropanol a partes iguales,
mezclados y posteriormente centrifugados a 12 000 RPM por 5 min.
10. Se retiró el isopropanol y se prosiguió a conservar las muestras a -70 °C
SOLUCIONES
TRIS-HCL 1 M
REACTIVO CONCENTRACIÓN
AGUA DESIONIZADA 50 mL
TRIS-HCL 7.88 g
MgCl2 1 M
REACTIVO CONCENTRACIÓN
AGUA DESIONIZADA 10 mL
MgCl2 2.033 g
STM Sacarosa 0.25 M/Tris HCl/ MgCl2
REACTIVO CONCENTRACIÓN
SACAROSA 17.12 g
TRIS-HCL 2 Ml
MgCl2 0.2 mL
AGUA DESIONIZADA AFORAR A 200 mL
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Se filtra a 0.2 micras para, STM c/inhibidores se le agregan todos los inhibidores
preparados.
INHIBIDORES
COMPLETE COCTEL INHIBIDOR DE PROTEASAS
Ref. 11697498001 Roche
2 tabletas 50X en 2 mL de agua desionizada
PMSF
Ref. 78830-SG Sigma
2 mL de PMSF en 2 mL de isopropanol
APROTININ
2 TABLETAS 25u/mL en 10 mL de agua desionizada
DETERMINACIÓN DE CONTENIDO DE PROTEÍNAS (MÉTODO DE
BRADFORT)
La determinación se realizó en el espectrofotómetro Epoch con un algoritmo incluido
para la determinación de la concentración de proteína total.
1. Se toman alícuotas de 2 micro litros de los pellets y el sobrenadante
2. Se ponen en la placa para medir
3. Se programa el espectrofotómetro en la interfaz del ordenador
4. Se selecciona el parámetro de medición (proteínas totales)
5. Se realiza el corrido.
ELECTROFORESIS (SDS-PAGE)
PREPARACIÓN DE MUESTRAS
1. Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada (4x O 2x) en
proporción 3:1
2. (tres partes de la muestra y una de buffer).
3. Asegurar la tapa de los tubos y someter la muestra a una temperatura de 100C
durante 5 minutos.
4. Controlar la temperatura con un termómetro adecuado.
5. Finalizado el procedimiento, agregar 2-mercaptoetanol al 0.05%
6. Conservar muestras
MONTAJE DE LAS PLACAS DE VIDRIO
A. Las placas de vidrio se lavan con agua bidestilada y con papel suave humedecido con SDS 0.2%
B. Se montan ambas placas (en sándwich), checando que queden con las caras internas encontradas y separadas con los espaciadores de plástico (costillas).
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C. Se fijan con los clamps, checando que todos los bordes coincidan (placas, costillas y clamps).
D. Se montan las placas de vidrio con las costillas y se fijan en el soporte equipado con los empaques de plástico.
E. Para comprobar que no hay fuga al montar las placas, se llena con agua bidestilada
PREPARACIÓN DEL GEL
1. Se realiza la mezcla a la concentración de acrilamida que se requiera y se coloca el gel separador.
2. Se coloca una capa de agua para que la superficie del gel quede homogénea y quitar burbujas, se deja gelificar
3. Se deja gelificar (20 - 30 min) y se revisa que se forme la interface entre SDS y gel separador.
4. Se extrae el SDS decantando, con ayuda de una toallita. 5. Se aplica el gel concentrador con una pipeta, calculando la cantidad en base al
peine que se utilizará, considerando que el gel debe llegar al borde superior del sándwich PAGE de vidrio.
6. Se coloca el peine (introduciendo diente por diente y en forma diagonal en el espacio del sándwich) y al final se checa que no queden burbujas, en caso contrario, estas se extraen moviendo el peine.
7. Si el gel concentrador no alcanza el borde del sándwich, se rellena. 8. Se deja gelificar (20-30 min) y posteriormente se extrae el peine.
MONTAJE DE LA CÁMARA DE ELECTROFORESIS
1. Se montan las placas de vidrio con el gel en la cámara de electroforesis.
2. Se pone amortiguador de corrida en las cámaras superior e inferior.
3. Se aplican las muestras (diluidas en buffer de muestra) en los carriles con ayuda de una jeringa Hamilton.
4. Se coloca la tapa con los electrodos y se hace la conexión a la fuente de poder.
5. Se prende la fuente de poder y se coloca al voltaje adecuado.
6. Se deja correr hasta que el frente llegue a nivel del borde inferior del sándwich.
7. Se apaga la fuente de poder, se quita la tapa con electrodos y se extraen las placas de vidrio con el gel.
TINCIÓN DEL GEL
39
1. Se desmontan las placas de vidrio y se colocan sobre una toallita.
2. Se separan las placas de vidrio, se corta una pequeña porción triangular del gel en su extremo inferior izquierdo (que sirve como marca).
