Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Hromatografsko određivanje stabilnosti

organofosfornih pesticidnih formulacija

-Master rad-

Mentor: Kandidat:

dr. Blaga Radovanović Zorica Petrović

Niš, Oktobar 2013

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Зорица Петровић

Ментор, МН: Блага Радовановић

Наслов рада, НР: Хроматографско одређиванје стабилности органофосфорних

пестицидних формулација

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Српски

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2013.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО:

(поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

поглавља 6/ страна 42/ табела 1/ слика 9

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Органска хемија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Пестицидна формулација, активна компонента, стабилност

УДК 543.544 : 632.95.028

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Испитивана је стабилност активне компоненте малатиона који

улази у састав органофосфорног комерцијалног пестицида

„Етиол течни“ применом течне (HPLC/DAD ) и гасне (GH/MS)

хроматографије. Под утицајем спољних фактора, односно

условa складиштења долази до делимиче деградације

малатиона и настајањa деградационих производа.

Датум прихватања теме, ДП: 15.01.2013.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник

:

Проф др Александар Бојић

Члан: Проф др Драган Ђорђевић

ментор: Проф др Блага Радовановић

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Accession number ,ANO:

Identification nuber, INO:

Docum

Document type, DT:

Monograph

Type of record, TR: Textual/graphic

Contents code, CC: University master degree thesis

Author, AU: Zorica Petrović

Mentor, MN: Blaga Radovanović

Title, TI: Chromatographic determination of stability of organophosphorus

pesticide formulation

Language of text, LT: Serbian

Lenguage of abstract, LA: English

Contry of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2013.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33

Physical description, PD:

(поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

chapters 6/ pages 42/ tables 1/ pictures 9

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Organic chemistry

Subject/Key words, S/KW: Pesticide formulations, the active component, the stability

UC 543.544 : 632.95.028

Holding data, HD: Library

Note, N:

Abstract, AB: In this study we investigated the stability of the active ingredients

malathion, which became part of the commercial

organophosphorous pesticides "Etiol liquid" by liquid (HPLC /

DAD) and gas (GC / MS) chromatography. Under the influence of

external factors and storage conditions, there is a partial

degradation of malathion and the formation of degradation

products.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2013

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: Prof dr Aleksandar Bojić

Member: Prof dr Dragan Đorđević

Member,Mentor Prof dr Blaga Radovanović

ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Eksperimentalni deo ovog master rada rađen je u istraživačkim laboratorijama

Prirodno-matematičkog fakulteta i u Institutu za javno zdravlje u Nišu.

Iskreno se zahvaljujem svom mentoru, Prof. dr Blagi Radovanović, na pruženoj

pomoći i ukazanom poverenju, kao i na savetima i utrošenom vremenu tokom izrade

eksperimentalnog dela master rada. Veliko hvala na strpljenju i razumevanju.

Takođe, zahvaljujem se Dejanu Nkoliću, dipl. hemičaru na pomoći pri izradi dela

eksperimentalnog rada u laboratoriji Instituta za javno zdravlje.

Zahvaljujem se rukovodiocu DAAD projekta sa Univerziteta u Lajpcigu (Nemačka) dr

E. Hey-Hawkins za stipendiju koja mi je olakšala izradu ovog rada.

Najveću zahvalnost dugujem mojim roditeljima, sestri, vereniku i svim prijateljima

koji su bili tu za mene tokom studiranja i pisanja ovog rada, na njihovo pomoći,

podršci i neizmernoj ljubavi. Najlepše hvala!

Sadržaj

1 UVOD ......................................................................................................................................................... 3

2 TEORIJSKI DEO ........................................................................................................................................... 6

2.1 Istorija razvoja pesticida................................................................................................................... 7

2.2 Toksično delovanje pesticida ........................................................................................................... 8

2.3 Stabilnost i degradacija pesticida ................................................................................................... 10

2.3.1 Degradacija ................................................................................................................................ 12

2.4 Podela pesticida ............................................................................................................................. 15

2.4.1 Insekticidi ................................................................................................................................... 17

2.4.2 Organofosforni insekticidi.......................................................................................................... 19

2.5 Hromatografija ............................................................................................................................... 23

