Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by...

13
Identification of the Phospholipid-binding Site of Human b 2 -Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance Masaru Hoshino 1 , Yoshihisa Hagihara 1 , Ichiro Nishii 1 Toshio Yamazaki 1 , Hisao Kato 2 and Yuji Goto 1 * 1 Institute for Protein Research Osaka University, Yamadaoka 3-2, Suita, Osaka 565-0871, Japan 2 The National Cardiovascular Center Research Institute Suita, Osaka, 565-8565, Japan To understand the mechanism of the interaction between human b 2 -glycoprotein I (b 2 -GPI) and negatively charged phospholipids, we determined the three-dimensional solution structure of the ®fth domain of b 2 -GPI by heteronuclear multidimensional NMR. The results showed that the molecule is composed of well-de®ned four anti-parallel b-strands and two short a-helices, as well as a long highly ¯exible loop. Backbone dynamic analysis demonstrated signi®cant mobility of the ¯exible loop on a subnanosecond time scale. Structural modeling of the nicked ®fth domain, in which the Lys317-Thr318 peptide bond was speci®cally cleaved, revealed the importance of this long C-terminal loop for the interaction between b 2 -GPI and negatively charged phospholipids. A titration experiment with the anionic surfactant SDS showed that this highly mobile loop, as well as the short b-hairpin between bC and bD strands, which is rich in positively charged residues, speci®cally interact with the surfactant. The mobile loop, together with the surrounding posi- tively charged residues, probably construct the binding site for negatively charged phospholipids such as cardiolipin. # 2000 Academic Press Keywords: apolipoprotein H; b 2 -glycoprotein I; backbone dynamics; membrane binding; NMR solution structure *Corresponding author Introduction Human b 2 -glycoprotein I (b 2 -GPI) is a highly glycosylated plasma protein consisting of a single polypeptide chain (326 amino acid residues) with 20 % (w/w) carbohydrates attached, and a mol- ecular mass of about 50 kDa. Although its function is still unclear, it is known to bind negatively charged substances such as DNA, heparin, dextran sulfate, and negatively charged phospholipids like cardiolipin (CL) (Krùll et al., 1976; Polz et al., 1980; Wurm, 1984; Schousboe & Rasmussen, 1988). It has been established that b 2 -GPI acts as a cofactor in the recognition of phospholipid antigen CL by anti-CL antibodies present in patients with auto- immune diseases such as lupus erythematosus (Matsuura et al., 1990; McNeil et al., 1990; Hunt et al., 1992; Shoenfeld et al., 1998). b 2 -GPI is com- posed of ®ve repeated domains, consisting of 60 amino acid residues and characterized by a set of 16 conserved residues and two fully conserved dis- ul®de bonds. The common structural motif is found in more than hundred mammalian proteins (Schultz et al., 1998; http://coot.embl-heidel- berg.de/), and has been designated as the short consensus repeat (SCR), complement control pro- tein module or Sushi-domain (Ichinose et al., 1990; Kato & Enjoji, 1991; Steinkasserer et al., 1991). While the ®rst four domains are regular SCR domains with respect to their amino acid sequences, the C-terminal ®fth domain (Domain V) is aberrant in that it contains a six-residue insertion and 20 residue C-terminal extension which is C-terminally cross-linked by a disul®de bond. The X-ray crystallographic structures reported recently revealed an elongated ®shhook-like arrangement of the ®ve globular SCR domains (Bouma et al., 1999; Schwarzenbacher et al., 1999). While the four E-mail address of corresponding author: [email protected] Abbreviations used: b 2 -GPI, b 2 -glycoprotein I; CL, cardiolipin; Domain V, the ®fth domain of human b 2 - glycoprotein I; NOE, nuclear Overhauser effect; HSQC, heteronuclear single quantum coherence; TOCSY, total correlation spectroscopy; SCR, short consensus repeat; CMC, critical micelle concentration. doi:10.1006/jmbi.2000.4243 available online at http://www.idealibrary.com on J. Mol. Biol. (1998) 304, 927±939 0022-2836/00/050927±13 $35.00/0 # 1998 Academic Press

Transcript of Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by...

Page 1: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

��������������� ����� �� ��������� ������ �� ������������������������ �� �� ���� ����� ������ )*+ � !"���

������������ � ��� �� ��������������� ���� ����� ��������������� � ���� � �� ������������������ �� ����

� �� � ���� ! ���� ������ ����� "� ����

# �� !�$%�� �� &�� �� !�'� ���(

���������� � ����� ���� ���� � ���������� � � � � ���� ���� � �� � ����� !"� # $ ��%�� & ��� ' ( ��� ���' (���� ���� �� ������������� � �� � � ���� ���� # $ �

@����� ���� �� ���������������E������$��(���$��$A�

/���������� ���? ������� ���������������3 0����� C� � � �� �������������� �3 !F@� ������ F�� ���������� ����� B������ �� ���������� ���������3 ).#� �.".� ������� ������� ������������$

11����-+46116171:�,I�+ J+7$1161

�� �������� � � ��� ���� �� � � ���������� ������� ������������������ � �������� ��� ���������� � ���� � �� ������� ����������� � � � ������������� ������� ������ �� � � �� �������� ������ �� ���������� ��������������� !"#$ � � ���� ����� �� � � �������� � ������� �� ������� ��� ��� ������������ ��������� ��� �� �� ������ � ���� � � ���� �� �� %�&���� ����$ '��(����������� ������ ���������� ���� ���� �������� �� � � %�&���� ������ � ����������� ���� ����$ )������� �������� �� � � ���(�� �� ������� �� � �� � � *�+�,�� +�- ������� ���� �� ���� ������������� ������� � � ��������� �� � � ���� .�������� ���� �� � ����������� ������� ������ ��� ���������� � ���� � �� ������$ /�������� �&������� ��� � � ������� �������� )0) ���� � �� � � �� �� ������ ����� � ���� � � � �� �� ����� ������� �. ��� �0����� � �� � �� �� ��������� � ���� ������ ���� ����� ���������� � � ��������$ � � ������ ����� ����� � ��� � � �������� ���������� � ���� ������ ������� ������� � � ������� ��� �� ����������� ���� � �� ������ �� � ����������$

� �111 /������� ��

)��*��+ ������������� 23 �������������� �3 ���(���� �������3������� �������3 !"# ������� ������

,(��$����- ���

����������

2���� �������������� � �������� � � �� ������������� ����� ������ �������� �� � ���������������� � ��� �+�4 ����� ���� ������ ��� ��15 ��6�� ���� ����� ����� ��� ��� � ��������� �� �� ����� 71 (0�$ /�� ��� �� ��������� ���� ������� �� � (���� �� ���� ����������� ���� ������� �� � 0!/� ������ ��&���������� ��� ���������� � ���� � �� ������ ��(����������� �.*� �89�� �� '$� �:,43 ���; �� '$� �:-13<��� �:-=3 )� ����� > #������ �:--�$ �� � ���� ������ �� � �� ������ ��� � � ��������� � � ���������� �� � �� ������ ������� .* �������.* ��������� ����� �� ������� ��� �����

��� �?