3. Se toma el gel con las manos teniendo mucho cuidado para evitar que se rompa y se coloca en una palangana en donde se pone azul de Coomassie (lo anterior también se puede realizar colocando la placa de vidrio en donde está el gel bajo chorro de agua y así el gel resbalará hacia la palangana, después se retira el agua y se pone el colorante).
4. Se coloca la palangana sobre el agitador y se deja teñir entre 15-60 min.
5. Se retira el colorante, se pone solución desteñidora y se coloca nuevamente sobre el agitador.
6. La solución desteñidora se cambia cada que se pinte con el colorante. Esto se repite hasta que el gel este desteñido.
7. Una vez terminado el proceso se lleva a fotografiar el gel. Las fotografías se pegan en una hoja blanca y se les anota como pie de figura las condiciones en que se realizó la electroforesis así como lo que se aplicó en cada carril.
SECADO DEL GEL
Para su conservación, el gel se seca de la siguiente manera.
1. Se toman 2 hojas de papel celofán dulce, se hidratan con agua y posteriormente se bañan con la solución desteñidora.
2. Una de las hojas se pone sobre una placa de vidrio, encima se coloca el gel y finalmente se cubre con la otra hoja de papel.
3. Se tensan amibas hojas de papel, de tal forma que no queden burbujas y se fijan en los cuatro lados con ayuda de costillas de plástico y pinzas de mariposa.
4. Se coloca sobre un soporte giratorio y se sitúa frente a un ventilador y se deja hasta que se seque.
5. Se desmonta el gel ya seco y se corta el exceso del papel celofán dulce, se pega sobre una hoja de papel y se anotan las condiciones de corrida.
SOLUCIONES
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SDS 20%
Dodecil sulfato de sodio (SDS) (PIERCE) 20 g
Agua cbp 100 mL
Almacenar a temperatura ambiente. Esta solución se usa como solución madre.
Acrilamida 30%/Bisacrilamida 0.8%
Acrilamida (SERVA) 30 g
N,N'-metilen-bisacrilmida (BIO-
RAD)
0.8 g
Agua cbp 100 ml
Filtrar por 0.45 mm y almacenar en oscuridad a 4°C hasta por un mes.
Tris-Cl 4X/SDS, pH 6.8 Tris-Cl 0.5M, SDS 0.4%
Mezclar 6.05 g de Trizma base (SIGMA) en 40 ml de agua, ajustar pH a 6.8 con HCl 1
N y aforar a 100 ml. Filtrar por 0.45 µm y adicionar 0.4 g de SDS. Almacenar a 4°C
Tris-Cl 4X/SDS, pH 8.8 Tris-Cl 1.5 M, SDS 0.4%
Mezclar 91 g de Trizma base en 300 ml de agua, ajustar pH a 8.8 con HCl i N y aforar a
500 ml. Filtrar por 0.45 µm y adicionar 2 g de SDS. Almacenar a 4°C.
APS 10%
Persulfato de amonio (BIO-RAD) 100 mg
Agua cbp 1 ml
BUFFER DE CORRIDA 10X
Trizma base (SIGMA) 30 g
Glicina (SIGMA) 144 g
SDS 20% 50 ml
41
EDTA 0.2 M, pH 8 (no es
necesario)
40 ml
Agua cbp 1000 ml
Ajustar pH a 8.3
BUFFER DE MUESTRA 2X
4X Tris-Cl/SDS pH 6.8 25 ml
Glicerol 20 ml
SDS 4 g
2-mercaptoetanol 2 ml
Azul de bromofenol 1 mg
Agua cbp 100 ml
BUFFER DE MUESTRA 4X
4X Tris-Cl/SDS pH 6.8 50 ml
Glicerol 40 ml
SDS 8 g
2-mercaptoetanol 4 ml
Azul de bromofenol 2 mg
Agua cbp 100 ml
Tris-Cl 0.49 M, pH 6.8
Trizma-base (SIGMA) 5.98 g
EDTA o.2 M, pH 8 4 ml
Glicerol 50%
Glicerol (SIGMA) 500 ml
Agua cbp 1 ml
Azul de Bromofenol 0.2%
42
Azul de bromofenol (SIGMA) 20 mg
Agua cbp 10 ml
AZUL DE COOMASSIE
A B
Metanol (BAKER) 50 ml 500 ml
Ac. acético (BAKER) 10 ml 100 ml
Azul Brillante de Coomassie R-250
(SIGMA)
50 mg 500 mg
Agua cbp 100 ml 1000 ml
SOL. DESTEÑIDORA
Metanol 5%/Ac. Acético 10%
Metanol (BAKER) 150 ml
Ac. acético (BAKER) 300 ml
Agua cbp 3000 ml
GEL SEPARADOR
Cantidades de cada reactivo para preparar geles a diferente concentración de acrilamida
Concentración final de acrilamida en el gel (12%)
