ii UFSM Dissertação de Mestrado VARIABILIDADE GENÉTICA DE...
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ii UFSM Dissertação de Mestrado VARIABILIDADE GENÉTICA DE Acacia mearnsii De Wild. QUANTO À RESISTÊNCIA AO COMPLEXO DE FUNGOS CAUSADORES DE GOMOSE Rita de Cassia Sobrosa PPGEF Santa Maria, RS, Brasil 2001
Transcript of ii UFSM Dissertação de Mestrado VARIABILIDADE GENÉTICA DE...
ii
UFSM
Dissertação de Mestrado
VARIABILIDADE GENÉTICA DE Acacia mearnsii De Wild. QUANTO À RESISTÊNCIA AO COMPLEXO DE FUNGOS
CAUSADORES DE GOMOSE
Rita de Cassia Sobrosa
PPGEF
Santa Maria, RS, Brasil
2001
ii
VARIABILIDADE GENÉTICA DE Acacia mearnsii De Wild. QUANTO À RESISTÊNCIA AO COMPLEXO DE FUNGOS
CAUSADORES DE GOMOSE
por
Rita de Cassia Sobrosa
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-
Graduação em Engenharia Florestal, Área de Concentração em
Silvicultura, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS),
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Engenharia Florestal.
PPGEF
Santa Maria, RS, Brasil
2001
ii
Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
VARIABILIDADE GENÉTICA DE Acacia mearnsii De Wild. QUANTO À RESISTÊNCIA AO COMPLEXO DE FUNGOS
CAUSADORES DE GOMOSE
elaborada por:
Rita de Cassia Sobrosa
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Engenharia Florestal
COMISSÃO EXAMINADORA:
Profa. Dra. Maisa Pimentel Martins Corder (Presidente/Orientadora- UFSM)
Profa. Dra. Alice Battistin- UFSM
Dr. Celso Garcia Auer- EMBRAPA- Florestas
Prof. Dr. Ricardo Balardin- UFSM
Santa Maria, 29 de janeiro de 2001
1
Este trabalho é dedicado com carinho a meu querido avô
Orestes Sobrosa (in memoriam), a minha amiga Angélica Adriana
Goz (in memoriam), a minha mãe Orieta Souza Sobrosa e a toda a
minha família, que sempre me apoiou.
2
AGRADECIMENTOS
Quero, aqui, manifestar minha gratidão:
À minha orientadora, Profa Dra Maisa Pimentel Martins Corder,
pelo seu profissionalismo e competência, incentivo, amizade, interesse,
dedicação, convivência, e por acreditar no meu ideal de vida.
À minha mãe, Orieta Souza Sobrosa e a meus tios Arani César
Pereira, Aramis Sobrosa e Marilei Sobrosa, pela sua amizade, apoio e
constante carinho e afeto em todos os momentos.
À amiga Mariela Pasa pela contribuição e incentivo, e a minhas
primas Cláudia Rocha e Márcia Rocha, pela amizade, apoio e carinho.
À colega e amiga, Engenheira Florestal Jocelaine Bolzan Della-
Flora, pelas horas de estudo, amizade, convivência e carinho.
Às colegas e amigas, Engenheiras Florestais Cristiane Raddatz e
Veronilda Bonet de Quadros, pelo estímulo, amizade e auxílio na
instalação de experimentos.
Aos acadêmicos do Curso de Engenharia Florestal e amigos Flávia
Elise Meneguini dos Santos, pela sua amizade, apoio e contribuição
3
efetiva durante toda a execução do trabalho, Jônatas Davi Stiegemeier e
Vanessa Fiad Amaral, pela contribuição na instalação de experimentos.
À Empresa Florestal AGROSETA S.A., através do Engenheiro
Florestal Elias Moreira dos Santos, pela colaboração na coleta de
material e instalação de experimentos.
Aos professores e amigos Vanoli José Xavier Lopes e Amélia
Moema Veiga Lopes, pelo incentivo, amizade e constante apoio.
À professora Ruth Farias Larré pela revisão de Português.
A todas aquelas pessoas que, de uma forma ou de outra,
colaboraram para a elaboração deste trabalho, agradeço.
A Deus, por ter me ajudado nas horas mais difíceis de minha vida.
4
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................ ix
ABSTRACT................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS................................................................... xiii
LISTA DE FIGURAS.................................................................... xvi
LISTA DE ANEXOS...................................................................... xxi
1 INTRODUÇÃO........................................................................... 01
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.................................................... 06
2.1 Sintomas de gomose na A. mearnsii........................................ 06
2.2 Resistência vertical e horizontal.............................................. 11
2.3 Mecanismos de resistência....................................................... 16
2.4 Estado da arte do melhoramento genético para resistência a
doenças em espécies florestais.................................................
22
2.4.1 Melhoramento genético convencional.................................... 22
2.4.2 Utilização da biotecnologia como ferramenta para o
melhoramento genético, visando à resistência a doenças em
espécies florestais.....................................................................
26
2.4.2.1 Cultura de tecidos e resistência a doenças........................... 26
2.4.2.2 Marcadores genéticos na resistência a doenças.................... 29
2.4.2.3 Engenharia genética na resistência a doenças...................... 33
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................ 37
3.1 População.................................................................................. 37
3.2 Descrição da área de coleta do material................................. 38
5
3.2.1 Localização.............................................................................. 38
3.2.2 Clima....................................................................................... 38
3.2.3 Relevo e geologia.................................................................... 39
3.2.4 Solos........................................................................................ 39
3.3 Isolamento e cultivo de patógenos associados à gomose da
A.mearnsii........................................................................................
40
3.4 Teste de patogenicidade........................................................... 41
3.4.1 Teste de patogenicidade em mudas de A. mearnsii................. 41
3.5 Instalação dos testes de progênies.............................................. 44
3.5.1 Coleta de sementes.................................................................. 44
3.5.2 Teste de germinação................................................................ 46
3.5.3 Testes de progênies................................................................. 47
3.5.3.1 Delineamento experimental.................................................. 48
3.5.4 Inoculação dos fungos............................................................. 49
3.6 Teste de inoculação em árvores de A. mearnsii no campo......... 52
3.7 Avaliações da severidade dos sintomas nos testes de progênies 54
3.8 Análises estatísticas.................................................................... 58
3.9 Estimativa de parâmetros genéticos........................................... 59
3.9.1 Estimativa do coeficiente de herdabilidade............................. 59
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................. 61
4.1 Teste de patogenicidade............................................................. 61
4.2 Testes de progênies.................................................................... 64
4.2.1 Experimento I: teste de progênie (PS1, PS2, PS3, PR6, PR7,
PR10 e PRS11) de A. mearnsii visando resistência à
6
gomose................................................................................... 64
4.2.2 Experimento II: teste de progênie (PS4, PS5, PR8, PR9 e
PRS11) de A. mearnsii visando resistência à gomose...........
87
4.2.3 Experimento III: teste de inoculação sem ferimento............... 104
4.3 Teste de inoculação em árvores de A. mearnsii no campo, com
os isolados I1 (Cylindrocladium sp.), I3 (Fusarium sp.) e I5
(Pestalotia sp.)...........................................................................
108
4.4 Índice de Suscetibilidade............................................................ 112
5 CONCLUSÕES............................................................................. 119
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................. 121
7
RESUMO
Dissertação de Mestrado Programa de Pós-Graduação em Engenharia Florestal Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil
VARIABILIDADE GENÉTICA DE Acacia mearnsii De Wild. QUANTO
À RESISTÊNCIA AO COMPLEXO DE FUNGOS CAUSADORES DE GOMOSE
AUTORA: RITA DE CASSIA SOBROSA
ORIENTADORA: PROFa DRa MAISA PIMENTEL MARTINS CORDER
Local e data da defesa: Santa Maria, 29 de janeiro de 2001.
Com o objetivo de selecionar indivíduos de acácia-negra (Acacia mearnsii De Wild.).resistentes a dois isolados de Cylindrocladium sp., dois isolados de Fusarium sp. e um isolado de Pestalotia sp., fungos conhecidamente causadores de gomose, foram instalados três testes de progênies, em condições de casa de vegetação, nos quais foram realizadas inoculações artificiais. O primeiro ensaio constou de seis progênies, três suscetíveis (PS1, PS2 e PS3), três resistentes (PR6, PR7 e PR10) e uma testemunha (PRS11); seis plantas por parcela, em quatro repetições. O segundo foi instalado com quatro progênies, duas suscetíveis (PS4 e PS5), duas resistentes (PR8 e PR9) e uma testemunha (PRS11); cinco plantas por parcela, em três repetições. O terceiro ensaio foi instalado com duas progênies, uma suscetível (PS1), uma resistente (PR6) e duas testemunhas (PRS11 e PRS12); uma planta por parcela, em três repetições. O delineamento estatístico usado foi blocos ao acaso, com parcelas subdivididas, em que as parcelas principais foram constituídas pelos isolados, e as parcelas secundárias pelas progênies, nas quais foram inoculados os cinco isolados, através de ferimento na casca com perfuração de disco de micélio com agulha de metal. No terceiro ensaio, os discos de micélio dos diferentes isolados foram, inicialmente, apenas colocados em contato com o caule das plantas, sem a realização de ferimento, e, após 30 dias, as mesmas plantas foram também inoculadas com perfuração dos discos de micélio com agulha de metal. Avaliações qualitativas foram feitas durante 90 dias, em que foi observado o surgimento de sintomas como exsudação de goma e formação de lesão, e avaliações quantitativas foram feitas no final desse período, em que foi medido o comprimento, a largura e a área das lesões externas e o comprimento das lesões internas, após o corte longitudinal do caule. As árvores matrizes no campo, resistentes e suscetíveis à gomose, das quais foram coletadas as sementes, correspondentes às progênies em casa de vegetação, também foram inoculadas com um isolado de Cylindrocladium sp., um isolado de Fusarium sp. e um isolado de Pestalotia sp. Observou-se manifestação da doença com exsudação intensa
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de goma em progênies resistentes e suscetíveis, no primeiro e no segundo ensaio. Esses indivíduos também apresentaram necrose da casca que se expandiu longitudinalmente nos caules. No terceiro ensaio, foi verificado que, sem ferimento da casca, não houve manifestação de sintomas de gomose, evidenciando que são necessárias aberturas naturais ou ferimentos para que os fungos colonizem as plantas e promovam a doença. Esses indivíduos, quando inoculados com ferimento, após 30 dias, apresentaram sintomas típicos de gomose com formação de lesão e exsudação de goma. Para as variáveis comprimento, largura e área das lesões externas e comprimento das lesões internas, medidas nos três testes de progênies, foram realizadas análises da variância (ANAVA) a partir das médias. Verificaram-se diferenças altamente significativas (P< 0,01) entre os isolados e entre as progênies, em que se observou que as progênies suscetíveis e resistentes apresentaram as maiores e as menores lesões, respectivamente. Foi observado que ocorreram sintomas de gomose em 93,1% das progênies suscetíveis, e em 90,8% das progênies resistentes, havendo variação no tamanho das lesões entre e dentro dessas progênies. Portanto, as progênies suscetíveis e resistentes apresentaram 6,86 e 9,2% de indivíduos sem nenhum tipo de sintoma de gomose. Com base no comprimento das lesões externas, foi também calculado o Índice de Suscetibilidade (IS) para classificar as progênies do primeiro e do segundo teste como resistentes e suscetíveis. No primeiro teste, verificou-se pelo IS que as progênies suscetíveis apresentaram 30 indivíduos sem nenhum tipo de sintoma, e as progênies resistentes 40 indivíduos livres de gomose. No segundo teste, foi observado que as progênies suscetíveis apresentaram seis indivíduos sem gomose, e as progênies resistentes nove indivíduos sem sintomas da doença. Através do comprimento das lesões internas foi estimado o coeficiente de herdabilidade em nível de médias de progênies (h2p) para o primeiro e para o segundo teste de progênie, o qual apresentou valores elevados para o primeiro (h2p= 0,54) e para o segundo (h2p= 0,53) teste, indicando estar essa característica sob alto grau de controle genético. Das árvores matrizes no campo, correspondentes às progênies, apenas duas manifestaram sintomas de gomose, através de exsudação de goma e formação de lesão, após a inoculação artificial. Três dessas árvores apresentaram-se naturalmente infectadas, mostrando sintomas da doença. Os resultados permitiram concluir que houve variação para resistência à gomose entre e dentro de progênies resistentes e suscetíveis, tendo sido identificados indivíduos altamente suscetíveis dentro de progênies resistentes, e indivíduos altamente resistentes dentro de progênies suscetíveis. Portanto, foi possível a identificação e seleção de indivíduos com resistência a essa doença.
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ABSTRACT
Dissertation of Master’s Post-Graduation Program in Forest Engineering Federal University of Santa Maria, RS, Brasil
GENETIC VARIABILITY OF Acacia mearnsii De Wild. AS TO
RESISTANCE TO THE COMPLEX OF FUNGI CAUSER OF GUMMOSIS
AUTHORA: RITA DE CASSIA SOBROSA
ADVISER: PROFa DRa MAISA PIMENTEL MARTINS CORDER
Local and date of defense: Santa Maria, 29 of january of 2001.
With the objective of selecting individuals of black wattle (Acacia mearnsii De Wild.) resistant to two isolated of Cylindrocladium sp., two isolated of Fusarium
sp.,and one isolated of Pestalotia sp. fungi which are well-known causes of gummosis, three progenys tests were implanted, in glasshouse conditions, in which artificial inoculations were done. The first essay was carried out with six progenys, three susceptible (PS1, PS2 and PS3), three resistant (PR6, PR7 and PR10) and one witness (PRS11); six plants for portion, in four repetitions. The second essay was implanted with four progenys, two susceptible (PS4 and PS5), two resistant (PR8 and PR9) and one witness (PRS11); five plants for portion, in three repetitions. The third essay was implanted with two progenys, one susceptible (PS1), one resistant (PR6) and two witness (PRS11 and PRS12); one plants for portion, in three repetitions. The statistical design used was randomized blocks, with subdivided portion, in which the portions were constituted by the isolated and the subportions by the progenys, where were inoculated the five isolated, through wound in the peel with perforation of disk of mycelium with metal needle. In the third essay, the disks of mycelium of the different isolated initially were only put in contact with the stem of the plants, without the wound, and after thirty days, the same plants were also inoculated with perforation of the disks of mycelium with metal needle. Qualitative estimation were made during ninety days, in which it was observed the first symptoms like exudation of gum and formation of lesion, and quantitative estimation were made in the end of this period, in which it was measured the length, the width and the area of the external lesions and the length of the internal lesions, after the longitudinal incision of the stem. The matrix trees in the field, resistant and susceptible to gummosis, from which were collected the seeds, corresponding to progenys in glasshouse, also were inoculated with one isolated of Cylindrocladium sp., one isolated of Fusarium sp. and one isolated of Pestalotia sp. Manifestation of the disease with intense exudation of gum in resistant and susceptible progenys were observed in the first and in the second essay. These individuals also presented necrosis of the pell that expanded longwise at the stem. In the third essay, it
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was verified that, without wound of the peel, there was not manifestation of symptoms of gummosis, evidencing that natural openings or wounds are necessary so that the fungi colonize the plants and promote the disease. These individuals, when inoculated with wound, after thirty days, presented typical symptoms of gummosis with formation of lesion and exudation of gum. For the variables length, width and area of the external lesions and length of the internal lesions, measured in the three progenys tests, were done analysis of the variance (ANOVA) from the averages. Highly significant differences were verified (P< 0,01) among the isolated and among the progenys, in whith it was observed that the susceptible and resisting progenys respectively presented the greatter and the smaller lesions. It was observed that symptoms of gummosis occurred in 93,1% of the susceptible progenys, and in 90,8% of the resistant progenys, presenting variation in the size of the lesions among and inside these progenys. Therefore, the susceptible and resistant progenys present 6,86 and 9,2% of individuals without any symptom of gummosis. Through of length of the external lesions, it was also used the estimate of the Susceptibility Index (SI) for classifying the progenys of the first and of the second test as resistant and susceptible. In the first test, it was verified by the SI that the susceptible progenys presented thirty individuals without any type of symptom, and the resisting progenys, forty individuals free of gummosis. In the second test, it was observed that the susceptible progenys presented six individuals without gummosis, and the resisting progenys, presented nine individuals without symptoms of the disease. Through of length of the internal lesions it was estimate the herdability coefficient in level of average of progenys (h2p) for the first and for the second test of progenys, the which presented values elevated for the first (h2p= 0,54) and for the second (h2p= 0,53) test, indicate to be that characteristic under high degree of genetic control. Of the matrix trees corresponding to the progenys in the field, only two presented symptoms of gummosis, through exudation of gum and formation of lesion, after the artificial inoculation. Three of these trees presented themselves naturally infected showing symptoms of the disease. The results allowed to conclude that there was variation for resistance to gummosis among and inside resistant and susceptible progenys, having been identified highly susceptible individuals inside resistant progenys, and highly resistant individuals inside susceptible progenys. Therefore, it was possible the identification and selection of individuals with resistance to this disease.
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LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Identificação, gênero, local e data de coleta dos fungos isolados de regiões de transição entre o tecido sadio e doente em troncos de A. mearnsii, com sintomas de gomose, em plantios comerciais, utilizados nos testes de progênies...........................................................................
44
TABELA 2- Identificação das árvores das quais foram coletadas as sementes para os testes de progênies, em condições de casa de vegetação..............................................................
45
TABELA 3- Análise da variância para experimento com parcelas subdivididas- Modelo fixo................................................
59
TABELA 4- Médias do comprimento das lesões externas e comprimento das lesões internas (cm), obtidas 60 dias após a inoculação de mudas de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, com Cylindrocladium sp.(I1), Cylindrocladium sp (I2), Cylindrocladium sp (I3) e Fusarium sp................
61
TABELA 5- Análises da variância e médias para as variáveis comprimento, largura e área das lesões externas, e comprimento das lesões internas (cm), obtidos 90 dias após a inoculação de mudas de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, no primeiro teste de progênie, com os isolados de Cylindrocladium sp. (I1 e I2), Fusarium sp. (I3 e I4) e Pestalotia sp. (I5)...........................................................
68
TABELA 6- Total de indivíduos mortos das progênies PS1, PS2, PS3, PR6, PR7, PR10 e testemunha PRS11 de A.
mearnsii, no primeiro teste de progênie, e os respectivos isolados responsáveis pela morte desses indivíduos, 90 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em condições de casa de vegetação..................................
83
12
TABELA 7- Análises da variância e médias para as variáveis comprimento, largura e área das lesões externas, e comprimento das lesões internas (cm), obtidas 90 dias após a inoculação de mudas de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, com os isolados de Cylindrocladium sp. (I1 e I2), Fusarium sp. (I3 e I4) e Pestalotia sp. (I5)..........................................................
92
TABELA 8- Médias do comprimento das lesões internas (cm) em que a interação isolado x progênie foi significativa, obtidas 90 dias após a inoculação de mudas de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação...........................................................................
99
TABELA 9- Análises da variância e médias para as variáveis comprimento, largura e área das lesões externas (cm), obtidas 90 dias após a inoculação de mudas de A.mearnsii, aos 14 meses de idade, no terceiro teste de progênie, com os isolados de Cylindrocladium sp. (I1 e I2), Fusarium sp. (I3 e I4) e Pestalotia sp. (I5)................
106
TABELA 10-Relação das árvores matrizes de A. mearnsii no campo, aos cinco anos de idade (sem sintomas de gomose), progênies correspondentes nos testes em casa de vegetação, manifestação de sintomas em resposta à inoculação e comprimento das lesões externas causadas pelos isolados I1 (Cylindrocladium sp.), I3 (Fusarium sp.) e I5 (Pestalotia sp.)....................................................
108
TABELA 11-Relação das árvores matrizes de A. mearnsii no campo, aos cinco anos de idade (com sintomas de gomose), progênies correspondentes nos testes em casa de vegetação, manifestação de sintomas em resposta à
13
inoculação e comprimento das lesões externas causadas pelo isolado I5 (Pestalotia sp.).........................................
109
TABELA 12---Número de indivíduos conforme a nota, notas e teste de Tukey (5%), Índices de Suscetibilidade (IS) e classificação de suscetibilidade para as progênies de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, obtidos 90 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no primeiro teste de progênie.................................................
113
TABELA 13-Número de indivíduos conforme a nota, notas e teste de Tukey (5%), Índices de Suscetibilidade (IS) e classificação de suscetibilidade para as progênies de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, obtidos 90 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no segundo teste de progênie.................................................
116
14
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Mapa com a localização da Fazenda Chagastelles, onde localiza-se o plantio comercial de A. mearnsii,
situado no município de Butiá-RS, onde foram coletadas as sementes....................................................
37
FIGURA 2- Vista parcial do teste de progênie de A.mearnsii, em condições de casa de vegetação, mostrando mudas inoculadas e sob câmara úmida.....................................
51
FIGURA 3- Comprimento médio das lesões externas e internas causadas pelos isolados de Cylindrocladium sp. e Fusarium sp., em mudas de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, em casa de vegetação, 60 dias após a inoculação.....................................................................
62
FIGURA 4- Manifestação de sintomas de gomose nas progênies PS3 e PR6 de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I4 (Fusarium sp.), caracterizados por exsudação de goma das lesões de cor parda (setas), em condições de casa de vegetação.......................................................................
64
FIGURA 5- Porcentagem de indivíduos de A. mearnsii com sintomas de gomose, em cada progênie, aos 11 meses de idade, inoculados com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, conforme períodos de avaliação, no primeiro teste de progênie. As três primeiras avaliações foram realizadas em intervalos semanais, e as demais em intervalos quinzenais. PS: progênie suscetível; PR: progênie resistente.........................................................
66
15
FIGURA 6- Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento das lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, no primeiro teste de progênie, em condições de casa de vegetação..........
70
FIGURA 7- Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento das lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em cada progênie de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, no primeiro teste de progênie, em condições de casa de vegetação..........
74
FIGURA 8- Amplitude e freqüência dos valores de área das lesões (A) e comprimento das lesões internas (B) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação, no primeiro teste de progênie, em condições de casa de vegetação....................................
76
FIGURA 9- Indivíduo da progênie resistente PR7 de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I2 (Cylindrocladium sp.), após ter retomado suas atividades fisiológicas, apresentando lignificação na área da lesão.............................................................
80
FIGURA 10- Secção longitudinal de um indivíduo da progênie resistente PR7 de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I2 (Cylindrocladium sp.), em condições de casa de vegetação, mostrando que a colonização interna do lenho pelo patógeno foi contida....................................
80
FIGURA 11- Indivíduos das progênies PS3 (A) e PR6 (B) de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, apresentando calo
16
cicatricial nos pontos de inoculação, 90 dias após a inoculação com o isolado I5 (Pestalotia sp.), em condições de casa de vegetação....................................
81
FIGURA 12- Seção longitudinal de um indivíduo da progênie resistente PR6 de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I5 (Pestalotia sp.), em condições de casa de vegetação, em que foi observado que a colonização interna do lenho pelo patógeno foi contida....................................
82
FIGURA 13- Indivíduos de A. mearnsii da progênie suscetível PS2 e da progênie resistente PR7, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação, apresentando indivíduo resistente dentro de progênie suscetível, e indivíduo suscetível dentro de progênie resistente. Da esquerda para a direita: indivíduo com sintoma de gomose, apresentando exsudação de goma; indivíduo com sintoma de gomose, apresentando lesão necrótica; indivíduo sem sintoma e testemunha (ferimento na casca com agulha).........................................................
85
FIGURA 14- Indivíduos de A. mearnsii das progênies resistentes PR6 (A) e PR7 (B), aos nove meses de idade, 40 dias após a inoculação com os isolados I3 (Fusarium sp.) e I1 (Cylindrocladium sp.), respectivamente, em condições de casa de vegetação, apresentando secamento e escurecimento dos ramos terminais..........
86
FIGURA 15- Necrose da casca em indivíduos de A. mearnsii das progênies suscetíveis PS4 (A) e PS5 (B), aos nove meses de idade, nos pontos de inoculação com o
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isolado I3 (Fusarium sp.), sete dias após a inoculação, em condições de casa de vegetação..............................
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FIGURA 16- Porcentagem de indivíduos de A. mearnsii com sintomas de gomose, em cada progênie, aos 12 meses de idade, inoculados com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, conforme períodos de avaliação, no segundo teste de progênie. As três primeiras avaliações foram realizadas com intervalos semanais, e as demais avaliações, com intervalos quinzenais PS: progênie suscetível; PR: progênie resistente................................
91
FIGURA 17- Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento das lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, 90 dias após a inoculação, em mudas de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação..........................................................
95
FIGURA 18- Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento das lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, 90 dias após a inoculação, em cada progênie de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação....................................