��������� �3 .*���� �� ���� ������ ������3 2)G.�����3 �F.)H� ������ ������ �����3

������ ����� �� � ���� ��� �������"����� �� '$� �::13 "�!��� �� '$� �::13 2����� '$� �::�3 ) ������� �� '$� �::-�$ ������ � �������� �� �� ������� ������� �������� �� �41����� ���� ����� ��� � ������;�� �� � �� ���4 ������� ����� ��� ��� ����� ������� ����� �� ����$ � � ������ ������� ����� ������ �� ��� � �� ����� ��������� �������)� ���; �� '$� �::-3 ���?66����$����� ���������$��6�� ��� � ���� ��������� � � � �������� ����� �).#�� ���������� ������ ������� ������ � )� �������� ��� ���� �� '$� �::138��� > @�A�A�� �::�3 )����(��� �� '$� �::��$< ��� � � � ��� ������ �� ����� ).#������ ��� ����� �� � �� ����� �����B������ � � .�������� �� ������ �0����� C�� ������ �� � �� �� ������� � �&������ ���������� �1 ����� .�������� �&������ � �� �.���������� ������(�� �� � ���� �� ����$ � �D��� ���������� �� ������ ������ �������������� �� ��������� ��(���(� ����������� � � �� ������� ).# ������ �'���� �� '$��:::3 )� ��;����� � �� '$� �:::�$ < ��� � � ���

� �::- /������� ��

Page 2: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

� � ������ �� �� �� ���� ������ ������� �

!�������� ������ �� � ������� �� ����������� ����� ����� �� ��� �� � ��� �� �� ������� �� � � ���������� 0����� C ��� ������������ ��� ������� ���� ���� ������������ � � �� � ������$ <�� �� 0����� C� � ��&���� .�������� ���� �)�+���*�+�,� � ��������� �� �� �� �� ������ � �� �� ��� ������ ��� � ��� ������� ������ ��� �'���� �� '$� �:::��� �� �� �&����������� ���� �-1��41 /K �� ���������� ����� �)� ��;����� � �� '$� �:::�$�� � ���� ������� � �� � � ������ ��

������ ���� �������� ��� �� � � ������� �� ������ �� ���������� � ���� �������� ��� ����B���� ������ �� ������� �� ����������� ����������$ )����(��� �� '$ ��::�� ������ � �� � ����������� 0����� C� � �� �� �&���� ��.�������� �'�� �� ������ � � ���������� �� � �� ��� ������ �������� ��� .*$ 2��� �� �� '$��::,� ���� � �� 0����� C �&���� �� ���� ������ �� ����� ����� $ ����� ������� ��� .* ��� �� ���� ����� �� � �� �� � � � ��� �������$ 2������ � � ����� ������� ��� �� 0����� C � ��� ���� ������ �� �����������$ .������� ��*�+�,�� +�- ������� ���� �� 0����� C �������� �������� �� � � �� ���� �� .* �2��� �� '$��::+3 2��� �� �� '$� �::,�$ � � �������� ����+�4 �� � )� ����� ����� �� ��������)��� �� �� '$� �::,�$ � �� ��������� ��� ���;�� � � ��������� �� � � ��������� .��������

������ �� �2��7! 2)G. ������ �� 0����� C �� �7 �.��������� �� � � ����������� ���� ��� � � ����� �����$

����$ F� � � �� � ���� 2��� > 8��� ��::=������� � �� � � ������� ������� ������ ���� � �� �� ��������� � ���� �B����� �����.8!8@88. �.��-��.��--� �� ������ ������� ��� ��� ������ �� .*� � ��� ������� ������������ �� � ����� ���� �� �� �� ��������������$ � �� ���� ������� � �� � � ����� �� �� �� ��������� � ���� ����� � ��� ���������� � �� ������ �������$�� ������ � � ��� ���� �� � � ���������� ��

������ ��� .*� �� ������ � � ����������0����� C �� ���� ������ ��� �/ $ ����$ <���������� �� � ������������� ������� �������� ��������������� !"#$ � � ���(���� ������������� �� 0����� C ������ �� �7!����&������&������� ���� � ��������� ������ �����������(�� %�&������� �� � � ���� �����$ <� ��� ���������� � �� ���������� ����� ������ �� � ����(�� ���� �� � �� � � *�+�,�� +�- ����������� �� ���� ����� �������� �� � � ��� �� � ���������� �� �2��7! ���������� ����� B�������� ����� �2)G.� ������ ��� � � ���(����������� �� � �� �� � � ������ ���$ .��������� � � ���������� !"# ����� �� � � ��������� ������ �� � � ������� �������� )0)������� � � ����� �������� �� ������� ������������ � ���� � �� ������$

��� �2 4$ /������� �� ���(���� ����� ����� ��

Page 3: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

������ �� �� �� ���� ������ ������� � � �

�� ��� �� �� �� ��

, ������� �� ����������� ��� ��������

L���� � �� � � �2��7! 2)G. ������ ��� � ���������� 0����� C �� �2 4 ��� �7 �.$ � ������� ���� �� ������� �� ����� �2������� ��� +$1 ���� � ����� ������ �������������� �� ��� ������$ �� �� ������ ������ ��� � � ���(���� ����� ����� ������ --����� ���� � �� �� ��� ��� !�������� �������� 2!./.'� � ���� � ��� ����� ��� ������ ���� 2..2��F.)H$ /���� � � ����� �� -=����� ������ �� � � �2��7! 2)G. ������� � ���������� �� )�+�� ��� )�+�� ��� �������������� �������� ������������� �&� ���� �� � �������$ /��:- �� ��� �&��������� ��� ����� ���� ���� ���� ��� ����� �2 � ������ ������$7 ����$ � � ��� ��� ���� ��� �� � � �������� �� � � ����� ������� ����� � � ��������� �� ���� ������ ����$� � � ������������� ������� ������ ��

0����� C �� ��������� �� ���������� !"#$� � �1 ��� ������ ���������� ��� !"# ������ ��� �� L���� ����$ � � ������� ����������� ������ �������� ��� �7!������� ������F�� ��� ������ ��������� �!F@)H� ����+.������� !F@)H �����$ � � ������� ��� �����

������ � � ������������� ������ �� 0����� C$ ��� F� � ������� ������� ������� ��� ���� ����� �� ��������� �� ������ ��$ /������ ��� ���� ���� ��� � ������ )� ������ ������ �� D��� ���������� �� ������ ���� ������ ��� � �� ���� �� ���� �� ���������$ ����0������ M -1 /K �3 2�+�1�� +�-� �� ������ ������ ���� ������� "F*"F* �8���� �� '$� �::4�$

������ ��� �� ����������� �� �����;�� ������� �$ !��� �� � � ���������� ������ �� ��������� ����� � �� 1$� /K �� � � ������� ��������� � � �� � � �� ���� �����$ � � ������ ��������� ����� �� ��� �� ��/ ��� �'� ��� ������� ��. ��� �0� ������� � �� ��� � ����������������� �� ���� ��� �� ����� ��� � ����.�������� ���� �.��:4�/��+�1�$ �� ���������� +11 ��� ���+1� �� ����� �� ��� � �������� ����� � ��� � � .�������� ��� �� �0���� �.��:4 ��� ����:,�$ � � #")0 ����� ��� � ���(���� ���� �� � �� �1 ������ ���$+� /K �� � � ������ �������� ��� 1$+� /K ��� ��� � ������� ������ �������$ 2��� � � �������� ������ ������� ��� �������� �����#[email protected] ����� �*�(��(� �� '$� �::4�$.������� �� � � �1 ������ ���� � �� � ���� ������ ��� ����� �������� ����� � ���� � ���� .�������� ���� ����� ���� ������ �����������$ � �� �� ����� ����� �� ���� ��������� �� � � ������ ����� �� � � ��� �C���7=�C���77� ���74 �� �/3 C���4�� ����4+ �� �'3 � ��,:�� ��-1 �� �. ������ � ����� ������ � ���� ���� ���� ��� �� � � ��������$ F� � � �� � ���� � � ���������� �� � � ���� ����� ���������� � .�������� ��� �*�+1-�� +�-�� �� �&������� ��� ������ �� � � ���� !F@ ��������$'�� ������� �� � � %��������� ���� ��

����� �� ���(���� ���� �� �1 !"# ������� ������$�� ����( ��� ����� ����������$ � � ����� �� ��� ���������� � ���� ���� ��� �� ��� ��� �� ����$������ ���� � � ��������� �� ���;$ � � ������� �� ������ ������ ��� ���� ��� � � �� �� ������ ����� ��� ����������$ � � ��� ��� ������� ���� � �

Page 4: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

�� � �� )������� ������� �� �������������� ������� C

����� ����� �� ������� �������� ��,-���������� 77=)�B������� ��� � 1� � �� �,,"������#���� ��� � 1� � =� �1+*����#���� ��� � 1� M =� +==

2������ ���� �������� �40� ���� ����� ��������

� 7,�� +�

0������ �������� ��������� ������ �� 1$� /K

1

0� ���� ����� �������� �������������� � �� � �

1

�� ��� ������;�� �������� �������'��� �/K � 1$1�4 �� +$�: � �1�7�/���� ����$� 1$7�= �� 1$11+:������� ����$� 1$+47 �� 1$1177�

�� ��� �&��������� ��������'��� �/K � 1$11:= �� +$,1 � �1�7�/���� ����$� 1$��� �� 1$11+7��

�#[email protected] #���� ����� ���� �������#����� �� ��� ������ ����� �5� 44$�#����� �� ���������� ������������ �5�

+�$�

#����� �� �������� ������������ �5�

�$�

#����� �� ��������� ����� �5� 1$7�� �� � � ���� ��������� �������)������� �������'��(���� ���� ���� �/K � 1$+�/�� ���� ���� �/K � 1$4:

�����'��(���� ���� ���� �/K � �$+�/�� ���� ���� �/K � �$:4

��� ������ �� �� �� ���� ������ ������� �

��������� �� ��� ���� �� ����� �.��-��.�+14 ��� .��--�.�+�4� �� � � ��� �� �����. ��� �0� ����������$ � �� ���� �� �������� �� �� �������� �� ��� � � � ���� ���� ��� � ���� ������( �� � � ������$�� � � ������� ����� �� D��� ���������� ��

������ �� � ��� ������� � � ����� ����������� �� ����� )�+���*�+�, �� ����� �� ������ �� ��� �������� �� � � ��� ������ �'������ '$� �:::�$ /�� ��� ���� � ����� ������������������� ����� �� �� )� ��;����� ��� '$ ��:::� ���� � � ���������� ������ � &�� ������� � �� �� �&����������� �� 0������ �-1��41 /K ��$ '�� �� �� D��� ������������� � �� � � ���� � �� �� %�&����� ����������� �� ������� ������$ � � �� ��� �������� �� ������ �� � � ���(���� ������� ���������� �������� ��� � � ���(�� ���� ��� �� � � *�+�, �� � +�- ������� ���� ������ ����� ������� ��� ������$

-�%��� ������

/�� ��� � �� �� � ����� �� ������ �&���������� �� � � ������ �� ������� ������������ ������ ����� �$�$ ���������� �������� ��� � ������N � ������ ��� ��� ���������� ��������� �� � � !F@)H ������ ��� �&������ � � �� ������ ��� �������� ��� ������ F�� ���

������ �!F@� �������� ��� �������� ��������$� � +#2!�2� �������� ������� �� � � ���� ��������� ��� ������� 7$1 ��� -$1 2;� ����� ��� ��������� �� � � ���� ������� ������$ � ������� �� ������� �������� �� � � ����������� ����� ��� �%��� � � ��������������������$ �� ��� � � � ��������� �� �������� �7! ���&����� ���������� ��� �� � � ��������� ��� !"# ��� �� �� ������� �������� ������ �L��� �� '$� �::=�$ �7! #�� #� ���!F@ ����� �� -1 �� -- ����� ��� �������� ��� �� �������� �������� ���$ F� � � - ��� �������;�� ������ !�������� ����+:� /��=1 ���)�+�� ��� ��� ���( �� ������ ������� �&���������� ����� ���=-� ��+1= ��� ��+�7 �� ��� ������������ ������ ��� *��,4 ��� .��:4 ������������ �� � �� � � �0 �2��7! 2)G. ������$L���� + �� � � #�� #� ��� !F@ ���� ���������� � �� �������� �������� ���� ��������� � � ���� ����� ���� � � �������� ��������� ��������$ � � �&��������� ���� ��� � � ��������� ����� ����� ���������� � � �������� ������� �������� ��� � � �������� �������$ ��� � �������� �&�������� #� ���&����� ��� �������� ��������� �� � � �&����� �������� �������� � � ��� #� ���&����� ���� �������� �� 71��� 41 "2; ��� ����� ���������$ 2������ ������ #� ����� �������� �� -1 "2; ��� ����� �� � �� �������� �� 71 ��� 41 "2;� ������������� ����� �� ����������� ��� � ������ ����&� ���� ����� .�"� ���� ���� �'���� �� '$��:47�$ � � !F@ ���� ��� ��� � ���������� ����� ��� ���� ������ �� ���� ���� ��������������� *��=4�/���7�� *��4-�����,1� *��-=�.��--� ���+1��*�+17 ��� *�+1-�/��+�1$ � ����� ��������� ���������� %�&������� �� � ������ ����� �� � ����� �� ��������� ���� ����$�� � ������;� � � ������� ������ �� 0�����

C �� �������� � � �&��������� #�� #� ��� !F@����� ��� ���� �� � � �&������ *�����);���������� ����� ��������� � � ��� �������������� �� "����� �� '$ ��::7�$ L� ��� ������������ �����=� ��� �� ����� �� �&����� � � �&���������� ���� ��� "�� ���$ 2������ ����� ������� �$�$ � �=�� *��=�� *��=4� *���=,� *��4-�����:7 ��� )�+���/�+��� ���� ���� ������� ���� ����������� ���������� ��� �������� )�� ��� ��� ��������� ��������� ���� ��$� � ��� ������� )�� � �� � � ����� �� � ���������� �� ������� ������ �� � � ���� �� ���������� ���� ����� �� �������� ��� � � �������� ������� ����$ "�� �� � � ����� ��������� �� � � �� ���& � �� ��� ����� �� � ���� ������� ����� �� �1$: ��� ���������� �������� ���������� � �� � �� ����� �� ���� ��������� �� � ���� �� ��������� ���� ����$ ��������� � � ����� ���� ����� �� � � ��������� ��$�$ /��-+�*��-,� ���+1��*�+17� �� )�

����� �� �� � �� 1$- ��� �� ����� �� �1�41 �������������� � �� � �� ����� �� ���� ������ %���������� �� � � ���� ����$ �� ������� ����� ��������� �� � � ! ��� . ������ ��� ������������������ �� �������$ L� 0����� C� � ��� � �

Page 5: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

������ �� #���&����� ������� ��� ���� �� ��������� ������ �� 0����� C ������� � � �������� �� ��������� ����� �����$ ��� #�� ��� #� ��� ��� !F@ ������ ��� ��������� �� �7! *��� ��B������ �� 71 ����� 41������ ��� -1 �����(� "2;$ � � ��������� ���� �� � � ����� ����� ����������� ���� � � �������� ����������������$ ��� )�� ��� �� ��� ��� #�& �� ������� ������ ����� �����$ L� ����� ������ ����������� �� ������������ ��� ������� �� ��� ���� ���� ������� ������ �)�

� ��� ))� �� ������� ������ �� � � ��� ��� ���

���� ����� ����������� �� ������ �� � � � �&��������� �����$ L� � �� ������ �� �� ��� �� ��$ � � �������� ������� ������� �� ��������� �� ���� � ���&� ��� ����� ������ �� �� � � ��� �� � � ���$

������ �� �� �� ���� ������ ������� � ���

Page 6: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

�� ������ �� �� �� ���� ������ ������� �

!�������� ����� ���� ���� ������ ������� ������� ��� � �� 1$7�� � �� �� � �. ������ �� ��������� ���� ��� �������$� � �� ������ � � .�������� .�+�4 ���������� �� .��-- �� � ���� �� ����$/���� � � ���� ����� � �� ���� � � ����

��� �������� � � ����� �� � � ���� . ����������� ��� ���� ������ ����$ �� ��������� ��� ��� � ����� �� � � ����� ���� ���� ������� �� �� ��� ��� ��������� � � ������������� ������� ��� �� ����� �� ��� �������������� �&� ����$ / � ����� � �� ����� ����������� �� ��� � ��� ��� ������� �� 1$-��� � ��� ��������� ��������� ���� �� 711��111���� ���������� ���� ���� %��������� �� � ������������ ���� ����$ � � ��������� ���������� �� � �� ����� ��� �������� ���� � � ��A� ���� �� � � ������ �� ���������� �2��2 !F@ �� � � � �������������� �+.�!F@)H�2)G. ��� �7!�!F@)H�2)G.�����$

.���� � � ��� ���%�� �� ����� ��� ����� �

.������� �� � � *�+�,�� +�- ������� �������� �� � ���� ���� ������ �� ������� �� ������ 0����� C �� ���������� � ���� � �� �������� � ���������� �2��� �� '$� �::+3 2��� ���� '$� �::,3 F (�� �� '$� �::-�$ �� �������� � ��������� ��� ���� �� � � ���������� �� ��������� � �� ������� �� � �������� �� ������ � �� ������������� ������ �� � � ��������������� ��� � �� �� � � ������ ���$ L� � � �������� ������ � � ���(�� ��� �� ���� � ����������� ������ �� *�+�,�� +�-� ��� ����������� !"# ����� ���� � � ��� ����������������$L���� =��� �� ������ �� �2��7! 2)G. ����

�� �� � � ������ ��� ���(�� ��� �� �7 �. ����2 4$ �� � ����� ��� �� � � ������ ���� � � ������� �� � � ���(�� ��� �� ���� ������ �������� �2 ��� �7! �&�� ����� � �� � � ���(����� ��� � � ���� ������ ������ ������$ � ����( ������� �� ����� �� ����� ������ ������� ��� *�+1- �� .�+�4$ �� � ��������� � ��� �� ����� ��� ����� ������� �� � � ���� ��� �� � � ���( ���1 ����� ��� *�+�,�� +�-������� �����$ �� ������� � � � ������ ��� ��� � �� � ����� ������� �� ��� ������� ���� � ���( ��� ��� � �����$ � � �������� � ��� �� ��� �� ���� ������������� � ���� ���������� � � ������ ������ �� � � ��������$�� ��� � � � ���� � �� � � ������ �� � � ���( �

�� �� ����� ��� �� ��� ��� ������ � � ������ ��������� �� � � ��������� �� ������� �7! ���&������&������� ���� � � ��� ��������� � � �� ��� � ������ ���$ �� �������� �� � � ��� � ������ �� ��� ��� ��� �� � � ������ �� � � ���������� � �� ����� �� � � ����� ������� !�������� �� +�-�/��+�1�� ��� 2�+�1 ��� )�+����� �&������ ��� � � ������ ������ �� � �

���( ��������$ L���� 7������� �� � � #�� #���� !F@ ���&����� ���� �������� �� � �� ��������� ���$ @&���� �� � � ����� ���� �� � ����(� � � ���&����� ���� ��� ����� � � ��� �� �� �� � � ������ ������$ L� ����� ������C���4������47� .��-�� *��-� ��� ���+1��*�+17�� � � #� ����� �������� �� -1 "2; �������� ���� ��������� ��� � �� �������� �� 71 ���41 "2;$ � � ��� ��A������ ������ �� ��������� �� � � ������ ���� ����� ���������� � ������������ ��� � ������ ��� �&� ����$ � � ����������� �� � � !F@ �� ��� � � ��� � � �� ��� � ������ ���� ����� ���� ��� ���� ���� �� ������ �� ���� ���� ����� �*��=4�/���7�� *��4-�����,1� *��-=�.��--� ���+1��*�+17 ��� *�+1-�/��+�1�$�� ������ �� � � ������ �������� �� � � ���&�

����� �������� � � ������� � ���� �������� �� � � !F@ ���� ����� � � ���($ � �!F@ ����� ��� ���� ������ ������� ��*��+�+ ��� � � ��������� ������ ��� ������������ ����� �� � �+�7� ��+�4 ��� *�+�,$� �� ����� �� ������� �� � � .�������� �� � ����(� ����� � � �������� �� � � *�+�,�� +�-������� � ���������� �������� �� � � �����$� � �� ��� ������� ��� � � ���� �� � � ��������� ������ �L���� 7��������$ � � �������;����� ������� ��� ����� ��������� �������� � ������ ��� ���(������ � ��� ��� � ��B������ ��� � � �&������� �� � � ���� ���������� ����� � � ���($ � � ������ ������ ��� � �� � ��� ������� ��$�$ ��������� �������������� ��3 � ������ �&� ���� ���� #�&� �� ��� ������ ������� � � ��� ���� ��� ��� �� ������� ����� ������ � � � ������ �&� ���� ��� ��� � �� ����� �����$� � �������� �� � � �7!�2)G. ������ ���

� � ���&����� ������� ������� � � ��� ����� � � ������ ���������� � �� � � ������ �� � ����( �� �� �� ����� ��� � �� �� �� ������� ���� �� � � ����������� �� � � ������$ ����������� � � ����� ��� �������� �� !F@ ������( ������ �� � � +0 �7!�!F@)H�2)G. ������� ��� ����� ��������� ������� � � ������ ������(�� ��� ����� ��� ����$ /�� ��� �� ������ ����� ��� � � ����� ������ �� ������� � �� ������������� ������ �� � � ���(�� ����� � ����� ��������� ������� � �� �������� � � �� ���������� ������ �� � � ���(�� ����� 0����� C �� � � �������� � �� � � �� �!"# ����� ����� ��� �� �� ������� � ����$L���� =��� �� � � �������� � �� ���������������� �� � � ���(�� ��� ��������� ���� � ���� ������� � � �� ��� �� � � ������ ���$/ ��� � �� �&������� � ��� ��� �� � � ����� ��� � � ��� ��� �������� � � ���� .������������ �� ���������� ��� %��������� � ��� �� �� � � ������ ���$� � ����� ������ ������� �� ����� � �

�������� � �� � � ������ �� �������� � � *�+�,�� +�- ������� ���� �� ��� ����� ��� �&��������������� ��� �� ����� ����� ����� � � ���($!���� ���� �������� �� � � ������� ���� ����

Page 7: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

������ �� ��� F����� �� � � �2��7! 2)G. ����� �� ������ ���� ��� ���(�� ��� ������ �� 0����� C �� �7 �. ����2 4$ � � ����� � �� ����� �� ����������� �� � � ���( �� ��������� �� ����� ����� ��� ��� �� ����($� �� ����� �� � � ����� ������� ! ������ �� +�-�/��+�1� � �� ��� ��������� �� � � ������ �� � ����(�� ��� �� ��������� �� ����� ����� �� �� ����$ ��� F����� �� ���(���� ���� �� �1 !"# ������� ������� �� ���(�� ��� �� 0����� C� ���������� ���� � � ��� ������� ��� ����� ������ � � � ������ ��� ����� ������� �$ � � ������� ������� ������� ��� � � �� �� ������ ���� �*�+1-�*�+�,� �� ������ ����( ��� �������������$ � � ����� � �� ��� ��� ����� �� � � 2)G. ������ �� � � ���( �C���=:�� �7+ ��� *��-4�.��--� �� ������ ����$

������ �� �� �� ���� ������ ������� � ���

�� � ���� ������ �� �� ���� �� ����������� ���� � �� ������$ � � ����� ������� ���� �� ���� ���� ����� �*��+�+�/���� ����+�4�� ��� � �� �� ������� �� � ����� ����������� � ���� �����$ � � ���( ���� ������ � ����������� ���������� ��� ���� ���������$ � ������ ��� ��� � � ���� .������������ � �� �� ������� � � *�+�,�� +�- �������

���� ��� ������� �� ��� � � � ����� �� ����� ���� ����� ��� �� � � ��������� � ��������������� ��(��� �� ������ �� ������� ������������� ��� ���������� � ���� � �� ������$�� ��������� � � ����������� ������� ������� � ������� � �� ������ ��� � � �&�� ����&�� �������� ������� �� � � ���( ���� ��� ������ � ��� ����$

Page 8: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

������ �� #���&����� ������� ��� ���� �� ��������� ������ �� � � ���(�� ��� �� 0����� C ������� � ��������� �� ����� ���� ����� �����$ ��� #�� ��� #� ��� ��� !F@ ����� ��� ��������� �� �7! *��� ��B�������� 71 ����� 41 ������ ��� -1 �����(� "2;$ � � ��������� ���� �� � � ����� ����� ����������� ���� � � ����������������� �������$ ��� )� ��� �� ��� ��� #�& �� ������� ������ ����� �����$ �� ���� � � )� ����� �� � � ���(����� ���� ��� � � ������ ��� �����(� �� ������� �� ��������$ L� ����� ������ ����������� �� �� ������������� ������� �� ��� ���� ���� ������� ������ �)�

� ��� )� �� ������� ������ �� � � ��� ��� ��� ���� �����

����������� �� ������ �� � � � �&��������� �����$ L� � �� ������ �� �� ��� �� ��$ � � ������� �������� ������� �� ��������� �� ���� � ���&� ��� ����� ������ �� �� � � ��� �� � � ���$ � � ������� �� � � ���(�� ��������� �� � � ���$

��� ������ �� �� �� ���� ������ ������� �

Page 9: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

������ �� �� �� ���� ������ ������� � ��#

��� �������

� �� �� ����� ���� �� �������� � �� � � �������& �� ���������� � ���� � �� ������ ��� ������ � � � ����� �� ����� �� ������ ��������� ����������� ����� �� � ������ ���� ��� ������� �2��� > 8���� �::=�$ '��� �� ���������� ������ ���� ���������� � �� � � ����������������� 0����� C ��� ���������� � ���� � ��� ������ �� � ���� � � �� �� � � � ��� ���������� � � �� �� ��������� � ���� ������ ����� ������� �� �� �������� �� ������� �� ������ �� ���������� � ���� � �� �������)����(��� �� '$� �::�3 2��� �� �� '$� �::7�$ �������� � � ��� ���� �� ���������� �������0����� C ��� ���������� � ���� � �� ��������� ������� � � )0) �������� �&������� ����������� � � �2��7! 2)G. �����$ "������������� �� � ������ �� �������� ��������� )0) ��� ���� ������ ��� � ����� ���� �� � ���������������� ���������� �� �&����� �������� ������� ������ ��� � �� ������ �8�(�� ��� '$� �:::�$ )0) � � �������� ��� ������� ��������� ��� � �������� ���� � �� �--� ��� � �������������� ������������ �.".� �� 1$7� ��� -$� �" ��� � ������ ��� ������ �� 711 �" !�.������������ �2������ > )����� �:,7�$<� ������ ����� �2��7! 2)G. ����� ��

�������� )0) ������������ �� �� � �" ��� � �" �� ������ �� �2 7 ��� �7 �. �L���� 4����$ ��� � ������ �� � ������� ������������ �� )0)���� �� � � ���( ��������� ��� ������� ���715 �� � �� �� � � ������ �� )0)$ � �������� ��� � ��� ���� ��� �� � � ������������� ��������� �� ������� ���6� � � ���� ���������� �� ��� ���( ��� �� � � ������ �� ��������������� ���� � �� � � )0)������� ������&$!���� ���� � � �������� �� ��� ���( ��������� ������ ���� ���� ���� �������� ������������� �$�$ � �� ��� ����� ����� � � ���(��������� �� � �� ��� ��(���� ��������L���� 4����$ < �� � �� ����� ��� ���������� � � � ������������� ������ �� 0����� C���� ��� ������;�� �� � � �������� �� � � ���������� �� ���� �.� �0 ��� � � ���� .������������ �L���� 4����$ � � ������� �� � � ������������� �� )0) ��� � � ���������� �� � � ���������� � ���� ����� ����� ��� ����$� � ���� �� ���&����� ������ ��������� � ��

� � .�������� ���� ���� � �� �� %��������� ������������� ���� ����$ � � ���� � ������ ���������� �� ����� ����� ��������� � � �������� �������� �� )0) ������� � �� � � ��������� )0) ���������� ���� � � ����� ���� � �������� �������� �� � ����������� ���� ���� ��� ���� �� ���������� ���� ����� �� � �� ���!"# ���( �� ��� ���� �� ����� ������ �� � ����� ���� ���� ���������$ �� ������� �� � ������ � �� ��� ��(���� �������� �� )0) ���������� �� � � ��� �� � � �� ����� ������� ������ �. ��� �0$ � �� ����� ���� ������� ������� ����� �)� � 1$:� �� L���� +��

���������� � � ��� ������� �������� �� � ����� ����������� ���� ���� �� � � ������ �� )0)$� � ��� ���� �� ���� �.��-��.�+14�

.��--�.�+�4� ��� � ��������� �� ��������;������ �� � � �� �����$ �� � ��(��� � �� � � �� �������� ����� ����� � ��� � � ���� ����� ���� �� ������ ������� ��� � � )0) ���������� ��� ����������� � � ������ ��� �� � � ������ ���������$ � � ����������� �� � � ����� )0) ��������� � ��(����$ 2������ � � ��������� ���� ���������� ����� � �� )0) ���� �� 0����� C � ����������� ����$ ��� � � .". �� )0) � �� ����� ���������������������� �-$� �" �� ������� ��� 1$7� �" �� � � ������ �� 1$7 " !�.��$O��� �� �&��������� ���������� � � ������������� �� )0) ��� ��� ��� ��� �� ������� �� ���&������ � �" )0) ��� �1 �" ����� � ��� ��� ��2 7��$ ���� �� )0) �� ����� �� ������ � ��������� � � ���� ���� �� � � �2��7! 2)G. ������� � � ������ �������������� ������& ���� ������ ������ ����� ������ � � �&������ �;� ��������� � �-�+4 (0�� ��� ���� � �� � � ����������� ��1 (0��$ ����� � � ���( �������� �� �2� �7!2)G. ����� �� ��� ����� ����� �� �������� ��� ��� �������� ������������� � ��������� �������� ��� ��� ����$

��������� �� ��� ������ � ��� ������� �������

/�� ��� � � ����� �������� ��� �� � � �������� � ���(����� �� ����� ���( �� � � �2��7!2)G. ������ � ��(����� �� � ��(��� � �� � � .�������� ��� �� ���� �.� � � !�������� ������� ���� �0 ��� .�������� ���� ���� ��������� � �� ��� � ������� ���(�� �� � � ����������� � ���� ��� ���� �� ��������$ � �� �� ������ �� ��� � ��������� � ���� ����� ������ � �������� ������� ������ �& �� � �� �*��-��*��-=� *��-,� *�+1-� 2�+�1 ��� *�+�, ������� � �� � � ����� � �� �� ������� ����� � ������ ��� ����� � � �������� �� ��� � ������������� � ���� ����� �L���� 4����$ �� ������� �� ����� � �� � �� � � �B����� �� ����� ���� ����� �*��+�+�/���� ����+�4� �� � ���� �� � � ���� .�������� ����$ � � ����� �� ���� ���� ����� �� � � �� �� ������ ���������� � ��� � � �������� ��������� � ���������� ��� �� ������� �� ����� ������� ��� �������� �� ���������� � ���� � �� ������$"������� �� �� �� ������� +�4 �� � )� �����

�� ������ �� ���� �� � � �� �� �� ���� �� � ����������� � ���� � �� ������ �)��� �� �� '$��::,�$ F� � � �� � ���� � � �7������ ������������� ��� � � ��� ������� �. ��� �0�����,=�.��--� �� ������� �� ���� �� ����������� ���� � �� ������� � ��� � � ������� ����������� �� � � ���� .�������� ���� �.�+14�.�+�4� ��� ��� �� ��� ������� �2��� > 8�����::=�$ � � ����� ���� ��������� � �� ��� ��� �� ����� ��(� ��� �� ������� �� )0)$ � ������� ��� ������� �� � � � ������������������� �� � � ��������� ������ � � �������

Page 10: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

L���� 4$ �2�-��� $$�����

��� ������ �� �� �� ���� ������ ������� �

Page 11: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

������ �� �� �� ���� ������ ������� � ��!