30% acril/0.8% bis. 6
4XTris-Cl/SDS pH
8.8
3.8
H2O 4.9
APS 10% 0.015
TEMED 0.006
Todos los valores expresados en ml
43
GEL CONCENTRADOR
30% acril/0.8% bis. 0.67
4XTris-Cl/SDS pH
6.8
0.5
H2O 2.7
APS 10% 0.04
TEMED 0.004
Todos los valores expresados en ml
WESTER BLOT
SISTEMA SEMISECO
1. Hacer una electroforesis de la muestra (cada muestra por duplicado).
2. El gel se marca y se sumerge 15 minutos en el buffer de transferencia.
3. La membrana de nitrocelulosa se corta y se sumerge en el buffer de transferencia por 15 min. (la membrana de nitrocelulosa siempre se debe manejar con guantes).
4. Se monta el sistema de transferencia, colocando la membrana de nitrocelulosa en contacto con el gel y se cubren por ambos lados con papel Whatman
5. Se sacan del buffer de transferencia y se escurren. Se colocan en la cámara de transferencia teniendo cuidado que el papel quede hacia el lado positivo y se monta la cámara de transferencia.
6. Se deja correr a 400 mAmp por 60 min.
7. Sacar el sistema de transferencia, se extrae el papel y se marca. Se tiñe con rojo de Punceau para comprobar la transferencia. Se cortan los carriles (previamente identificados),
8. Bloquear con leche descremada 5% en PBS-Tween 0.05% (PBS-T) por una hora.
9. Lavar 5 veces con PBS-T.
44
10. De cada pareja de muestra, una se incuba con el Ac primario por 1-3 hrs a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C. La otra se deja en PBS-T, ya que servirá como control negativo.
11. Lavar 5 veces con PBS-T.
12. Se incuban todas las membranas con el Ac secundario (peroxidado) por 1-2 hrs a temperatura ambiente
13. Lavar 5 veces con PBS-T.
Es recomendable tener un gel control de las proteínas que se están corriendo
teñido con azul de Coomassie y si es posible correr por triplicado la muestra a
transferirse, ya que uno de ellos se teñiría con negro de Amido para que sirva como
control de las proteínas que se transfirieron.
Las membranas de nitrocelulosa con las proteínas transferidas se pueden
almacenar, esto se logra secando la membrana sobre un papel filtro, después se pone
entre dos hojas de papel filtro y todo se envuelve en papel aluminio. Se mantienen en
congelación hasta su uso.
REVELADO POR QUIMIOLUMINISCENCIA
1. Mezclar las soluciones 1 y 2 del kit ECL (Amersham) por partes iguales para tener la solución de revelado.
2. Colocar las membranas sobre un cristal, con la superficie de transferencia hacia arriba, se cubren con la solución de revelado y se incuban 1 min.
3. Retirar el exceso de solución reveladora y los papeles se colocan sobre un plástico.
4. Cubrir con otro plástico, de tal forma que el papel quede envuelto. 5. Colocar dentro del chasis radiográfico y poner la película radiográfica en contacto
con la membrana cubierta por el plástico, cuidando que la superficie de transferencia del papel quede dirigida hacia la radiografía.
6. Cerrar el chasis y dejar exponiendo la placa radiográfica por un minuto.
7. Sacar la placa radiográfica y sumergir en solución reveladora hasta que aparezcan las bandas. Se saca y se lava con agua.
45
8. Sumergir en solución fijadora 3-15 min.
9. Sacar la placa radiográfica del fijador, lavar con agua y dejar secar.
Dependiendo de la señal obtenida, se puede repetir y el tiempo de exposición de
la placa al papel puede aumentarse o disminuirse.