97
FIGURA 19- Valores do comprimento médio das lesões externas (A), área média das lesões (B) e comprimento médio das lesões internas (C), causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação..........................................................
98
FIGURA 20- Amplitude e freqüência dos valores de comprimento das lesões internas (A) e área das lesões (B) causadas
18
pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, 90 dias após a inoculação, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação....................................
101
FIGURA 21- Indivíduos de A. mearnsii, aos 10 meses de idade, 35 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no segundo teste de progênie: (A) lesões exsudativas observadas no caule de um indivíduo da progênie suscetível PS4, em pontos acima e abaixo do local de inoculação com o isolado I1 (Cylindrocladium sp.); (B) lesões exsudativas observadas no caule da testemunha PRS11, em quatro diferentes pontos acima do local de inoculação com o isolado I3 (Fusarium sp.)..............................................
103
FIGURA 22- Indivíduos de A. mearnsii, em plantio comercial, aos seis anos de idade, os quais se encontravam próximos às três árvores matrizes que foram infectadas, apresentando sintomas típicos de gomose. (A) lesão tipo GC (gomose no colo); (B) lesão tipo GT (gomose no tronco); (C) lesão tipo GCT ( gomose no colo e no tronco), conforme nomenclatura de Santos et al., (1998)............................................................................
112
19
LISTA DE ANEXOS
ANEXO I- Relação de patógenos de Acacia mearnsii De
Wild., com sintomas associados e distribuição, conforme Roux et al., (1995)....................................
141
ANEXO II- Patógenos associados a sintomas de gomose e a ferimento causado por inseto, em árvores de Acacia
mearnsii, conforme Roux & Wingfield (1997).........
143
ANEXO III- Sintomas de gomose em árvores de A. mearnsii De Wild. no campo, em plantio comercial, aos seis anos de idade, apresentando exsudação intensa de goma nos troncos (Figuras A, B e C) e morte de um indivíduo afetado pela doença (Figura D), no município de Butiá-RS..............................................
145
20
1 INTRODUÇÃO
A família das leguminosas possui de 12.000 a 17.000 espécies
distribuídas nas subfamílias Mimosoideae, Caesalpinoideae e Faboideae.
A acácia-negra (Acacia mearnsii De Wild.) pertence à família
Leguminosae e à subfamília Mimosoideae (Lamprecht, 1990).
As acácias ocorrem nas regiões tropicais e subtropicais da América
do Sul, África, Ásia e Austrália (Burkart, 1952). Existem de 700 a 800
espécies de acácia ocorrendo naturalmente nas savanas australianas e nas
regiões da África, Índia e América do Sul. A maioria das espécies
compõe-se de árvores e arbustos perenifólios, que suportam períodos
secos prolongados (Lamprecht, 1990). De acordo com Sherry (1971), a
A. mearnsii distribui-se no sudeste da Austrália Continental e ocorre de
forma abundante também na Tasmânia.
A A. mearnsii pertence ao subgênero Heterophyllum Vassal,
caracteriza-se por ser uma árvore de porte médio, copa arredondada e
apresentar casca castanho-escura, rica em tanino. Possui folhas alternas
bipinadas, compostas de 13 a 17 pares de pinas subopostas (Sherry,
1971). As flores são amarelo-claras e dispostas em capítulos globosos de
5 a 7mm de diâmetro, reunidas em panículas terminais, são usualmente
hermafroditas com quatro a sete sépalas e pétalas (Sedgley, 1986; Grant
et al. 1994). O pólen é agregado dentro de uma estrutura denominada
políade, a qual contém 16 grãos de pólen (Kenrick & Knox, 1982).
21
A A. mearnsii é uma espécie florestal originária da Austrália, hoje
plantada em vários países (Roux & Wingfield, 1997). Introduzida no
Estado do Rio Grande do Sul há mais de quarenta anos, compõe um dos
maiores maciços florestais homogêneos do Estado, cuja área plantada é
superior a 160.000 ha, distribuídos principalmente em minifúndios, sendo
atualmente plantada em cerca de trinta municípios na Depressão Central
(Maestri et al., 1987).
Devido à sua grande importância econômica no Brasil, a cultura da
A. mearnsii se propagou para outras regiões, atingindo um raio atual de
aproximadamente 300 km, tendo como limites as coordenadas
geográficas: latitude 28° 30’- 31° 00’ S e longitude 50° 30’-52° 30’ W,
apresentando altitude variável entre 5 e 1.000 metros, de acordo com
Mantoefel (1991).
A. mearnsii é usada para vários fins, aproveitando-se desde a casca
até a madeira. Da casca é extraído o tanino, usado no curtimento de
couros e peles, na produção de anticorrosivos e no tratamento de água
(Oliveira, 1968). A madeira, além do uso tradicional como carvão e
lenha, é usada como matéria-prima de superior qualidade para fabricação
de celulose e papel. De acordo com Higa (1993), a madeira também é
usada para a produção de escoras para minas na África do Sul; para
telhados no Zimbabwe e Kenia e para postes ou moirões na Indonésia.
A produtividade da A. mearnsii tem sido ameaçada e limitada pelos
danos que sofre quando atacada pela gomose. Essa doença causa desde a
redução do aproveitamento da casca até a morte dos indivíduos mais
22
suscetíveis (Auer & Sotta, 1995). Segundo Santos et al. (1997a), a
patologia apresenta sintomas externos (depressão, necrose e ruptura da
casca e exsudação de goma); e internos (surgimento de estrias escuras no
lenho). A patologia manifesta-se pela degeneração dos condutos
liberianos, havendo depósitos de seiva orgânica em zonas do córtex, com
rachaduras do tecido e exsudação de goma (Schuch, 1975; Schuch &
Pederzolli, 1975). Árvores com gomose apresentam lesões que se
estendem da região do colo para porções superiores do tronco (Santos et
al., 1998).
Foi verificado que, em plantios adultos, a gomose pode atingir até
38% dos indivíduos, sendo também observada sua incidência em
indivíduos jovens, com até três meses de idade (Santos et al., 1997a).
Essa doença ocorre nas regiões produtoras do Brasil, da África do
Sul e dos países asiáticos (Santos et al., 1998), sendo que, na África do
Sul, o termo gomose tem sido aplicado a um complexo de doenças
associado com A. mearnsii (Roux et al., 1995). Pela presença de mais de
um fungo associado à gomose da A. mearnsii, em diferentes partes do
mundo, foi considerada a hipótese de diferentes patógenos estarem
atuando em vários locais de ocorrência da doença (Auer & Sotta, 1995).
De acordo com Auer (1997), vários estudos têm sido realizados
para determinar a etiologia da doença, de modo a subsidiar o seu controle.
Zeijlemaker (1971) mostrou, em estudos etiológicos conduzidos na África
do Sul, que o fungo Phytophthora nicotianae var. parasitica é um dos
agentes causais da gomose. Outros autores também têm relatado a
23
associação de Phytophthora sp. a essa doença, como Roux et al. (1995),
Santos et al. (1997a), Santos et al. (1997b), Auer (1997) e Santos et al.
(1998), os quais verificaram a presença desse patógeno em alguns tipos de
sintomas. Alguns autores também verificaram a associação da gomose
com fungos do gênero Cylindrocladium sp. e Fusarium sp. (Sotta & Auer,
1995; Santos et al., 1997a; Santos et al, 1997b; Roux & Wingfield, 1997).
Esses patógenos mencionados são capazes de sobreviver no solo por
longos períodos, através da formação de estruturas especializadas, como
clamidosporos, oosporos e zoosporos, constituindo uma fonte de inóculo
para as plantas hospedeiras (Bergamin Filho et al., 1995).
Pesquisas na área de melhoramento genético para resistência a
doenças em espécies florestais têm apresentado importantes resultados
nos últimos anos. A maioria dos estudos tem sido realizados em famílias,
mas também em árvores individuais dentro de famílias (Zobel & Talbert
1992). A eficiência de um processo de seleção visando à obtenção de
resistência a doenças, depende inicialmente da constatação de
variabilidade genética capaz de oferecer essa resistência.
Uma das formas mais econômicas para reduzir os efeitos causados
pela gomose é a seleção de genótipos resistentes à doença, pois, até o
momento, o material genético normalmente plantado é proveniente das
primeiras introduções, realizadas por volta de 1930 (Resende et al.,
1991). Os estudos para o melhoramento genético de A.mearnsii têm sido
realizados no sentido de aumentar a qualidade e a quantidade de casca e
madeira, através da seleção de árvores superiores, em testes de
24
progênies. Embora alguns experimentos venham sendo conduzidos em
Bloemendal (África do Sul), para testar a resistência de material genético
selecionado contra alguns patógenos, estudos para seleção de genótipos
resistentes à gomose ainda são incipientes (Dunlop, 1997).
Em plantas alógamas os métodos de seleção massal e de famílias
são muito utilizados para acumular genes de resistência. Na seleção
massal, plantas são selecionadas com base em suas reações individuais à
doença. Na seleção de famílias (progênies) as plantas são selecionadas
com base na resposta de suas progênies (Camargo & Bergamin Filho,
1995).
Deste modo, o presente estudo teve como objetivo identificar, em
testes de progênies, indivíduos de A. mearnsii resistentes a alguns dos
fungos associados à gomose da A. mearnsii, os quais mostraram-se
patogênicos nesta espécie, causando lesões contínuas e sintomas típicos
da doença.
25
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Sintomas de gomose na A. mearnsii
A gomose em A. mearnsii ocorre nas regiões produtoras de vários
países e apresenta uma sintomatologia complexa, em que a exsudação de
goma é o sintoma mais característico (Anexo IIIA, Anexo IIIB e Anexo
IIIC). A exsudação de goma no tronco pode estar associada a doenças ou
a injúrias (Santos et al.,1998).
De acordo com Sotta & Auer (1995), a gomose é um dos principais
problemas da A. mearnsii, sendo que os principais prejuízos verificados
são a redução no rendimento de casca e a morte dos indivíduos
suscetíveis à doença (Anexo IIID).
A identificação de novos patógenos causadores de murcha
vascular, como Ceratocystis albofundus, em 1989, sugeriu que outras
doenças poderiam ter surgido na A. mearnsii nos últimos 30 anos (Morris
et al., 1993). Roux et al. (1995), apresentaram uma relação de patógenos
de A. mearnsii com os sintomas associados e sua distribuição (ver o
Anexo I). Na África do Sul, o termo gomose tem sido aplicado a um
complexo de doenças relacionado com A. mearnsii, nas quais está
associado um grande número de patógenos, conforme comentaram os
autores. Esse complexo de doenças incluídas no termo gomose envolve
vários sintomas, dentre os quais se destaca: formação de pontos de goma,
26
caracterizados por um grande número de pequenas lesões; lesões em
bolhas, que são caracterizadas pela formação de bolhas devido ao
acúmulo de goma sob a casca; sintoma tipo mosqueado, que se
caracteriza por apresentar lesões necróticas de cor escura na casca. Essas
lesões podem espalhar-se e formar caminhos que eventualmente cobrem
a maioria do caule. Em caminhos isolados, fendas podem se desenvolver
completamente, quando a goma é exsudada. Os autores citaram que
isolamentos desses sintomas revelaram vários fungos, dos quais
Phytophthora sp. foi o mais abundante. Zeijlemaker (1971) sugeriu que
as referidas lesões foram causadas por Phytophthora parasitica.
Entretanto, esse autor relatou que não foi possível isolar esse fungo de
tecidos sintomáticos, situados acima da base de árvores. Isso pode
ocorrer devido ao fato de que a infecção por P. parasitica pode facilitar
pontos de entrada para patógenos oportunistas, os quais seriam os
responsáveis por lesões escuras que se estendem em direção à
extremidade das árvores. Roux et al. (1995) citaram também sintomas
como o da base negra, considerado um dos mais importantes sintomas no
complexo gomose: apresentou, na base das árvores, uma descoloração
escura da casca, que se estendeu ao longo do caule, acompanhada por
exsudação de goma através de fendas na casca; também referiram a blind
pocket disease, caracterizada por buracos fundos nos caules, com
surgimento de ondulações devido à inibição do crescimento nas áreas do
câmbio.
27
Vários fungos têm sido isolados de tecidos com sintomas de
gomose, incluindo P. parasitica var. parasitica de sintomas tipo
mosqueado e lesões do tipo tongue, Pestalotia sp. de vários sintomas, e
espécies de Fusarium e Rhizoctonia de sintomas tipo mosqueado e base
negra (Roux et al., 1995).
Roux & Wingfield (1997) conduziram um levantamento de
doenças em A.mearnsii por um período de dois anos, realizado em duas
grandes áreas de plantio comercial na África do Sul. Os fungos foram
isolados de sintomas como base negra; cancro basal; casca mosqueada;
rachaduras e lesões descoloridas nos caules, na medula e na madeira; die
back e feridas com exsudação de goma. Os isolamentos também foram
realizados a partir de feridas causadas por insetos e de lesões semelhantes
a bolhas (Anexo II). De acordo com os autores, uma grande classe de
gêneros e espécies de fungos foram isolados de árvores de A. mearnsii,
incluindo Ceratocystis albofundus, Cylindrocladium candelabrum,
Fusarium spp., Pestalotiopsis spp., Phoma spp. e P. parasitica, que
haviam sido registrados anteriormente. Outros patógenos foram isolados:
Botryosphaeria dothidea, Diplodia spp. Phytophthora boemeriae,
P.meadii, Sphaeropsis sp. e Seiridium sp. Os mais abundantes fungos
isolados em A. mearnsii foram espécies de Diplodia, Fusarium e
Pestalotiopsis. Nos testes de patogenicidade, foram usados somente
aqueles gêneros de fungos isolados com maior freqüência tidos como
patógenos de Acacia spp. As lesões foram produzidas por Glomerella sp.,
28
B. dothidea, Fusarium spp., Seiridium sp., Sphaeropsis sp., P. boemeriae,
P. meadii, C. candelabrum e Pestalotiopsis (Roux & Wingfield, 1997).
No Brasil, Ribeiro et al. (1988) verificaram a ocorrência de
gomose em A. decurrens, causada por Ceratocystis fimbriata, em que as
árvores apresentavam-se murchas ou totalmente secas, os caules
mostraram rachaduras com exsudação de goma, e o cerne apresentava
áreas de coloração cinza-escuro, verificado após o corte transversal dos
caules.
Gomose e murcha de A. mearnsii causada por Ceratocystis foi
relatada pela primeira vez, em 1989, na África do Sul. Isso ocorreu
quando as árvores sofreram danos mecânicos pelo corte de ramos, o que
evidenciou que esse organismo requer ferimento para infectar as plantas.
Os sintomas são murcha, die back e eventual morte de árvores. Ocorre
também exsudação de goma de caules e ramos afetados, e a casca poderá
alterar sua cor, apresentando áreas que vão do marrom ao preto. Há
bolhas ou aumento de bolsas de goma que adquirem um tom amarelado
(Morris et al., 1993). De Beer apud Roux et al. (1995) mencionou que o
agente causal dessa doença era uma nova espécie de Ceratocystis, ainda
não identificada. Inicialmente foi caracterizada como C. fimbriata,
porém, após análise mais detalhada, mostrou taxonomia distinta desse
fungo.
No Brasil, como as informações sobre os patógenos associados à
gomose de A. mearnsii são contraditórias, estudos etiológicos vêm sendo
conduzidos (Sotta & Auer, 1996).
29
Isolados de C. candelabrum inoculados em árvores de A. mearnsii,
através da inserção de disco de micélio-ágar na casca, mostraram-se
patogênicos nesta espécie, e as lesões desenvolveram-se lenta e
continuamente (Sotta & Auer, 1995). Foram realizadas coletas de
amostras de casca com sintomas de gomose em árvores de um a dois
anos de idade, no município de General Câmara, RS, onde foram
encontrados Cylindrocladium sp. e Fusarium sp. com maior freqüência.
Testes de patogenicidade de Cylindrocladium sp. mostraram que este
fungo é patogênico em A. mearnsii, e que, após a infecção, ocorreu a
manifestação dos sintomas característicos de gomose. No reisolamento
desse patógeno, foi encontrado Fusarium sp. de lesões surgidas nos
tratamentos e na testemunha, na qual não foram realizadas inoculações, o
que sugeriu que esse fungo pode estar participando como patógeno após
a contaminação natural (Sotta & Auer, 1996).
No Brasil, vários fungos têm sido associados à gomose da
A.mearnsii, como Cylindrocladium sp., Fusarium sp., Pestalotia sp. e,
mais recentemente, Phytophthora sp. (Santos et al., 1997b). Isolamentos
feitos a partir de lesões em árvores vivas, em um experimento com
parcelas permanentes, revelou a presença de Phytophthora sp., além de
Fusarium sp., que é freqüentemente isolado de lesões no colo. A espécie
de Phytophthora não foi identificada (Auer, 1997).
Santos et al. (1998), em estudo para caracterizar tipos de sintomas
freqüentemente associados à gomose causada por Phytophthora,
definiram quatro tipos de sintomas básicos, de acordo com a posição no
30
tronco e a presença de exsudação de goma. Foram verificados sintomas
tipo mosqueado (M), que é caracterizado por lesão necrótica na casca, de
cor escura, que se alonga longitudinalmente no tronco acima da região do
colo, com escurecimento interno do lenho; sintomas tipo gomose no
tronco (GT), em que ocorre lesão tipo M, com exsudação de goma;
sintomas tipo gomose no colo (GC), em que se verifica lesão necrótica na
casca, de cor escura, com exsudação de goma limitada à região do colo; e
sintomas tipo gomose no colo e no tronco (GCT), caracterizada por lesão
tipo GC, que inicia no colo e se estende para o tronco. Os autores
verificaram que Phytophthora sp. foi isolado a partir de amostras
coletadas de lesões novas tipo M, GT e GC. No teste de patogenicidade,
em todas as plantas inoculadas com esse patógeno, foi verificada a
formação de lesões exsudativas ou não, tipo M e GT, semelhantes às
lesões observadas em árvores naturalmente infectadas. Em estudo para a
caracterização sintomatológica da gomose causada por Phytophthora, em
diferentes alturas do tronco, Santos (2000) verificou que a maior
severidade da doença, em troncos de A.mearnsii, ocorreu na região basal
(desde o colo até 0,50 m de altura). A medida que se distanciou do solo,
houve uma redução significativa na severidade da doença.
2.2 Resistência vertical e horizontal
Van Der Plank (1963) definiu resistência vertical como aquela
efetiva contra uma ou algumas raças fisiológicas de um dado patógeno,
31
também chamada de resistência perpendicular; enquanto que a resistência
horizontal seria aquela efetiva contra todas as raças, também chamada de
resistência lateral. Na resistência vertical, ocorre interação diferencial
entre as variedades da planta hospedeira e as raças do mesmo organismo
fitopatogênico, e há evidências de que a resistência vertical é governada
por poucos genes, geralmente por apenas um ou poucos em interação
com o ambiente. Na resistência horizontal, não há manifestação da
interação diferencial; é geralmente poligênica, isto é, controlada por
muitos genes que não são específicos para resistência a doenças; mas
simplesmente genes que ocorrem em plantas sadias, regulando os
processos normais, os quais combinados, expressam a resistência (Van
Der Plank, 1968).
Quando diferentes isolados de um patógeno são inoculados em
diferentes indivíduos de um hospedeiro, pode ou não ocorrer uma
interação significativa. Na ausência de interação, a resistência é do tipo
horizontal, e os isolados diferem quanto à agressividade. Entretanto, se
ocorrer interação diferencial, a resistência é vertical, e os patógenos
diferem quanto à virulência. A presença de interação indica que há
especialização do patógeno em nível intra-específico do hospedeiro e,
portanto, os isolados são classificados em raças, de acordo com seus
espectros de virulência diante de uma série de hospedeiros diferenciais,
conforme Camargo & Bergamin Filho (1995), em uma extensa revisão.
Nelson (1978) sugeriu que a resistência horizontal pode ser causada
por um conjunto de genes da resistência vertical, superados pelo
32
patógeno. No entanto, Eskes (1980) relatou que altos níveis de resistência
horizontal podem ser encontrados independentemente da existência de
genes de resistência vertical.
Variedades que apresentam resistência vertical permanecem
resistentes no campo até que surja uma raça do patógeno com o gene
complementar de virulência. A perda dessa resistência está associada a
mecanismos de resistência do hospedeiro (Van Der Plank, 1968).
Bergamin Filho et al. (1995) citaram que estudos de H. H. Flor
(1942) em relação à ferrugem do linho (Melampsora lini) resultaram na
teoria do gene-a-gene, na qual cada gene de virulência de um patógeno
corresponde a um gene de resistência ou suscetibilidade no genótipo
hospedeiro. Assim, essa teoria parece ter validade quando a interação
patógeno-hospedeiro envolver resistência vertical e virulência. Essa
teoria não se aplica à resistência horizontal, quando os mecanismos de
defesa do hospedeiro não puderem ser superados pelo patógeno.
Vários estudos sobre interações patógeno-hospedeiro para cada
relação gene-a-gene têm sido realizados. Embora muitas pesquisas
tenham sido direcionadas à identificação de genes e produtos gênicos
envolvidos, elucidações em nível molecular são recentes (Boller &
Meins, 1992).
Os conceitos de que resistência vertical é do tipo monogênica e
resistência horizontal é do tipo oligo/poligênica são encontrados com
freqüência na literatura. Embora existam muitos exemplos de que essa
correlação é verdadeira, a mesma não deve ser generalizada (Bergamin
33
Filho et al., 1995). A resistência em sorgo à Periconia circinata é
monogênica e horizontal, e a resistência de cevada à Puccinia hordei é
poligênica, porém apresentou interações diferenciais com raças do
patógeno (Parlevliet, 1977). Resistências vertical monogênica e
horizontal poligênica podem ocorrer em um mesmo genótipo. De acordo
com Parlevliet et al. (1989), a seleção de resistência horizontal na
presença de resistência vertical monogênica pode produzir efeito
contrário ao desejado, resultando em frequências elevadas de genes de
resistência vertical.
A resistência horizontal foi considerada como parcial, devido a
mecanismos que dificultam parcialmente o crescimento do patógeno nos
tecidos do hospedeiro. Essa resistência pode ter uma expressão de quase
imunidade ou de uma reação de resistência semelhante ao da resistência
vertical (Eskes, 1980).
A reação de hipersensibilidade é uma resposta celular extrema da
planta, que pode levar a um alto grau de resistência à doença, resultando
na morte de um número limitado de células do hospedeiro, próximas aos
pontos de infecção, e é considerada como uma resposta de defesa
induzida, que impede o crescimento do patógeno nos tecidos da planta.
Essa resposta ocorre em função do reconhecimento da infecção pelo
hospedeiro, como conseqüência da incompatibilidade entre a planta e o
patógeno (Camargo, 1995).
A resistência horizontal diminui o tamanho das lesões produzidas,
aumenta seu período latente e diminui o número de esporos produzidos
34
por lesão. Todos os seus efeitos são parciais e quantitativos. Em plantas
com resistência horizontal, a eficiência da infecção é menor do que em
plantas suscetíveis; as lesões se desenvolvem mais lentamente, e os
esporos do patógeno são produzidos mais tarde e em menor quantidade
(Bergamin Filho et al., 1995).
A resistência com herança poligênica geralmente apresenta maior
durabilidade do que a resistência monogênica (Van Der Plank, 1968;
Parlevliet, 1977). Os conceitos de durabilidade da resistência vertical e
horizontal não se originaram apenas de resultados de campo.
Considerações teóricas indicaram que sistemas poligênicos de resistência
apresentaram maior capacidade de tolerar mudanças genéticas no
patógeno do que sistemas monogênicos. Dessa forma, uma resistência
poligênica será mais estável do que uma monogênica; são requeridas
mudanças genéticas em vários loci de patogenicidade, ao contrário do
sistema monogênico, em que a mudança ocorre em apenas um locus
(Bergamin Filho et al., 1995).
A utilização de métodos de seleções massal e recorrente, em
populações de plantas suscetíveis, aumentou a probabilidade de
selecionar plantas para resistência horizontal. Em plantas alógamas, os
métodos de seleção massal e de famílias são muito utilizados para reunir
genes de resistência. Na seleção massal, as plantas são selecionadas por
critérios baseados nas respostas individuais à doença. Na seleção de
famílias, as plantas são selecionadas segundo a resposta de suas
progênies, em que as sementes das plantas cujas progênies foram mais
35
resistentes, são usadas no próximo ciclo de seleção (Camargo &
Bergamin Filho, 1995).