2.5.1 Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC) ................................................................ 24

2.5.2 Gasna hromatografija ................................................................................................................ 26

3 EKSPERIMENTALNI DEO .......................................................................................................................... 29

3.1 Pribor i aparatura ........................................................................................................................... 30

3.2 Uzorci i reagensi ............................................................................................................................. 30

3.3 Priprema radnih rastvora uzoraka ................................................................................................. 31

3.3.1 Pesticidna formulacija Etiol tečni i malation ............................................................................. 31

3.4 UV/VIS analiza ................................................................................................................................ 31

3.5 HPLC analiza ................................................................................................................................... 32

3.6 GH analiza uzoraka ......................................................................................................................... 32

4 REZULTATI I DISKUSIJA ........................................................................................................................... 33

5 ZAKLjUČAK............................................................................................................................................... 39

6 LITERATURA ............................................................................................................................................ 41

3

1 UVOD

4

U svetu se sve veći značaj pridaje ekološki zdravoj ishrani stanovništva čiji je broj u stalnom

porastu. Sa porastom broja stanovnika površina obradivog zemljišta se smanjuje, a zbog zagađenja

dolazi i do opadanja kvaliteta zemljišta, a i hrane. Smanjenje kvaliteta vezano je za neumernu

upotrebu hemijskih sredstava, čime se zemljište zagađuje ostacima pesticida i teškim metalima,

degradira struktura zemljišta ili opada kvalitet roda .

Lista pesticida dozvoljenih za stavljanje u promet i upotrebu utvrđuje se svakih nekoliko

godina. Neki, do tada vrlo poznati pesticidi, ispadaju sa liste. Retko kada se priznaje, da su dotični

pesticidi skinuti sa liste dozvoljenih jer je tokom godina primene na kraju otkriveno da je

kancerogen, mutagen i sl. Nakon toga, proizvodnja se obično obustavlja, ali se neki i dalje radi

novčane dobiti izvoze u siromašne zemlje.

Određjivanje pesticida i njihova stalna kontrola je veoma važna jer se pesticidi razlikuju po

hemijskoj strukturi, načinu delovanja, biotransformaciji, načinu eliminacije iz organizma kao i po

različitom stepenu toksičnosti. Prema podacima koje su objavljene od strane epidemioloških studija,

uticaj dugotrajne izloženosti reziduama pesticida dovodi do pojave malignih oboljenja, alergija i

oštećenja brojnih vitalnih organa. Iz navedenih razloga postoji stalna potreba za razvojem novih,

osetljivih analitičkih metoda za kvantitativno praćenje i određivanje pesticida u biološkom

materijalu i hrani.

Pod pesticidima se podrazumevaju proizvodi hemijskog ili biološkog porekla koji su

namenjeni zaštiti značajnih biljaka i životinja od korova, bolesti, štetnih insekata, grinja, plesni i

drugih štetnih organizama.

Pod štetnošću se podrazumeva ekonomska šteta ljudima, poljuprivredi i industriji – smanjenje

prinosa ili količine – kvaliteta dobijene hrane. Svako korišćenje pesticida sa sobom nosi negativne

posledice na ekosistem u kome se primenjuje i okolne ekosisteme. Smanjenje upotebe pesticida je

jedan od temelja održive poljoprivrede i održivog razvoja.

Iako je upotreba pesticida kritikovana, naročito u poslednjim decenijama, mnogi proizvođači i

korisnici pesticida ukazuju na činjenicu da su hemikalije bile presudni faktor koji je omogućio

poljoprivredi da u određenoj meri održi korak sa problemom gladi u svetu. Postoji još nekoliko

velikih problema sa kojima bi se čovečanstvo suočavalo, da nije upotrebe pesticida:

Prinos useva bi se smanjio za više od 30% bez korišćenja pesticida,

Stočni fond bi se smanjio za 25%

Cena hrane bi se povećala za 50-75%

5

Korišćenjem pesticida su mnoge bolesti koje prenose insekti, poput tifusa, malarije, žute

groznice i encefalitisa, stavljene pod kontrolu. Procenjeno je da je upotrebom samo DDT-ja

spašeno preko 25 miliona ljudi od bolesti i gladi, a životni vek u Indiji je produžen za 15 godina.