SOLUCIONES
Buffer de Transferencia
Solución 1 (Tris/Glicina 5X)
Tris 30.2 g
Glicina 144.2 g
Agua 1800 ml
Aforar con agua 2000 ml
Ajustar pH 8.3 con glicina
Para preparar el buffer de transferencia:
Solución 1 (Tris/Glicina 5X) 1 volumen
Metanol 1 volumen
Agua 3 volúmenes
Rojo de Ponceau
Rojo de Ponceau 0.5% en ácido acético 2%
Negro de Amido 0.1%
Negro de amido (SIGMA) 100 ml
Ac acético (BAKER) 10 ml
Metanol (BAKER) 10 ml
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Leche Descremada 5%
Leche descremada (SVELTES) 5 g
PBS-Tween 0.05% cbp 100 ml
Buffer de Fosfatos 50 mM
Ac fosfórico 1 M 50 ml
Agua cbp 1000 ml
Ajustar pH a 7.4.
Sol. NiCo
NiCl2 (SIGMA) 30 mg
CoCl2 (SIGMA) 30 mg
Agua cbp 3 ml
SECUENCIA DE LA PROTEÍNA TAU
En el banco de datos de NCBI se buscó la proteína tau correspondiente a la
isoforma 2 de homo sapiens la cual posee un código de acceso NP_005901, y se
descargó en formato FASTA para posteriormente ser utilizada en el programa I-TASSER
(Fig. 18 en Resultados).
ESTRUCTURA SECUNDARIA
Se realizó en el programa PSIDRED para obtener el su estructura secundaria con
base a la secuencia de aminoácidos de la proteína Tau (Fig. 19 mostrada en resultados).
I-TASSER
Es un servicio de bioinformática basado en procesos estadísticos, de homología e
interacción molecular que predice la estructura y función de las proteínas. Permite a
los usuarios generar automáticamente predicciones de alta calidad de la estructura 3D
y la función biológica de las proteínas a partir de sus secuencias de aminoácidos.
¿CÓMO FUNCIONA I-TASSER?
Cuando los usuarios envían una secuencia de aminoácidos, el servidor primero
intenta recuperar plantillas de proteínas de pliegues similares (o estructuras súper-
47
secundarias) de la biblioteca de base de datos de proteínas (PBD) Contiene todos los
modelos estructurales de proteínas y de ácidos nucleicos, experimentalmente
resueltos por cristalografía de Rayos X y por RMN y que están disponibles
públicamente. No contiene modelos derivados por homología u otros tipos de
modelos teóricos. (Rhodes y col., 2002).
En la segunda etapa, los fragmentos continuos extirpados de las plantillas de PBD
se vuelven a montar en los modelos de larga duración por réplica de intercambio de
simulaciones de Monte Carlo que pertenece a una ecuación estocástica de mecánica
molecular que se realiza para la interacción con un solvente. (Vaderrama y col., 2009).
Con las regiones no alineadas (bucles principalmente) construidos por modelización ab
initio (desde la nada). En los casos en que ya hay una plantilla adecuada se identifica
por LOMETS (es un servicio web en línea para la estructura de la proteína de predicción.
Genera modelos 3D mediante la recopilación de alineaciones - diana de alta puntuación,
alineadas a la plantilla, consta de 9 programas de roscado instalados localmente ( FFAS
- 3D , HHsearch , Muster, pGenTHREADER , las EPP , la República Popular China ,
PROSPECT2 , SP3 y CHISPAS - X ), I-TASSER construirá el conjunto de estructuras
de modelización ab initio. Los estados de baja energía libre se identifican por un
algoritmo de agrupamiento para identificar los modelos de estructura nativa más
cercanos de un grupo de estructuras de proteínas señuelo. (SPICKER). En el tercer
paso de la simulación de montaje fragmento, se realiza de nuevo a partir de los
centroides de racimo SPICKER. El propósito de la segunda iteración es eliminar el
choque estérico, así como para refinar la topología global de los centroides de racimo.
Los señuelos generados en la segunda simulación son entonces agrupados y las
estructuras de energía más bajos son seleccionados.
Los modelos finales se obtienen por un algoritmo para la construcción de
proteínas de estructuras atómicas de rastreo de C- alfa mediante la optimización de las
redes de enlaces de hidrógeno de cadena principal (REMO) que construye los detalles
atómicos de los señuelos e I-TASSER selecciona mejor optimización. (Véase la Fig. 14
tomado de I-tasser.com).
48
Figura 14 Pasos de I_TASSER para generar la estructura 3D
¿POR QUÉ I-TASSER?
Porque ha sido ganador del premio CASP que se basa en la evaluación crítica
de la predicción de las estructuras de proteínas. Estos experimentos tienen por objeto
establecer el estado actual de la técnica en la predicción de estructura de la proteína,
identificando lo que se ha avanzado, y destacando el esfuerzo.
