IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE...
Transcript of IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE...
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
MEDIANTE ESPECTROMETRÍA
DE MASAS
MS:¿Cómo surge en biología?•Técnica clásica de análisis:
Determinación muy exacta de la masa de una molécula
•Técnicas de ionización suave: MALDI y ESIPermiten ionización de moléculas grandes, polares y no volátiles (moléculas biológicas)
•Generalización: Avances en:InstrumentosSotfwareFacilidades de uso
J.B.Fenn K.Tanaka
QUÉ ES?Es una técnica analítica que consiste en la producción de
iones en fase gaseosa a partir de moléculas y la posterior determinación de sus masas moleculares.
El resultado es una representación de la abundancia relativa de los iones producidos frente a la relación m/z
ESPECTRÓMETRO DE MASASEs una balanza de precisión de moléculas.
QUE HACE?Determinación muy precisa de masas moleculares
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
699.0 1459.2 2219.4 2979.6 3739.8 4500.0Mass (m/z)
00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
ns
ity
904.48
1296.68
2094.09
2466.191570.64
3659.68
ESPECTROMETRO DE MASAS
CÓMO?Produce iones en fase gaseosa de las moléculas.
Los mueve, y los separa y los selecciona
Los detecta, determinando la relación masa/carga de estos iones.
Ion source: Generación de iones
Mass analyzer: separa los iones
Mass spectrum:Detección y representación
Analito
Espectrometría de masas
• Sensibilidad • Rapidez • Automatización• Economía
ESPECTROMETRÍA DE MASAS:
Conceptos generales:•Definiciones de masa •Resolución•Precisión
Masa y abundancianatural de distintos isótopos
Definiciones de Masa
Definiciones de Masa
”Masa monoisotópica”: suma las masas exactas de los isótopos más abundantes de cada elemento presente,
ej: H = 1.007825, C = 12.000 (por definición).• Medida más precisa• Elegida cuando hay resolución suficiente
Daltons (Da) o unidades de masa (u)
”Masa media”: suma las masas químicas medias de los elementos presentes.
Tiene en cuenta la abundancia natural de cada uno de los isótopos presentes.•No tan exacta, por las variaciones en las abundancias naturales de los isótopos
Masa Monoisotópica
Cuando los isótopos están bien resueltos las masa monoisotópica como la medida más precisa.
Para compuestos que sólo contienen C, H, O, N, S or P, corresponde al pico más pequeño del grupo
Masa Monoisotópica
Masa Media
Masa media
Cuando los isótopos no estan bien resueltos, el centroide de la envuelta de los picos isotópicos en el grupo, corresponde con la masa media
Precisión
Precisión en la medida de la masa: diferencia entre el valor de la masa medida experimentalmente y el valor teórico
• Sólo puede calcularse en compuestos de composición elemental conocida.
•Depende de la calibración y de la reproducibilidad de la medida.
•Puede expresarse como error absoluto, como porcentaje de la masa medida o como partes por millón (ej: 1000 ±0,1 Da, 1000 ±0,01% o 1000 ±100 ppm)
Entrada de
muestra
Ionización
Analizador de Masa
Análisis de masas (selección)
Detector
Detección
Fuente de iones
• Sólido• Líquido
Detecta ionesForma iones(moleculas cargadas)
Separa o Selecciona los ionessegún su masa (m/z)
Componentes de un Espectrómetro de Masas
Procesamiento de datos
Vacío
Rel
ativ
e A
bund
anc e
m/z 1000 2000
Espectro de masas
Datos
Sistema de entrada
Fuente de iones
Analizador Detector Proceso de datos
Sistema de alto vacío
Portamuestras HPLC
MALDIElectrosprayAPIFAB/LSIMSEI, CI
TOFCuadrupoloTrampa de ionesSector MagnéticoFTMS
Placa microcanalMultiplicador de electronesSistemas híbridos
Componentes de un espectrómetro de masas
TÉCNICAS DE IONIZACIÓN UTILIZADAS EN PROTEÓMICA
•MALDI (Karas and Hillenkamp, 1988)
•ESI (Fenn et al., 1989) J.B.Fenn K.Tanaka
ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF: IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE “HUELLA PEPTÍDICA”Matrix-assisted laser desortion-ionization (MALDI).
