IBS (CEA-CNRS-UJF) HPBP, un marqueur potentiel du risque vasculaire ?
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IBS (CEA-CNRS-UJF)
HPBP,
un marqueur potentiel du risque vasculaire ?
Rappels sur le transport des lipides et
les maladies cardio-vasculaires
Les lipoprotéines
Plusieurs catégories
-chylomicrons
-VLDL
(Very Low Density Lipoprotein)
-LDL
(Low Density Lipoprotein)
-HDL
(High Density Lipoprotein)
alias "bon cholesterol"
intestin
foie
acides grascholestérol
chylomicronTGCE
TGCE
CE
cellule adipeuseou muscle
triglycérides
Cholestérol
triglycérides
Cellulecholestérol
acide gras
cholestérol
acide gras
cholestérol
HDL
TG
CE
VLDL
LDL
Cycle des lipides
L’athérosclérose
1ere cause de mortalité dans les pays à mode de vie occidentale
C’est un dépôt de cholestérol
et de phosphate de calcium qui bouche les artères
Provoque l’infarctus et la thrombose
Le processus est encore mal connu mais implique les LDL oxydées qui sont captées par des macrophages
Découverte de la Human Phosphate Binding Protein (HPBP)
Structure de HPBP
R.Morales et al., Structure (2006)
Essais de cristallisation de HPON1 à partir de lots HPON1 "purs"
Plasmas fournis par le CTS
Structure de HPON chimérique
Harel et al., Nat. Struct Biol (2004)
HPBP est copurifiée avec la paraoxonase (HPON1)
la paraoxonase (38-45 KDa) :- apoprotéine associée aux HDL- protéine hydrophobe - glycosylée- activité arylesterase et phosphotriesterase- hydrolyse les agents neurotoxiques (soman, sarin ..)- la paraoxonase a un rôle antiathérogénique (Souris knock-out)
Rôles physiologiques ?:Activité thiolactone : dégrade l’homocystèineProtège les LDL de l’oxydation…
HPBP est associée avec HPON1 et elles ont la même masse moléculaire
Gel bidimensionnel
Seules des conditions drastiques ont permis de séparer HPBP et HPON1
On parvient à les séparer sur hydroxyapatite
F. Renault et al., J Chrom B (2006)
45kDa
39kDa
HPON1
HPBP
Éch
ange
ur
d’an
ion
hydr
oxya
patit
e
39kDa
45kDa
Immunoprécipitation
phosphate
2 ponts disulfures
Structure SIRAS à 1.9 ÅDérivé coloré fournit par ML. Chesne-Seck
HPBP est similaire aux "Phosphate Solute Binding Proteins" associées aux transporteurs ABC
Boucle 1
Boucle 2
Boucle 3
Boucle 4
HPBP
E. coli PstS protein
M. tuberculosis PstS1
IonsPeptides
…
Binding protein
HPBP est la première "binding protein" détectée chez un eucaryote
Schéma d’un transporteur ABC
HPBP fixe le phosphate
Avec 13 liaisons hydrogènes- affinité submicromolaire (32P)- Spécificité entre phosphate et le sulfate (105)
HPBP est le premier transporteur de phosphate caractérisé dans le plasma
La paraoxonase “pure” est un mulltimèreJosse et al., JBC (2002)
L’oligomérisation du complexe paraoxonase-HPBP dépend de la concentration de phosphate et de calcium
Cela confirme que HPBP est liée au mécanisme phosphocalcique
Poster M. Elias
Localisation physiologique de HPBP
sur la plupart des lipoprotéines
Dans les cellules de foie et d’intestin
HPBP PON
Région hydrophobe
HPBP est une apolipoprotéine hydrophobe
HPBP et génome
HPBP n’a jamais été caractérisée ni prédite par les banques de données génomiques
Initialement HPBP (378 aa) a été séquencée par cristallographie (10% d’ambigüité)
Puis vérifiée par spectrométrie de masse MS/MS (A. Van Dorsselaer).
La complémentarité des deux techniques ont permis de séquencer complètement la protéine sans ambigüité.
Séquençage de HPBP
Attribution à partir de densité
MALDI-MS spectrum of trypsin digest of HPBP
Ambiguities of the crystallographic sequencingAmbiguities of the crystallographic sequencing
Isosteric amino acids
Difficult to discriminate C, N, and O at 1.9Å Discrimination using chemical neighborhood
Very difficult: attribution not reliable : 50%
Possible: attribution reliable: more than 70%
Residues with similar electronic density shapes
Human DING proteinsN-terminus: D I N G G G A T L P Q…
Protein Origin Function
Synovial stimulatoryprotein
Fibroblasts T lymphocyte proliferationEtiology of rheumatoid arthritis?