GRÁFICO DE RAMACHANDRAN
El gráfico se realizó en la plataforma virtual
http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php,. Para evaluar la viabilidad
estructural de la proteína (Fig. 20 y 21 en resultados)
DINÁMICA MOLÉCULAR
El modelo 3D de la proteína Tau se sometió a un proceso de refinamiento por DM
en el programa NAMD versión 2.8 (Phillips y col., 2005). utilizando el campo de fuerza
CHARMM27 (MacKerell y col., 1998)., en servidores GPU basados en CPU intel X5675
CON 2070/2075 y tarjetas Tesla GPU. Todas las DMs se realizaron en el cluster híbrido
de la unidad de supercomputo-Xiuhcoatl del CINVESTAV-IPN
(http://clusterhibrido.cinvestav.mx/). Las condiciones de unión periódicas usadas en la
DM fueron; las partículas mesh Ewald (PME) necesarias para las interacciones
electrostáticas (Batcho y col., 2001). Los parámetros de campo de fuerza de las
49
interacciones no-unidas fueron: corte 9 Å y 2 fs de tiempo. Los átomos de hidrógeno se
añadieron usando el psfgen software, del programa de VMD (Humphrey y col., 1996).
El sistema fue sometido a reducción de mínima energía en 1000 pasos, seguidos por el
equilibrio del sistema por 1 ns de simulación. La DM se realizó por 100 ns, utilizando el
ensamble NTV.
Posterior al refinamiento por DM, se tomó el último snapshot que corresponde al
plegamiento estructural que adopta la proteína en determinado momento de la DM y se
sometió nuevamente al gráfico de Ramachandran para comprobar el refinamiento de
los ángulos de torsión.
ANÁLISIS DE LA TRAYECTORIA DE DM
La DM se sometió a los siguientes análisis estructurales: desviación de la raíz
cuadrática media RMSD (por sus siglas en inglés root mean square deviation), que
evalúa la convergencia del sistema durante la trayectoria de DM, radio de giro (RG) que
es un parámetro geométrico que define la compactación o expansión del sistema
durante la trayectoria de la DM, y las fluctuaciones raíz cuadrática media RMSF (por sus
siglas en inglés root mean square fluctuations) que evaluá la flexibilidad de los cα
durante la trayectoria de DM. El análisis estructural se realizó con el programa Carma
así como los "snapshots" o la captura estructural de cierto momento en la trayectoria de
DM, con los cuales se realizaron los docking de las proteínas (Glykos y col., 2006).
ACOPLAMIENTO MOLECULAR
Se realizó el acoplamiento molecular proteína-proteína en el sevidor Cluspro 2.0
(http://cluspro.bu.edu/login.php?redir=/queue.php). Cluspro se encuentra dentro de los
mejores servidores para la predicción de uniones proteína-proteína, de acuerdo con
CAPRI (Critical Assestment of Predicted Interactions) (Vajda y col., 2009), Cluspro
realiza acoplamiento proteína-proteína y las acopla con las diferentes tipos de uniónes
que puede adoptar, entre estas se encuentran, las uniones por puentes de hidrógeno,
uniones por puentes de sal, interacciones electrostáticas y uniones hidrofóbicas cada
una de las uniones tiene un valor de acuerdo con el número de aminoácidos participando
en la unión y la magnitud de la fuerza de esta unión de tal manera que cada
conformación del heterodímero tiene un valor global conocido como energía mínima y
es a partir de este valor y el número de repeticiones de la unión, es decir cuando se
realiza el docking el algoritmo que utiliza el programa realiza el acoplamiento 100 veces,
a esto le denominamos cluster de acoplamiento, por lo tanto de acuerdo al modelo de
menor energía y el modelo más repetitivo en el cluster, se elige el mejor modelo de
acuerdo a la menor energía global. Se realizaron acoplamientos moleculares para
predecir la interacción entre las proteína TAU y el receptor de insulina se eligió el modelo
de menor energía.
50
RESULTADOS
ANÁLISIS IN SILICO
RELACIÓN ENTRE PROTEÍNAS
Resultados de la pruebas in silico de las proteínas relacionadas con Tau, INSR y
ISR1 obtenidas por el programa STRING 10. Y la acción que tienen con la proteína.