���(�� �� � � ������ �������� )0)$ � � ��� �������� ��� �� � � ������� �� �������������������� �������� �� � ���������� ��� � ��� ����������$L������� � �� �� �������� �&����� �� � �� �

������ �� �B����� � ������ �������� ��� �� ������� ����� �� �������� �� ���������� ��������� �<�� � > 0���� �:::�$ L� �&������"�(� �� '$ ��::,� ������ � �� � � �� �� %�&����� �7������ ���� �� ������� ������ *���.,4� �������� �� #!/ �������� ��� ������ �������� ������ �� &��� �� � � ���������� �����$� � ��� ��� �� � � ��� �� 0����� C? � � �� �������� .�������� ����� ����� � ��� � � ���������� �. ��� �0� ��� ��� � ������� ��� ������������ � ���� � �� ������� ��� ������������� ��� ���� &��� � � ���� ���� �������������� � ���� �� � � ���������� �����$

������ �� �����

������

�7!�/������� ������ �� ��� ��� ��� ) �(�.�$� *��$ �+.+�������� ��� �+.���� ���� ��� ���� ��� ��� !����� )��� .��������$ 0�������� )0)��� �� � ������ ��� ��� ��� ��� !������ ��B��$

������ ��������

� � �&����� ����� ���������� � � ���������� ���� ������ ������ C �� ��������� �� ��� ������� �� ����� �/ $ ����� ��� � � ������ �� �&������� ��� �� � ������� �� 2��� �� �� '$ ��::,��8���(�� �� '$ ��::-� ��� F (�� �� '$ ��::-�$ 2��� � ������������ �� �/ $ ���� �� ������� ��� ������������ �'"�H ��� '""H�� ������� �� � � ���������3 �� ' � ����� .4$����� )�� �����������$ < �� � ���������� ��� �� ������ ������ ��� ."�)�� ���.*�4' �/�� �� � ������ '����� � �� ������� �� �������� �� 2�*. ������� ��� ������ ���������� ������ �� � ���� �� -?�$ �� ������ �� � � ������� ���� �� �� ����� �2��� �� �� '$� �::,�� �������B������� ��� �� ��������� ���� � �� � ���A� ������� �� � � !�������� �B����� ��������/������� ��*��$ /�� ��� � � !�������� � ������������� ����� ������� ��� 0����� C ��� ��� � ������ ����� �� ��� � � ��A� ������ �� � ������ ����$ � � �������� �� � � ����� ���� ������ � � ��� � � � � ��� ������� �$�$ ������ �������+:�/��=1�� �=��*��=�$ L� ��������� ���������� �7! ��� �+.�������� ������� �7!���������������� �+.+�������� ��� �+.���� ���� ��� ���$

������ �� ��� F����� �� � � �2��7! 2)G. ����� �� 0���7 �. ��� �2 7 �����(�$ � � ����� � �� ����������� ������� �����$ ��� � � ���� �� ���( �������� �� � � ���������$ ��� )� ������ ������ � � +0 ������ �� 0������� � �� �� ���� ������ ���(���� �� )0) �� ������ ����*��+�+���+�4� �� � � ��� �� � � �� �� ������ ���� �� ��� � � ��� �����$ � � ����������� ��������� � ���������� �� ���� ��� �� ��$ � � ��� ��� ������� ���� � � �

� � ��������� �� � � ���(�� ��� �� ���������������� � � ������� �� F (�� �� '$ ��::-� ��� ������� ������$ �� ����� � � ��� �� 0����� C �����;�������� �11 �" ���2.� ��2 -$1�� �1 �" !�.� ���1$+ �" .�.�� �� ��������� ��� ������ �� +, �. ���= �� �� ��;��� �� ������ ���� ���� �?71$ /���� � �������� ��������� ������ ��� ��;��� �� �������� ���� � 2���� 2����� ������ �/�� �� � ������� '����� � �B��������� ��� �1 �" ���2.���2 -$1�$ � � ���(�� ��� �� ������ �� ������ ��� � 1�� � " ����� !�.� ������������ �������$

"�� �� �������

� � !"# ����� ��� ��������� �� �7 �. �� '�(�411 "2; ��� -11 "2; �'�(� 0#D411 ��� 0#D-11��������� �B������ ��� �������&��������� ��� �������������� ����$ L� �7! ���&����� ����������'�(� 0#D711 �� ��� ��� ���� � � ��� ����������������$ � � ����� ������������ �� � �" ��������1 �" ����� � �� ��� ��2 4$1� ��� �15 � �115�2�F$ )����� ��� ������ ��� ������ ��� ������;�� ��� ��0�� ��� ���� ������ �� '$� �::�30������� �� '$� �::7�$.������� �B���������� � !"# �������� �� � �

���������� 0����� C ��� �������� ���� 2!./.'�2!�.F�./2/ ��� 2..2��F.)H �'�& �� '$� �::13 '�&> �(��� �::�3 <����(��� > "������ �::+�$ � � ��A������ ������� ����� ��� �������� ��� �2��7! !F@)H�2)G. ��� �+. !F@)H�2)G. ����� ��� � ��&������� �� �11 ��� �"���� �� '$� �:-:3 "� ������ �� '$��::+�$ � � !F@ ������������� ��� ����� ������� ������( �� ���( ��� �������;�� ��� ����� �� �������� �� � � ���� ����� �� ����������� ��������� +$1� =$1 ��� 7$1 /K � ����������$ "�� ��� ��� �������� ������� ��� ����� � �� ��� ��� �������� ������ ������ ��� ������ � ����� ���� ������� ��� � ��������$ � � � ����� ������ ��� �������� ���+#2!�2� �������� ������� ������ �� 2"G.�P�&������� �8�� > '�&� �::1�$ +#2!�2� ����� �� ��� �� 7 2;� ��� � �� - 2; ��� ����� �1 2;��� �������� �� �� ���� ����� ����� ���:1 � � � � � +1 �� � �41 � � � � -1 � ��� � �=1 � � �� �11 �� ����������$ � � ����� ��� �� ���� ������ ����� ��������� ������������ ��� � � �������� ��������� �� � � ����� ����� ����� ��� � � ������� � � +#2!�2��

+#.F�2� ��� +#2��2� ���� �������� ��������� ��������� �� � � 2!2'� 2!�.F�2' ����7!��F.)H �&�������� ���������� ����� �� '$��::+�$ 2������ ���� ��� ��������� �� ���� ��������� + #2!�.F ������ �� 2!.F��#F)H �&��������<��� �� '$� �:::�$ 2������ ������� ���������� �� ������ ����� ��� ���������� �2!�F � �$-��$� /K ��� !�F � �$��+$+ /K $ )������������������ ��� ������� ��� D��*F# ����� +$��'�Q ����� �::��$

��� C �� � � ������ ���� ��� ������ �� � �" )0) ������ �� �������� ���� ������ �� )0) �� ��������� ���� ��� ������ �� � �" )0) � � �������� �� �����C$ ����� #����� ������ �� � �� ����� � � ���������$ � � ����� ��� �� � �B���� �� ���� ���� �������$ �������� )����� ���� ��� � � ��� ���������� ��� ��������� � ���� ����� �� ���� ��� ����������

���� "F*"F* �8���� �� '$� �::4�$

Page 12: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

��� ������ �� �� �� ���� ������ ������� �

�/" ������ �� ������� �� ��� �

�7! ���(���� ������� ��������� ��� �������� �� � �� �������� �������� ��� ��7! *�����B������ �� 71� 41 ��� -1 "2;� �� �7 �. ��� �2 4$� � ���� �B����� ��� �� ������ �7! ���������������&����� ����� ��� � �

�7! ����������� ���&����� �������� ��� R�2S��7! ���������� !F@ ����� ��� �������� �� L��� �� '$ ��::=�$ � � ���&����� ������� �� ��� �1� �11� �11 ��� +11 ���$ �� ��������� =11�711 ��� -11 ��� �� 71 "2;3 711� -11 ��� �111 ��� ��41 "2;3 711� -11 ��� ��11 ��� �� -1 "2; ��� ���$� � ���&����� ����� �� �� ��� �-� +4� 7=� :1� �1-� ��4��� �-1 ���$ � � ���������� R�2S��7! !F@ �������� �������� �� ������� ����� ��� ��� ��� ��� � �� ����� �2 �������� �����$� � #� ���6���� #� ���6��� ��� !F@ ����� ���

�����;�� �� � � �&������ ��������� ������ ���� � ������ "������� =$1 �������� �� 0 /$�$ ������$L��� ����� ��� ��������? ��� � � ��� ������� )�

����� ��������� ���� �� ��� �&� ���� ����� ���&�����#�& �� ����������3 ��� )

� ��� ��3 �+� )� ��� #�&3 �=� )

�� ����� #�&3 �7� ����������� �� �� ���������� ��� �������� �� ��� ���� ���� ������� ������ �)�

� ��� )� ��

������� ������ �� � � ��� ��� ��� ���� �����$ L�������� � ����� �� ��� ������ �� ��� 5��65� �������� &�� �� � � ����� ��������� �������� ��� � � #�6#� ����$ /��� ����� �������� �� ��� ������ � ���������;����� �� ������� �� � �� � � ��������������� ������� �� ��� !2 ����� ��� ������;��������������$ � � �&����� ������� �������� �������� � � ������� �������� ����� ��� ��� �� � ������� ��� ���(�� ���� ����������$ L� � � ������ ����� � ������ ��������� ���� ���� ��� 5��65� ��� ��������� �� �� 4$+ ��������� ��� �$�7� ����������$< ��� )�� �� ��� #�& ����� ��� ������;�� �� ��� ������� � � ������ �� ��� 5��65� ����� ��� ������;�� ���� 4$�== ��������� ��� �$�+� ����������$ L�� � ���(�� ���� � � ������� ��������� �� �� �� 7$4 ���������� �� ��������� ��� ������;�� �� �� 7$-1 ���$

������ �� -�% ��� �� ���0

� � ��� ������� �� �1 ������� ��� ����� �������;�� ������ ������ ��� ���� �������� ��� � �#.)' ������ 0��� '��(� ������� ����� ��=� �����=�� ����������$

,�%�1��������

<� � ��( 0 H$ 8���(�� �F�(� O�������� �� ��������� � ���� �� ����� $ ���� �&����� 0����� C$� � ��( �� ������� �� � � ����� �� ���������� L���������� )����� �� 2���� )������ �� � � F�����;����� �� � ����������� )����� ��� #���� �� P����$

���������

'�&� /$ > �(��� "$ ��::��$ /� �� ����� +0 !"# ��� ���B�� �� ��������� � � ����� ��� �7! ���(��������� ������� ��� � � ��� ������� �� � ��������� ����� �� �������� �7!6�+. ���� ��������$ #/ 0��'/ &3�� �� ::��1=$

'�&� /$� .���� �$ "$ > ��������� /$ "$ ��::1�$�2��2 ��������� �� ������� ��&��� �� �+.�������;������ � ��� � ������������� ������

�� ������� �2 ��� �+. ����� �� �+.����� ��������$ #/ 3 -�/ ����/ ��� =�7�=+�$

'����� "$� #����� *$ <$ > <���� @$ P$ ��:47�$ )����� �� ��� � ������ �&� ����$ #/ (���/ ����/ ���4�7��4�=$

'����� '$� �� ����� �$ �$� ��� ��� @���� P$ "$ 2$�#������� #$ '$ �$� )� ������ /$� )�������(� "$ P$ /$�0�(��� #$ 2$ <$ "$� 8���� P$ > ��� �$ ��:::�$/� ���� ��� ���� �� ���� �������������� � ��� �� ������ ���� �� �� ����� ������$ .30�#/ ��� 7�44�7�,=$

'�Q���� /$ �$ ��::��$ D��*F#� ����� �/"+ 6 ������ �7� � (��� ''- $�� �� &3�� H��� O���������� !�� 2����$

0�������� L$� �;���(� )$� C����� �$� T �� �$� ������� P$> '�&� /$ ��::7�$ !"#����? � ��������������������� ������� ���� ���� �� O!�D ����$#/ 0��'/ &3�� �� �,,��:+$

L���� !$ /$� "� ������� #$� )����� /$ O$� ������)$ "$� 8��� .$ "$ > �� � �$� �� '$ ��::=�$ '��(����������� �� � ��� ��� � � �� ����������������&�� )� ������� � ������ ������ ���7! !"# ���&�����$ 0���������� ��� 7:-=�411+$

������ 0$ )$� ����� #$� ��������� /$ "$ > .�����$ "$ ��::��$ / ������ ��� ������ �� ���(���(��� �� ���� � �� ��� �������������� ��������� ��������� ������� ������ �� ������ �������$ #/ 3 -�/ ����/ ��� ��=���1$

2��� ��� H$� ����� H$� 8���� 2$ > H� ����� �$ ��::7�$#��� �� � � ! ��� .�������� ������ �� ������ �������������� � �� �� ���������� ��� ����������$#/ 0�����/ ���� ��:��+4$

2��� ��� H$� @�A�A�� 8$� FU ���� �$� 8���(��� H$� )����8$ > ���� �� "$� �� '$ ��::,�$ )������ ����������� �� � � ���������� �� ������ �� ������������������ �? ������ �� ���� � ��������������� *�,, ��� � ,-$ #/ 0������ ��� ��-��+,$

2������� /$ > )����� 8$ ��:,7�$ )�������;����� �� �������� �� ��������$ 0�����/ 0�$���/ 6�� / ���� �:�,:$

2���� P$ @$ > 8���� )$ ��::=�$ � � �� ������ ���������������� � ������� � � �� ������ ���������� �.��-���--� ��� � ����� ������;�� �� ��������������� ���������$ #/ �����'/ ��� 47+�47:$

2���� P$ @$� "�!���� 2$ �$� "����� �$ P$� .����� #$ "$> 8���� )$ /$ ��::��$ / � �� ���������������������� � ������& � �� ������� �� ����������������������� ������� �� ���������� ����� ��� ������ ���������$ 2�$��� �� ,7�-�$

2���� P$ @$� )������ #$ P$ > 8���� )$ /$ ��::+�$ ������ ������� �� � ����� �� �������������� � ������� ��������������� ��� �������������� �������� ���������������$ ��/ & �' 6� �/ ���/ ��6� ��� ��=����=7$

�� ����� /$� '������� #$ @$ > 0����� @$ <$ ��::1�$)������ �� �������������$ #/ 0�'/ (���/ ����+=����+=�=$

8���(��� H$� T ���� <$� ���B����� T$� F���� �$�8� ������ "$� ����� H$ > )���� 8$ ��::-�$ @����� ����� ���� ������������ �� � � ��������� �� ���� �������������� � ������ C �� � ����������� ����� $ ����? � ����� ���� �� � � �������� ��� ���� ������������ ���� � ������������� ���$ #/ 8�����/ 0���-/ ��� =-��=-,$