Hirudin binding protein(leech thrombin inhibitor)
Fibroblasts Cell proliferation
Genistein binding protein(soybean isoflavone with oestrogen activity)
Carcinoma cell culturemedium
Cell proliferation?Apoptosis?
Proteolysis inducing factorreceptor
Muscles and liver(tumors)
Activation of phospholipase A2 : proteasome activation (cachexia)
Crystal (Ca oxalate)adhesion inhibitor (CAI)
Kidney epithelial cells Inhibition of kidney stoneadhesion to epithelial cells
Phosphate binding protein (HPBP)
Plasma (HDL) Involved in phosphocalcicmechanism ?
Les protéines DING sont absentes des banques donnéesElles sont principalement caractérisée que par leurs extrémités N-term
HPBP est la première DING séquencée complètement
Il y au moins 3 protéines humaines absentes du génome séquencé
Autres DING protéines
Protein Origin Functions
Cotinine receptor(nicotine derivative)
Rat: neurones Cotinine receptor
Lipid-free polysaccharide-binding protein
Turkey: “air sac fluid”
Pathogen adhesion to epithelial cells:trigger of defense reactions?
Hepatitis Virus bindingprotein
Woodchuck plasma
?
Macrophage C3R ligand Candida albicansAspergillus nidulans
C3R ligand :« hijacking » of complement system
Germin-Like Protein(GLP) binding protein
Tobacco ?
DING protein Hypericum perforatum(St.John’s wort)
?Inhibits HIV transcription andreplication
Les protéines DING semblent ubiquitaires chez les eucaryotes
Il existe des fragments de gènes de DING
eucaryotes
procaryotes
Absence systématique de HPBP des banques de données nucléotidiques.
Autre mystère : La très grande conservation des séquences partielles nucléotidiques entre des espèces très différentes.
97% d’identité (sur 628 pb)
Les protéines DING sont liées à plusieurs pathologies
Références
Rôles possibles de la HPBPLe phosphate est une molécule très importante impliquée dans de
nombreux mécanismes biologiques.
•HPBP est principalement liée aux lipoprotéine
•HPBP fixe le phosphate
•HPBP est associée à HPON1. modulée par l’environnement phosphocalcique
•HPBP est similaire à la CAIInhibe la formation des calculs rénaux
HPBP peut être impliquée dans les maladies
liées à la phosphatémie telle que l’athérosclérose
Mapping des anticorps polyclonaux
Mapping des anticorps monoclonaux
Très utile pour dévelloper un ELISA "type sandwich"
Etude des cohortes
HPBP et HPON1 un bio-épurateur
Essentielle à la stabilité et la fonctionnalité du complexe paraoxonase-HPBP
Un enjeu pour la prophylaxie et le traitement des intoxications par les agents neurotoxiques.
Paraoxonase : bio-épurateur catalytique.
(responsable de la résistance des mammifères face aux insecticides)
La butyrylcholinesterase : épurateur stoechiométrique.
Production U.S. Army (1 million de dose (200mg) par an) remplacera en 2007 la pyridostigmine.
Production par chèvres transgéniques (Nexia).
Co-exprimer HPON1 avec HPBP
L’étude de cette nouvelle protéine :
• soulève des questions au niveau génétique
• de plus, elle pourrait avoir un intérêt au niveau médical (Maladies cardiovasculaires, arthrite, cancer, HIV).
L’opportunité de travailler avec une protéine inconnue ouvre un large champs d’investigation, autorisant tous
les espoirs.
Conclusions
Remerciements
LCCP,IBS, Grenoble: R. Morales, P. Carpentier, J. Dupuis, C. Contreras,J.C. Fontecilla
IBMP, Strasbourg: F. Bernier
LCM, IBS, Grenoble: M.L. Chesne, R. Kahn, J. Vicat
CRSSA Grenoble: D. Rochu, F. Renaud, P. Masson
LBA, Nancy: M. Nicodeme
LSMBO, Strasbourg: H. dimer, C. Schaefer, A. Van Dorsselaer
FIP, LCM3B
Et bien d’autres ….