Malarija je još uvek veliki problem u mnogim zemljama, pa godišnje umiru milioni ljudi od ove

bolesti. Zato se, pre upotrebe ovih sredstava, moraju uzeti u obzir dobre strane, ali i svi rizici koje sa

sobom ta upotreba nosi.[1]

Mnogobrojni su izveštaji Svetske organizacije za poljoprivredu i hranu (FAO) i Svetske

zdravstvene organizacije u kojima se otvoreno priznaje da u pogledu pojedinih pesticida mnogo

toga ostaje nejasno čak i posle dobijanja dozvole za upotrebu i puštanje u promet. Tako, na primer,

delovanje klofentezina na ljudsko zdravlje i dalje je nepoznat. Koristi se, ali se zbog mogućeg

štetnog dejstva preporučuju dodatna, naknadna istraživanja ... a on se i dalje nalazi u svakodnevnoj

upotrebi.

Da mehanizam delovanja pesticida na ljudsko zdravlje još uvek nije sasvim razjašnjen

najbolje potvrđuje činjenica da se dozvoljena karenca i toleranca razlikuju u propisima pojedinih

zemalja.

Hemijska metoda zaštite useva (upotrebom pesticida) daleko je najzastupljenija mera.

Konvencionalnu poljoprivrednu proizvodnju danas je nemoguće zamisliti bez upotrebe pesticida.

Takva, hemijska zaštita bilja, nosi sa sobom niz negativnih propratnih pojava.[2]

Cilj ovog master rada je ispitivanje komercijalnog preparata koji se koriste za zaštitu bilja u

poljoprivredi Etiol tečni, odnosno prisustvo aktivne supstance malationa. Ispitivanje je vršeno

tečnom i gasnom hromatografskom metodom uz dodatne spektrofotometrijske provere apsorbance.

6

2 TEORIJSKI DEO

7

2.1 Istorija razvoja pesticida

Istorija korišcenja pesticidnih sredstava veoma je duga. Sumpor je korišcen u Kini još

hiljadite godine pre nove ere kao fungicidno sredstvo, a u Evropi je primenjen kao fungicid tek

1800. godine. Ekstrakt lista duvana je korišćen 1690. godine kao insekticid. Bakar-sulfat je 1882.

godine uveden u zaštitu vinove loze, a 10 %-ni rastvor sumporne kiseline je na početku XX veka

služio za uništavanje nekih vrsta korova.

Prva generacija ''pravih pesticida'' imala je kao osnovu teške metale (živa, bakar, olovo,

arsen i dr.), odnosno mineralna ulja i sumpor.

Druga generacija pesticida, započela je sa sintezom organo-sintetičkih pesticida.

Treću, najnoviju generaciju pesticida, proizvođači su nazvali ''biopesticidi'', iako nemaju

nikakve veze za organskom ili biološkom poljoprivredom. Vrlo često to su proizvodi biološkog

inženjeringa - genetskih modifikacija mikroorganizama i oni se u ekološkoj poljoprivredi ne koriste.

Prava „nauka“ o pesticidima nastala je neposredno pre i za vreme II svetskog rata

zahvaljujuci razvoju organske hemije. Tridesetih godina dvadesetog veka, hemijska industrija je

naročitu pažnju posvetila mogućnosti korišćenja novosintetisanih jedinjenja u borbi sa štetočinama i

bolestima biljaka. Prvu grupu sintetisanih pesticida činila su organofosforna jedinjenja, a zatim

organohlorna, karbamatna i druga jedinjenja.

Organohlorna i organofosforna jedinjenja, kao i karbamati predstavljaju najznačajnije

insekticide pomoću kojih je prvenstveno vođena borba protiv insekata. Bez pesticida moglo bi se

izgubiti trećina svedskih useva svake godine zbog delovanja raznih štetočina, korova i bolesti.

Primena pesticida pomaže u povećanju proizvodnje hrane bilo uništavanjem štetočina, korova ili

pak produžavanjem trajanja hrane. Međutim upravo iz tog razloga postoji i opravdana briga o

njihovom mogućem štetnom delovanju na ljude i okolinu; i upravo zbog toga postoji stroga kontrola

u njihovoj proizvodnji i korišćenju.