2.3 Mecanismos de resistência
De acordo com Galli et al. (1968) pode-se considerar resistência
como uma reação de defesa do hospedeiro, resultante da soma de fatores
que tendem a diminuir a patogenicidade e a agressividade do patógeno,
uma vez estabelecido o contato entre este e o hospedeiro. Sendo uma
resultante de fatores variáveis, a reação de defesa e, portanto a
resistência, apresenta-se também variável, dando origem a plantas
imunes num extremo, e completamente suscetíveis no outro.
A resistência induzida depende de fatores presentes somente após
o contato do patógeno com o hospedeiro. Por definição, é o oposto da
resistência constitutiva, que depende de fatores pré-formados. Plantas
com resistência a doenças, que envolvem mecanismos de defesa
induzida, incluem acúmulo de fitoalexinas, deposição de material
semelhante à lignina e aumento na atividade de certas enzimas
hidrolíticas (Sequeira, 1983).
Lignificação induzida durante a penetração da parede celular tem
sido verificada na resistência de gramíneas a fungos. Em alguns sistemas,
a lignina é produzida em resposta a patógenos. Essa lignina pode diferir
na composição química da lignina normal. A supressão da lignificação
pode induzir suscetibilidade, isto é, os sítios receptores que induzem a
lignificação podem ser bloqueados por produtos de um patógeno
36
compatível. Produtos fúngicos podem ligar-se a polímeros da parede
celular que fornecem a matriz para deposição da lignina e bloquear a
lignificação (Vance et al., 1980).
Sherwood & Berg (1991), estudando a anatomia de vasos e o
conteúdo de lignina em plantas de Dactylis glomerata resistentes e
suscetíveis à Stagonospora arenaria, verificaram, após inoculação de
folhas, a presença de altos conteúdos de compostos semelhantes à
lignina, que foram sintetizados durante a infecção pelo fungo. No
entanto, a resistência não foi relacionada com os conteúdos de lignina
constitutiva de plantas não inoculadas, comentaram os autores.
Vance et al. (1980) citaram que, quando patógenos que são
compatíveis com a planta hospedeira induzem a lignificação, esses
patógenos podem metabolizar ou tolerar compostos intermediários de
lignina em pontos de crescimento do fungo.
Casares et al. (1986) compararam a capacidade de Phytophthora
cambivora e de P. cinnamomi em retirar fenóis da lignina de Castanea
sativa. Foi verificado que os dois fungos diferiram na capacidade de
oxidar fenóis. P. cambivora não oxidou um dos 21 fenóis testados,
enquanto P. cinnamomi foi capaz de retirar fenóis da lignina e oxidar
esses compostos.
Weste & Marks (1987) relatou que, em raízes infectadas por
P.cinnamomi, o processo de penetração do fungo é semelhante em todas
as espécies testadas. Quando ocorre a infecção, forma-se uma pequena
lesão que aumenta em três a seis dias, e o crescimento das raízes cessa.
37
Entretanto, em espécies resistentes, a colonização do fungo limita-se a
uma pequena lesão. A resistência se manifesta após a penetração e
limitação da colonização e após o surgimento de sintomas primários.
Essa resistência é caracterizada pela formação de barreiras anatômicas ao
crescimento do fungo, como depósito de calose. Dessa forma, sintomas
secundários não são verificados nas gemas, e mudanças fisiológicas não
ocorrem. Cahill et al. (1992) observaram, em raízes inoculadas com
P.cinnamomi, que 88% das raízes primárias de clones resistentes
micropropagados de Eucalyptus marginata foram capazes de restringir e
limitar a colonização desse patógeno. Entretanto, nenhuma raiz de
plantas suscetíveis dessa espécie restringiu o crescimento do fungo. Os
autores observaram também que, nos clones de E. marginata, nos quais
ocorreram poucas lesões, essas apresentaram comprimento semelhante
àquelas encontradas nas raízes das plantas suscetíveis.
A resistência de raízes de plantas a P. cinnamomi não depende
somente de barreiras morfológicas, mas também de mecanismos
bioquímicos (Cahill & McComb, 1992).
Em raízes de E. marginata suscetível a P. cinnamomi, foi
verificado uma redução nas concentrações minerais após a infecção;
entretanto, raízes de E. calophylla resistentes no campo, que foram
também inoculadas com esse patógeno, não apresentaram modificações
nessas concentrações (Cahill et al., 1986b). A resposta de plantas a esse
patógeno, conforme Cahill & McComb (1992), variou através de graus
de tolerância, porém poucas espécies são resistentes a esse patógeno de
38
raiz. A resistência foi demonstrada somente em algumas espécies de
Eucalyptus, especialmente aquelas do subgênero Symphyomyrtus (Cahill
et al., 1986b), e muitas espécies desse subgênero, segundo Tippett et al.
(1985), expressaram resistência, com completa inibição do crescimento
fúngico. Os autores verificaram que compostos fenólicos no floema
podem ter contribuído para a resistência. Mudanças na concentração de
fitohormônios também foram verificadas em estudo realizado por Cahill
et al. (1986a) no qual foi observado uma redução na concentração de
citocininas (zeatina e isopenteniladenina) no xilema de mudas de
Eucalyptus sp. suscetíveis, infectadas por P. cinnamomi; esse fungo,
preferencialmente, penetrou e destruiu as extremidades das raízes e,
portanto, os sítios de síntese das citocininas.
Cahill & McComb (1992) verificaram aumento na atividade da
fenilalanina amonia-liase (PAL), enzima-chave da biossíntese de
fenilpropanóide, lignina e produtos fenólicos. Esse aumento verificou-se
48 horas após a infecção por P.cinnamomi em raízes de E. calophylla,
resistente no campo. Entretanto, essas mudanças não ocorreram nas
raízes de espécies suscetíveis de E. marginata. A resistência de
E.calophylla a P. cinnamomi foi associada à produção de fenóis.
Raízes de clones resistentes (RR), clones suscetíveis (SS) e de
indivíduos descendentes de plantas resistentes de uma família suscetível
(RS) de E. marginata foram inoculadas com P. cinnamomi. A atividade
da enzima PAL aumentou em raízes de clones RR 48 horas após a
inoculação com o fungo. Os níveis constitutivos de fenóis, em raízes de
39
clones RR, mostraram-se superiores a 94% e aumentaram ainda mais
após a inoculação. O aumento na atividade dessa enzima e na síntese de
lignina e fenóis está associado à restrição de lesões e à resistência de
clones selecionados de E. marginata (Cahill et al., 1993).
Matern & Kneusel (1988) relataram que infusões de flavanólicos
da parede celular podem ser uma resposta ativa e coordenada de células
submetidas a estresse no córtex de raízes primárias de Pseudotsuga
menziessi. A exposição de raízes primárias de P. menziessi a Laccaria
bicolor não inibiu a colonização intercelular por Fusarium oxysporum,
porém, induziu resistência à colonização intracelular pelo patógeno.
Nesse processo, L. bicolor evitou que F. oxysporum degradasse a parede
celular do hospedeiro, devido à produção de infusões de flavanólicos na
parede celular. Foi observado que L. bicolor estimulou o acúmulo de
condensados taninos entre células do córtex, o que indicou que esses
fenólicos foram a base da proteção de raízes (Sylvia & Sinclair 1983;
Strobel & Sinclair, 1991).
A espécie mais resistente a P. cinnamomi pode ser a Acacia
pulchella nas florestas australianas, a qual mostrou reações celulares
semelhantes àquelas de resposta de hipersensibilidade. Porém o patógeno
penetrou o xilema dessa espécie. Sintomas secundários não foram
observados nas gemas, e não ocorreu a formação de esporângios nas
raízes que produziram inibidores (Tippett & Malajczuk, 1979).
Cahill & Weste (1983) observaram a formação de calose em
raízes de algumas espécies resistentes a P. cinnamomi, como
40
E.calophylla, A. melanoxylon, A. pulchella, Zea mays, Triticum aestivum
(Gramineae), Gahnia raducula (Cyperaceae) e Juncus bufonius
(Juncaceae), o que retardou ou impediu o crescimento do patógeno. Em
hospedeiros suscetíveis, como E. sieberi, E. marginata, Themeda
australis, Xanthorrhoea australis e X. resinosa, essa formação não foi
observada. A formação de calose em A. pulchella ocorreu somente no
córtex, ao longo da parede celular, e em pontos de penetração. Em
A.melanoxylon, houve depósito na epiderme; na bainha, ao redor de
pontos de penetração; no córtex, em depósitos invaginados em células
novas; e na endoderme.
Mudanças celulares e histológicas foram verificadas por Cahill et
al. (1989) em plantas resistentes e suscetíveis a P. cinnamomi.
Lignificação da parede celular, deposição de fenólicos e formação de
papilas calósicas foram observadas com maior freqüência nas espécies
resistentes (A. pulchella, E. calophylla, E. maculata, Gahnia raducula,
Juncus bufonius, Zea mays e Triticum aestivum), mas também ocorreram
nas espécies suscetíveis (E. sieberi, E. marginata, A. melanoxylon,
Xanthorrhoea australis, X. resinosa e Themeda australis). Embora os
autores tenham verificado a presença de células necróticas na epiderme e
córtex de raízes infectadas de A. pulchella, algumas células
permaneceram sadias e não se desenvolveram grandes lesões. Raízes de
A. melanoxylon foram rapidamente invadidas, resultando na granulação e
interrupção do citoplasma. Em espécies resistentes, o crescimento de
lesões cessou entre 48 e 72 horas, e o tamanho permaneceu limitado.
41
Mecanismos de resistência induzidos, incluindo o acúmulo de
fitoalexinas, receberam especial atenção nos últimos anos sob o ponto de
vista bioquímico, patológico e molecular. Esses mecanismos contrastam
com os mecanismos de resistência constitutivos, como a cutícula espessa
e os tricomas, os quais fornecem proteção durante todo o ciclo de vida da
planta. Os mecanismos de resistência induzidos, que atuam após a
infecção da planta pelo patógeno, estão ausentes em tecidos sadios da
planta ou se encontram em baixas concentrações, sendo detectados
durante a expressão da resistência (Smith, 1996).
2.4 Estado da arte do melhoramento genético para resistência a
doenças em espécies florestais
2.4.1 Melhoramento genético convencional
Os principais objetivos do melhoramento genético florestal são
reduzir danos causados por doenças e pragas e produzir árvores
adaptadas para crescer em ambientes adversos. O melhoramento para
resistência genética a doenças em árvores é complexo e não é
determinado por um sistema mendeliano simples (Zobel & Talbert,
1992).
Em resposta ao impacto crescente de doenças em florestas
plantadas, alguns programas têm enfatizado mais o melhoramento para
42
resistência a doenças, pois inicialmente a preocupação era somente
melhorar a taxa de crescimento, forma do fuste e propriedades da
madeira (Carson & Carson, 1989).
Patógenos que causam doenças em árvores são geralmente
difíceis de combater, e pouco é conhecido sobre seu controle genético. A
falta de conhecimento sobre a interação genética em sistemas
árvores/patógenos é talvez o principal motivo do lento progresso nas
pesquisas (Nance et al., 1992).
O melhoramento para resistência a doenças é o mais importante
em programas de melhoramento para espécies florestais. De acordo com
Carson & Carson (1989), maior atenção foi dada nos últimos anos ao
melhoramento de coníferas, incluindo várias espécies de Pinus, embora
muitas espécies de folhosas, como Eucalyptus e Gmelina, também
tenham sido estudadas.
Butcher et al. (1984), após constatarem a presença de genes de
resistência à P. cinnamomi em populações de P. radiata, analisaram 49
famílias elites para localizar genótipos resistentes a esse patógeno. Os
autores observaram grande variação entre famílias na resistência à
doença e puderam classificar nove famílias resistentes, dentro das
famílias estudadas. A consistência dos resultados de casa de vegetação e
de campo indicou que a resistência a P. cinnamomi em P. radiata esteve
submetida a um forte controle genético e foi transmitida, uma vez que as
estimativas de herdabilidade nas famílias foram altas, sendo 0,90 e 0,88%
para os dois testes em casa de vegetação, e 0,86% para os testes de
43
campo. A partir dos resultados obtidos nesse trabalho, os autores
concluíram que a grande variação genética para resistência a esse
patógeno, em P. radiata, possibilitou iniciar a seleção de uma nova
população resistente.
Van Der Kamp & Tait (1990) estabeleceram um modelo de
variação para suscetibilidade de P. contorta a Endocronartium
harknessii. Esse modelo promoveu uma fonte de variação adicional no
número de infecções por árvore, o qual foi atribuído ao posicionamento
ao acaso de esporos em árvores individuais. Van Der Kamp (1993)
analisou a influência do modelo na eficiência de seleção de árvores
resistentes em populações naturais que apresentaram vários níveis de
severidade de doença, com particular atenção ao efeito do depósito ao
acaso do inóculo no hospedeiro, na eficiência da seleção. O autor
verificou que o modelo de variação na suscetibilidade relativa pode ser
usado para avaliar a eficiência de seleção para resistência.
Ades et al. (1992) estudaram a variação na severidade de uma
doença causada por Dothistroma septospora, caracterizada por acículas
queimadas, entre procedências e famílias de P. muricata, e compararam
com a severidade em várias origens de P. radiata, em uma série de
experimentos na Austrália. Os autores verificaram, em uma progênie de
seis anos de idade de árvores de uma procedência de P. muricata, uma
herdabilidade de 0,29% para acículas infectadas, que foi semelhante a
estimativas para algumas características em P. radiata. Isso indicou que,
embora essa população seja menos suscetível que a procedência mais
44
resistente de P. radiata, ocorreu grande variação na herdabilidade e a
resistência foi obtida por seleção entre procedências.
Tippett et al. (1989) analisaram o efeito de sítios e estações do
ano na suscetibilidade de E. marginata a P. cinnamomi. Foi avaliado o
efeito do conteúdo de água nos tecidos, temperatura, concentração de
carboidratos e fenóis na taxa de invasão do fungo no floema secundário.
Os autores verificaram que árvores que cresceram em sítios com
deficiência hídrica foram menos vulneráveis ao patógeno do que as que
cresceram em sítios úmidos no verão. A concentração de carboidratos e
fenóis mudou nas diferentes estações do ano e diferiu entre sítios, porém,
evidências de que essas mudanças tenham influenciado diretamente no
crescimento do fungo nos tecidos da planta não foram verificadas.
Nos últimos anos, novas técnicas e tecnologias tornaram-se
importantes ferramentas na seleção de plantas resistentes a doenças,
certamente não visando a substituir o melhoramento genético
convencional, mas buscando formas de alcançar objetivos não atingidos
pelas técnicas convencionais, reduzindo o tempo necessário para
obtenção de genótipos resistentes.
Estudos iniciais da seleção de materiais genéticos de A. mearnsii
em relação à gomose foram realizados por Resende et al. (1993) e Santos
& Auer (1998). Os autores comentaram sobre a existência de
variabilidade genética em A. mearnsii e da possibilidade de seleção de
material resistente.
45
2.4.2 Utilização da biotecnologia como uma ferramenta para o
melhoramento genético, visando à resistência a doenças em espécies
florestais
2.4.2.1 Cultura de tecidos e resistência a doenças
A cultura de tecidos contribuiu significativamente com a ciência
da patologia de plantas para elucidar mecanismos básicos de virulência
de patógenos e resistência de hospedeiros. Os estudos têm enfocado a
infecção e replicação de vírus, no entanto importantes contribuições têm
sido feitas em relação ao modo de ação de toxinas e à resposta da
resistência e mudanças fisiológicas que ocorrem em células de plantas
infectadas com fungos e bactérias (Daub, 1986)
Bronson et al. (1992) citaram que interações entre organismos,
para avaliar a resistência a doenças, foram estudadas, usando-se agentes
de seleção, como propágulos do patógeno, fitotoxinas purificadas ou
parcialmente purificadas, e, em alguns exemplos, filtrados de cultura de
patógenos.
Sistemas de co-cultura de patógenos com os tecidos de plantas
hospedeiras permitiram estudar as relações entre os dois organismos em
condições controladas, conduzindo à descoberta de mecanismos de
patogenicidade e de resistência em nível celular (Duval et al., 1998).
Daub (1986) citou que alguns estudos foram feitos, usando-se
patógenos para selecionar plantas resistentes a doenças. A maioria dessas
46
seleções envolveu viroses, e geralmente, protoplastos foram infectados.
Entretanto, a infecção completa de protoplastos não foi obtida, e a morte
de protoplastos suscetíveis não ocorreu. De acordo com o autor, o uso de
toxinas de patógenos solucionou um dos problemas encontrados na
seleção com patógenos. Culturas de células foram expostas facilmente e
uniformemente a toxinas, por dispersão de células em uma solução de
toxinas, ou filtrado de culturas contendo toxinas.
Tanto cultura de calos quanto de protoplastos podem ser usadas
na busca de resistência a doenças. Várias estratégias foram utilizadas
para obter plantas resistentes a fungos, bactérias e vírus. Essas estratégias
diferiram quanto à fonte de resistência e quanto a metodologias de
seleção e/ou detecção de mutantes (Duval et al., 1998).
Jang & Tainter (1990) descreveram a expressão da resistência
diferencial em tecidos de calos de espécies de Pinus em resposta a
P.cinnamomi. P. taeda, P. echinata, P. virginiana e um híbrido de
P.taeda x P. echinata foram inoculados com P. cinnamomi. P. taeda e o
híbrido foram mais resistentes à infecção e invasão pelo fungo do que
P.echinata e P. virginiana. Dentro dos clones de cada espécie, os autores
identificaram dois tipos de reação. A reação de resistência apresentou
crescimento esparso de hifas na superfície de calos com pouca ou
nenhuma injúria visível nas células. Algumas mudanças morfológicas na
parede celular do hospedeiro também foram verificadas pelos autores. A
reação de suscetibilidade mostrou extenso crescimento de hifas do fungo
e colapso de células superficiais. Jang & Tainter (1991) compararam o
47
melhor meio nutricional, temperatura e reguladores de crescimento para
indução de calos de P. taeda, P. echinata, P. virginiana e um híbrido de
P. taeda x P. echinata, e avaliaram seu efeito no crescimento e
desenvolvimento de P. cinnamomi nos tecidos desses calos. O meio
modificado de Murashige & Skoog (1962) contendo 10-5M de ácido 2,4-
diclorofenoxiacético (2,4-D), a 26°C no escuro, promoveu a expressão
diferencial da resistência após a inoculação. Os autores observaram que
altas concentrações de 2,4 D inibiram o crescimento desse patógeno nos
tecidos de calos.
Ragazzi et al. (1995) utilizaram o método de inoculação de calos
para testar a resposta de Pinus nigra var. laricio a Cronartium flacidum.
Os tecidos de calos foram inoculados com culturas do fungo obtidas por
incubação de basidiósporos em meio modificado de Schenk &
Hildebrandt (1972). O crescimento de colônias foi mais rápido em
P.nigra var. laricio, mas esparso em P. sylvestris. Foi observado que o
crescimento de hifas aéreas foi abundante em P. nigra e menos freqüente
em P.sylvestris. A ramificação de hifas iniciou após 18 horas em P. nigra
e após 45 horas em P. sylvestris. De acordo com os autores, esses
resultados foram consistentes com a resistência das duas espécies em
plantas inteiras .
A variação somaclonal foi proposta como uma fonte de
variabilidade a ser explorada em programas de melhoramento, visando
também a obter plantas resistentes a doenças. As mudanças genéticas
48
espontâneas e aleatórias podem ser detectadas ainda in vitro, ou
selecionadas após o plantio no campo (Daub, 1986).
Hammerschlang et al. (1995) relataram a possibilidade de
selecionar variantes somaclonais de pêssego (Prunus persica) por
técnicas de cultura de tecidos. Os autores verificaram aumento nos níveis
de resistência a manchas foliares bacteriais causada por Xantomonas
campestris, os quais foram observados em regenerantes de pêssego in
vitro, em casa de vegetação e em condições de campo, quando
submetidos à toxinas selecionadas e não selecionadas. Regenerantes de
pêssego também apresentaram aumento nos níveis de resistência a
Pseudomonas syringae e a Meloidogyne incognita.
A técnica de cultura de tecidos tornou-se uma importante
ferramenta no melhoramento para obtenção de plantas resistentes a
doenças através da micropropagação ou pelo cultivo de células em meio
seletivo, na presença de fitotoxinas de fungos, permitindo assim a seleção
in vitro de variantes genéticos resistentes a determinadas doenças.
2.4.2.2 Marcadores genéticos na resistência a doenças
A genética molecular possibilita a elucidação de mecanismos de
patogenicidade de fungos e estudos da variação em fungos patogênicos
(Leong & Holden, 1989).
49
Os marcadores genéticos são de fundamental importância no
estudo de genes ou grupos de genes associados com a resistência a
doenças (Vega, 1995).
De acordo com Klopfenstein et al. (1993), em espécies florestais,
os marcadores têm importância ainda maior, visando a selecionar
indivíduos nos primeiros estágios de desenvolvimento.
A utilização de diferentes marcadores, como ferramenta no
estudo das relações patógeno-hospedeiro, depende do objetivo do estudo.
Assim, isoenzimas foram utilizadas com êxito no estudo da variabilidade
de isolados de Colletitrichum orbiculare e na identificação de espécies
do nematóide Meloidogyne spp. (Rego et al., 1994 e Alonso et al., 1995).
O gênero Populus é propagado vegetativamente para gerar
florestas monoclonais e tem apresentado fragilidade ao ataque de
patógenos (Cervera et al.,1996). As mais importantes doenças verificadas
no centro e norte da Europa foram: ferrugem de folha, causada pelo
fungo Melampsora laricii cancro bacterial, causado por Xantomonas
populi; e mancha de folhas, causada pelos fungos Marssonini brunnea.
Os autores relataram o uso de marcadores do tipo AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphism) no estudo dos mecanismos de
resistência a M. laricii, que causou a desfoliação prematura, reduzindo o
crescimento em mais de 20%. Cruzamentos entre espécies resistentes,
como Populus nigra, e suscetíveis, como P.deltoides, foram analisados.
Foi observado que 50% da variação para resistência foi explicada por um
gene de efeito maior, e 50% por genes de efeito aditivo. Também para
50
Populus foi utilizada a técnica BSA (Bulked Segregant Analysis) para a
detecção de genes de resistência e a estratégia pseudo-tesscross para
mapeamento, comentaram os autores.
O uso de marcadores moleculares, como RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), permitiu desenvolver métodos
estatísticos mais avançados para a detecção de genes responsáveis por
características quantitativas, denominados QTL (Quantitative Trait Loci),
que permitiram localizar regiões genômicas nas quais existiam os QTLs.
O uso desses métodos no mapeamento de genes de resistência
quantitativa em alguns patossistemas, no entanto, não revelou um grande
número de genes envolvidos, conforme Bergamin Filho et al. (1995) em
uma extensa revisão.
Dirlewanger et al. (1996) analisou a resistência de Sphaerotheca
pannosa em progênies híbridas de Prunus persica x P. davidiana. O
mapa gerado foi composto por 15 marcadores RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) distribuídos em quatro grupos de ligação.
Para P. davidiana, um QTL de efeito maior foi detectado, e cinco QTLs
de efeitos menores em diferentes grupos de ligação foram detectados.
Mapeamento genômico foi usado para identificar uma região do
genoma de P.taeda que determina resistência à ferrugem, causada por
Cronartium quercuum. Um locus de resistência, comportando-se como
um simples gene dominante, foi mapeado por associação com
marcadores genéticos RAPD. Foi enfatizada a importância do
mapeamento genômico como instrumento para caracterizar a base
51
genética das interações patógeno-hospedeiro em espécies florestais
(Wilcox et al.,1996).
De acordo com Yang & Kruger (1994), a resistência em maçã ao
fungo Venturia inaequalis é regulada pelo gene Vf. No estudo e
mapeamento desse gene, foi utilizada a estratégia BSA e marcadores
RAPD. Foi utilizado DNA de cinco indivíduos resistentes e DNA de dez
variedades suscetíveis. Os marcadores obtidos foram usados na seleção
assistida num programa de introgressão do gene de resistência. Tartarini
(1995) relatou para a maçã a existência de oito genes maiores que
controlam a resistência à Venturia inaequalis. As formas alélicas desses
genes de resistência foram identificadas em várias espécies. A variação
da resistência observada em progênies segregantes indicou a presença de
genes de efeito menor. De acordo com o autor, as progênies utilizadas
para mapear os genes da resistência foram do cruzamento Prima x
Golden delicius. O marcador molecular utilizado foi RAPD e a estratégia
foi BSA.
A introgressão de genes de interesse é de fundamental importância,
embora apresente algumas dificuldades como: (i) utilização de
populações ou espécies que contenham os genes de interesse que
apresentem baixa qualidade para as demais características de
importância comercial; (ii) necessidade de muitas gerações de
retrocruzamento para recuperação de características do parental desejado
e (iii) custo elevado na seleção de indivíduos contendo o gene de
interesse e as características do parental desejado (Nance et al., 1992).