Time of flight (TOF).
MALDI láser
1. La muestra (A) se mezcla con un exceso de matriz (M) y se seca en una placa portamuestras para MALDI.
2. Flashes de láser ionizan las moléculas de matriz
3. Las moléculas de la muestra se ionizan por transferencia de protones desde la matriz en fase gaseosa:
MH+ + A M + AH+.
AH+
+20 kV
Placa portamuestras
Se forman iones con una sola carga: AH+
Analizador de tiempo de vuelo TOF (time-of-flight)
+
+
+
+
Fuente Tubo de vuelo
det
ecto
r
V• Los iones se forman mediante pulsos de láser.
• Los iones se aceleran mediante la aplicación de un voltaje
• Los iones pequeños llegan al detector antes que los grandes
• Se mide el tiempo que tardan los iones en llegar al detector.
Tubo de vuelo
Detector
Fuente de iones
¿Qué es tiempo de vuelo (TOF)?
20-25 kV
Principio: Si todos los iones son acelerados con el mismo potencial en un punto determinado en el momento inicial, y posteriormente, se les
permite volar, se separarán según sus relaciones masa/carga
KE = 1/2 Mv2KE =energía cinética (=zeV)M =masav= velocidad 2KE/M = v2
Detector20-25 kV
¿Qué es tiempo de vuelo (TOF)?
Tubo de vuelo
Fuente de iones
Vacio: no rozamiento
+
-1000 V -100 V
Primary Ion from Flight Tube
e-
e- e-
e-
L
D= 6 u
e-
~103
Amplification per
MCP
e-
e-
e-e-
e-
e-
to 2nd MCP
Amplificación de la señal en una placa microcanal (MCP)
Identificación de proteínas
Caracterización
automática
Separación
Mezcla de péptidos
Búsqueda en bases de datos
protein ID
digestión
detección
Adquisición de la imagen
Corte
Análisis de imagen
Secuencia “de novo”
ESI-MS/MS
Etiqueta de secuencia
Huella péptica
MALDI-TOF
Huella peptídica
-Aproximación más sencilla a la identificación de proteínas:
Fácil y rápido
-Sólo pueden identificar proteínas depositadas en bases de datos:
GENOMAS SECUENCIADOS
Identificación de proteínas:
Digestión con tripsina
N CR R RPKR K
N C
N
Huella peptídica
Huella peptídica
Espectro de masas característico de cada proteína obtenido al analizar la mezcla de péptidos obtenidos por digestión enzimática (por ej. con tripsina)
Este espectro es comparado con los espectros teóricos calculados de las secuencias proteicas de las bases de datos
Cuando un número adecuado de péptidos coinciden con los péptidos teóricos de una proteína en la bases de datos y cubren un porcentaje adecuado de la proteína: IDENTIFICACIÓN
Digestión de la muestra en el gel
Su buen funcionamiento depende de:
• Evitar contaminaciones• Digerir la proteína eficientemente• Recuperar la mayor cantidad de
péptidos posible• Minimizar las pérdidas por
manipulaciones
Tratamiento de las manchas proteícasDestinción
Reducción y alquilación
Deshidratación
Hidratación con tripsina y digestión
Extracción de los péptidos
¿Concentración y limpieza?