PROTEÍNA TAU (MAPT)
Figura 15 Proteínas relacionadas con Tau tomado de STRING 10
Este análisis arroja las siguientes funciones con base a la relación con TAU
Tabla 4 Muestra las interacciones que tienen Tau con las distintas proteínas
Proteína Activación Inhibición Unión Postraduccionales
PRKACA
CDK5
YWHAZ
GSK3B
MARK2
FYN
UBC
MAPK8
SNCA
STUB1
51
SUSTRATO DEL RECEPTOR DE INSULINA 1 (IRS1)
El receptor de la insulina, se clasifica dentro de aquellos receptores con actividad
de tirosina cinasas. Puede mediar el control de diversos procesos celulares por la
insulina. Cuando es fosforilado por el receptor de la insulina se une específicamente a
varias proteínas celulares que contienen dominios SH2 tales como fosfatidilinositol 3 -
quinasa subunidad p85 o GRB2. (Cruz y col., 2001).
Figura 16 Proteínas relacionadas con ISR1 tomado de STRING 10
Este análisis arroja las siguientes funciones con base a la relación con IRS1
Tabla 5 Proteínas con interacción a IRS1
Proteína Activación Inhibición Unión Catálisis Postraduccionales Reacción
MAPK8
PIK3R1
GRB2
IGF1R
JAK2
PTPN11
PIK3CA
SOCS1
JAK1
INSR
52
RECEPTOR DE INSULINA
Figura 17 Proteínas relacionas con el INSR tomado de STRING 10
Este análisis arroja las siguientes funciones con base a la relación con INSR
Tabla 6 Interacción de proteínas con INSR
Proteína Activación Inhibición Unión Catálisis Postraduccionales Reacción Expresió
n
IRS1
PTPN1
SHC1
IRS2
GRB10
GRB14
INS
PIK3R1
PTPN11
SOCS3
En los resultados obtenidos no se observa relación con la proteína Tau, con INSR
e ISR1, ya que no existen estudios reportados entre estas interacciones.
Pero podemos apreciar que la proteína MAPK8 es una de las encargadas de la
activación de la proteína Tau, esta a su vez se relaciona con ISR1 en cambios
53
postraduccionales de unión e inhibición a su vez el ISR1 está relacionado con INSR en
procesos de activación, unión, catálisis, cambios postraduccionales y de reacción.
Brindándonos un panorama de estudio entre estas biomoleculas.
ESTRUCTURA PRIMARIA
Estructura primaria secuencia de aminoácidos tomada de NCBI proteína Tau isoforma
2
Proteína Asociada a Microtúbulos Tau isoforma 2 [Homo sapiens]
MAEPRQEFEVMEDHAGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLKESPLQTPTEDGSEEPGSETSDAKS
TP
TAEDVTAPLVDEGAPGKQAAAQPHTEIPEGTTAEEAGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSKSKDGTGSD
DK
KAKGADGKTKIATPRGAAPPGQKGQANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKSGDRSGYSSPGSPGTPGS
RS
RTPSLPTPPTREPKKVAVVRTPPKSPSSAKSRLQTAPVPMPDLKNVKSKIGSTENLKHQPGGGKVQII
NK
KLDLSNVQSKCGSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSKCGSLGNIHHKPGGGQVEVKSEKLDFKD
RV
QSKIGSLDNITHVPGGGNKKIETHKLTFRENAKAKTDHGAEIVYKSPVVSGDTSPRHLSNVSSTGSID
MV
DSPQLATLADEVSASLAKQGL
Figura 18 Formato FASTA de Tau isoforma 2 Homo Sapiens tomado de NCBI NP_005901.2
54
ESTRUCTURA SECUNDARIA
Se refiere a la ordenación regular y periódica en el espacio de las cadenas
polipeptidicas a lo largo de una dirección. Los enlaces que mantienen esta estructura
son no covalentes; lo que se pretende es adoptar conformaciones de menor energía
libre y, por tanto más estable. (Garrido, 2006)
EL análisis se realizó en el programa PSIPRED obteniendo lo siguiente
Figura 19 Análisis de la estructura secundaria de Tau isoforma 2 tomado de PSIPRED
Los rectángulos azules indican el nivel de energía de la estructura en base al
algoritmo de predicción de la estructura. Como también se indican las estructuras
formadas por la secuencia de aminoácidos encontrando en la posición 275-279 el primer
dominio repetido, 305-310 la segunda, 337-341 la tercera y el aparte final entre los
aminoácidos 426-439 encontramos el carboxilo terminal.
En rosa se observan las alfa hélices
La flecha amarilla indica las hojas
beta
Las flechas indican los dominios
repetidos, el cilindro indica el carboxilo
terminal.