52
Para Castanea dentata, suscetível ao fungo Cryphonetria
parasitica, foi utilizada uma estratégia de introgressão de genes de
resistência, provenientes da espécie Castanea mollissima, resistente,
porém de menor qualidade comercial. Marcadores RFLP foram utilizados
na seleção assistida de genótipos com os genes de resistência num
programa de introgressão (Bernatzky & Mulcahy, 1992).
O uso de marcadores genéticos em espécies florestais, para estudar
mecanismos de resistência a doenças, constitui uma importante
ferramenta. Assim, foram utilizados com êxito: mapeamento de genes
maiores ligados à resistência; estudo de variabilidade genética em isolados
de fungos; seleção assistida de genótipos resistentes; monitoramento de
genes de interesse em estudos de introgressão, e mapeamento de QTL.
2.4.2.3 Engenharia genética na resistência a doenças
Para acelerar o ciclo de melhoramento em árvores, técnicas de
engenharia genética possibilitaram transferir, em um ciclo de cultura de
tecidos, características que são monogênicas ou oligogênicas. Isso
solucionou o problema da transferência do conjunto de cromossomos no
melhoramento convencional, o que pode resultar em genótipos
indesejáveis em uma única geração (Séguin et al., 1998).
Pesquisas visando à obtenção de árvores transgênicas têm sido
realizadas. Vários estudos enfocaram o desenvolvimento de protocolos
53
para construção de plasmídeos contendo o gene de interesse (Hooykaas
& Schilperoort, 1992; Leple et al., 1992; Macrae & Staden, 1993;
Aronen et al., 1995; Confalonieri et al., 1995; Ebinuma et al., 1997); a
modificação da lignina (Boudet & Pettenati, 1996); a tolerância a
herbicidas e a inseticidas (Shin et al., 1994; Donahue et al., 1994; Bauer,
1997); a alteração em características da madeira (Tuominen et al., 1995)
e o desenvolvimento de protocolos de cultura de tecidos para regenerar as
plantas transformadas (Block, 1990; Robertson et al., 1992; Chupeau et
al., 1994). Para a obtenção de árvores resistentes a doenças, estudos
foram realizados com angiospermas e gimnospermas, porém
procedimentos de transferência de genes foram freqüentes somente com
certos híbridos de Populus (McCown et al.,1991; Jouanin et al., 1993;
Schuerman & Dandekar, 1993; Klopfenstein, 1993).
Na busca de resistência a fungos têm sido introduzidos em plantas
genes que codificam para enzimas que atuam na hidrólise de
componentes da parede celular, como as quitinases e glucanases, ou que
atuam na membrana citoplasmática, modificando sua permeabilidade. É
esperado que plantas transgênicas que expressem essas enzimas
apresentem resistência a fungos patogênicos (Brasileiro & Dusi, 1999).
Estudos em nível molecular visaram a elucidar mecanismos
genéticos de resistência de hospedeiros que podem facilitar a obtenção de
resistência a pestes em árvores, de duas formas: (i) caracterização de genes
de resistência em plantas e sistemas regulatórios que geram informações
para rápida seleção de traços de resistência, (ii) sistemas de resistência em
54
árvores que podem ser baseados na transformação genética com a
identificação de genes de resistência a pestes e seqüências regulatórias
(Klopfenstein et al., 1993).
McCown et al. (1991) relataram que a incorporação de DNA em
árvores, e a subseqüente regeneração das plantas transformadas, foi
verificada apenas em alguns gêneros, utilizando Agrobacterium como
vetor para a transferência do gene de interesse. Os autores obtiveram
sucesso na transferência direta de genes com aceleração de partículas por
descarga elétrica em genótipos híbridos, como Populus alba x Populus
grandidentata e P. nigra x P. trichocarpa. Plasmídeos contendo
neomicina fosfotransferase (NOS-NPT), o promotor constitutivo do
mosaico vírus da couve-flor, contendo β-glucuronidase (CaMV35S-GUS)
e Bacilus turingensis (CaMV35S-BT), foram usados na transformação. Os
autores verificaram que quatro plantas transformadas do híbrido P. alba x
P. grandidentata, contendo todos os três genes, foram recuperadas e
analisadas. Dois expressaram β-glucuronidase (GUS) e um foi altamente
resistente a dois lepdópteros (Malacosoma disstria e Lymantria dispar).
Em estudo visando ao melhoramento para resistência a pestes,
Klopfenstein et al. (1993) analisaram dois híbridos de Populus, os quais
foram transformados com genes de defesa de plantas quiméricos,
construídos com base no gene pin2 (inibidor II da proteinase da batata).
Um sistema de vetor binário de Agrobacterium foi usado na transformação
desses híbridos. Foi confirmada a expressão de genes em Populus
transformados com nos-PIN2 ou 35S-PIN2. Populus transgênicos
55
expressando PIN2, mostraram resistência a insetos (Plagiodera
versicolora e Chrysomela scripta) e a patógenos fúngicos (Septoria
musiva e Melampsora medusae).
Em diferentes sistemas, utilizando material de plantas juvenis e
adultas, foram transferidos genes para cultivares de damasco (Prunus
armeniaca) e ameixa (Prunus domestica). Foi relatada a transformação
desses cultivares com Agrobacterium tumefasciens, contendo vários
plasmídeos binários pBINGUSINT, carregando o gene marcador β-
glucuronidase (GUS), e pBINPPVm, carregando o gene da capa de proteína
do vírus da varíola da ameixa (PPV), o agente causal da doença sharka
(Machado et al., 1995).
A introdução de genes de interesse em plantas, através da
engenharia genética, está se tornando uma estratégia adicional a ser incluída
no melhoramento genético de plantas. Genes provenientes de espécies
vegetais distintas ou mesmo de organismos que apresentam distância
genética entre si podem ser introduzidos no genoma vegetal através da
engenharia genética (Brasileiro & Dusi, 1999).
56
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 População
Os indivíduos de A. mearnsii foram provenientes de um plantio
comercial aos quatro anos de idade, localizado na Fazenda Chagastelles,
que possui 291 ha (Figura 1), pertencente à Empresa Florestal Agroseta
S.A., localizada no município de Butiá-RS. Foram coletadas sementes de
dez árvores com sintoma de gomose e dez árvores sem sintomas de gomose.
FONTE: Carta Topográfica– Ministério do Exército (1964)
FIGURA 1- Mapa com a localização da Fazenda Chagastelles, onde localiza-se o plantio comercial de A. mearnsii, situado no município de Butiá-RS, onde foram coletadas as sementes.
57
3.2 Descrição da área de coleta do material
3.2.1 Localização
O município de Butiá faz parte da região fisionômica natural do
Estado do Rio Grande do Sul, denominada Serra do Sudeste (Escudo Rio-
grandense), tendo as seguintes coordenadas geográficas: Latitude 30º07’12”
Sul e Longitude 51º57’45” Oeste de Greenwich.
3.2.2 Clima
De acordo com Köeppen, o clima da região é do tipo Cfa,
subtropical (Moreno, 1961). A temperatura média do mês de janeiro é 24ºC,
a temperatura média do mês de julho é 13ºC, e a temperatura média anual
fica entre 18-19ºC, sendo que a temperatura média das máximas no ano é de
24ºC,.e a temperatura média das mínimas no ano é de 14ºC. A precipitação
pluvial nos meses de janeiro e julho e a precipitação anual são,
respectivamente, 120-140 mm, 120 mm e 1400 mm. A região de Butiá
possui, de maio a agosto, 600 horas de frio abaixo de 10ºC e 200 horas de
frio abaixo de 7ºC (Instituto de Pesquisas Agronômicas, 1989). Em relação
58
ao número de dias de chuva, os meses de janeiro e julho possuem dez dias
de chuva, e, anualmente, 110 dias de chuva. (Instituto de Pesquisas
Agronômicas, 1989). A umidade relativa do ar, radiação solar e insolação
anual, de acordo com o Instituto de Pesquisas Agronômicas (1989) são,
respectivamente, 75-80%, 350 cal cm-2 dia-1 e 2.400 horas.
3.2.3 Relevo e geologia
A Serra do Sudeste abrange a parte montanhosa do Estado do Rio
Grande do Sul, tendo altitude média de 300 metros, subindo ocasionalmente
até 600 metros. As principais cotas altimétricas são 11 metros em Jaguarão,
39 metros em Arroio Grande, 345 metros em Piratini, 450 metros em
Caçapava do Sul (Rambo, 1994). No município de Butiá, a cota altimétrica
fica em torno de 35 metros. A natureza geológica da Serra do Sudeste é
granito. Os solos provenientes do granito, no caso a Serra do Sudeste, são
bastante silicosos (Rambo, 1994).
3.2.4 Solos
De acordo com a Embrapa (1999), o solo dessa região pertence à
Unidade de Mapeamento São Jerônimo, sendo classificado como
59
Argilossolo Vermelho Distrófico Latossólico. Essa unidade de mapeamento
é formada, na maior parte, por solos profundos, bem drenados, de coloração
avermelhada, textura franco-argilosa e argilosa com cascalhos porosos e
desenvolvimento a partir de granitos. Os solos dessa Unidade de
Mapeamento são fortemente ácidos, com saturação e soma de bases baixa e
com teores baixos de matéria orgânica (Embrapa, 1973).
3.3 Isolamento e cultivo de patógenos associados à gomose da A. mearnsii
Amostras de segmentos do tronco de árvores de A. mearnsii aos
quatro anos de idade, apresentando sintomas de gomose na transição entre o
tecido doente e sadio, foram coletadas do segmento basal (correspondente à
porção do tronco desde o colo até 0,50 m de altura), segmento mediano
(0,51 a 1,00 m de altura) e do segmento superior (1,01 a 1,50 m de altura),
conforme Santos (2000).
Parte dos fragmentos de tecidos das amostras, medindo
aproximadamente 2 mm2, foram esterilizados superficialmente com álcool
70%, por 30 segundos, e hipoclorito de sódio 1% (v/v), por 1 minuto.
Posteriormente, os fragmentos foram lavados em água destilada, por duas
vezes (Butcher et al., 1984). Em seguida, os fragmentos foram transferidos
para placas de petri com meio de cultura BDA (infusão de 200 g de batata,
20 g de ágar marca MERCK e 20 g de dextrose). As culturas foram
incubadas em câmara de germinação a 25ºC, por um período de sete dias.
60
Os fungos que se desenvolveram no meio de cultura foram
classificados pelo tipo morfológico e transferidos para novas placas de
petri, com meio BDA. Esses fungos foram estocados em meio BDA, em
tubos de ensaio, no escuro, em temperatura ambiente.
Os fungos isolados das lesões e identificados como possíveis
patógenos causadores de gomose, três isolados de Cylindrocladium sp. e um
isolado de Fusarium sp., foram utilizados para o teste de patogenicidade,
em mudas de A. mearnsii, em casa de vegetação.
3.4 Teste de patogenicidade
3.4.1 Teste de patogenicidade em mudas de A. mearnsii
Foram selecionadas 30 mudas de A. mearnsii em casa de
vegetação, de tamanho uniforme, aos 12 meses de idade, medindo 1,6 m de
altura e apresentando diâmetro do colo de 8 cm. Foi feita a desinfestação
superficial do caule a aproximadamente 40 cm da base, com álcool 70%,
utilizando-se gase estéril. Nesse local, foram feitas perfurações no caule
com um vasador cilíndrico de metal de 0,5 cm de diâmetro, para retirada de
discos de casca e exposição do lenho, conforme metodologia de Auer &
Krugner, (1993). Os três isolados de Cylindrocladium sp. e um isolado de
Fusarium sp. foram inoculados com um disco de BDA com micélio de
61
mesmo diâmetro, com a face voltada para o lenho das mudas. A testemunha
foi constituída de discos de meio BDA sem fungo. Foram utilizadas cinco
plantas por tratamento, nas quais foram inoculados três isolados de
Cylindrocladium sp., um isolado de Fusarium sp., testemunha constituída
de BDA e cinco plantas, nas quais foi feita somente a retirada de disco de
casca. Uma gase umedecida com água bidestilada estéril foi mantida logo
abaixo do ferimento em cada planta, após a inoculação. Em seguida, a
região foi envolvida com plástico, amarrado nas duas extremidades, com o
objetivo de promover uma câmara úmida, a qual foi mantida por 48 horas.
Avaliações do surgimento e desenvolvimento dos sintomas foram feitas
semanalmente, durante dois meses, quando foi medido o comprimento das
lesões externas, e, ao final desse período, o comprimento das lesões internas
das mudas, as quais foram seccionadas longitudinalmente, iniciando-se o
corte no centro das lesões externas das mudas.
Posteriormente, foi feito o reisolamento dos fungos através da
retirada de fragmentos dos tecidos lesionados das plantas, nos quais foi feita
a desinfestação superficial com álcool 70% e hipoclorito de sódio comercial
(2,5% de cloro ativo) por 30 segundos, e, após, foram transferidos para
placas de petri com meio BDA. As culturas foram incubadas em câmara de
germinação por um período de sete dias a 25°C e, após, os fungos foram
estocados no escuro em temperatura ambiente.
Posteriormente, novos isolamentos de patógenos foram realizados
em árvores de A. mearnsii em outros plantios comerciais da empresa. A
62
metodologia utilizada foi a mesma descrita para o primeiro isolamento de
fungos de lesões ativas no campo.
Outro isolado de Fusarium sp. e um isolado de Pestalotia sp.
foram obtidos e submetidos a teste de patogenicidade em mudas de
A.mearnsii. O isolado de Pestalotia sp. foi obtido utilizando-se o meio de
cultura V8 (100% Vegetable Juice) a 20% (Cahill et al., 1993), seletivo
para isolamento de Phytophthora sp., no qual se observou somente o
crescimento de Pestalotia sp. Os patógenos foram reisolados de tecidos
lesionados, como descrito anteriormente, e armazenados em meio de cultura
BDA, no escuro, em temperatura ambiente.
A identificação morfológica dos fungos foi feita na Clínica
Fitopatológica da ESALQ/USP, em Piracicaba, SP.
A Tabela 1 apresentou a identificação e o local de coleta dos
fungos que foram isolados de lesões ativas de árvores de A. mearnsii, os
quais foram inoculados nos testes de progênies em condições de casa de
vegetação.
63
TABELA 1- Identificação, gênero, local e data de coleta dos fungos isolados de regiões de transição entre o tecido sadio e doente em troncos de A. mearnsii, com sintomas de gomose, em plantios comerciais, utilizados nos testes de progênies
N. do isolado
Gênero Local de coleta Data de coleta
I1 Cylindrocladium sp. Plantio comercial, Butiá/ RS maio/1998
I2 Cylindrocladium sp. Plantio comercial, Butiá/ RS maio/1998
I3 Fusarium sp. Plantio comercial, Butiá/ RS maio/1998
I4 Fusarium sp. Teste de procedências e
progênies, Minas do Leão/ RS
março/1999
I5 Pestalotia sp. Teste de procedências e
progênies, Minas do Leão/ RS
novembro/1999
3.5 Instalação dos testes de progênies
3.5.1 Coleta de sementes
Em um plantio comercial, no município de Butiá, RS, em maio de
1998, foram coletadas sementes de dez árvores consideradas resistentes à
gomose no campo (que não apresentavam sintoma, embora estivessem
convivendo com indivíduos infectados), e de dez árvores suscetíveis
(apresentando exsudação de goma, necrose e ruptura da casca). As sementes
foram coletadas quando as vagens se apresentavam ainda verdes, e foram
64
submetidas a secagem em estufa a 56°C, até a estabilização do peso. Após a
extração das sementes das vagens, essas foram armazenadas em câmara fria
a 5°C. Cinco progênies das dez árvores consideradas resistentes e cinco
progênies das dez árvores consideradas suscetíveis não foram analisadas
nos testes de progênies. Levou-se em consideração o fato de que as
progênies apresentaram baixa porcentagem de germinação, conforme será
explicado posteriormente.
A Tabela 2 apresentou a identificação das árvores no campo, com e
sem sintomas da doença, e sua correspondência com as progênies, em casa
de vegetação.
TABELA 2- Identificação das árvores das quais foram coletadas as sementes para os testes de progênies, em condições de casa de vegetação
N. das árvores no campo
N. da progênie nos testes em casa de vegetação
A2 com gomose PS1
A3 com gomose PS2
A4 com gomose PS3
A5 com gomose PS4
A8 com gomose PS5
A1 sem gomose PR6
A2 sem gomose PR7
A3 sem gomose PR8
A4 sem gomose PR9
A6 sem gomose PR10
PS: Progênie Suscetível; PR: Progênie Resistente
65
3.5.2 Teste de germinação
As sementes das progênies foram submetidas a um teste de
germinação em laboratório, em que a semeadura foi feita em caixas
plásticas do tipo gerbox, utilizando como substrato vermiculita expandida,
esterilizada em autoclave, a uma temperatura aproximada de 127ºC, por 60
minutos.
A quebra de dormência das sementes foi feita por imersão em água
quente (80ºC) por três minutos, conforme Martins-Corder & Borges Júnior
(1999). Foram utilizadas 25 sementes de cada progênie por gerbox, em
quatro repetições, no delineamento em blocos ao acaso. As sementes foram
mantidas em câmara de germinação tipo BOD, com temperatura de 25 ±
2ºC e fotoperíodo de 12 horas de luz branca fluorescente. As avaliações da
porcentagem de sementes germinadas por progênie foram tomadas aos 21
dias após a semeadura, conforme a regra de análise de sementes (Brasil,
1992). As progênies que apresentaram maior porcentagem de germinação
foram selecionadas para ser empregadas nos testes de progênies. Foram
selecionadas sementes de cinco progênies suscetíveis e sementes de cinco
progênies resistentes à gomose, as quais foram numeradas de 1 a 10 nos
testes em casa de vegetação (Tabela 2).
As progênies foram divididas em dois testes, nos quais foram feitas
as inoculações com perfuração de disco de micélio dos fungos. Essa divisão
foi devida ao fato de algumas progênies não apresentarem satisfatória
66
germinação e, por isso, não haver um número de plantas suficiente por
progênie para a instalação de um único teste. Também foi instalado um
terceiro teste, no qual foi feita uma inoculação dos fungos sem ferimento na
casca, para verificar se os patógenos eram capazes de infectar as plantas
sem a realização de ferimentos artificiais.
3.5.3 Testes de progênies
Três testes de progênies, denominados de experimentos 1, 2 e 3,
foram instalados em casa de vegetação, com controle de umidade, com
irrigação por meio de aspersão intermitente e controle de temperatura. O
substrato utilizado para a semeadura foi solo, vermicomposto e vermiculita,
na proporção de 1:1:1. Após a homogeneização, o substrato foi fumigado
com brometo de metila, por três dias. Os recipientes utilizados para a
formação das mudas foram tubetes de polietileno com capacidade de 104,5
cm3. A quebra de dormência das sementes foi feita por imersão em água
quente (80ºC), por três minutos (Martins-Corder & Borges Júnior,1999). As
mudas receberam, por um período de oito meses, antes da inoculação com
os fungos, aplicações em intervalos quinzenais com nutriente Ubyfol (1%),
o qual apresenta a seguinte composição: Ubyfol ML-5 (1% de cobalto,
0,2% de boro e 3% de molibdênio); Ubyfol L-7 (10% de cálcio e 3% de
magnésio) e Ubyfol L-8 (20% de fósforo e sódio e 40% de potássio). A
concentração da solução foi de 1%, com respeito aos três produtos.
67
3.5.3.1 Delineamento experimental
O primeiro teste foi constituído por seis progênies, três suscetíveis
(PS1, PS2 e PS3), três resistentes (PR6, PR7 e PR10) e uma testemunha
(PSR11), a qual foi a mistura das progênies suscetíveis e resistentes. Foram
utilizadas quatro repetições e seis plantas por parcela, totalizando 840
indivíduos. O segundo teste foi constituído por quatro progênies, duas
suscetíveis (PS4 e PS5), duas resistentes (PR8 e PR9) e uma testemunha
(PSR11), que foi a mistura das mesmas. Foram usadas três repetições e
cinco plantas por parcela, totalizando 375 indivíduos. O terceiro teste, no
qual foi realizada a inoculação sem ferimento, foi constituído por duas
progênies, uma suscetível (PS1), uma resistente (PR6), e duas testemunhas
(PSR11 e PSR12), que foram a mistura das mesmas. As progênies PS1 e
PR6, usadas nesse teste, também fizeram parte do primeiro teste de
progênie. Foram usadas três repetições com uma planta por parcela,
totalizando 60 indivíduos. Todos os testes foram instalados em blocos ao
acaso, com parcelas subdivididas, em que as parcelas principais foram
constituídas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5 (Tabela 1) e as subparcelas
foram constituídas pelas progênies.
68
3.5.4 Inoculação dos fungos
As inoculações foram realizadas quando as mudas atingiram 8, 9 e
12 meses de idade, no primeiro, no segundo e no terceiro teste de progênie,
respectivamente, quando as mudas apresentaram um diâmetro do colo
superior a 0,5 cm.
No primeiro teste, as mudas foram preparadas para a inoculação,
recebendo entre o segundo e o terceiro nó das plantas, plástico tipo parafilm
em torno do caule, para servir de suporte para o disco de meio com micélio
do fungo, e para o disco de meio BDA estéril. Os pontos do caule nos quais
foram feitas as inoculações com os fungos e o disco de BDA foram
desinfestadas com álcool 70%, utilizando-se para isso um bastão plástico
flexível com algodão (cotonete).
O disco de meio BDA com micélio dos fungos a serem inoculados,
retirados dos bordos das colônias, e o disco de meio BDA estéril foram
retirados das placas de petri com um vasador cilíndrico de 0,5 cm de
diâmetro. Na posição entre o segundo e o terceiro nó, foi colocado, de um
lado, o disco com micélio do fungo com a face do micélio voltada para a
planta, e do outro, o disco de meio BDA estéril. Esses discos foram
perfurados com agulha de metal em direção ao caule até atingir e ferir a
casca. Na posição entre o terceiro e o quarto nó, foi realizado somente o
ferimento na casca, por meio de duas pequenas perfurações com agulha de
metal. A inoculação com meio BDA e o ferimento na casca foram
69
empregados como testemunhas em todas as plantas. Após a realização das
perfurações através dos discos de micélio e BDA estéril, foi mantido, acima
das inoculações, um pequeno pedaço de algodão umedecido com água
bidestilada. Em seguida, a região foi envolvida com saco plástico amarrado
nas duas extremidades para promover uma câmara úmida, a qual foi
mantida por 48 horas (Figura 2). As inoculações foram realizadas em
dezembro de 1999, e as temperaturas mínima e máxima na casa de
vegetação, nos dias em que foram realizadas as inoculações, foram de 16,5
e 33,5°C, respectivamente.
No segundo teste de progênie, foi usado procedimento de
inoculação idêntico ao anterior, diferindo somente na posição em que foram
feitas as inoculações com o disco de BDA, o qual foi inoculado entre o
terceiro e o quarto nó, e o ferimento com agulha de metal, o qual foi
realizado entre o quarto e o quinto nó do caule das mudas. As inoculações
foram realizadas em janeiro de 2000, e as temperaturas mínima e máxima
na casa de vegetação, nos dias em que foram realizadas as inoculações,
foram de 25,3 e 38°C, respectivamente.
No terceiro teste de progênie, o qual consistiu no teste de
inoculação sem ferimento, as plantas também foram preparadas para a
inoculação, recebendo parafilm para servir de suporte para o disco de
micélio do fungo entre o segundo e o terceiro nó do caule.
Os discos de micélio dos fungos foram retirados das placas de petri
com vasador cilíndrico de 0,5 cm de diâmetro, e somente foram colocados
em contato com o caule com a face do micélio voltada para a planta, sem a
70
realização de ferimento com agulha de metal, após desinfestação da região
com álcool 70%. Após a inoculação sem ferimento, foi mantida no local
uma câmara úmida com algodão umedecido em água bidestilada e saco
plástico envolvendo a região, por 48 horas. Os mesmos indivíduos foram
inoculados com os cinco isolados, 30 dias após a inoculação sem ferimento,
quando foi realizada, entre o segundo e o terceiro nó, a inoculação com
perfuração de disco de micélio, e entre o sétimo e o oitavo nó, nova
inoculação sem ferimento, na qual foi empregado o mesmo procedimento
de câmara úmida descrito anteriormente. As inoculações foram realizadas
em abril de 2000, e as temperaturas mínima e máxima na casa de vegetação,
nos dias em que foram realizadas as inoculações, foram de 13 e 28°C,
respectivamente.
FIGURA 2- Vista parcial do teste de progênie de A.mearnsii, em condições de casa de vegetação, mostrando mudas inoculadas e sob câmara úmida.