Pesticidi se u modernom značenju te reči koriste širom sveta više od 70 godina, tačnije od

1943.g. kada je započela komercijalna proizvodnja DDT-a, jednog od najpoznatijeg pesticida.

Međutim i u antičkom svetu čovek je poznavao i koristio neka sredstva kao što je duvan da bi

zaštitio svoje useve od štetočina. U XIX veku sa sigurnim poznavanjem biljnih bolesti i štetočina,

počinje razvoj sredstava za zaštitu bilja. Polovinom XIX veka već se znalo i korišćeni su nikotin,

piretrin, rotenoidi a primenjivan je i petrolej i cijanovodonična kiselina.[1]

8

Pre nove ere

1000 Homer pominje supor kao sredstvo protiv insekata

100 Rimljani primenjuju ekstrakt biljke Helleborus odorus protiv glodara

25 Virgilije opisao zaštitu semena

Posle nove ere

900 Kinezi koriste arsen u kontroli baštenskih insekata

1300 Marko Polo opisuje upotrebu mineralnih ulja

1669 Prvi put se pominje arsen u zapadnom svetu koji se pomešan sa medom koristio protiv

mrava

1690 Ekstrakt duvana

1773 Paljen duvan i dimom zaprašivana polja

1787 Sapun kao insekticid

1874 Zeidler sintetisao DDT

1892 Olovo-arsenat prvi put korišćen u Masačusetsu

1922 Kalcijum-cijanid se komercijalno koristi

Prvo zaprašivanje iz vazduha (pamuk)

1927 Postavljene granične vrednosti za arsen u jabukama u SAD

1936 Pentahlorfenol

1938 Prvi organski pesticid pronašao Schrader

1939 Otkrivena insekticidna svojstva DDT – Miller u Švajcarskoj

1941 Upotreba prvog insekticida u obliku aerosola

1943 Prvi ditiokarbamatni pesticid (cineb) počinje da se komercijalno koristi

1942/43 Zaprašivanje stanovnika Napulja protiv prouzrokovača tifusa (DDT)

2.2 Toksično delovanje pesticida

Brojni su slučajevi trovanja ljudi hemijskim sredstvima za zaštitu bilja, ali i trovanja

životinja i poljoprivrednih useva. Do trovanja ljudi pesticidima dolazi na više načina – kroz usta,

kožu, putem disajnih organa. Životinje se pesticidima najčešće izlažu konzumiranjem tretiranih

biljaka, dok se biljke oštećuju neposredno tokom nanošenja pesticida. Čak i kada ne izazivaju

akutna trovanja, pesticidi su opasni jer imaju sposobnost nakupljanja u tkivima ljudi i životinja – i

to najviše u masnom tkivu, jetri i bubrezima.

9

Štetni efekti pesticida posledica su neracionalne i nestručne upotrebe, rukovanja ili čuvanja

kao i zloupotrebe. Pri tom su žrtve ljudi, životinje i životna okolina. Neadekvatnom hemizacijom

poljoprivrede uspostavljeno je već danas stabilno kruženje pesticida i njihovih degradacionih

proizvoda u životnoj sredini. Kao posledicu nalazimo pesticide i njihove rezidue u hrani. Nađeno je

da više od polovine uzoraka hrane sadrži nedozvoljene visoke koncentracije rezidua pesticida .

Toksičnost pesticida je jedna od važnih osobina koja karakteriše delovanje nekog pesticida

na živi organizam. Ona uglavnom zavisi od sposobnosti delovanja pesticida na različitim

konstituentima ćelije koji igraju važnu ulogu u biohemijskim i fiziološkim procesima. Sam pojam

otrovnosti-toksičnosti često se pogrešno shvata. Tako je švajcarski fizičar Paracelsus je potvrdio da

toksični efekti neke supstance zavise od doze.

Za svaki pesticid postoji izvesna količina ispod koje taj pesticid u organizmu ne prouzrokuje

dejstva koja se na današnjem nivou metodike mogu registrovati. Ova količina se naziva granična

količina.