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GRÁFICO DE RAMACHANDRAN
Figura 20 Gráfico de Ramachandran tomado de RAMPAGE
Tabla 7 Porcentaje de residuos permitidos, no permitidos dentro del gráfico de Ramachandran
Numero de residuos en región favorable 71.8 % 315
Numero de residuos en región permitida 21.6% 95
Numero de residuos en región no permitidita 6.6% 29
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Figura 21 Gráfico General de Ramachandran
57
MODELO DE TAU
Figura 22 Estructura 3D de la proteína Tau modelada en VMD
En la figura 22 podemos apreciar la estructura 3D de la proteína Tau. Se obtuvo
en el programa computacional I-TASSER, y es representado mediante el programa VMD
de interfaz gráfica, con el cual se hizo la representación de esta proteína en forma de
caricatura, en la cual se puede observar en su estructura los dominios repetidos con
unión a microtúbulos por flechas en color amarillo, los colores azul fuerte indican los
dominios repetidos de prolina en la parte derecha inicial ubicamos el amino terminal y la
parte final el carboxilo terminal su estructura es muy peculiar ya que no encaja en la
descripción general de una proteína, globular o fibrilar, ya que su forma distendida y
alargada carece de una descripción exacta, esto debido a su enorme flexibilidad para
poder brindar estructura a los microtúbulos.
58
ESTUDIO PRÁCTICO
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
Se realizó la determinación de proteínas por el método de Bradford, en el cual se
obtuvieron los siguientes resultados.
Tabla 8 Cuantificación de proteínas método de Bradford
Muestra Concentración mg/mL
Control pellet 2.152
Control sobrenadante 0.329
Control proteína total 5.848
Frontal izquierdo pellet 7.222
Frontal izquierdo sobrenadante 0.883
Frontal izquierdo proteína total 8.749
Lóbulo temporal pellet 3.736
Lóbulo temporal sobrenadante 1.068
Lóbulo temporal proteína total 5.08
CORRIDA EN GEL AL 12% EN BIS-POLIACRILAMIDA.
Se realizó una corrida en gel de bis-poliacrilamida al 12% cargando distintas
muestras de tejido cerebral en cada uno de los carriles obteniendo lo siguiente (los
sobrenadantes no fueron considerados)
Y el orden de carga fue el siguiente:
Tabla 9 Orden de carga en el gel de bis-poliacrilamida
Muestra
Marcador de peso molecular
Control pellet
Control proteína total
Frontal izquierdo pellet
Frontal izquierdo proteína total
Lóbulo temporal pellet
Lóbulo temporal proteína total
59
Figura 23 Corrida en gel de bis-poliacrilamida 12% a 100 V por 2.5 h
En la figura 23 se muestra la corrida en gel de bis-poliacrilamida en la cual el primer
carril se observa el marcador de peso molecular en los carriles 2 y 3 se muestran los
controles en los cuales se observan pequeñas bandas idénticas en ambos carriles en
los carriles siguientes tenemos en las partes inferiores bandas alrededor de los 20 y 10
kDa que los casos control no presentan.
INMUNOBLOT
Se realizaron 3 diferentes pruebas para el inmunoblot en los cuales se usaron en
primer lugar un marcador de actina en el cual verificamos que la cantidad de muestra
es la misma, la segunda prueba se realizó con el anticuerpo secundario para descartar
falsos positivos, y los anticuerpos utilizados fueron TG3 que detecta a la proteína Tau,
y anticuerpo para el receptor de insulina.
Se usaron dos carriles con anti-actina en el cual se puede apreciar que el tamaño y la
intensidad de las bandas son muy similares.
60
Figura 24 Inmunoblot con anti actina
En el segundo inmunoblot se utilizó TG3 para determinar la presencia de Tau en
la muestra en los casos con enfermedad de Alzheimer se notan las bandas más
marcadas en los carriles del 3 al 6 y en los carriles 1 y 2 esas marcas no se encuentran,
se puede inferir que los casos con Alzheimer presentan estas bandas, y debido a que
los anticuerpos son específicos en los casos con Alzheimer
Podemos decir que la proteína Tau está presente.
Figura 25 Inmunoblot con anticuerpo TG3, detección de Tau
En el tercer inmunoblot utilizamos el anticuerpo para el receptor de insulina. En el
cual podemos notar que hay bandas no definidas en los casos de control pero en los
casos podemos notar que aparecen bandas en los carriles 4 y 5 de derecha a izquierda
alrededor de los 37 kDa, en lo cual podemos suponer que se encuentra en mayor
expresión el receptor de insulina en casos de Alzheimer.