71
3.6 Teste de inoculação em árvores de A. mearnsii no campo
Foram empregados um isolado de Cylindrocladium sp., um isolado
de Fusarium sp. e um isolado de Pestalotia sp. reisolados de lesões ativas
dos testes de patogenicidade nas mudas de A. mearnsii descritos
anteriormente (Tabela 1). Culturas fúngicas desses patógenos aos sete dias
de idade foram usadas como inóculo.
A primeira inoculação em árvores de A. mearnsii foi realizada em
novembro de 1999, quando foram inoculadas, pelo método de substituição
de disco de casca por disco de micélio-ágar, conforme metodologia de Auer
& Krugner (1993), dez árvores crescendo em plantio comercial aos quatro
anos de idade, sem sintomas de gomose no campo, das quais foi feita a
coleta de sementes para a instalação dos testes de progênies. Após a
desinfestação superficial dos pontos de inoculação com gase umedecida
com álcool 70%, em cada árvore, foram feitas quatro perfurações no tronco
com vasador cilíndrico de metal de 1,0 cm de diâmetro: as duas primeiras
perfurações 20 cm acima do solo, feitas de lados opostos na árvore. Em
uma perfuração, foi inoculado o isolado de Cylindrocladium sp.; na outra
perfuração, o isolado de Fusarium sp. cerca de 30 cm acima do solo, foi
inoculado um disco de meio BDA estéril, e a 40 cm acima do solo foi feito
um ferimento constituído somente da retirada de disco de casca, usados
como testemunhas, ambos feitos do mesmo lado da inoculação com
Cylindrocladium sp., conforme metodologia de Auer & Krugner (1993).
72
Os fungos foram inoculados com a face do micélio voltada para o
lenho e, após a inoculação, o tronco foi envolvido com faixas duplas de
gase, que foram amarradas nas extremidades. A retirada das gases e a
primeira avaliação das lesões foram feitas 15 dias após a inoculação. As
outras avaliações foram feitas aos 42 e aos 180 dias.
A avaliação das lesões produzidas foi iniciada com a raspagem
superficial da casca nos pontos de inoculação para limitar os seus bordos.
Foi medido o comprimento (C) e a largura (L) das lesões.
A segunda inoculação foi realizada em dezembro de 1999, com o
isolado de Pestalotia sp., em que foram inoculadas, pelo método de
substituição de disco de casca por disco de micélio-ágar, as dez árvores no
plantio comercial aos quatro anos de idade, sem sintomas de gomose no
campo, e as dez árvores com sintomas de gomose, das quais foi feita a
coleta de sementes para a instalação dos testes de progênies. Em cada
árvore, foram feitas duas perfurações no tronco, com vasador cilíndrico de
1,0 cm de diâmetro, uma 20 cm acima do solo, onde foi inoculado o
isolado, e outra 40 cm acima do solo, onde foi inoculada a testemunha
constituída de disco de meio BDA estéril, seguindo a metodologia de Auer
& Krugner (1993).
O isolado de Pestalotia sp. foi inoculado com a face do micélio
voltada para o lenho e, após a inoculação, o tronco foi envolvido com faixas
duplas de gase, que foram amarradas nas extremidades. A retirada das gases
e a primeira avaliação das lesões foram feitas 15 dias após a inoculação. As
outras avaliações foram aos 42 e aos 180 dias após a inoculação.
73
A avaliação das lesões produzidas foi iniciada com a raspagem
superficial da casca nos pontos de inoculação para verificar os limites das
bordas. Foi medido o comprimento (C) e a largura (L) das lesões.
3.7 Avaliações da severidade dos sintomas nos testes de progênies
Nos três testes de progênies foram realizadas avaliações
qualitativas e quantitativas dos sintomas de gomose. A primeira avaliação
qualitativa, nos três testes, foi feita sete dias após a inoculação dos
patógenos, em que foi observado o surgimento de sintomas, como
exsudação de goma e lesão com formação de necrose da casca.
As três primeiras avaliações foram feitas em intervalos semanais e,
a partir da quarta avaliação, as observações dos sintomas foram feitas em
intervalos quinzenais, durante 90 dias, somando-se oito avaliações para
cada um dos testes.
Foi observada a formação de lesão e exsudação de goma, as quais
foram classificadas em várias categorias. As avaliações qualitativas em
relação à exsudação de goma foram classificadas em LE: lesão na casca e
exsudação de goma; LEI: lesão e exsudação intensa; LES: lesão e
exsudação seca; LEN: lesão e exsudação nova; LER: lesão, exsudação e
rachadura da casca na área da lesão. As avaliações qualitativas foram
analisadas através da porcentagem de plantas com sintomas de gomose.
74
No primeiro e segundo testes de progênies, as avaliações
quantitativas foram realizadas no final dos 90 dias, iniciadas com a
raspagem da casca no local das lesões e seguidas pela medição do
comprimento (C) e da largura (L) das lesões externas provocadas pelos
agentes patogênicos. Também foi calculada a área das lesões,
multiplicando-se o comprimento pela largura das lesões externas. O
comprimento das lesões internas foi medido após a realização de corte
longitudinal no caule. No terceiro teste de progênie, foram medidos o
comprimento (C) e a largura (L) das lesões externas causadas pelos agentes
patogênicos; também foi calculada a área das lesões, porém não foi medido
o comprimento das lesões internas.
De acordo com o tamanho da lesão externa, na avaliação
quantitativa, as lesões foram classificadas em LP: lesão pequena,
apresentando comprimento menor ou igual à 0,5 cm; L: lesão com
comprimento entre 0,5 e 1,0 cm e LG: lesão grande, apresentando
comprimento maior ou igual a 1,0 cm.
O reisolamento dos fungos foi feito com a retirada de fragmentos
dos tecidos lesionados, desinfestação superficial com álcool 70% e
hipoclorito de sódio (2,5% de cloro ativo) e, após, transferência para placas
de Petri com meio de cultura BDA. Todos os fungos foram recuperados
através do reisolamento e caracterizados para confirmação. Após, foram
estocados em solução salina a 0,85% em geladeira.
Através do comprimento das lesões externas, foi empregado o
cálculo do Índice de Suscetibilidade (IS) para classificar as progênies do
75
primeiro e do segundo testes como resistentes e suscetíveis (Mello et al.,
1997).
Os comprimentos das lesões externas formadas nos caules foram
classificados em uma escala de notas: 0 (zero)= ausência de lesão; 1= LP:
lesão pequena- comprimento das lesões menor ou igual a 0,5 cm; 2= L:
comprimento das lesões entre 0,5 e 1,0 cm e 3= LG: lesão grande-
comprimento das lesões maior ou igual a 1,0 cm.
Além da avaliação por notas, foi obtido o Índice de Suscetibilidade
(IS) pela fórmula:
3
∑ [ Ni x (i + 1)
IS= i=0 ,
10
em que:
IS: Índice de Suscetibilidade;
Ni: número de plantas obtidas na i-ésima nota.
Foi calculado o Índice de Suscetibilidade para cada progênie
inoculada com cada um dos isolados.
Para o primeiro teste de progênie, de acordo com o valor do Índice,
a suscetibilidade foi classificada em: baixa suscetibilidade (B): de 2,7 até o
valor menor que 5,0; moderada suscetibilidade (M): de 5,0 até o valor
menor que 7,3 e alta suscetibilidade (A): de 7,3 até 9,6.
76
Para o segundo teste de progênie, a suscetibilidade foi classificada
de acordo com o valor do Índice: baixa suscetibilidade (B): de 1,8 até o
valor menor que 3,2; moderada suscetibilidade (M): de 3,2 até o valor
menor que 4,6 e alta suscetibilidade (A): de 4,6 até 6,0.
O intervalo desses valores foi obtido através da fórmula do IS, em
que substituindo-se Ni pelo número total de indivíduos de cada progênie
inoculados com cada um dos isolados (24 indivíduos no primeiro teste e 15
indivíduos no segundo teste) e i por três (nota máxima), foram obtidos os
valores máximos do IS de 9,6 e 6,0 para o primeiro e segundo teste de
progênie, respectivamente. A partir desses valores, para determinar os
intervalos de notas de alta suscetibilidade, moderada suscetibilidade e baixa
suscetibilidade, subtraiu-se os valores de 2,3 e 1,4 para o primeiro e
segundo teste de progênie respectivamente, os quais foram obtidos da
seguinte forma: 24-1/10 para o primeiro teste, e 15-1/10 para o segundo
teste, em que 24 e 15 foi o número total de indivíduos de cada progênie
inoculados com cada um dos isolados, conforme critério utilizado por Mello
et al. (1997).
Para a análise da variância, as notas foram transformadas de
acordo com Vencovsky & Barriga (1992) em Z= (nota + 0,5)1/2, em que Z é
o valor da nota transformada.
77
3.8 Análises estatísticas
Para a análise da variância, os valores das medições das lesões
(cm) foram transformados em √x, e os valores de porcentagem (plantas com
sintoma da doença) foram transformados em arc seno√x.
O modelo matemático, para um experimento no delineamento em
blocos ao acaso com parcelas subdivididas, usado foi:
Yijk = m + bk + ai + (ba)ik + dj + (ad)ij + eijk,
em que:
Yijk: é uma observação da variável aleatória y, referente à subparcela que
recebeu o nível i do tratamento principal na parcela principal e o nível j do
tratamento secundário na subparcela no bloco k;
m: é a média geral do experimento;
bk: é o efeito aleatório do bloco k;
ai: é o efeito (geralmente fixo) do nível i do tratamento principal na parcela
principal;
(ba)ik: é o efeito aleatório da interação entre o i-ésimo isolado com a j-ésima
progênie;
dj: é o efeito do nível j do tratamento secundário;
(ad)ij: é o efeito da interação do nível i do tratamento principal com o nível j
do tratamento secundário;
eijk: é o efeito aleatório do erro experimental referente à subparcela.
78
O esquema da análise da variância em blocos ao acaso com
parcelas subdivididas foi apresentado na Tabela 3.
TABELA 3- Análise da variância para experimento com parcelas subdivididas-Modelo fixo
Causas de variação
Graus de liberdade
Soma dos quadrados
Quadrado médio
F (sob Ho)
Blocos K-1 SQ1 QM1 QM1 / QM3 Trat. principal (Isolado)
I-1 SQ2 QM2 QM2 / QM3
Erro experimental (K-1) (I-1) SQ3 QM3 QM3 / QM6 Trat. secundário (Progênie)
J-1 SQ4 QM4 QM4 / QM6
Interação ( I x P) (I-1) (J-1) SQ5 QM5 QM5 / QM6 Erro experimental I(J-1) (K-1) SQ6 QM6 Total IJK-1 SQ7
Em que: K: número de blocos; I: número de tratamentos principais; J: número de tratamentos secundários.
A comparação entre as médias dos tratamentos foi realizada
através do teste de Tukey.
As análises estatísticas foram realizadas através do programa
estatístico Estat (Sistema para Análises Estatísticas V. 2.0), e os gráficos
foram elaborados através do programa de computador SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences).
3.9 Estimativa de parâmetros genéticos
3.9.1 Estimativa do coeficiente de herdabilidade
79
Com base no comprimento das lesões internas foi estimado o
coeficiente de herdabilidade em nível de médias de progênies (h2p) para o
primeiro e para o segundo teste de progênies. O cálculo de herdabilidade foi
feito com base no comprimento das lesões internas devido ao fato dessa
variável ter apresentado as maiores variações nos valores medidos.
A expressão utilizada para a estimativa da herdabilidade, conforme
Vencovsky & Barriga (1992) foi:
σ2p h2p= σ2p + σ2e + σ2d
j ji
Em que:
h2p= herdabilidade em nível de médias de progênies;
σ2p= variâncias genéticas entre progênies;
σ2e= variâncias ambientais entre parcelas;
σ2d= variâncias ambientais e genéticas dentro das parcelas.
80
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Teste de patogenicidade
O surgimento de sintomas nas mudas inoculadas com os isolados
foi observado sete dias após a inoculação. Os danos causados pelos
patógenos foram mais extensos do que os produzidos pela testemunha
(sem fungo), tendo resultado em lesões com comprimento (C)
significativamente maiores (Tabela 4).
TABELA 4- Médias do comprimento das lesões externas e comprimento das lesões internas (cm), obtidas 60 dias após a inoculação de mudas de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, com Cylindrocladium sp. (I1), Cylindrocladium sp. (I2), Cylindrocladium sp. (I3) e Fusarium sp
Tratamentos Comprimento lesões externas
Comprimento lesões internas
Cylindrocladium sp. (I1) 1,24 b 1,86 b
Cylindrocladium sp. (I2) 1,24 b 2,86 b
Cylindrocladium sp. (I3) 1,20 b 2,96 b
Fusarium sp. 2,00 a 15,00 a
Testemunha 0,10 b 0,16 b
C.V.(%) 18,37 41,24
C.V.(%): Coeficiente de variação experimental; médias seguidas por mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 1%.
Verificou-se claramente a distinção de três grupos, formados por
Cylindrocladium sp., Fusarium sp. e testemunha.
81
Pelo comprimento das lesões externas produzidas, observou-se que
não houve diferença significativa entre os isolados de Cylindrocladium
sp., quanto ao grau de patogenicidade, porém estes diferiram
significativamente do isolado de Fusarium sp. e da testemunha, tendo o
isolado de Fusarium sp. produzido lesões maiores, mostrando ser mais
patogênico (Figura 3).
FIGURA 3- Comprimento médio das lesões externas e internas causadas pelos isolados de Cylindrocladium sp. e Fusarium sp., em mudas de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, em casa de vegetação, 60 dias após a inoculação.
As lesões externas produzidas pelos isolados de Cylindrocladium
sp. mostraram-se necróticas, de forma elíptica, com tendência a contornar
o caule, semelhantes aos resultados obtidos por Auer & Sotta (1995) em
inoculações realizadas em árvores de A. mearnsii aos 2,2 anos de idade,
com dois isolados de C. candelabrum. Esses autores também verificaram
que não houve diferença significativa entre os dois isolados em relação
ao grau de patogenicidade. As lesões produzidas pelo isolado de
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Comprimento das lesões (cm)
Cylind.sp.I1 Cylind.sp.I2 Cylind.sp.I3 Fusariumsp Testem.
L.externa
L.interna
82
Fusarium sp. também mostraram-se necróticas, porém apresentaram uma
tendência a aumentar no sentido longitudinal do caule. Foi também
observada exsudação de goma nos pontos inoculados em todos os
isolados, como ocorre em condições naturais da doença, sendo que as
mudas inoculadas com Fusarium sp. apresentaram exsudação de goma
mais intensa. Roux & Wingfield (1997) obtiveram resultados
semelhantes em relação à formação de lesões causadas por isolados de
C.candelabrum e Fusarium sp. Em testes de patogenicidade, em que
foram inoculadas com esses isolados árvores de A. mearnsii, aos 18 e aos
36 meses de idade, os autores verificaram lesões externas medindo 1,6 e
2,2 cm, produzidas pelos isolados de C. candelabrum e Fusarium sp.,
respectivamente.
Analisando-se o comprimento das lesões internas produzidas no
lenho, observou-se que o isolado de Fusarium sp. mostrou diferença
significativa entre os isolados de Cylindrocladium sp., porém os isolados
de Cylindrocladium sp. não diferiram estatisticamente entre si, nem da
testemunha. Essas lesões caracterizaram-se pela presença de estrias
escuras no lenho, também verificados por Ribeiro et al. (1988) e Morris
et al. (1993), os quais observaram, após a realização de cortes
longitudinais em caules de árvores de A. mearnsii infectadas pelo fungo
Ceratocystis fimbriata, a formação de áreas de coloração cinza-escuro no
cerne.
Rachaduras na casca lesionada foram observadas, 30 dias após a
inoculação com os fungos testados.
83
Todos os isolados foram recuperados das mudas inoculadas,
demonstrando o seu estabelecimento nos tecidos da casca e do lenho.
4.2 Testes de progênies
4.2.1 Experimento I: Teste de progênie (PS1, PS2, PS3, PR6, PR7, PR10
e PRS11) de A. mearnsii visando resistência a gomose
O surgimento de sintomas de gomose nas progênies de
A.mearnsii foi observado 48 horas após a inoculação com os isolados. Os
sintomas em A. mearnsii iniciaram com a necrose da casca nos pontos
inoculados e seguiram com o surgimento de exsudação de goma nas
lesões de cor parda-escura (Figura 4). Sintomas semelhantes foram
relatados por Zeijlemaker (1971); Roux et al. (1995); Sotta & Auer
(1995) e por Santos et al. (1998), após inoculações artificiais em
A.mearnsii.
FIGURA 4-Manifestação de sintomas de gomose nas progênies PS3 e PR6 de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I4 (Fusarium sp.), caracterizados por exsudação de goma das lesões de cor parda (setas), em condições de casa de vegetação.
PS3 PR6
I4- Fusarium sp.
84
Na Figura 5, observou-se que, sete dias após a inoculação dos
patógenos, todas as progênies apresentaram mais de 80% dos indivíduos
com manifestação de sintomas de gomose, caracterizados por necrose da
casca e/ou exsudação de goma, em que as progênies suscetíveis PS1, PS2
e PS3 apresentaram maior porcentagem de indivíduos com sintoma de
gomose do que as progênies PR6, PR7 e PR10, consideradas resistentes.
A partir da segunda avaliação, aos 14 dias após a inoculação, as
progênies suscetíveis PS2 e PS3 apresentaram mais de 90% dos
indivíduos com gomose. Houve uma estabilização no surgimento de
sintomas a partir da sexta avaliação, aos 66 dias após a inoculação, em
que se verificou uma maior porcentagem de indivíduos com gomose na
progênie suscetível PS3, que apresentou 95,8% dos indivíduos doentes, e
na progênie PS2, que apresentou 96,7% dos indivíduos com gomose. As
progênies PS1, PR6, PR7, PR10 e PRS11 apresentaram, respectivamente,
90,8, 91,6, 93,3, 94,9 e 95,8% de indivíduos com sintoma de gomose, 90
dias após a inoculação.
Observou-se que, nas progênies suscetíveis, os sintomas da
doença evoluíram com o aumento das lesões necróticas e intensa
exsudação de goma durante o período experimental, porém, nas
progênies resistentes, os sintomas foram contidos. Resultados similares
foram observados por Cahill et al. (1993) em clones de Eucalyptus
marginata resistentes (RR) e suscetíveis (SS) à P. cinnammomi. Esses
autores verificaram, após a inoculação, que as lesões formadas nas raízes
85
dos clones resistentes foram restritas a uma área limitada, porém, nos
clones suscetíveis, as lesões continuaram aumentando rapidamente.
FIGURA 5- Porcentagem de indivíduos de A. mearnsii com sintomas de gomose, em cada progênie, aos 11 meses de idade, inoculadas com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, conforme períodos de avaliação, no primeiro teste de progênie. As três primeiras avaliações foram realizadas em intervalos semanais, e as demais, em intervalos quinzenais. PS: progênie suscetível; PR: progênie resistente.
Em relação à porcentagem de indivíduos com exsudação de
goma, observou-se, durante as avaliações, que houve uma tendência para
as progênies resistentes apresentarem uma maior porcentagem de
indivíduos com exsudação, em relação às progênies suscetíveis. As
progênies resistentes PR10 e PR6 apresentaram maior porcentagem de
indivíduos com exsudação de goma das lesões. A testemunha PRS11
80%
90%
100%
Indivíduos com sintoma de
gomose (%)
7 14 21 36 51 66 81 96
Avaliação (dias após a inoculação)
PS1
PS2
PS3
PR6
PR7
PR10
PRS11
86
manteve-se com 20 e 30% de indivíduos apresentando exsudação de
goma. Isso indicou uma forma de defesa histológica dos indivíduos
resistentes, que se manifestou pela produção e deposição de goma ao
redor das lesões e nos vasos do lenho nos pontos de infecção pelo
patógeno, agindo como uma forma de bloqueio da extensão do fungo no
interior das células vivas. Foi também observada uma maior intensidade
na exsudação de goma das lesões em dias quentes e úmidos, devido ao
fato de as condições serem favoráveis ao crescimento e esporulação dos
fungos. Tippett et al. (1985) também verificaram maior intensidade na
manifestação de sintomas em Eucalyptus marginata (suscetível) e em
E.calophylla (resistente) inoculados com Phytophthora cinnamomi, em
períodos de temperatura mais elevada, nos meses de dezembro a março.
Os resultados das análises da variância e médias para as variáveis
comprimento, largura e área das lesões externas, e comprimento das
lesões internas em A. mearnsii, foram apresentados na Tabela 5.
87
TABELA 5 - Análises da variância e médias para as variáveis comprimento, largura e área das lesões externas, e comprimento das lesões internas (cm), obtidos 90 dias após a inoculação de mudas de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, no primeiro teste de progênie, com os isolados de Cylindrocladium sp. (I1 e I2), Fusarium sp. (I3 e I4) e Pestalotia sp. (I5)
Variáveis
Comp. lesões externas (cm)
Largura lesões externas (cm)
Área das lesões C x L (cm2)
Comp. lesões internas (cm)
ANAVA F blocos
0,20 ns
ANAVA F blocos
2,49 ns
ANAVA F blocos
0,01 ns
ANAVA F blocos
3,12 ns
F isolados1 19,96** F isolados1 19,52** F isolados1 13,37** F isolados1 22,05** Tukey(5%) 0,1009 ds Tukey(5%) 0,0721 ds Tukey(5%) 0,1018 ds Tukey(5%) 0,2070ds C.V(%) MÉDIAS
16,01 C.V(%) MÉDIAS
12,88 C.V(%) MÉDIAS
22,77 C.V(%) MÉDIAS
25,31
Média Isolados
0,7395 Média Isolados
0,6562 Média Isolados
0,5243 Média Isolados
0,9593
I1 0,8103a I1 0,7334a I1 0,6240a I4 1,1429a I4 0,8005a I2 0,6872ab I4 0,5567ab I2 1,0596a I3 0,7678a I4 0,6718ab I2 0,5279ab I3 1,0539a I2 0,7535a I3 0,6452b I3 0,5158b I1 0,9455a I5 0,5655b I5 0,5437c I5 0,3973c I5 0,594b ANAVA F progênies2
5,24**
ANAVA Fprogênies2
1,35 ns
ANAVA F progênies2
4,63**
ANAVA F progênies2
2,16 ns
Tukey(5%) 0,0689 ds Tukey(5%) - Tukey(5%) 0,1077 ds Tukey (5%) - C.V(%) MÉDIAS
9,77 C.V(%) MÉDIAS
8,82 C.V(%) MÉDIAS
21,55 C.V(%) MÉDIAS
25,35
PS2 0,7902a PS1 0,6740a PS2 0,6081a PS1 1,0940a PS1 0,7818ab PS2 0,6647a PS1 0,5875ab PS2 1,0387a
PR10 0,7392abc PS3 0,6646a PRS11 0,5140abc PR6 0,9603a PRS11 0,7382abc PRS11 0,6632a PR10 0,5077abc PRS11 0,9337a
PR6 0,7253abc PR6 0,6549a PR6 0,5037abc PR7 0,9203a PS3 0,7195bc PR10 0,6406a PS3 0,4967bc PS3 0,8990a PR7 0,6825c PR7 0,6317a PR7 0,4527c PR10 0,8694a
Interação (P x S)
0,99 ns Interação (P x S)
0,86 ns Interação (P x S)
1,51 ns Interação (P x S)
0,91 ns
C.V.(%): Coeficiente de variação experimental; ns: Diferenças não significativas em nível de 5% de probabilidade; **: Diferenças significativas em nível de 1% de probabilidade; Tukey (5%): Diferença mínima detectada pelo teste de Tukey (P< 0,05); 1 Tratamento principal; 2 Tratamento secundário; PS1, PS2, PS3: progênies suscetíveis, PR6, PR7, PR10: progênies resistentes, PRS11: testemunha; I1 e I2: Cylindrocladium sp; I3 e I4: Fusarium sp; I5: Pestalotia sp.
88
Pela Tabela 5, observaram-se diferenças significativas (P< 0,01)
entre os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, para as variáveis comprimento e
largura das lesões externas, área das lesões e comprimento das lesões
internas.
Os valores médios para as variáveis comprimento e largura das
lesões externas, área das lesões e comprimento das lesões internas foram
0,73; 0,65; 0,52 e 0,95 cm respectivamente. As lesões internas
produzidas foram maiores do que as lesões externas, o que indicou que a
colonização pelos fungos foi maior no lenho do que na superfície da
casca. Isso ocorreu, provavelmente, devido à presença de estruturas de
defesa pré-existentes, como a cutícula espessa e estrutura da parede
celular epidérmica (Smith, 1996). A superfície intacta da planta constitui
uma barreira aos agentes patogênicos de penetração direta, após a
deposição do inóculo Os fatores mais considerados neste tipo de
resistência são as espessuras da cutícula e da parede externa das células
epidérmicas (Mazau et al., 1987).