Corte del gel
Seleccionar una matriz
Preparar la matriz
Preparar la muestra
Mezclar la matriz y la muestra (exceso de matriz)
Poner sobre una placa de muestras limpia
Secar
Preparación de la muestra
Selección de la matriz
Ácido Sinapínico Proteínas >10kDa
Ácido α-Cyano-4-hydroxy-cinámico (CHCA)
Péptidos<10kDa
Ácid 2,5-Dihydroxybenzoico (DHB)
Carbohydratos neutros,Polímeros sintéticos
“Super DHB” Proteínas,
Proteínas glicosiladasOligonucleótidos
HABA Proteínas,
Oligosacáridos
Ácido-3-Hydroxypicolínico
α−cyano Ácido Sinapínico Cristales pequeñoscompactos y redondeados
Apariencia de la matriz cristalizada
Cristales romboides ypuntiagudos
Limpieza de las muestras
Eliminar sales procedentes de los tampones, urea, guanidina, EDTA, glicerol, DMSO, detergentes, etc.:•Dilución•Lavado•“Drop dialysis”: Diálisis de gota•Intercambio iónico•Puntas de pipeta con columnas de cromatografías (ZipTips)
Voyager 96x2 Sample Plate P/N V700813
Standard de calibraciónMuestra
Placa portamuestrasPlaca de 96 pocillos de acero inoxidable recubierta de teflón. Disposición de pocillos pàra calibración externa cercana.
•
1. Muestra+matriz se secan en la placa
Time
High voltage
20 - 25 kV
6. Un sistema informático, controla los parámetros del aparato, adquiere las señales/tiempo y procesa los datos
5. Los iones golpean el detector a distintos tiempos, según su relación m/z
4. Los iones son acelerados mediante un campo eléctrico adquiriendo la misma energía cinética. Van atravesando el tubo de vuelo y separándose según su masa
3. Las muestras son irradiadas con pequeños pulsos de láser
2. La placa es introducida en el portamuestras
Tubo de vuelo
Alto vacío
láser
1. Quitar ruido del espectro.
2. Excluir las masas contaminantes.
3. Identificar las masas monoisotópicas.
Procesamiento de datos:
Filtrar los datos de pesos moleculares obtenidos del espectro
Seleccionar los péptidos correspondientes a nuestra proteína
Espectro de MALDIA
bu
nd
anc
ia r
ela
tiv a
Masa (m/z)
1. Quitar ruido del espectro. electrónico: señal-ruidoquímico: iones contaminantes
2. Excluir las masas contaminantes: origen proteíco: queratinas, tripsina
origen no proteíco: matrizpolímerosaductos Na (+22Da) , K
Las contaminaciones dificultan la detección de los iones del analito y pueden llevar a identificaciones erróneas.
3. Identificar las masas monoisotópicas.
Masa monoisotópica
Suma de los pesos exactos de los isótopos más abundantes de cada elemento presente. ej: H = 1.007825, C = 12.000 (por definición).
•Medida más precisa
• Elegida cuando hay resolución suficiente
Aumento de la resolución y de la precisión
• Reflector• Tiempo de retardo
Tubo de vueloReflectorDetector
Fuente de iones
Reflector TOF
20-25 kV
Reflector (Espejo de iones)
Reflector
++ +
Iones de la misma masa tienen diferentes velocidades (por la energía del láser)
1: No hay campo eléctrico, los iones se mueven
2: Voltaje. El gradiente acelera los iones lentos más que los rápidos.
++ +
3: Todos los iones llegan al detector al mismo tiempo
+20 kV
+20 kV
0 V
+++
Tiempo de retardo
AUTOMATIZACIÓN
Análisis a gran escala para la obtención de la huella peptídica
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0
100
%
1619.28968.64
836.58
893.67
1251.93
969.70
970.69
1013.80
1060.23
1061.26
1252.97
1254.00
1570.17
1448.14
2313.69
2312.761621.14
1670.25
1671.24
1672.14
1873.46
1853.38 2019.571876.41
2271.83
2036.57
2314.75
2315.80
2366.83
2367.90
2368.85
2369.91 2718.09
2D Gel
Robot digestor
MALDI-TOF-MS
(modo automático)
Procesamiento automatizado de los datos y búsqueda en las
bases de datos.
Obtención de resultados
Robot que corta las manchas