Dopušteni dnevni unos (ADI) je kao veličina nastala na bazi doze bez efekta. Ona

predstavlja onu količinu pesticida koja se može unositi u organizam čoveka u toku dužeg

vremenskog perioda bez oštećenja organizma.

Kad se želi izraziti otrovnost pesticida na čoveka i razne vrste drugih organizama koristi se

letalna doza i govori se o srednje letalnoj dozi LD50. Ona predstavlja količinu toksične supstance

izraženu u mg/kg telesne težine tretiranih organizama koja izaziva 50 % smrtnosti. [1]

Zbog različite brzine razgradnje pesticidi se u manjoj ili većoj meri nagomilavaju u

zemljištu. Degradacija pojedinih pesticida može trajati 5 do 10 godina (primer DDT-a čiji su ostaci

pronađeni i posle 20 godina), što zavisi od geološkog sastava zemljišta, načina obrade, vlažnosti,

temperature.

Hemijska kontaminacija hrane i vode potiče od nenamernih ljudskih aktivnosti (tzv.

antropogena kontaminacija) i iz prirodnih izvora. Putem vazduha, iz zemljišta, zagadenih

vodotokova u hranu može dospeti veliki broj zagadivača koje emituju industrijska postrojenja i

izduvni gasovi motornih vozila. Smatra se da preko hrane i vode za piće u organizam dospeva

najveći broj hemijskih zagadivača životne sredine čak oko 90%.

10

Slika 1. Putevi dospevanja pesticida u sve delove životnog okruženja, takođe i u lanac iskrane

2.3 Stabilnost i degradacija pesticida

Pesticidi su neizostavni deo životne sredine, jer se usled intezivne primene njihovi ostaci

često detektuju u prirodi. Bez obzira na koji način oni dospeju, njihova dalja sudbina zavisi od

mnoštvo faktora.

Fizičko-hemijski procesi koji se odvijaju u prirodi imaju veliki uticaj na razgradnju, bilo da

je reč o pesticidima koji se nalaze u vodi, atmosferi, zemljištu ili živim organizmima. Što se tiče

fizičkih procesa transformacije pesticida u prirodi, najbitniji su sedimentacija, adsorpcija i

isparavanje, a kada je reč o hemijskim najvažniji procesi su oksidacija, redukcija, hidroliza i

fotoliza.

Slika 2. Procesi koji određuju sudbinu pesticida u zemljištu

Pesticid

zemljište

vazduh

voda

Zemljini beskičmenjaci

biljke

Fito i zooplakton

herbivore

Akvatični

živi svet

karnivore i

omnivore

11

Molekuli pesticida različito reaguju na unutrašnje i spoljašnje parametre, što se odražava na

stabilnost samog jedinjenja. Unutrašnji uticaj se javlja pri dužem čuvanju jer su pojedini pesticidi

nestabilni i menjaju strukturu pri dužem stajanju, i usled razlaganja ili polimerizacije, gubi bitne

hemijske karakteristike.

Zbog toga se ovakvim pesticidima dodaju razna hemijska jedinjenja tzv. stabilizatori, radi

usporenja navedenih procesa. Mnogi pesticidi imaju visok stepen stabilnosti za vreme čuvanja u

optimalnim uslovima ali promenom spoljašnjih uslova čuvanja (temperature, pritiska, ili kiseonika,

pH, svetlosti), za neke od pesticida stabilnost molekula se drastično smanjuje, skoro do tog stepena

da postaju neaktivni i neupotrebljivi.

Prema stabilnosti molekula pesticida u uslovima spoljašnje sredine se mogu podeliti na:

veoma stabilne (vreme razlaganja na netoksične komponente duže od 2 godine)

stabilne (vreme razlaganja na netoksične komponente od 6 meseci do 2 godine)

srednje stabilne (vreme razlaganja na netoksične komponente od 1 do 6 meseci)

slabo stabilne (vreme razlaganja na netoksične komponente kraće od mesec dana).[6]

Na osnovu stepena akumulacije u organima toplokrvnih životinja pesticidi se

mogu podeliti na:

pesticide visokog stepena akumulacije (koeficijent akumulacije manji od 1)

pesticide izraženog stepena akumulacije (koeficijent akumulacije između 1 i 3)

pesticide srednjeg stepena akumulacije (koeficijent akumulacije između 3 i 5)

pesticide slabo izraženog stepena akumulacije (koeficijent akumulacije veći od 5).