A invasão e o crescimento dos fungos em células da superfície
das plantas são complexos. A partir do momento em que o patógeno
invade os tecidos, ocorrem eventos, como o reconhecimento de sítios
específicos e a degradação da parede celular da planta pelo patógeno por
enzimas específicas, como as hidrolases. Esses processos dificultam e
retardam o crescimento dos fungos nos tecidos, pois quanto maior for a
resistência estrutural da superfície da planta, maior deverá ser a atividade
89
do patógeno para degradar os constituintes da parede celular (Mazau et
al., 1987).
Em relação ao comprimento das lesões externas e internas,
somente o isolado I5 diferiu significativamente dos demais. Na Figura
6A, observou-se que o isolado I4 causou o maior comprimento das lesões
internas nos indivíduos de A. mearnsii, porém não diferindo
significativamente dos isolados I1, I2 e I3.
A B
C
FIGURA 6-Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento das lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, no primeiro teste de progênie, em condições de casa de vegetação.
168168168168168N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Comprimento lesão externa (cm)
,8
,7
,6
,5
,4
,3
,2168168168168168N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Área da lesão (cm2)
,5
,4
,3
,2
,1
0,0
168168168168168N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Comprimento lesão interna (cm)
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
90
Os isolados I1, I2, I3 e I4 não diferiram entre si quanto ao grau de
virulência em relação às variáveis comprimento das lesões externas e
internas. O isolado que apresentou os menores valores nas dimensões das
lesões, em todas as variáveis analisadas, foi o isolado I5 (Pestalotia sp.),
o que indicou a baixa virulência desse fungo nas progênies de
A.mearnsii. Zeijlemaker (1971) obteve resultados semelhantes, quando
árvores de A. mearnsii foram inoculadas com o fungo Pestalotia
crassiuscula. A baixa virulência desse fungo foi constatada pelo autor
através do reduzido número de indivíduos que apresentaram sintomas de
gomose após a inoculação. Roux & Wingfield (1997) também
verificaram que o fungo Pestalotiopsis sp. produziu lesões pequenas em
árvores de A. mearnsii.
Os primeiros sintomas causados pelo isolado I5 foram verificados
15 dias após a inoculação, através da exsudação de goma. O
desenvolvimento de lesões necróticas foi observado 40 dias após a
inoculação. Resultados similares foram demonstrados por Roux &
Wingfield (1997), que observaram o desenvolvimento de lesões causadas
por Pestalotiopsis sp. em A. mearnsii 42 dias após a inoculação.
Os isolados de Cylindrocladium sp. (I1 e I2) apresentaram os
maiores valores de largura das lesões (Tabela 5). Isso ocorreu porque as
lesões induzidas por esses fungos mostraram-se necróticas de forma
elíptica, semelhantes aos resultados observados por Auer & Sotta (1995),
em árvores de A. mearnsii inoculadas com dois isolados de
C.candelabrum.
91
As progênies que apresentaram maior suscetibilidade aos
patógenos associados à gomose foram as progênies suscetíveis PS1 e
PS2, nas quais as dimensões das lesões foram maiores. A progênie
resistente PR7 foi a que apresentou os menores valores nas dimensões
das lesões (Figura 7).
Os resultados obtidos nesse teste de progênie, em condições de
casa de vegetação, em relação à resistência e suscetibilidade à gomose,
foram condizentes com o comportamento das árvores matrizes no campo,
pois foi observada uma tendência para as progênies suscetíveis
apresentarem as maiores lesões, e para as progênies resistentes
apresentarem os menores valores de lesões, e um maior número de
indivíduos livres da doença.
Das progênies inicialmente consideradas suscetíveis, somente a
PS3 mostrou-se resistente, com valores de lesões menores, semelhantes
aos valores apresentados pelas progênies resistentes PR7 e PR10. Isso
ocorreu devido à variação genética existente nessa progênie em relação à
resistência à gomose, evidenciando que foi possível selecionar indivíduos
resistentes à doença também dentro de progênies suscetíveis. Essa
progênie também apresentou indivíduos livres da doença, sem nenhum
tipo de sintoma. Alguns autores também foram capazes de encontrar
indivíduos de Eucalyptus sp. resistentes à ferrugem entre e dentro de
espécies/procedências e de progênies suscetíveis (Ferreira, 1981 e 1983;
Ferreira & Silva, 1982).
92
A testemunha PRS11, que foi a mistura de sementes das
progênies resistentes e suscetíveis, apresentou valores próximos da média
para todas as variáveis analisadas, demonstrando que a amostragem das
progênies foi representativa da população.
As Figuras 7A e 7B mostram a amplitude dos valores de lesões
internas e área das lesões causadas pelos isolados nas progênies, em que
foi possível verificar as variações entre as progênies resistentes e
suscetíveis. Observou-se que as progênies suscetíveis e resistentes
apresentaram respectivamente os maiores e menores valores nas
dimensões das lesões.
Pela Tabela 5, verificou-se que a interação entre os isolados e as
progênies não foi significativa (P< 0,01), indicando que a resistência
apresentada por essas progênies deve ser do tipo horizontal, a qual é
geralmente poligênica e em que não ocorre interação diferencial entre
patógeno e hospedeiro (Bergamin Filho et al., 1995).
Foi observado que, antes da transformação dos dados, os
coeficientes de variação experimental (C.V.%) para isolados e para
progênies apresentaram valores acima de 30%, considerados muito altos
(Pimentel Gomes, 1990). A transformação dos dados em √x diminuiu a
heterogeneidade da variância e, conseqüentemente o coeficiente de
variação. Altos coeficientes de variação ocorreram devido à variação
genética observada entre e dentro de progênies de A. mearnsii, em
relação à resistência à gomose, a qual foi verificada através da variação
nas dimensões das lesões. Os maiores coeficientes de variação foram
93
observados, mesmo após a transformação dos dados, no comprimento das
lesões internas, em que se verificou para isolados, uma amplitude de 0,3
a 1,6 cm (Figura 6A), e, para progênies, uma amplitude de 0,55 a 1,4 cm
(Figura 7A).
A B
C
FIGURA 7-Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento das lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em cada progênie de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, no primeiro teste de progênie, em condições de casa de vegetação.
120120120120120120120N =
Progênie
PRS11PR10PR7PR6PS3PS2PS1
Comprimento lesão externa (cm)
,8
,7
,6
,5
,4
120120120120120120120N =
Progênie
PRS11PR10PR7PR6PS3PS2PS1
Área da lesão (cm2)
,4
,3
,2
,1
120120120120120120120N =
Progênie
PRS11PR10PR7PR6PS3PS2PS1
Comprimento lesão interna (cm)
1,6
1,4
1,2
1,0
,8
,6
,4
94
Nas Figuras 8A e 8B, verificou-se a amplitude e a freqüência dos
valores de comprimento das lesões internas e área das lesões causadas
pelos isolados, em que pode ser visualizada a dispersão desses valores,
observando-se que alguns indivíduos isolados afastaram-se dos valores
mais freqüentes. Isso demonstrou a variação genética entre e dentro das
progênies, em resposta aos mesmos isolados. Resultados similares foram
obtidos, em relação à resistência de Eucalyptus sp. à ferrugem causada
por Puccinia psidii, por vários autores, como Ferreira (1981 e 1983);
Ferreira & Silva (1982) e Mello et al. (1997), os quais encontraram
indivíduos resistentes à ferrugem entre e dentro de espécies/procedências
e de progênies suscetíveis.
A estimativa do coeficiente de herdabilidade em nível de médias
de progênies, para a variável comprimento das lesões internas,
apresentou um valor elevado (h2p=0,54), indicando estar essa
característica sob alto grau de controle genético.
Foram observados indivíduos altamente suscetíveis dentro das
progênies resistentes PR6, PR7 e PR10. Na Figura 8B, observou-se que
um indivíduo da progênie PR10, inoculado com o isolado I2
(Cylindrocladium sp.), apresentou comprimento de lesão interna de 15
cm, e um indivíduo da progênie PR7 mostrou comprimento de lesão
interna de 13 cm.
95
A
B
FIGURA 8- Amplitude e freqüência dos valores de área das lesões (A) e comprimento das lesões internas (B) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação, no primeiro teste de progênie, em condições de casa de vegetação.
2424242424 2424242424 2424242424 2424242424 2424242424 2424242424 2424242424N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Área da lesão (cm2)
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
Progênie
PS1
PS2
PS3
PR6
PR7
PR10
PRS11
627415416
752
289293
71337458
369579
538
195825614
156529 401568
357
106
692
182814
396
352562
808805
810
92
52
264
53
12
802
716
257673
631
2424242424 2424242424 2424242424 2424242424 2424242424 2424242424 2424242424N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Comprimento lesão interna (cm)
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
Progênie
PS1
PS2
PS3
PR6
PR7
PR10
PRS11
420419
713
538283285497
496
824
529
72
818
525
274
654
774
810
555
512
9426410
591802
342466
421426
3
96
Foi observado que um indivíduo da progênie resistente PR7, 15 dias
após a inoculação com o isolado I2 (Cylindrocladium sp.), apresentou-se
dobrado no ponto de inoculação, onde se formou a lesão, permanecendo
nessa condição por um período de 15 dias. A partir daí, esse indivíduo
iniciou um processo de recuperação, tendo sido observada uma
lignificação no local da lesão. Esse indivíduo mostrou-se completamente
recuperado após 30 dias, tendo retomado o seu crescimento e
desenvolvimento normal (Figura 9). Essa reação demonstrou a capacidade
da progênie resistente PR7 para reagir ao ataque desse patógeno, tendo
contido a manifestação dos sintomas e retomado suas atividades
fisiológicas normais. Foi verificado, após o corte longitudinal do caule
desse indivíduo, que o crescimento do patógeno no lenho foi contido,
restringindo a área da lesão, impedindo assim o aumento da lesão interna
causada pelo fungo. Observou-se também uma calosidade no lenho, na
região onde a lesão foi contida (Figura 10). Essa reação caracterizou-se
como um mecanismo de resistência induzida, que ocorreu após a infecção
da planta pelo patógeno. A especificidade da lignificação induzida é
governada pelo potencial genético de microorganismos que induzem à
lignificação e pelo potencial genético de plantas que respondem a essa
indução (Vance et al., 1980). Ride (1978) sugeriu que a lignificação pode
ter a função de retardar o crescimento do fungo nos tecidos da planta, até
que as fitoalexinas se acumulem em concentrações efetivas. Vários autores
têm relatado a produção de lignina como um mecanismo de resistência
induzida ao ataque de fungos em várias espécies. Cahill & McComb
97
(1992) observaram um aumento na concentração de lignina em segmentos
de raízes de E. calophylla (resistente), inoculado com P. cinnamomi. O
aumento verificado foi de 12, 41, 53, 42 e 33% nos segmentos de raízes 1
(2 cm a partir da extremidade da raiz), 2 (3-4 cm a partir da extremidade
da raiz), 3 (4-5 cm a partir da extremidade da raiz), 4 (5-6 cm a partir da
extremidade da raiz) e 5 (6-7 cm a partir da extremidade da raiz),
respectivamente, em relação à testemunha (sem inoculação). Em
E.marginata (suscetível), não foi verificado aumento nos níveis de lignina
em nenhum dos cinco segmentos de raízes. Cahill et al. (1993) também
verificaram aumento na concentração de lignina em clones de E.marginata
resistentes (RR), suscetíveis (SS) e em clones resistentes provenientes de
uma família suscetível (RS) após a inoculação de segmentos de raízes com
P. cinnamomi. O maior aumento na concentração de lignina, 48 horas após
a inoculação, foi observado nos clones resistentes, os quais apresentaram
244 e 154% de lignina a mais que a testemunha (sem inoculação) para os
segmentos 1 (2 cm a partir da extremidade da raiz) e 2 (3-4 cm a partir da
extremidade da raiz), respectivamente. Altos conteúdos de compostos
semelhantes à lignina, em folhas de Dactylis glomerata, inoculadas com
Stagonospora arenaria, também foram verificadas por Sherwood & Berg
(1991).
Em dois indivíduos da progênie resistente PR6 e em um indivíduo
da progênie suscetível PS3, inoculados com o isolado I5, 30 dias após a
inoculação dos fungos, foi verificada a formação de um calo cicatricial
nos pontos de inoculação, apresentando um inchaço no local de invasão
98
pelo patógeno, caracterizando-se como uma reação de resistência
(Figuras 11A e 11B). Após o corte longitudinal do caule de um dos
indivíduos da progênie PR6 (Figura 12), verificou-se que o crescimento
interno do fungo no lenho foi contido e limitado a uma pequena região. A
formação de calo cicatricial, como resposta à inoculação, também foi
verificada por Auer & Krugner (1993), em áreas de lesões induzidas por
Valsa ceratosperma, em E. grandis. Diversos autores têm verificado, em
espécies florestais, modificações celulares, histológicas, e metabólicas
em resposta a patógenos fúngicos, as quais agem como mecanismos de
resistência formados após a infecção (Sylvia & Sinclair, 1983; Cahill &
Weste, 1983; Cahill et al., 1986a; Cahill et al., 1986b; Matern &
Kneusel, 1988; Cahill et al., 1989; Strobel & Sinclair, 1991).
99
FIGURA 9-Indivíduo da progênie resistente PR7 de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I2 (Cylindrocladium sp.), após ter retomado suas atividades fisiológicas, apresentando lignificação na área da lesão.
FIGURA 10-Seção longitudinal de um indivíduo da progênie resistente PR7 de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I2 (Cylindrocladium sp.), em condições de casa de vegetação, mostrando que a colonização interna do lenho pelo patógeno foi contida.
PR7
I2- Cylindrocladium sp.
PR7 I2- Cylindrocladium sp.
100
FIGURA 11-Indivíduos das progênies PS3 (A) e PR6 (B) de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, apresentando calo cicatricial nos pontos de inoculação, 90 dias após a inoculação com o isolado I5 (Pestalotia sp.), em condições de casa de vegetação.
A
B
PS3 I5-Pestalotia sp.
PR6 I5-Pestalotia sp.
101
FIGURA 12-Seção longitudinal de um indivíduo da progênie resistente PR6 de A.mearnsii, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação com o isolado I5 (Pestalotia sp.), em condições de casa de vegetação, em que foi observado que a colonização interna do lenho pelo patógeno foi contida.
A Tabela 6 apresentou o total de indivíduos das progênies de
A.mearnsii mortos no primeiro teste, 90 dias após a inoculação dos
patógenos.
PR6
I5- Pestalotia sp.
102
TABELA 6-Total de indivíduos mortos das progênies PS1, PS2, PS3, PR6, PR7, PR10 e testemunha PRS11 de A. mearnsii, no primeiro teste de progênie, e os respectivos isolados responsáveis pela morte desses indivíduos, 90 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em condições de casa de vegetação
Progênie Isolado N. de indivíduos mortos
PS3
I1 1
PR6 I1 1 I3 1
I5 1
PR7 I1 4
I3 3
PR10 I1 1 I3 2 I5 1
Total 15
PS3: progênie suscetível; PR6, PR7, PR10: progênies resistentes; I1: Cylindrocladium sp.; I3: Fusarium sp.; I5: Pestalotia sp.
Pela Tabela 6, observou-se que, dentro de progênies resistentes,
foram verificados indivíduos altamente suscetíveis à gomose, os quais
foram levados à morte pelos isolados inoculados. O isolado que causou a
morte de um maior número de indivíduos foi o isolado I1
(Cylindrocladium sp.), com o qual morreram sete indivíduos, o que
indicou um maior grau de virulência desse fungo. Isso ocorreu devido a
esse patógeno ter produzido lesões de forma elíptica, estrangulantes,
contornando o caule, o que foi também verificado por Auer & Sotta
(1995), com C. candelabrum.
103
Verificou-se que, no primeiro teste de progênie, a inoculação dos
patógenos causou a morte de 15 indivíduos (Tabela 6), o que
correspondeu a 1,79% do total de indivíduos do teste.
Na Figura 13, observou-se a presença de indivíduos de A. mearnsii
resistentes dentro de progênies suscetíveis, e a presença de indivíduos
suscetíveis dentro de progênies resistentes. As Figuras 13A e 13B
mostraram indivíduos de A. mearnsii nas progênies PS2 e PR7,
apresentando sintomas típicos da doença, caracterizados por exsudação
de goma e lesão necrótica, e também a presença de indivíduos sem
sintomas de gomose, evidenciando a variação genética entre e dentro de
progênies resistentes e suscetíveis. Isso ocorreu devido a troca de genes
entre árvores adjacentes, pelo fato da A. mearnsii ser uma espécie
alógama, de polinização cruzada, em que indivíduos sadios e infectados
pela gomose crescem juntos na mesma área, ocorrendo cruzamentos
entre esses indivíduos. Por essa razão, é fundamental a identificação de
indivíduos resistentes a doença e a instalação de um Pomar de Sementes
Clonal (P.S.C.) com genótipos resistentes à gomose.
104
FIGURA 13-Indivíduos de A. mearnsii da progênie suscetível PS2 e da progênie resistente PR7, aos 11 meses de idade, 90 dias após a inoculação, apresentando indivíduo resistente dentro de progênie suscetível, e indivíduo suscetível dentro de progênie resistente. Da esquerda para a direita: indivíduo com sintoma de gomose, apresentando exsudação de goma; indivíduo com sintoma de gomose, apresentando lesão necrótica; indivíduo sem sintoma e testemunha (ferimento na casca com agulha).
Suscetível PS2 Resistente
Testemunha Ferimento Suscetível Resistente
Testemunha Ferimento
PR7
105
Foi verificada, 40 dias após a inoculação, a ocorrência de
secamento e escurecimento da extremidade do ramo terminal em um
indivíduo da progênie resistente PR6, inoculado com o isolado I3
(Fusarium sp.), e em um indivíduo da progênie resistente PR7, inoculado
com o isolado I1 (Cylindrocladium sp.). Esse sintoma cessou e
estabilizou no quinto e no oitavo nó do caule, de cima para baixo, nas
progênies PR6 e PR7, respectivamente. Os ramos laterais desses
indivíduos tornaram-se dominantes, e seu crescimento e desenvolvimento
não foi afetado. Isso evidenciou que essas progênies resistentes foram
capazes de conter a evolução dos sintomas antes que esses indivíduos
tivessem seu desenvolvimento interrompido (Figuras 14A e 14B).
FIGURA 14-Indivíduos de A. mearnsii das progênies resistentes PR6 (A) e PR7 (B), aos 9 meses de idade, 40 dias após a inoculação com os isolados I3 (Fusarium sp.) e I1 (Cylindrocladium
sp.), respectivamente, em condições de casa de vegetação, apresentando secamento e escurecimento dos ramos terminais.
A B PR6 I3- Fusarium sp.
PR7 I1- Cylindrocladium sp.
106
Foi verificado que, nos tratamentos de inoculação com disco de
BDA estéril e de ferimento da casca com agulha de metal, os quais
consistiram na testemunha, não foram observados sintomas de gomose.
Foi verificada somente uma moderada exsudação de goma de cor clara
nos pontos de inoculação com BDA estéril, durante a primeira semana
após a inoculação. Isso se caracterizou como uma reação natural,
freqüentemente observada em A. mearnsii, a qualquer tipo de agressão,
sendo muitas vezes confundida com gomose (Santos et al., 1997a).
4.2.2 Experimento II: Teste de progênie (PS4, PS5, PR8, PR9 e PRS11)
de A. mearnsii visando resistência à gomose
Os primeiros sintomas de gomose foram observados, assim como
no primeiro teste, 48 horas após a inoculação com os isolados, iniciando-
se com a necrose da casca nos pontos de inoculação, semelhante ao
sintoma tipo mosqueado, que se caracterizou por lesão necrótica da casca
de cor escura e formato irregular, também verificado em A. mearnsii por
Roux et al. (1995) e Santos et al. (1998). A progressão dos sintomas
seguiu com o surgimento de exsudação de goma das lesões de cor parda,
tornando-se marrom após algum tempo em contato com o ar, indicando
um sinal da doença. A necrose da casca de indivíduos das progênies PS4
e PS5, sete dias após a inoculação, foi apresentada nas Figuras 15A e
15B.
107
FIGURA 15-Necrose da casca em indivíduos de A. mearnsii das
progênies suscetíveis PS4 (A) e PS5 (B), aos 9 meses de idade, nos pontos de inoculação com o isolado I3 (Fusarium sp.), sete dias após a inoculação, em condições de casa de vegetação.
I3-Fusarium sp.
PS5
I3-Fusarium sp.
PS4
A
B
108
Na Figura 16, observou-se que, sete dias após a inoculação, todas
as progênies apresentaram entre 80 e 95% dos indivíduos com
manifestação de sintomas. Foi verificado que, entre a terceira (aos 21
dias após a inoculação) e a quarta avaliação (aos 36 dias após a
inoculação) as progênies resistentes PR8 e PR9 apresentaram maior
porcentagem de indivíduos com sintomas de gomose. A partir da quarta
avaliação, as progênies suscetíveis PS4 e PS5 apresentaram maior
porcentagem de indivíduos com sintomas da doença do que as progênies
resistentes. Isso indicou a ocorrência de reações semelhantes às de
resposta de hipersensibilidade, em que a morte de células e a necrose de
tecidos nos pontos de inoculação, nos indivíduos resistentes, ocorreu
mais rapidamente do que nos indivíduos suscetíveis, como uma reação de
resistência, que ocorre em resposta à infecção pelo patógeno, na tentativa
de impedir a sua multiplicação e crescimento em células sadias do
hospedeiro. De acordo com Camargo (1995), em algumas interações
entre patógeno e hospedeiro, ocorre o fenômeno da hipersensibilidade,
pelo qual células do hospedeiro, vicinais ao ponto de penetração do
patógeno, morrem logo após a infecção. Com a morte dessas células, o
crescimento do patógeno é restrito ao local de infecção. Tippet &
Malajczuk (1979) também verificaram reações de hipersensibilidade em
raízes de A .pulchella inoculadas com P. cinnamomi. Alfenas et al.
(1997) avaliaram 13 clones superiores de Eucalyptus, quanto à
resistência à ferrugem, e observaram que, dos quatro clones que
apresentaram resistência completa à Puccinia psidii, dois exibiram reação
109
típica de hipersensibilidade. Essa reação caracterizou-se pela morte das
células adjacentes à célula de penetração do primeiro haustório,
evidenciando-se, assim, em nível histológico, a reação de
hipersensibilidade que bloqueou a colonização do patógeno.
A partir da sexta avaliação (aos 66 dias após a inoculação), ocorreu
uma estabilização no surgimento de sintomas nos indivíduos de
A.mearnsii, e verificou-se que todas as progênies, exceto a progênie
resistente PR8, apresentaram mais 90% dos indivíduos com gomose.
As progênies PR8, PS5, PS4, PR9 e PRS11 apresentaram,
respectivamente, 90 dias após a inoculação dos patógenos, 90, 94,7, 96,
96 e 96% de indivíduos com sintomas de gomose (Figura 16).
Verificou-se que, no segundo teste de progênie, em que o período
experimental foi de janeiro a março, com temperaturas mais elevadas,
variando entre 25,3 e 38°C, as progênies apresentaram uma porcentagem
de indivíduos com exsudação de goma entre 35 e 85%. Porém, no
primeiro teste, em que a temperatura no período experimental (de
dezembro a fevereiro) variou de 16,5 a 33°C, as progênies apresentaram
entre 15 a 45% de indivíduos com lesões exsudativas. Isso indicou que
temperaturas mais elevadas favoreceram o crescimento dos patógenos
nos tecidos das plantas, e que a exsudação de goma foi uma resposta dos
indivíduos à maior atividade dos fungos, o que também foi verificado por
Zeijlemaker (1971) em A. mearnsii e por Tippett et al. (1985) e Tippett et
al. (1989) em Eucalyptus. Observou-se também maior intensidade na
exsudação de goma das lesões em dias úmidos e com temperaturas
110
elevadas, quando as condições climáticas foram favoráveis ao
crescimento dos patógenos nos tecidos das plantas.
FIGURA 16-Porcentagem de indivíduos de A. mearnsii com sintomas de gomose, em cada progênie, aos 12 meses de idade, inoculadas com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, conforme períodos de avaliação, no segundo teste de progênie. As três primeiras avaliações foram realizadas com intervalos semanais, e as demais avaliações, com intervalos quinzenais. PS: progênie suscetível; PR: progênie resistente.
As análises da variância e médias para as variáveis comprimento,
largura e área das lesões externas, e comprimento das lesões internas, no
segundo teste de progênie, foram apresentadas na Tabela 7.