Figura 26 Inmunoblot con anticuerpo de receptor de insulina
61
DISCUSIÓN
En nuestro estudio se presenta la enfermedad de Alzheimer como uno de los
principal padecimientos que van en aumento en nuestra sociedad, se considera un tema
de prioridad ya que la inminente tasa de casos abarca cerca de los 350 000 pacientes
solo en México, haciendo de prioridad estudios que busquen encontrar una plausible
solución o aminoramiento de los síntomas tan marcados que muestra esta patología.
El análisis hecho sobre los casos de esta enfermedad muestran una sintomatología ya
descrita (López, 1994), de la cual retomamos lo ya establecido para poder explicar uno
de los estadios que se encuentra ubicado en la polimerización de la proteína Tau, en la
membrana celular de las neuronas propiciando su acumulación hasta la formación de
los pares helicoidales apareados y la formación de las marañas neurofibrilares. Dentro
de este estadio encontramos la relación de la proteína Tau y el sustrato del receptor de
insulina demostrado por (Mark Yarchoan y col., 2014)., esto nos abre la ventana para
poder relacionar lo que se conoce como “cross-talk” interacción cruzada en la cual se
demuestra que ciertas proteínas con dominios específicos generan relaciones no
lineales en las rutas metabólicas utilizando estas proteínas no solo como activadoras,
sino como moléculas de trasporte o andamiaje. Esto es que el complejo formado por la
proteína Tau-ISR1-INSR, genera un transducisoma que dentro de la vía de
neurodegeneración típica de esta enfermedad está inmersa propiciando uno de los
mecanismos de reclutamiento de polimerización de la proteína Tau en la membrana
celular, y esto a su vez propiciara la glicacion de más fragmentos de la proteína Tau ya
que la ruta pleiotrópica usual de la insulina se verá afectada en el transcurso, una
manera de probar esta relación es mediante el uso de los anticuerpos. En este caso el
receptor de insulina detectará que proteínas se encuentran unidas al receptor y si este
se encuentra en mayor expresión en casos Alzheimer como lo descrito en resultados,
ya que se encuentran bandas distintivas en casos de la enfermedad y en los casos
control estas bandas se encuentran ausentes. Esto a su vez queda limitado en la
comprobación de que tipo de proteína se está interrelacionando con el INSR, ya que
requiere de una inmuno-precipitación y una secuenciación para poder determinarlo.
Estos estudios por practicidad son sustituidos por cuestión de tiempo y limitación del
material con un Docking molecular para probar la interacción entre estas dos moléculas,
que enes mostrado en el trabajo por limitación de tiempo ya que el resultado se obtendrá
a finales del mes de enero de 2016, lo cual la presentación de este proyecto es el día
8 de enero de 2016. Los estudios in silico realizados no muestran relación entre estas
62
proteínas. Pero esto no quiere decir que la relación no existe. Pues no se han reportado
más trabajos afines a este proyecto y a (Mark Yarchoan y col., 2014).
CONCLUSIÓN
En los inmunoblot realizados observamos algunas bandas distintivas en los casos de
Alzheimer, en comparación con los casos control. Esto dándonos un indicativo que el
receptor de insulina se encuentra en mayor expresión con casos de esta enfermedad.
La elaboración del el modelo tridimensional de la proteína Tau se elaboro para conocer
su estructura . sus dominios y su disposición para posteriormente verificar por medio
computacional una buena estabilidad tanto en la distribución de los aminoácidos, como
en la menor energía.
El estudio in silico de las proteínas con relación con a Tau muestran que no existe una
relación estrecha esto debido a que aún no se tiene el conocimiento adecuado de esta
enfermedad y todas sus posibles relaciones con otras proteínas y rutas metabólicas.
RECOMENDACIONES
Para optimizar los resultados obtenidos, se sugieren técnicas de espectrofotometría de
masas para determinar las secuencias de las proteínas, que están asociadas al receptor
de insulina tipo 1, que se observan en el gel de bis-poliacrilamida al 12% entre los pesos
moleculares 40 y 25 KDa.
Se sugiere realizar ensayos de cambio en la corrida electroforética (Electrophoretic
Mobility Shift Assay; EMSA por sus siglas en inglés) para poder dar una idea mayor de
que proteínas están asociadas al receptor de insulina en la EA, y poder tener una idea
mayor entre que rutas metabólicas y bajo que dominios estas proteínas cambian su
función que se afecta por el steering molecular, pueden ser de provecho para detectar
y contrarrestar los deterioros de esta enfermedad.
63
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