Količine pesticida koje se trajno zadržavaju na tretiranim biljkama označavaju se kao rezidualne

količine pesticida.

Prema definiciji WHO rezidui predstavljaju zaostale količine aktivne supstance, njene metabolite i

nečistoće u namirnicama i vodi za piće (mnogi metaboliti mogu biti toksičniji od polazne aktivne

supstance, kao što je to, npr. slučaj sa paraoksonom – metabolitom parationa. Količina rezidua

pesticida u namirnicama, tlu,vazduhu, vodi zavisi od njihove perzistencije.

Perzistencija predstavlja vreme zadržavanja nekog pesticida u prirodnoj sredini i ona zavisi od:

12

hemijskih (osetljivost prema hidrolizi, oksidaciji, svetlosti),

fizičkih (rastvorljivost u vodi, lipidima, napon pare),

bioloških (površina i priroda biljke) i

metereoloških faktora.

Perzistentnost i kretanje pesticida u prirodnim uslovima takođe zavise od konstante apsorpcije tla (

Koc ) i vreme poluživota u zemljištu DT50 ( ili oznakom t1/2 ) a to je vreme koje je potrebno da se

razgradi 50% pesticida od početne koncetracije. Konstanta apsorpcije tla ( Koc ) zavisi od

apsopcionog koeficienta Kd i udela organskog ugljenika u zemljištu w(OC). Adsorpcioni koeficient

Kd se definiše kao odnos koncentracije pesticida adsorbovanih za zemljište (Cs) i koncentracije

pesticida u zemljišnom rastvoru (Ce) .

100)(OCw

KdKoc

Ce

CsKd

Cs i Ce se obično izražavaju kao u jedinicama (g/g) a Kd, Koc i w(OC) su bezdimenzionalne

veličine.

Peticidi mogu biti zagađujuće supstance i podzemnih voda ukoliko je njihov sorpcioni koeficient

nizak, a vreme poluraspada dugo i imaju visoki stepen rastvorljivosti u vodi. Ovaj proces se često

dešava jer su pesticidi uglavnom polarna jedinjenja hidrosulubilni i termolabilni čime se umanjuje

njihova toksičnost i olakšava uklanjanje iz životne sredine.[5]

2.3.1 Degradacija

Pod degradacijom pesticida se podrazumeva razgradnja molekula ovih jedinjenja do koje dolazi

usled hemijskih, fotohemijskih i mikrobioloških transformacija.

Fotodegradacija predstavlja proces razlaganja pesticida pod dejstvom sunčeve svetlosti, pri čemu

ona zavisi ne samo od intenziteta svetlosti, već i od karakteristika zemljišta, vegetacije i fizičko-

hemijskih osobina pesticida.

Fotohemiske reakcije se mogu odvijati u vazduhu ili vodi, ali samo kada je prisutno Sunčevo

zračenje. Najčešće se velike količine pesticida gube isparavanjem u atmosferu i zatim razgrađuju

13

pomoću dva glavna degradaciona puta. Prvi su fotohemiske reakcije koje su izazvane sunčevim

zračenjem, a drugi su reakcije izazvane slobodnim radikalima. Produkti koji su na ovaj način

formirani mogu ali i ne moraju da budu toksičniji od polazne komponente.

Sunčeva svetlost može se posmatrati kao energija fotona koji imaju talasnu prirodu. Molekuli mogu

apsorbovati tu energiju što može izazvati raskidanje hemijskih veza. Energija koja je potrebna da se

raskinu hemijske veze u molekulu pesticida obično iznosi od 70-120 kcal/mol što odgovara

talasnim dužinama zračenja između 290-400 nm ( UV oblast ). Deo Sunčevog svetlosnog zračenja

pripada ovom opsegu talasnih dužina, koji je bitan za fotodegradaciju pesticida.