80%
90%
100%
Indivíduos com sintoma de gom
ose
(%)
7 14 21 36 51 66 81 90
Avaliação (dias após a inoculação)
PS4
PS5
PR8
PR9
PRS11
111
TABELA 7- Análises da variância e médias para as variáveis comprimento, largura e área das lesões externas, e comprimento das lesões internas (cm), obtidas 90 dias após a inoculação de mudas de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, com os isolados de Cylindrocladium sp. (I1 e I2), Fusarium sp. (I3 e I4) e Pestalotia sp. (I5)
Variáveis
Comp. lesões externas (cm)
Largura lesões externas (cm)
Área das lesões C x L (cm2)
Comp. lesões internas (cm)
ANAVA F blocos
1,50 ns
ANAVA F blocos
1,03 ns
ANAVA F blocos
2,85 ns
ANAVA F blocos
0,49 ns
F isolados1 8,42** F isolados1 9,98** F isolados1 15,38** F isolados1 2,19 ns Tukey(5%) 0,2231 ds Tukey(5%) 0,2107 ds Tukey(5%) 0,2898 ds Tukey(5%) - C.V(%) MÉDIAS
20,33 C.V(%) MÉDIAS
21,76 C.V(%) MÉDIAS
31,59 C.V(%) MÉDIAS
42,38
Média isolados
0,8690 Média isolados
0,7669 Média isolados
0,7267 Média isolados
1,0799
I2 1,0353a I2 0,9247a I2 1,0486a I1 1,2459a I1 0,9462ab I1 0,8520ab I1 0,8293ab I2 1,2303a I3 0,8866abc I3 0,8024abc I3 0,7473bc I3 1,1135a I4 0,7708bc I4 0,6599bc I4 0,5393c I4 0,9762a I5 0,7063c I5 0,5959c I5 0,4691c I5 0,8338a
ANAVA F progênies2
3,67*
ANAVA F progênies2
0,97 ns
ANAVA F progênies2
2,46 ns
ANAVA F progênies2
11,13**
Tukey(5%) 0,1059 ds Tukey(5%) - Tukey(5%) - Tukey(5%) 0,1631ds C.V(%) MÉDIAS
11,69 C.V(%) MÉDIAS
9,57 C.V(%) MÉDIAS
21,88 C.V(%) MÉDIAS
14,48
PS4 0,9139a PS5 0,7962a PS5 0,7890a PS4 1,3133a PS5 0,9130a PS4 0,7748a PRS11 0,7664a PR9 1,0524b
PRS11 0,8741ab PRS11 0,7568a PS4 0,7595a PS5 1,0423b PR9 0,8513ab PR8 0,7561a PR9 0,6818a PRS11 1,0252b PR8 0,7928b PR9 0,7509a PR8 0,6369a PR8 0,9664b
Interação (P x S)
1,03 ns Interação (P x S)
0,86 ns Interação (P x S)
0,61 ns Interação (P x S)
2,55**
C.V.(%): Coeficiente de variação experimental; ns: Diferenças não significativas em nível de 5% de probabilidade; **: Diferenças significativas em nível de 1% de probabilidade; *: Diferenças significativa em nível de 5% de probabilidade; Tukey (5%): Diferença mínima detectada pelo teste de Tukey (P< 0,05); 1 Tratamento principal; 2 Tratamento secundário; PS4 e PS5: progênies suscetíveis, PR8 e PR9: progênies resistentes, PRS11: testemunha; I1 e I2: Cylindrocladium sp.; I3 e I4: Fusarium sp.; I5: Pestalotia sp.
112
Pela Tabela 7, observou-se diferenças significativas (P< 0,01)
entre os isolados I1, I2, I3, I4 e I5 para as variáveis comprimento e
largura das lesões externas e área das lesões. Os valores médios para as
variáveis comprimento e largura das lesões externas, área das lesões e
comprimento das lesões internas foram 0,87; 0,77; 0,73 e 1,08 cm,
respectivamente. Verificou-se que as lesões internas produzidas por
todos os patógenos foram maiores que as lesões externas (Figura 17),
provavelmente devido à presença na superfície externa das plantas de
estruturas de defesa preexistentes, como a estrutura da parede celular,
que impediram ou reduziram o crescimento dos fungos nos tecidos
externos (Smith, 1996). A ativação de genes que codificam determinadas
enzimas, as quais estão relacionadas com a síntese de compostos
secundários, ocorre após a infecção da planta pelo patógeno. O aumento
nas concentrações de alguns metabólitos secundários sugere também
aumento nas concentrações de compostos como fitoalexinas e lignina, os
quais conferem resistência à invasão e colonização pelos patógenos
(Bennett & Wallsgrove, 1994).
Yuan & Mohammed (1999) também verificaram que o
comprimento das lesões internas foi maior que o comprimento das lesões
externas, em mudas de Eucalyptus globulus e E. nitens, aos 12 meses de
idade, inoculados artificialmente, em condições de casa de vegetação,
com 17 isolados causadores de cancro.
Foi verificado que todos os isolados produziram lesões nas
progênies de A. mearnsii, porém os que causaram as maiores lesões
113
foram os isolados I1 e I2 (Cylindrocladium sp.) e o isolado I3 (Fusarium
sp.), os quais não diferiram estatisticamente entre si, o que indicou que
esses fungos foram mais patogênicos que Pestalotia sp. (Figura 17).
O isolado que causou as menores lesões, em todas as variáveis
analisadas, foi também, assim como no primeiro teste de progênie, o
isolado I5 (Pestalotia sp.), o que indicou a sua baixa virulência na
maioria das progênies. Porém, foi observado que as maiores lesões
causadas por esse isolado ocorreram nas progênies suscetíveis PS4 e PS5,
o que indicou que, em função do genótipo do hospedeiro, esse fungo
pode ou não ser patogênico. Lesões pequenas também foram verificadas
por Zeijlemaker (1971), com um isolado de Pestalotia crassiuscula, e por
Roux & Wingfield (1997), com isolados de Pestalotiopsis sp. em
A.mearnsii.
Observou-se que, mesmo após a transformação dos dados, os
coeficientes de variação (CV%), para as variáveis área das lesões e
comprimento das lesões internas, apresentaram valores acima de 20%
(Tabela 7), considerados altos (Pimentel Gomes, 1990). Foi verificada,
no comprimento das lesões internas, uma amplitude de 0,5 a 2,1 cm, e, na
área das lesões, uma amplitude de 0,1 a 1,2 cm2. Isso ocorreu devido às
variações observadas nas dimensões das lesões entre e dentro de
progênies, em função dos diferentes graus de patogenicidade dos isolados
e devido à maior resistência ou suscetibilidade das progênies em resposta
a esses patógenos.
114
A B
C
FIGURA 17-Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento das lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, 90 dias após a inoculação, em mudas de A.mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação.
Quando os genótipos dos hospedeiros diferem quanto ao nível de
suscetibilidade, os genótipos dos patógenos podem variar no grau de
patogenicidade e na taxa de crescimento e colonização nos tecidos dos
hospedeiros (Parlevliet, 1995). Verificou-se que as progênies que
apresentaram maior suscetibilidade aos isolados testados foram as
progênies suscetíveis PS4 e PS5, nas quais ocorreram as maiores lesões,
7575757575N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Comprimento lesão externa (cm)
1,4
1,2
1,0
,8
,6
,4
,2 7575757575N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Área da lesão (cm2)
1,4
1,2
1,0
,8
,6
,4
,2
0,0
7575757575N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Comprimento lesão interna (cm)
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
115
e as progênies que apresentaram menor suscetibilidade, o que foi
verificado pelas menores lesões produzidas, foram as progênies
resistentes PR8 e PR9 (Figura 18). Foi observada na progênie suscetível
PS4, a qual apresentou maior suscetibilidade aos isolados, uma amplitude
no comprimento das lesões internas de 1,4 a 2,4 cm, e na progênie
resistente PR8, a qual apresentou maior resistência, uma amplitude de 0,8
a 1,3 cm (Figura 18). Isso evidenciou que as progênies resistentes foram
capazes de restringir a colonização interna pelos patógenos e impedir a
progressão da lesão. Resultados similares foram verificados por Tippett
et al. (1985) e por Cahill et al. (1993), os quais observaram que o
aumento de lesões foi contido em indivíduos de Eucalyptus sp.
resistentes à P. cinnamomi. Pela Figura 18, observou-se também que o
comprimento das lesões internas mostrou-se superior ao comprimento
das lesões externas, em que se verificou uma variação no comprimento
das lesões externas de 0,55 a 0,95 cm (Figura 18A), e uma variação no
comprimento das lesões internas de 0,8 a 2,4 cm (Figura 18C). Na
progênie PS4, por exemplo, as lesões externas variaram de 0,75 a 0,95
cm, ao passo que as lesões internas, na mesma progênie, variaram de 1,4
a 2,4 cm. Isso indicou que a colonização interna pelos fungos foi maior
que a externa, provavelmente devido à presença de estruturas de defesa
preexistentes na casca, como espessura da cutícula e estrutura da parede
celular epidérmica, que impediram o aumento da extensão da lesão
externa, ou devido a mecanismos de resistência morfológicos
desenvolvidos após a infecção, como formação de tiloses e alterações nas
116
paredes celulares devido à deposição de celulose, calose e lignina (Cahill
& Weste, 1983; Mazau et al. 1987; Bennett & Wallsgrove, 1994; Smith,
1996).
A B
C
FIGURA 18-Comprimento das lesões externas (A), área das lesões (B) e comprimento da lesões internas (C) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, 90 dias após a inoculação, em cada progênie de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação.
7575757575N =
Progênie
PRS11PR9PR8PS5PS4
Comprimento lesão externa (cm)
1,0
,9
,8
,7
,6
,5
7575757575N =
Progênie
PRS11PR9PR8PS5PS4
Área da lesão (cm2)
,9
,8
,7
,6
,5
,4
,3
7575757575N =
Progênie
PRS11PR9PR8PS5PS4
Comprimento lesão interna (cm)
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
117
Na Figura 19, verificou-se que a testemunha PRS11, a qual foi a
mistura das sementes de progênies suscetíveis e resistentes, apresentou
valores de comprimento de lesão externa, área de lesão e comprimento de
lesão interna próximos da média, o que indicou que a amostragem das
sementes foi representativa da população. Observou-se também que as
progênies suscetíveis e resistentes, em relação às variáveis comprimento
e área das lesões externas e comprimento das lesões internas,
apresentaram, respectivamente, os maiores e menores valores em torno
da média, evidenciando que as progênies resistentes foram capazes de
conter o aumento das lesões através de mecanismos de resistência
formados antes ou após a infecção pelos patógenos (Smith, 1996).
A B C
FIGURA 19-Valores do comprimento médio das lesões externas (A), área média das lesões (B) e comprimento médio das lesões internas (C), causados pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação.
Observou-se que houve uma interação diferencial significativa
(P<0,01) entre os isolados e as progênies, em relação apenas ao
comprimento das lesões internas produzidas (Tabela 7). A resposta de
Comprimento lesão externa
PRS11PR9PR8PS5PS4
Média (cm)
,925549
,852375
,779200
,706025
,632851
Área da lesão
PRS11PR9PR8PS5PS4
Média (cm2)
,80114
,68398
,56683
,44967
,33251
Comprimento lesão interna
PRS11PR9PR8PS5PS4
Média (cm)
1,88394
1,59637
1,30880
1,02123
,73366
118
cada progênie à inoculação com cada um dos isolados em relação ao
comprimento das lesões internas foi apresentada na Tabela 8.
TABELA 8- Médias do comprimento das lesões internas (cm), em que a interação isolado x progênie foi significativa, obtidas 90 dias após a inoculação de mudas de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação
Isolado Progênie Comprimento médio da lesão
(cm) PS4 1,69 a PR9 1,29 b I1 PRS11 1,16 b PS5 1,09 b PR8 0,99 b PS4 1,31 a PR9 1,29 a I2 PRS11 1,27 a PS5 1,20 a PR8 1,09 a PS4 1,39 a PS5 1,21 a b I3 PR8 1,02 b PRS11 1,01 b PR9 0,92 b PS4 1,09 a PR8 1,02 a I4 PRS11 1,01 a PS5 1,00 a
PR9 0,74 a PS4 1,08 a PR9 1,01 a b I5 PR8 0,70 b PS5 0,70 b PRS11 0,66 b DMS 0,3647
DMS: diferença mínima significativa; médias seguidas por mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (P< 0,05); I1 e I2: Cylindrocladium sp.; I3 e I4: Fusarium sp.; I5: Pestalotia sp.; PS4 e PS5: progênies suscetíveis; PR8 e PR9: progênies resistentes; PRS11: testemunha.
Essa interação indicou que a ordem das progênies, de acordo com a
resistência, ou dos isolados, de acordo com a patogenicidade, não foi
determinada apenas pela reação frente a um isolado ou a uma progênie,
respectivamente. O comportamento das progênies não foi o mesmo em
119
resposta aos diferentes isolados testados, quanto ao comprimento das
lesões internas (Tabela 8). Provavelmente, ocorreu resistência do tipo
vertical, pois os patógenos diferiram quanto à virulência. Na presença de
interação diferencial existe especialização do patógeno em nível intra-
específico, conforme Bergamin Filho et al. 1995.
Nas Figuras 20A e 20B, verificou-se a amplitude e freqüência dos
valores de comprimento das lesões internas e área das lesões causadas
nas progênies pelos isolados, individualmente, em que foi verificada a
dispersão dos valores, observando-se que alguns indivíduos isolados
afastaram-se dos valores mais freqüentes, o que indicou variação
genética entre e dentro das progênies, em resposta aos isolados. A
estimativa do coeficiente de herdabilidade em nível de médias de
progênies, para a variável comprimento das lesões internas, também
apresentou um valor elevado no segundo teste de progênie (h2p=0,53) o
que também indicou que essa característica está sob alto grau de controle
genético. Foram observados indivíduos altamente suscetíveis dentro das
progênies resistentes PR8 e PR9, em que ocorreram indivíduos com área
de lesão acima de 2 cm2 (Figura 20B). Possivelmente devido à variação
genética, proporcionada pela alogamia, em relação à resistência à
gomose, foram encontrados indivíduos resistentes dentro de progênies
suscetíveis, e indivíduos altamente suscetíveis dentro de progênies
resistentes (Figura 20), o que foi também verificado por Ferreira (1981 e
1983); Ferreira & Silva (1982) e por Mello et al. (1997), em estudo sobre
a resistência de E.grandis à ferrugem causada por Puccinia psidii, os
120
quais verificaram variação genética para resistência à doença entre e
dentro de procedências e progênies de E. grandis. Pela Figura 20B, foi
possível observar que as progênies suscetíveis PS4 e PS5 apresentaram
uma amplitude nos valores de área de lesão de 0,0 a 3,0 cm2 e que as
progênies resistentes PR8 e PR9 mostraram uma amplitude de 0,0 a
1,5cm2.
FIGURA 20-Amplitude e freqüência dos valores de comprimento das lesões internas (A) e área das lesões (B) causadas pelos isolados I1, I2, I3, I4 e I5, em mudas de A. mearnsii, ao 12 meses de idade, 90 dias após a inoculação, no segundo teste de progênie, em condições de casa de vegetação.
1515151515 1515151515 1515151515 1515151515 1515151515N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Comprimento lesão interna (cm)
20
10
0
-10
Progênie
PS4
PS5
PR8
PR9
PRS11
249125248122371
100
197
272
23
243366
219 11388
213313
262
11208
307
182 228205
204
29153
280277151
253
1515151515 1515151515 1515151515 1515151515 1515151515N =
Isolado
I5I4I3I2I1
Área da lesão (cm2)
5
4
3
2
1
0
-1
Progênie
PS4
PS5
PR8
PR9
PRS11
373
325
298
367
94194
316
291
270
213
313
290287
289
12
234
206208
306
205
302
277
252
A
B
121
Durante as avaliações, foi observado que alguns indivíduos
apresentaram sintomas de gomose em diferentes pontos ao longo do
caule, onde não foram realizadas inoculações com os patógenos. Foram
verificadas lesões exsudativas nas progênies PS4 e PRS11, inoculadas
com os isolados I1 (Cylindrocladium sp.) e I3 (Fusarium sp.),
respectivamente (Figura 21).
Foi observada, na progênie PS4, a formação de lesão e exsudação
de goma em locais acima e abaixo do ponto de inoculação com o fungo
(Figura 21A), e, na progênie PRS11, verificou-se a formação de lesão em
quatro diferentes pontos acima do local de inoculação (Figura 21B). Os
sintomas da doença foram verificados em diferentes pontos do local de
inoculação, devido ao fato de a infecção ter ocorrido por aberturas
naturais ou ferimentos existentes na casca, o que foi também verificado
por Zeijlemaker (1971) e por Morris et al. (1993) em A. mearnsii.
Verificou-se que, na progênie PS4, a lesão exsudativa, abaixo do
ponto de inoculação, ocorreu em um nó situado na região do colo, através
do qual o patógeno penetrou e infectou o indivíduo. Isso indicou que foi
necessária a existência de uma abertura natural para que a infecção
ocorresse (Morris et al, 1993).
A constatação de que essas lesões em diferentes pontos do caule
surgiram por contaminação externa pelo patógeno foi feita após a
realização de cortes longitudinais nos caules, em que se verificou que
essas lesões não estavam ligadas internamente à lesão formada no ponto
de inoculação. Isso evidenciou que os sintomas não surgiram pelo
122
crescimento interno dos fungos no lenho, e sim por infecções externas
pelos patógenos.
FIGURA 21-Indivíduos de A. mearnsii, aos 10 meses de idade, 35 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no segundo teste de progênie: (A) lesões exsudativas observadas no caule de um indivíduo da progênie suscetível PS4, em pontos acima e abaixo do local de inoculação com o isolado I1 (Cylindrocladium sp.); (B) lesões exsudativas observadas no caule da testemunha PRS11, em quatro diferentes pontos acima do local de inoculação com o isolado I3 (Fusarium sp.).
I1- Cylindrocladium sp.
Ponto de inoculação
Ponto de inoculação
PS4
PRS11 I3- Fusarium sp.
B A
123
4.2.3 Experimento III: teste de inoculação sem ferimento
Foi observado, nas quatro progênies que foram inoculadas com os
isolados I1 e I2 (Cylindrocladium sp.), I3 e I4 (Fusarium sp.) e I5
(Pestalotia sp.) sem ferimento, as quais foram somente colocadas em
contato com os fungos, que, em todas as avaliações, nenhum indivíduo
apresentou sintomas de gomose, apesar de ter sido observado o
crescimento ativo do micélio dos fungos em contato com o caule das
plantas. Isso evidenciou que a infecção não ocorreu porque os patógenos
não encontraram nenhuma abertura natural ou ferimento no caule para
que pudessem infectar as plantas e causar a doença. Porém, quando esses
indivíduos foram inoculados com os isolados com perfuração da casca
com agulha de metal, apresentaram surgimento de sintomas 48 horas
após a inoculação, como verificado no primeiro e no segundo testes de
progênie, e esses sintomas evoluíram durante os 90 dias de avaliação,
apresentando, nesse período, necrose da casca, lesões de diferentes
formatos e tamanhos e exsudação intensa de goma dos pontos
inoculados, semelhantes aos sintomas verificados por vários autores em
A. mearnsii após inoculações artificiais (Zeijlemaker, 1971; Ribeiro et
al., 1988; Auer & Sotta, 1995; Sotta & Auer, 1996; Roux et al.,1995;
Roux & Wingfield, 1997; Santos et al., 1998). A primeira exsudação foi
observada em um indivíduo da progênie suscetível PS1, 10 dias após a
inoculação. Verificou-se que o surgimento de exsudação de goma foi
mais lento em função da temperatura ser mais baixa. Nesse período,
124
foram observadas temperaturas mínimas e máximas de 13 e 28°C,
respectivamente, o que pode ter reduzido a atividade dos patógenos nos
tecidos, pois os estágios de patogenicidade, como infecção,
estabelecimento, invasão e esporulação dos fungos são
significativamente influenciados pela temperatura (Tippett et al., 1985;
Tippett et al.,1989).
Na inoculação sem ferimento, realizada no mesmo período em que
foi feita a inoculação com perfuração da casca, foram observados dois
indivíduos (PR6 e PRS12) com sintomas da doença, inoculados
respectivamente com os isolados I4 (Fusarium sp.) e I2
(Cylindrocladium sp.), apresentando exsudação de goma dos pontos em
contato com os fungos. Foi verificado que, nesses locais, havia fendas na
casca, provocadas pela queda de folhas, as quais deixaram ranhuras ao
longo do caule, o que promoveu aberturas pelas quais os patógenos
infectaram as plantas, evidenciando que são necessárias aberturas
naturais ou ferimentos nas plantas para que os agentes patogênicos
possam invadir e se estabelecer nos tecidos, causando a doença
(Zeijlemaker, 1971; Morris et al., 1993). Foi observado que os sintomas
causados pela infecção natural do patógeno foram similares aos
provocados pela inoculação artificial (Santos et al., 1998).
Na Tabela 9 são apresentadas a ANAVA e médias para as
variáveis comprimento e largura das lesões externas, e área das lesões
por isolado e por progênie, no terceiro teste de progênie, 90 dias após a
inoculação com ferimento com agulha de metal.
125
TABELA 9- Análises da variância e médias para as variáveis comprimento, largura e área das lesões externas (cm), obtidas 90 dias após a inoculação de mudas de A. mearnsii, aos 14 meses de idade, no terceiro teste de progênie, com os isolados de Cylindrocladium sp. (I1e I2), Fusarium sp. (I3 e I4) e Pestalotia sp. (I5)
Variáveis Comprimento
lesões externas (cm)
Largura lesões externas (cm)
Área das lesões (CxL) (cm2)
ANAVA F blocos
1,07 ns
ANAVA F blocos
0,01 ns
ANAVA F blocos
0,26 ns
F isolados1 19,05** F isolados1 3,68 ns F isolados1 9,06** Tukey(5%) 0,1727 ds Tukey(5%) - Tukey(5%) 0,2202 ds C.V(%) 16,58 C.V(%) 22,73 C.V(%) 32,35 MÉDIAS Média Isolados
0,7377
MÉDIAS Média isolados
0,6359
MÉDIAS Média isolados
0,4821
I3 0,8735a I2 0,6924a I4 0,5704a I1 0,8184ab I4 0,6907a I3 0,5676a I4 0,8127ab I3 0,6499a I1 0,5373a I2 0,6969b I1 0,6486a I2 0,4883a I5 0,4872c I5 0,4979a I5 0,2470b
ANAVA Fprogênies2
0,51 ns
ANAVA F progênies2
0,35 ns
ANAVA F progênies2
0,57 ns
Tukey(5%) - Tukey(5%) - Tukey(5%) - C.V(%) MÉDIAS
19,27 C.V(%) MÉDIAS
24,03 C.V(%) MÉDIAS
28,80
PRS12 0,7659a PRS12 0,6624a PRS12 0,5098a PS1 0,7508a PS1 0,6446a PS1 0,5007a
PRS11 0,7280a PRS11 0,6293a PR6 0,4594a PR6 0,7062a PR6 0,6073a PRS11 0,4586a
Interação (P x S)
0,90 ns Interação (P x S)
0,85 ns Interação (P x S)
1,96 ns
C.V.(%): Coeficiente de variação experimental; ns: Diferenças não significativas em 5% de erro; **: Diferenças significativas em nível de 1% de probabilidade de erro; Tukey (5%): Diferença mínima detectada pelo teste de Tukey (P<0,05); 1 Tratamento principal; 2 Tratamento secundário; PS1: progênie suscetível; PR6: progênie resistente; PRS11 e PRS12: testemunhas; I1 e I2: Cylindrocladium sp.; I3 e I4: Fusarium sp.; I5: Pestalotia sp.
Pela Tabela 9, verificou-se que os isolados I1, I2, I3 e I4 não
diferiram entre si quanto ao grau de patogenicidade, em relação às
126
variáveis comprimento das lesões externas e área das lesões. O isolado que
apresentou as menores lesões, em todas as variáveis medidas, assim como
no primeiro e no segundo testes de progênie, foi o I5 (Pestalotia sp.),
indicando a baixa patogenicidade desse fungo, o que foi também
observado por Zeijlemaker (1971) e por Roux & Wingfield (1997) em
A.mearnsii.
