Introducción a la Espectrometría de Masa Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa en...
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Introducción a la Introducción a la Espectrometría de MasaEspectrometría de Masa
Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masa
en biología y biomedicina
Espectrometría de Masa • La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).
• La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa.
• Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z).
• La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia……
Bioespectrometría
• Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones.
• Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.
Espectrometría de masa y BiologíaEspectrometría de masa y Biología Espectrometría de masa y BiologíaEspectrometría de masa y Biología
Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa:
• Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), para muestras sólidas
• Ionización por “Electrospray” (ESI) para muestras líquidas
Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF
Espectrómetro de masa MALDI-TOF
(Applied Biosystems Voyager DE-PRO)
Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF
(Applied Biosystems 4800 Analizer)
ESQUEMA:
Instrumento de tecnología MALDI-TOF
Camera
Laser
plate
Pumping Pumping
Beam guide
Timed ion selector Reflector
Linear detector
Extractiongrids
Reflectordetector
4000 Series MALDI TOF/TOF™ Analyzer Training
© 2007 Applera Corporation and MDS Inc.7
Analizador de masa TOF
Aceleración post-irradiación
láserRegión de deriva (Tubo de vuelo)
Detector
Iones de masas
diferentes
L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración .
Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.
+20 kV
Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión con tripsina “in gel” de una proteína de membrana de 91 kDa.
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
ElementoElemento MasaMasa %%1H 1.0078 99.9852H 2.0141 0.015
12C 12.0000 98.9013C 13.0034 1.1014N 14.0031 99.63415N 15.0001 0.36616O 15.9949 99.76217O 16.9991 0.03818O 17.9992 0.20031P 30.9738 100.0032S 31.9721 95.0233S 32.9715 0.7534S 33.9679 4.2136S 35.9671 0.02
79Br 78.9183 50.6981Br 80.9163 49.31
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z)
0
3222.3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
ns
ity
Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]
1672.917
Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM)
1672.92
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z)
0
1.6E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
ns
ity
Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]
1672.918
Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM)
Resolución en MALDI-TOF
100
5725 5729 5733 5737 5741 5745Mass (m/z)
0
2093
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% In
ten
sity
Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005]
2xC13
C12
C13
Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 l de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM)
Algunas aplicaciones............
CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
5000 7000 9000 11000 13000 15000
Mass (m/z)
0
6.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% I
nte
nsi
ty
Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367]
12366.46
6187.17
12583.58
12326.17
6292.68
12784.48
Espectro de masa del citocromo c de caballo
A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico
Mapeo peptídico por EM(Peptide Mass Fingerprinting/MS)
MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS
PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW
EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK
SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE
SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL
LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE
PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK
GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED
HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT
proteína intacta enzima
proteolítica
péptidos
1000 1160 1320 1480 1640 1800
Mass (m/z)
0
2.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
ten
sity
Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883]
1168.61
1190.54
1212.53 1433.76
1655.591170.181213.531296.681152.361046.18 1631.621350.70
1478.821124.52 1230.50
1633.82
B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico
Masa Teorica (Da)
Masa Medida (Da)
Error (Da) Residuos Secuencia
1168.61 1168.61 0.00 28-38 TGPNLHGLFGR 1296.71 1296.68 0.03 28-39 TGPNLHGLFGRK 1350.72 1350.69 0.03 89-99 TEREDLIAYLK 1433.77 1433.76 0.01 26-38 HKTGPMLHGGLFGR 1470.68 1470.67 0.01 40-53 TGQAPGFTYTDANK 1478.82 1478.82 0.00 89-100 TEREDLIAYLKK 1478.82 1478.82 0.00 88-99 KTEREDLIAYLK 1633.81 1633.82 0.01 9-22 IFVQKCAQCHTVEK
RESUMEN: Niveles de información……… en la caracterización de proteínas por MS.
• medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental
• medidas de masas en
mapeo peptídico 5-20 valores experimentales
• secuenciado de péptidos
por MS/MS más de 100 valores experimentales
…mejora en cantidad y calidad de la información
El Proteoma es dinámicoEl Proteoma es dinámico
ProteomaProteoma
Drogas
Estado metabólico
EstrésCondiciones ambientales
Estadío de Desarrollo
Interacciones Proteína-Proteína
Control traduccional y post-traduccional
mARN mARN ADNADNGenomaGenoma
Control transcripcional
Análisis por electroforesis 2D
1000 1500 2000
Mass (m/z)
Identificación de proteínas
Selección de la muestraTratamiento con una enzima proteolítica
Separación en gel 2D
Búsqueda en banco de datos
Extracción de péptidos y análisis de masas
m/z
Protein Prospector HomepageMS-Fit Search
ProFound Search for Protein ProFound Search for Protein IdentificationIdentification
Set Kingdom
Enzyme used for digestion
Cys Modificatition(reduced, alkylated)
Set Charge state
Search Result after Peptide Mass Fingerprinting
The result showed that in factthe spot contained 2 proteins.Both were identified,Vimentin and Tubulin.
Up to 5 proteins in the same spot could potentially be identified.
Note that the genomeof CHO-cells (hamster) is not sequenced.Therefore the mosthomologues proteins ofrelated species are scored.
Detailed Search Results View
Identificación de una proteína Identificación de una proteína regulada por hierro en membrana regulada por hierro en membrana externa de externa de Sinorhizobium melilotiSinorhizobium meliloti
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium containing 37 µM FeCl3 (lanes 1 and 2), 500 µM EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µM EDDHA and 4 µM hemoglobin
(lanes 5 and 6), or 500 µM EDDHA and 16 µM hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin.
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein digested in-gel with trypsin obtained by MALDI-TOF mass spectrometry.
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81
Identificación de proteínas por MALDI-TOF
• Proteína aislada• Proteína identificada por la masa de los péptidos
(PMF), generados por un método específico:– Enzimático o químico
• Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos
• La identificación es probabilística: según criterios estadísticos
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
Caracterización de proteínas por espectrometría de masa
362924
20
14
A
B
Pureza/HPLC/GCSFPureza/SDS-PAGE/ GCSF
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF
A
B
28.952 Da
muestra A
Espectro de masa por MALDI-TOF, del contaminante proteico (spot A en gel 2D).
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF
A
B
Electroforesis 2D de la materia prima
Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF
867.0 1191.6 1516.2 1840.8 2165.4 2490.0
Mass (m/z)
0
2.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
Voyager Spec #1=>BC[BP = 1286.8, 20135]
1286
.77
1351
.78
1783
.87
1740
.84
1414
.87
1029
.53
2083
.09
2178
.06
988.
45
2021
.94
1242
.66
1297
.67
1086
.56
MOW
SE Score
#/13(%)
Masses
Matched
% Cov
% TIC
Mean
Err Da
Data Tol Da
MS-Digest
Index #
Protein MW
(Da)/pI
Accession #
Species Protein Name
1 4.709e
+06 13
(100) 60.0
100.0
-0.011
2
0.0358
93727 28949/5.5 999812
M UNREADABLE
gi|999812|pdb|1BTL| Beta-Lactamase Tem1 (E.C.3.5.2.6)
2 4.709e
+06 13
(100) 60.0
100.0
-0.011
2
0.0358
377118 28950/5.3 925716
6 UNREADABLE
gi|9257166|pdb|1CK3|A Chain A, N276d Mutant Of Escherichia Coli Tem-1 Beta-Lactamase
3 3.603e
+06 13
(100) 55.0
100.0
-0.011
2
0.0358
590830 31530/5.7 299595
9 M
EXPRESSION VECTOR PPK113
beta-lactamase
Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN
Digestión tríptica: muestra A
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
Caracterización de proteínas por espectrometría de masa
NO2?
Fosforilación?