8���� 2$ > @�A��A�� 8$ ��::��$ /���� ���� �B�������� �������� �� � � ���� �� ���� �� ������ ������������� �? � � ������ �� �� )� � ������$0���������� ��� ��4-,���4:=$

Page 13: Identification of the Phospholipid-binding Site of Human β2-Glycoprotein I Domain V by Heteronuclear Magnetic Resonance

������ �� �� �� ���� ������ ������� � ���

8��� *$ @$ > '�&� /$ ��::1�$ !�� ��� �� �� � ���������� �� !2�.�2 �������� ������� ���7!�������� ������$ #/ 3 -�/ ���/ ��� ��1���4$

8�(�� �� P$� /�(��� �$� *��� � �$ /$� ��(��*��� � �$ )$�) ������ 8$ > 2����� .$ !$� �� '$ ��:::�$ / ��� �� ������� ������� ������ ����� �� ������ ������������ �� � � ������ �� ������������ ��� �������������� ����������$ 0�$'����� ��� +4��+,�$

8����� #$� '������� "$ > <�Q � �� � 8$ ��::4�$ "F*"F*� ����� �� ������ ��� ������ �� ������������� ������$ #/ 3'/ 9 $�/ ��� 7��77$

89��� P$� *���� P$ 8$� *���� 2$� @;���� "$� <������(� 8$> L���� "$ ��:,4�$ 0!/�������� ������ ��H� ��� ����� ���� %���$ 0�����/ 0�$���/ 6�� ����� =:1�71�$

*�(��(�� #$ /$� #��������� P$ /$� "��/� �� "$ <$�8������� #$ > � ������ P$ "$ ��::4�$ /GO/ ����#[email protected]�!"#? ����� �� � ��(��� � � B������� �� ������ ������ ����� �� !"#$ #/ 0��'/&3�� �� =,,�=-4$

"������ /$ "$� /((�� "$ > ������ /$ �$� ��� ��::7�$'��(���� ������� �� .�������� �'� ����������2�? ��������� ��� ������ ��� �������� �� �������� ��;���$ #/ 3'/ 0�'/ ��� �==��4+$

"����� 0$� 0������ �$ .$� 8��� *$ @$� <��� ���� �$ �$�'�&� /$� ��������� /$ "$ > .���� �$ "$ ��:-:�$F�������� � � ������ ������ �� � � ���������� �2 !"# ����� �� ���� ������ �� �� ��� ������������� ���������� �2��7! 2�������2� � �������� B������ �� ����� ��� ������F�� ������������ B������ �� ����� ����������? ����������� �� �������(�� ��$ 0������������ 4�71�4�74$

"�(�� "$ /$� 2���(� /$ �$� 2����� )$� 0���� 0$ @$ >��� ��� 0$ /$ ��::,�$ 2�� �������� ������������� �� ������� ������ *���.,4� � ������������ ��� � %�&���� ���� � �� ������ ����������� ������� �� #!/$ & ��� �����/ 0�'/ �� ,1�,,$

"������ @$� ���� �� H$� L�A������ "$� �� �(���� 8$ >8��(�� �$ ��::1�$ /������������� ��������� �������������� ������� �� ���������� �����$ 2 ������ ���� �,,��,-$

"�!���� 2$ �$� )������ #$ P$� . ������� .$ !$ >8���� )$ /$ ��::1�$ /���� �� ������ ��������� ��������� ������ � ������& ������� � �� ������� �������������� �� ����� �� �����������? ��������������� � �������������� 2�$ ��/ & �' 6� �/ ���/��6� ��� =��1�=��=$

"� ������� 0$ #$� L���� !$ /$� D�� �$�H$�)���������� )$ 2$ > 8��� *$ @$ ��::+�$ / ��������+. !F@)H�2)G. �&������� �� �������!F@)H ����� �� �+.�������� ������ ������� ��2�F$ #/ 3 -�/ ����/ 0� ��� +�,�+��$

F (��� !$� 2��� ��� H$� H� ����� �$� ����� H$ >8���� 2$ ��::-�$ ������ ��� ����� � � �������� �� ���� �������������� � �� �������� ������ C ����� ���(�� ���$ 0'�� ��� =�,+�=�,:$

���;� @$� <��� 2$ > 8����� �$ "$ ��:-1�$ ������������� �� ���������������� �� � � ��? �������� ���

��� ��� ����������� �� ���������� �������������$ ���/ #/ 0�����/ ��� �47��,1$

����� #$� ������ 0$ )$� "�� � .$ P$� L������� @$ /$���������� /$ "$ > .���� �$ "$ ��::+�$ � � �� ���������� � ������������� ������� ������ �� ���� �������(���= ��������� �� ���������������� ���������� �������� ������� ����������$ 0���������� �� 4,==�4,4�$

)��� ��� 0$ 8$� <����(��� �� 0$ #$� "������� P$ /$ >8���� � "$ �$ ��::,�$ ������ ������ �� ��������������� �� � � �� ������ �� ������������� 2��������������� �� � �� ������ � �� ������ ��������$ :��/ 3'/ 9����/ �� +���+�4$

)� ������ �$ > #������ "$ )$ ��:--�$ � � ������ ���������������� � �� � � ��&��� ������ ��� ��������� ���������� �� � � ������� ���� �2������ ������ ����� �� � � ����� �����������$ ���/ #/ 0�����/�� ,-,�,:�$

)� ���;� P$� "�����;� L$� '�(� �$ > �������� .$ �$ ��::-�$)"/#�� � ����� ������ �� ������� ���� ����? ������ ������ �� �������� ������$ ��/ & �'6� �/ ���/ ��6� ��� 7-7,�7-4=$

)� ��;����� �� #$� T�� � 8$� 0������ � 8$� ���� /$�8����� �$ "$� *������ �$ > ���� #$ ��:::�$.���� ������ �� ���� �������������� �? ������������ �� � �� ������ ������� ��� � � ����� ��� ������ ������$ .30� #/ ��� 4��-�4+�:$

) �������� H$� � ����� /$ > 8��(�� �$ ��::-�$ ������ ��� � ���� � �� ������ �2�� �N� ������ � ��� �������� �� �� ����������� � ��� ��������� ����������� �� ����� �� ������ ������$ 2�$��� ��71+�714$

)����(���� /$� @������ .$� <��� @$ 2$� )��� #$ '$ >0��� /$ P$ ��::��$ .������� ���������� ��� ������������ ���� �B����� �� ���� �������������� �$0�����/ #/ ��� +-,�+:�$

)����(���� /$� '����� �$ !$� <����� /$ .$� 8���;�T$� .�������� �$ 0$� )��� #$ '$ > !����� 0$ �$��::��$ /�������� ����� ��� ������� ��� ��������������� �� � � �� ������ �� ���� ��������������� �$ 8.0� 2������ ���� �:+��:,$

<���� H$ D$� P����� P$� .����� L$� <��� ���� �$� )�� ��)$ P$� *���2����� )$� ��� ��� 0$� �;���(� )$ > '�&�/$ ��:::�$ "�������� �� + #!.N ���������������� ������ ���� �� � +1 (0� ������$#/ 0��'/ &3�� ��� �-���-=$

<����(���� "$ > "������ "$ ��::+�$ 2!./.'� � �� ��������� +0 !"# �&������� �� ������� ����������� ��� ������� ������� ��� � � ��� � ������� ����� ������� �� ������$ #/ 3 -�/ ����/��/ 0� ���� �1���17$

<�� �� �$ @$ > 0���� P$ ��:::�$ ����������� ���������� ������? ������� � � ������ ��������������� �������$ #/ 3'/ 0�'/ ��� +���++�$

<��� 2$ ��:-=�$ ���������������� �������������� 2����������� ��� � �� ������ ������$ ���/ #/0�����/ ��� 7���7�7$

������ �� � � ��� �

;�������� � #�'� ����< ������� �� ������ �� "� ���=� ����< ���$��� "� ���=� ����>