Não foram verificadas diferenças significativas (P< 0,01) entre as
progênies, em relação às variáveis medidas (Tabela 9). Ocorreram apenas
diferenças numéricas nos valores das dimensões das lesões, em que a
progênie resistente PR6 apresentou os menores valores. Isso foi verificado
provavelmente devido à ocorrência de temperaturas mais baixas durante o
período experimental, em que foram verificados valores de temperatura
mínimo e máximo de 13 e 28°C, respectivamente. Isso pode ter reduzido a
atividade dos patógenos nos tecidos dessas progênies, os quais foram
menos patogênicos, causando lesões menores, mesmo na progênie
suscetível PS1. Observou-se que a interação entre os isolados e as
progênies não foi significativa, indicando que as progênies apresentaram
resistência do tipo horizontal (Bergamin Filho et al., 1995).
127
4.4 Teste de inoculação em árvores de A. mearnsii no campo, com os
isolados I1 (Cylindrocladium sp.), I3 (Fusarium sp.) e I5 (Pestalotia sp.)
As Tabelas 10 e 11 apresentam a resposta das árvores matrizes no
campo, das quais foram coletadas as sementes, à inoculação com os
isolados I1 (Cylindrocladium sp.), I3 (Fusarium sp.) e I5 (Pestalotia sp.).
TABELA 10- Relação das árvores matrizes de A. mearnsii no campo, aos cinco anos de idade (sem sintomas de gomose), progênies correspondentes nos testes em casa de vegetação, manifestação de sintomas em resposta à inoculação e comprimento das lesões externas causadas pelos isolados I1 (Cylindrocladium sp.), I3 (Fusarium sp.) e I5 (Pestalotia sp.)
N. da árvore matriz no
campo Progênie
correspondente em cv1 Manifestação de sintomas de gomose à inoculação no campo
Comprimento lesão externa (cm)
A1 sem gomose PR6 I1: - I3: - I5: -
A2 sem gomose PR7 I1: - I3: - I5: -
A3 sem gomose PR8 I1: - I3: + I5: -
0,5
A4 sem gomose PR9 I1: - I3: - I5: -
A5 sem gomose N.A. I1: - I3: - I5: -
A6 sem gomose PR10 I1: - I3: - I5: -
A7 sem gomose N.A. I1: - I3: - I5: -
A8 sem gomose N.A. I1: + I3: - I5: -
2,0
A9 sem gomose N.A. I1: - I3: + I5: -
1,0
A10 sem gomose N.A. I1: - I3: - I5: +
1,0 1 Casa de vegetação; I1: Cylindrocladium sp.; I3: Fusarium sp.; I5: Pestalotia sp.; +: manifestação de sintomas de gomose após a inoculação; -: sem manifestação de sintomas de gomose após a inoculação; N.A.: não analisada.
128
TABELA 11- Relação das árvores matrizes de A. mearnsii no campo, aos cinco anos de idade (com sintomas de gomose), progênies correspondentes nos testes em casa de vegetação, manifestação de sintomas em resposta à inoculação e comprimento das lesões externas causadas pelo isolado I5 (Pestalotia sp.)
N. da árvore matriz
no campo Progênie
correspondente em cv1
Manifestação de sintomas de gomose à inoculação no campo
Comprimento lesão externa
(cm)
A1 com gomose N.A. I5: -
A2 com gomose PS1 I5: -
A3 com gomose PS2 I5: + 1,5
A4 com gomose PS3 I5: -
A5 com gomose PS4 I5: -
A6 com gomose N.A. I5: + 0,8
A7 com gomose N.A. I5: -
A8 com gomose PS5 I5: -
A9 com gomose N.A. I5: -
A10 com gomose N.A. I5: + 1,0 1 Casa de vegetação; I5: Pestalotia sp.; +: manifestação de sintomas de gomose após a inoculação; -: sem manifestação de sintomas de gomose após a inoculação; N.A.: não analisada
Foi verificado que, dentre as dez árvores sem gomose inoculadas,
quatro manifestaram sintomas da doença em resposta à inoculação com
os patógenos (Tabela 10), e, dentre as dez árvores com gomose, as quais
foram inoculadas somente com o isolado I5 (Pestalotia sp.), três
manifestaram sintomas da doença (Tabela 11). Os sintomas observados,
os quais se caracterizaram por exsudação de goma e formação de lesão
nos pontos de inoculação, foram semelhantes aos verificados por Auer &
Sotta (1995) com dois isolados de C. candelabrum em árvores de
129
A.mearnsii aos 2,2 anos de idade, por Sotta & Auer (1996) com isolados
de Cylindrocladium sp. em árvores de A. mearnsii aos dois anos de idade
e por Santos et al. (1998) com isolados de Phytophthora sp. em árvores
de A. mearnsii aos três anos de idade, após inoculações artificiais.
Observou-se que, das árvores correspondentes às progênies nos
testes em casa de vegetação, apenas a A3 com gomose e a A3 sem
gomose, correspondentes às progênies PS2 e PR8, respectivamente,
apresentaram sintomas de gomose em resposta à inoculação artificial
com os patógenos; a primeira manifestou sintomas à inoculação com
Pestalotia sp., e a segunda apresentou sintomas em resposta à Fusarium
sp. (Tabelas 10 e 11). Isso indicou que indivíduos que não apresentam
sintomas de gomose no campo podem apresentar suscetibilidade à
doença, quando submetidos a inoculações artificiais, devido à
variabilidade genética existente na população em relação à resistência a
gomose, a qual foi verificada entre e dentro de indivíduos resistentes e
suscetíveis.
Durante o período de avaliação, foi verificado que três das dez
árvores sem gomose no campo mostraram-se naturalmente infectadas
pela doença, apresentando exsudação de goma na região do colo, com
acúmulo de goma, formando grumos em contato com o solo conforme
Santos et al. (1998). Essas árvores corresponderam às progênies
resistentes PR6, PR8 e PR9 nos testes em casa de vegetação (Tabela 10).
Esses três indivíduos, antes resistentes à gomose e atualmente com
sintomas da doença, encontravam-se no campo muito próximos a árvores
130
doentes, as quais se apresentaram altamente atacadas pela gomose, com
sintomas ocorrendo na região do colo e ao longo do tronco (Figura 22).
Provavelmente, as árvores foram infectadas pelos patógenos causadores
de gomose, por estarem próximas a árvores doentes. Os patógenos
também provavelmente penetraram por aberturas naturais, por fendas ou
ferimentos existentes nos troncos (Zeijlemaker, 1971; Morris et al.,
1993).
Foi observado que, dentre as dez árvores sem gomose no campo,
além das três que se apresentaram infectadas, outras também se
encontravam próximas a árvores doentes, porém não foram contaminadas
nem manifestaram qualquer tipo de sintoma, o que indicou que esses
indivíduos apresentaram alto grau de resistência à gomose, pois, mesmo
convivendo com indivíduos altamente atacados pela doença,
permaneceram sadias (Carson & Carson, 1989).
A Figura 22 apresentou indivíduos de A. mearnsii, no campo,
altamente atacados pela gomose, os quais se encontram próximos às
árvores que foram contaminadas. Observou-se abundante exudação de
goma de lesões de tamanhos variados e formatos irregulares.
131
FIGURA 22-Indivíduos de A. mearnsii, em plantio comercial, aos seis anos de idade, os quais se encontravam próximos às três árvores matrizes que foram infectadas, apresentando sintomas típicos de gomose. (A) lesão tipo GC (gomose no colo); (B) lesão tipo GT (gomose no tronco); (C) lesão tipo GCT (gomose no colo e no tronco), conforme nomenclatura de Santos et al., (1998).
4.5 Índice de Suscetibilidade
A Tabela 12 apresentou o número de indivíduos por nota, as notas
médias não transformadas, os Índices de Suscetibilidade e a classificação
das progênies do primeiro teste com cada um dos isolados, conforme os
respectivos índices.
A B C
132
TABELA 12- Número de indivíduos, conforme a nota, notas e Teste de Tukey (5%), Índices de Suscetibilidade (IS) e classificação de suscetibilidade para as progênies de A. mearnsii, aos 11 meses de idade, obtidos 90 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no primeiro teste de progênie
Isolado Progênie
n. N. zero
de 1
plantas 2
/ nota 3
Nota média
Suscetibilidade(1) IS Classificação
PS1 - 2 16 6 6,50 a 7,6 A PR10 - 8 8 8 6,15 a b 7,2 M PS2 - 7 14 3 5,75 a b 6,8 M I1 PRS11 - 9 12 3 5,57 a b 6,6 M PR7 2 10 7 5 5,31 a b 6,3 M PR6 1 13 9 1 4,74 b 5,8 M PS3 1 13 9 1 4,73 b 5,1 M PS1 1 7 12 4 5,60 a 6,7 M PR6 - 12 11 1 5,09 a b 6,1 M PR10 1 9 14 - 5,03 a b 6,1 M I2 PRS11 1 11 10 2 5,02 a b 6,1 M PS2 - 12 11 1 5,00 a b 6,0 M PR7 1 13 9 1 5,00 b 5,8 M PS3 1 15 8 - 4,40 b 5,5 M PS1 - 7 14 3 5,76 a 6,8 M PR6 - 9 11 4 5,66 a b 6,7 M PR10 4 4 13 3 5,50 a b 6,3 M I3 PS2 - 13 9 2 5,00 a b 6,1 M PRS11 3 6 14 1 4,90 a b 6,1 M PS3 - 13 11 - 4,90 a b 5,9 M PR7 - 18 3 3 4,71 b 5,7 M PS2 - 2 17 5 6,42 a 7,5 A PR6 - 8 15 1 5,48 a b 6,5 M PS3 - 10 11 3 5,46 a b 6,5 M I4 PRS11 1 7 14 2 5,30 a b 6,5 M PS1 - 8 16 - 5,30 a b 6,4 M PR10 1 10 9 4 5,32 a b 6,4 M PR7 1 11 10 2 5,03 b 6,1 M PS2 6 15 2 1 3,27 a 4,6 B PS3 9 9 5 1 3,08 a b 4,6 B PR10 7 16 - 1 2,90 a b 4,3 B I5 PR7 9 11 4 - 2,70 a b 4,3 B PS1 12 8 3 1 2,40 a b 4,1 B PRS11 9 15 - - 2,40 a b 3,9 B PR6 13 9 1 1 2,10 b 3,8 B
Média Teste C.V.(%)
Geral F:Parcela Subparcela Parcela Subparcela
6,7 55,53** 2,29* 8,74 8,56
5,9
CV:Coeficiente de variação experimental; **:significativo em nível de 1% de probabilidade; *:significativo em nível de 5% de probabilidade; I1 e I2: Cylindrocladium sp.; I3 e I4: Fusarium sp.; I5: Pestalotia sp.; PS1, PS2, PS3: progênies suscetíveis; PR6, PR7, PR10: progênies resistentes; PRS11: testemunha; (1):Classificação de Suscetibilidade: A= Alta; M= Moderada; B= Baixa.
133
Pela Tabela 12, observou-se que todas as progênies apresentaram
indivíduos infectados com todos os isolados. Foi possível verificar que as
progênies suscetíveis apresentaram 30 indivíduos sem nenhum tipo de
sintoma, e as progênies resistentes 40 indivíduos livres de gomose (que
receberam nota zero). Observou-se que ocorreu variação entre e dentro
de progênies suscetíveis e resistentes à gomose, e que foi possível
selecionar indivíduos sem a doença. Resultados similares foram
verificados por vários autores em estudo sobre a resistência de
Eucalyptus à ferrugem (Ferreira, 1981 e 1983; Ferreira & Silva, 1982;
Mello et al., 1997).
Observando-se os valores médios das notas, verificou-se que
existem diferenças significativas entre as progênies. A progênie que
apresentou maior suscetibilidade em resposta a quase todos os isolados
foi a progênie suscetível PS1, exceto com os isolados I4 (Fusarium sp.) e
I5 (Pestalotia sp.). A progênie que apresentou maior resistência foi a
progênie resistente PR7. O isolado que apresentou um maior número de
indivíduos com as maiores lesões (nota 3) foi o isolado I1
(Cylindrocladium sp.), o que indicou o seu maior grau de patogenicidade.
De acordo com o Índice de Suscetibilidade, somente as progênies
suscetíveis PS1 e PS2 foram classificadas com alta suscetibilidade aos
isolados I1 e I4, respectivamente; as demais progênies apresentaram
suscetibilidade moderada para todos os isolados, exceto para o isolado I5,
com o qual todas as progênies apresentaram baixa suscetibilidade, o que
indicou o baixo grau de patogenicidade desse isolado. O valor médio do
134
Índice de Suscetibilidade foi de 5,9, classificando as progênies, na média,
como de suscetibilidade moderada. Os coeficientes de variação (CV%),
tanto para parcela como para subparcela, constituídas, respectivamente,
pelos isolados e pelas progênies, apresentaram valores considerados
baixos (Pimentel Gomes, 1990), o que indicou uma boa precisão
experimental.
A Tabela 13 apresentou o número de indivíduos por nota, as notas
médias não transformadas, os Índices de Suscetibilidade e a classificação
das progênies do segundo teste, com cada um dos isolados, conforme os
respectivos índices.
135
TABELA 13- Número de indivíduos, conforme a nota, notas e Teste de Tukey (5%), Índices de Suscetibilidade (IS) e classificação de suscetibilidade para as progênies de A. mearnsii, aos 12 meses de idade, obtidos 90 dias após a inoculação com os isolados I1, I2, I3, I4 e I5, no segundo teste de progênie
Isolado IsoladoProgênie
n. N.
zero
de 1
plantas 2
/ nota 3
Nota média
Suscetibilidade(1)
IS Classificação
PS5 - 1 4 10 4,74 a 5,4 A PR9 - - 9 6 4,46 a 5,1 A I1 PS4 - 3 5 7 4,27 a 4,9 A PRS11 1 2 8 4 3,82 a 4,5 M PR8 1 3 6 5 3,82 a 4,5 M PS4 - - 4 11 4,92 a 5,6 A PS5 - 1 3 11 4,83 a 5,5 A I2 PR9 - 2 4 9 4,55 a 5,2 A PRS11 - 2 6 7 4,36 a 5,0 A PR8 - 3 7 5 4,08 a 4,7 A PS4 - 2 6 7 4,36 a 5,0 A PR8 - 2 9 4 3,99 a 4,7 A I3 PRS11 - 4 6 5 3,99 a 4,6 A PS5 - 6 2 7 3,99 a 4,6 A PR9 - 7 6 2 3,39 a 4,0 A PS4 - 5 9 1 3,52 a 4,1 M PR9 - 6 7 2 3,52 a 4,1 M I4 PS5 1 6 5 3 3,36 a 4,0 M PRS11 - 7 7 1 3,34 a 3,9 M PR8 - 8 5 2 3,34 a 3,1 M PS4 3 6 2 4 2,93 a 3,7 M PR9 3 5 6 1 2,75 a 3,5 M I5 PS5 2 10 3 - 2,44 a 3,1 B PRS11 5 5 4 1 2,22 a 3,1 B PR8 5 8 1 1 1,94 a 2,8 B
Média Teste
CV(%)
Geral F: Parcela Subparc. Parcela Subparc.
3,69 5,47* 1,45 ns 17,76 8,74
4,3
C.V.: Coeficiente de variação experimental; *: significativo em nível de 5% de probabilidade; I1 e I2: Cylindrocladium sp.; I3 e I4: Fusarium sp.; I5: Pestalotia sp. PS4 e PS5: progênies suscetíveis; PR8 e PR9: progênies resistentes; PRS11: testemunha; (1): Classificação de Suscetibilidade: A= Alta; M= Moderada; B= Baixa.
136
Pela Tabela 13, observou-se que todas as progênies apresentaram
indivíduos infectados com todos os isolados. Foi possível verificar um
maior número de indivíduos sem gomose nas progênies resistentes, as
quais apresentaram nove indivíduos sem nenhum tipo de sintoma, ao
passo que as progênies suscetíveis apresentaram seis indivíduos sem
gomose (que receberam nota zero). Observou-se que ocorreu variação
entre e dentro de progênies suscetíveis e resistentes à gomose, e que foi
possível selecionar indivíduos sem a doença.
Analisando-se os valores médios das notas, verificou-se que não
ocorreram diferenças significativas entre as progênies. A progênie que
apresentou maior suscetibilidade em resposta a quase todos os isolados
foi a progênie suscetível PS4, a qual apresentou os maiores valores de
Índice de Suscetibilidade, exceto em resposta ao isolado I1
(Cylindrocladium sp.) A progênie que apresentou maior resistência foi a
progênie resistente PR8. O isolado que apresentou um maior número de
indivíduos com as maiores lesões (nota 3) foi o isolado I2
(Cylindrocladium sp.).
Todas as progênies apresentaram alta suscetibilidade aos isolados
I2 (Cylindrocladium sp.) e I3 (Fusarium sp.), indicando que esses fungos
foram mais patogênicos. Todas as progênies apresentaram baixa e média
suscetibilidade ao isolado I5 (Pestalotia sp.), o que revelou seu baixo
grau de patogenicidade, que permitiu verificar o maior número de
indivíduos, de todas as progênies, sem sintomas de gomose. Observou-se
que as progênies suscetíveis e resistentes apresentaram, respectivamente,
137
61 e 37 indivíduos com as maiores lesões (nota 3), em que foi possível
verificar quase que o dobro de indivíduos com as maiores lesões nas
progênies suscetíveis. Foram verificados diferentes graus de resistência
entre e dentro de progênies resistentes e suscetíveis, por meio dos
diferentes tamanhos de lesões observados nas progênies em resposta aos
isolados testados.
Os coeficientes de variação (CV%), tanto para isolados como para
progênies, apresentaram valores considerados médios e baixos (Pimentel-
Gomes, 1990), indicando boa precisão experimental. O valor médio do
Índice de Suscetibilidade foi de 4,3, classificando as progênies, na média,
como de suscetibilidade moderada.
138
5 CONCLUSÕES
Ocorreu variação entre e dentro das progênies de A. mearnsii para
resistência à gomose, sendo possível ser selecionados indivíduos
resistentes a doença.
Devido à variação genética, foram observados diferentes graus de
resistência e suscetibilidade à gomose nas progênies, pela manifestação
de sintomas da doença após a inoculação com os agentes patogênicos
testados. Foram verificadas lesões de diferentes formatos e tamanhos
entre e dentro de progênies.
A morte de indivíduos de progênies resistentes indicou que
indivíduos altamente suscetíveis foram encontrados dentro de progênies
resistentes, devido à variação genética. Indivíduos resistentes à gomose
(sem nenhum tipo de sintoma) também foram identificados dentro de
progênies suscetíveis.
Verificou-se que os patógenos testados somente foram capazes de
infectar os indivíduos de A. mearnsii mediante a presença de ferimentos
no caule.
Os sintomas de gomose nas progênies, verificados após a
inoculação artificial, em condições de casa de vegetação, foram similares
aos observados em árvores naturalmente infectadas, o que indicou que foi
possível selecionar indivíduos de A. mearnsii resistentes à doença em
condições artificiais, em presença de inóculos e condições ambientais
favoráveis ao desenvolvimento dos patógenos.
139
Foi, portanto, observada variação genética quanto à resistência à
gomose entre e dentro de progênies de A. mearnsii resistentes e
suscetíveis para os patógenos estudados. Dentro de progênies
consideradas resistentes, detectaram-se indivíduos suscetíveis, e, em
progênies consideradas suscetíveis, detectaram-se indivíduos resistentes.
140
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159
ANEXOS
160
ANEXO I: Relação de patógenos de Acacia mearnsii De Wild., com sintomas associados e distribuição, conforme Roux et al., (1995)
Patógeno Sintoma Distribuição Amauroderm rude (Berk) G.H. Cunn.
Doença de raiz África do Sul
Amauroderma rugosum
(Blume e Nees) Torren Podridão do colo África do Sul
Calonectria theae Loos Mancha de folha Sri Lanka, Índia Ceratocystis sp. Die back, descoloração da
medula, bolhas, lesões
África do Sul, Brasil
Camptomerris verruculosa
(Syd.) Bessey Manchas Dominica, Kenia, África do Sul ,
Sudão
Cercosporella theae Petch. Mancha de folha, e lesões nos ramos, desfoliação
Índia
Coriolus hirsutus (Wolf. ex Fr.) Quél.
Podridão da madeira
África do Sul
Corticium salmonicolor Berk and BR.
cancros nos caules e ramos Malasia, Mauritius
Cylindrocladium scoparium Morgan
Doença de raiz África do Sul
Gonoderma applanatum
(Wallr.) Pat.
Podridão da copa Austrália, Sirilanka, Índia, Portugal, África do Sul, Sirilanka, Nova Zelândia
Ganoderma lucidum Karst. Doença de raiz Podridão da copa
Taiwan, Índia, Java, África do Sul
Glomerella acaciae (K. Ito e Shibukawa) K. Ito
Antracnose, lesões, desfoliação
Japão
Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. e Maubl.
doença de raiz África do Sul
Macrophomina phaseolina (Tassi.) Goid.
Doença de raiz, die back, gomose
África do Sul, Sirilanka
Phoma herbarum Westend. Die back nos ramos
Kenia
Physalospora abdita,(Berk. e Curt.) N.E Stevens
Cancros nos caules e ramos, folhas doentes, podridão de raiz
Austrália, Índia, A. do Norte, África do Sul
161
ANEXO I (continuação) Patógeno Sintoma Distribuição
Phytophthora parasitica (Dastur.) Waterhouse
Base negra África do Sul
Polystictus subcculoides Lloyd
Podridão da copa Índia, África do Sul, Sirilanka
Poria albobrunnea Petch
Podridão da copa Sirilanka
Rizoctonia lamellifera Small murcha, die back
África do Sul
Trametes cingulata Berk Podridão da copa África do Sul Trametes meyenii
(Klotzch) Lloyd Podridão da copa Kenia, África do Sul
Trametes roseola Pat. et Har. Podridão da copa África do Sul Uromycladium bisporum McAlp.
Ferrugem de ramos e folhas, inchaço nos ramos
Austrália, Nova Zelândia
Uromycladium notabile
(Ludwig) McAlp. Vesículas Austrália, Nova Zelândia
Uromycladium tepperianum
(Saccardo) Vesículas Austrália, Nova Caledônia Nova
Uromycladium alpinum
McAlp Ferrugem de folha África do Sul, Austrália
162
ANEXO II : Patógenos associados a sintomas de gomose e a ferimento causado por inseto, em árvores de A. mearnsii,conforme Roux & Wingfield (1997)
Lesão basal Descoloração da madeira
Lesão no tronco/ramo Ferimento causado por inseto
Aplosporella sp.
Bartalinia sp. Bartalinia sp.
Botryosphaeria dothidea Botryosphaeria
dothidea
Botryosphaeria dothidea Botryosphaeria
dothidea
Camarosporium sp.
Ceratocystis albofundus
Chaetomium sp.
Cladosporium sp. Cladosporium sp. Cladosporium sp.
Coleophoma sp.
Curvularia sp. Curvularia sp.
Cylindrocarpon sp.
Cylindrocladium
candelabrum
Cylindrocladium
candelabrum
Cytospora sp. Cytospora sp. Cytospora sp.
Diplodia sp. A Diplodia sp. A
Diplodia sp. B Diplodia sp. B Diplodia sp. B
Epicoccum sp. Epicoccum sp. Epicoccum sp. Epicoccum sp.
Fusarium sp. Fusarium sp. Fusarium sp. Fusarium sp.
Fusarium solani
Gliocladium roseum G. roseum G. roseum G. roseum
Gliomastix sp.
Glomerella sp.
Harknessia sp.
163
ANEXO II (continuação)
Lesão basal Descoloração da madeira
Lesão no tronco/ramo Ferimento causado por inseto
Helminthosporium sp.
Lasiodiplodia sp.
Leptosphaerulina sp.
Libertella sp.
Micropshaeropsis sp. Micropshaeropsis sp. Micropshaeropsis sp.
Nigrospora orysae Nigrospora orysae N. orysae
Pestalotiopsis sp. Pestalotiopsis sp. Pestalotiopsis sp. Pestalotiopsis sp.
Phacidium sp.
Phoma sp. Phoma sp.
Phomopsis sp.
Phomopsis sp.
Phytophthora
boehmeriae
Phytophthora meadii
Phytophthora parasitica
Pleurocytospora sp.
Pithomyces sp.
Pythium irregulare
Rhinocladiella sp. Rhinocladiella sp. Rhinocladiella sp.
Seiridium sp. Seiridium sp. Seiridium sp.
Sphaeropsis sp. Sphaeropsis sp. Sphaeropsis sp. Sphaeropsis sp.
Trichoderma sp. Trichoderma sp. Trichoderma sp.
Verticillium sp.
xii
ANEXO III- Sintomas de gomose em árvores de A. mearnsii De Wild. no campo, em plantio comercial, aos seis anos de idade, apresentando exsudação intensa de goma nos troncos (Figuras A, B e C) e morte de um indivíduo afetado pela doença (Figura D), no município de Butiá-RS.
A B
C D