Identificación de Modificaciones Postraduccionales
∆ (monoisotopic) modification -17 pyrrolidone carboxylic acid -2 disulfide formation (thiol oxidation) -0.98 amidation 0.98 deamidation 2 disulfide reduction (thiol formation) 14 methylation 16 oxidation (e.g. sulfoxide formation) 28 formylation 42 acetylation 43 carbamylation 44 -carboxyglutamic acid 71 Cys-propionamide 79.9568 sulfation 79.9663 phosphorylation
M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: 645-657 (1999).Delta Mass at http://www.abrf.org
Some modifications are natural.Many are the result of handling.
disulfide vs. two thiolsphosphate group vs. sulfate group good mass spectrometer needed especially with large molecules
Common Protein Post-Translational Modifications
Identificación de sitios de Identificación de sitios de fosforilaciónfosforilación
1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR
PknB de PknB de MycobateriumMycobaterium tuberculosistuberculosis
1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Identificación de dominios
– dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos
Caracterización de proteínas por espectrometría de masa
2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES
pH 3 10pH 3 10 pH 3 10pH 3 10A) B)
Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y no tratados con H2O2 respectivamente
ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA
ProteínaProteína
Alternativamente, secuenciación de
cada péptido
Verificación de secuencia y detección de modificaciones
postraduccionales
.…MS/MS
Espectrómetro de masa
Mezcla de péptidos
Enzima
Masa de los péptidos
Búsqueda en bancos de datos;
Identificación de la proteína
MS/MS
MS/MS+
+
+
+ +
+
1 péptido seleccionado para MS/MS
Espectro MS/MS:masa de los fragmentos
Mezcla de péptidos
Espectro MS
y ionsb ions
Proteínas Funcionales
Secuencia ADN
mARN Proteínas
Control Transcripcional
Control Traduccional
Control post-traduccional
Del Genoma al Proteoma
Algunas propiedades VITALES de las proteínas no pueden ser predecidas de su secuencia de ADN
Proyectos de Proteoma Humano
~40,000 Proteinas
~>1,000,000 Proteinas Variantes
~>5,000,000 Complejos?
APLICACIONES DE LA PROTEOMICA
Estudios de la funcion y organización Molecular de la celula
Descubrimiento de nuevas moleculasblanco de drogas
Descubrimiento de nuevas actividades
Biologicas y drogas
Predecir respuestas individuales a
drogas
Marcadores para diagnostico deenfermedades
Estudio de modo de accion de drogasy toxicidad
Investigaciones enFisiopatologia
La
se
r
Sample Loading Chamber
Ca
me
ra
La
mp
4800 MALDI TOF/TOF™ Analyzer
Schematic
Sample Plate and Stage
Mirrors
Linear Detector
Reflector Detector
2-Stage Mirror
Mirror Deflectors
Decel Deflectors
X2,Y2 Deflectors
X1,Y1 Deflectors
TIS
Collision Cell
Metastable Suppressor
Source 2
Decel Stack
Source 1Source 1 Lens
Lens 1
CID Lens (Lens 2)
Lens 3
Attenuator
Tubo de vuelo
Detector
4-25 kV
Los iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración.
Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.
Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF
(Applied Biosystems 4800 Analizer)
Time-of-Flight Mass AnalyzerSource
Acceleration Drift Region (Flight Tube)Detector
Ions will separate according to their mass-to-charge ratios: light ions accelerated to a higher velocity that heavy ions.
The lighter ions strike the detector before the heavier ions. The time of flight (TOF) can be used to calculate the mass-to-charge ratio.
+20 kV
• Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA). • Datos técnicos:
- Laser de nitrógeno ( 337 nm)- Voltaje de aceleración: hasta 25 kV- Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector)- Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10 -8 Torr)- Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa - Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm)- Sensibilidad (péptidos): subpicomolar
• Posibilidades de operación:- Modo lineal - Modo reflector - "Delay extraction" (DE) - "Post Source Decay“ (PSD) - "Collision-Induced Dissociation“ (CID)