Svetlost može izazvati fotolizu ( raskidanje hemiskih veza ) nekih molekula u vazduhu pa onda oni

stupaju u reakciju sa pesticidima. Najčešće su to O3, NO2, OH i O2. U ovom slučaju dolazi do

stvaranja slobodnih radikala koji su nestabilni i ukoliko se dovoljno njih formira, reaguju brzo sa

molekulima pesticida i na taj način utiču na njihovu degradaciju.

Mikrobiološka degradacija je transformacija molekula pesticida do CO2 , H2O i drugih neorganskih

jedinjenja pod dejstvom zemljišnih mikroorganizama. Ona u velikoj meri zavisi od stepena

adsorpcije molekula pesticida, jer se odnosi samo na slobodnu (nevezanu) frakciju molekula.

Hemijska degradacija predstavlja razlaganje molekula pesticida mehanizmima u koje nisu

uključeni živi organizmi. Tip i brzina hemijske transformacije, stepen adsorpcije molekula

pesticida, pH vrednost, temperatura, vlažnost i sastav zemljišta, su glavni faktori koji utiču na

stepen hemijske degradacije. Najzastupljeniji tipovi hemijske degradacije molekula pesticida u

zemljištu su hidroliza i redoks reakcije.

Kako se fotohemijska transformacija pesticida odvija isključivo na površini zemljišta, i kako je njen

doprinos ukupnoj transformaciji najmanji, većina istraživanja je usmerena na proučavanje hemijske

i mikrobiološke degradacije. Mikrobiološka degradacija pesticida je dominantnija od hemijske u

površinskom sloju zemljištama. Međutim, kada pesticid napusti biološki aktivnu zonu korenovog

sistema, tj. prodre u dublje slojeve zemljišta, broj mikroorganizama se značajno smanjuje, tako da

dominantnu ulogu preuzimaju hemijski procesi.

Vreme poluraspada (vreme poluživota) se definiše kao vreme potrebno da koncentracija pesticida

opadne na polovinu od početne vrednosti, i označava se sa DT50 (dani).

Degradacija pesticida u zemljištu se obično opisuje kinetikom reakcije I reda:

c(t) = co exp(- kt)

14

gde su: c(t) i c0 (mg/kg) - početna, tj. koncentracija pesticida nakon vremena t (dani); k - konstanta

brzine degradacije (dan-1

).

Ukoliko se uzme da se i hemijska i mikrobiološka degradacija nezavisno odvijaju po kinetici

reakcije I reda, ukupna degradaciona konstanta se može predstaviti kao zbir hemijske (kc) i

mikrobiološke degradacione konstante (k), k=kc+kf,. Doprinos hemijske, odnosno mikrobiološke

degradacije ukupnoj degradaciji pesticida se može odrediti na osnovu inkubacionih eksperimenata

sa prirodnim i sterilisanim zemljištem. Naime, kako se ovi ogledi izvode u strogo kontrolisanim

laboratorijskim uslovima (zadate vlažnosti i temperature), osim degradacije, svi ostali procesi koji

doprinose ukupnom iščezavanju pesticida (isparavanje, spiranje, ispiranje, usvajanje biljkama) se

mogu isključiti iz razmatranja. Sterilisanjem zemljišta, mikrobiološka degradacija se takođe

isključuje, tako da će u sterilnom zemljištu biti zastupljena samo hemijska degradacija (k), dok će u

prirodnom (nesterilisanom) zemljištu biti zastupljene i hemijska i mikrobiološka degradacija (k).

Temperaturna zavisnost degradacije se obično opisuje jednačinom Arrhenius-ovog tipa

RT

EaADT exp50

gde su: DT50(T)- vrednost za datu temperaturu (K); A - Arenijusova konstanta (dan); Ea - energija

aktivacije (J/mol); R - univerzalna gasna konstanta (8,314 J/Kmol).

Istraživanja ukazuju da brzina degradacije raste sa temperaturom. Izvesna, pak, istraživanja ukazuju

da temperatura ima veliki uticaj na brzinu degradacije za pesticide koji imaju DT50>100 dana, za

razliku od pesticida sa DT50<20 dana čija degradacija slabo zavisi od temperature .

Generalno se smatra da sorpcija ograničava degradaciju pesticida, što se objašnjava smanjenjem

njegove koncentracije u vodenoj fazi. Sorbovana jedinjenja su slaba hrana mikroorganizmima koji

preferiraju jedinjenja iz rastvora. Ovaj fenomen je najizraženiji u zemljištima sa visokim sadržajem

organske materije i/ili gline, zbog pojačane adsorpcije pesticida. Treba imati u vidu da zemljišna or-

ganska materija može poslužiti i kao alternativni izvor ugljenika i azota mikroorganizmima koji

učestvuju u degradaciji pesticida, i na taj način pesticid može biti delimično sačuvan od

degradacije.[5]

pH vode je kritični faktor efektivnosti mnogih pesticida i regulatora rasta. Mnoge substance su

najaktivnije kada se promešaju sa vodom koja je kisela (niža pH vrednost) dok su druge substance

aktivnije u neutralnoj ili vode veće pH vrednosti. Pesticidi poput organofosfornih, karbomata,

hlorovanih uglovodonika, podležu reakcijama hidrolize, što prouzrokuje njihovo raspadanje sa

15

pH>7. Što više alkalija ima u vodi to se pesticidi brže razlažu. Hidroliza je jako izražena kada je pH

veće od 8 i 9. Povećanjem pH vrednosti za jednu jedinicu brzina hidrolize se povećava 10 puta.

Brzina i obim reakcije zavisi od toga koliko su pesticidi podložni hidrolizi, dužinom

vremena koje pesticid provede u vodi (pH > 7) i temperature. Primer, ako sadržaj pesticida u boci

ostene nekoliko sati ili preko noći dok se sadržaj ne iskoristi, može se izgubiti čak i 50% aktivnih

sastojaka.

Mnogi istraživači ukazuju na pozitivan uticaj porasta pH vrednosti na ukupnu mikrobiološku masu i

aktivnost, iako se mikrobiološka degradacija smanjuje kada pH postane veći od 8,5. Degradacija ve-

likog broja neutralnih pesticida je brža u zemljištima sa većim pH vrednostima. U slučaju pesticida

koje karakterišu kisela ili bazna svojstva, jačina sorpcije generalno opada sa porastom pH vrednosti

zemljišta, zbog čega i dostupnost molekula za degradaciju raste.

Što se tiče uticaja početne koncentracije pesticida na njegovu degradaciju, jasna zakonitost još uvek

nije utvrđena. Postoje rezultati koji ukazuju i na pozitivnu i na negativnu korelaciju degradacije i

početne koncentracije pesticida.

2.4 Podela pesticida

Pesticid predstavlja svaku supstancu ili smešu supstanci organskog, neorganskog i prirodnog

porekla, koja se primenjuju u poljoprivredi, šumarstvu, veterinarstvu, prehrambenoj industriji i

komunalnoj higijeni koja ima za cilj da spreči, uništi ili kontroliše štetočina, uključujući i neželjene

vrste biljaka ili životinja tokom:

proizvodnje,

skladištenja,

transporta,

distribucije i pripreme hrane.

U ovu grupu jedinjenja spadaju i regulatori rasta biljaka, defolijanti,desikanti, inhibitori klijanja

itd.

Pesticidi se koriste protiv:

prouzrokovača biljnih bolesti (500 virusa, 10000 vrsti gljivica)

16

štetnih insekata, (10000)

nematoda-glodara, ptica

za suzbijanje korova

za regulisanje rasta biljaka

za uništavanje štetočina i gljivica u uskladištenim namirnicama

za uništavanje insekata i drugih prenosilaca uzročnika zaraznih bolesti ljudi i životinja, kao i

parazita kod ljudi i životinja

Stoga se pesticidi mogu podeliti na one koji suzbijaju štetočine životinjskog porekla (zoocidi), i

one koje suzbijaju štetočine biljnog porekla (fitocidi).

Zoocidi se dalje dele na:

insekticide (koji suzbijaju insekte, a mogu biti biljnog ili organsko-sintetskog porekla)

akaricide (sredstva za suzbijanje grinja)

nematocide (sredstva za suzbijanje nematoda)

limatocide (sredstva za suzbijanje puževa)

rodenticide (sredstva za suzbijanje glodara)

karvicide (sredstva za odbijanje ptica)

Fitocide delimo na:

fungicide (sredstva za suzbijanje gljivica)

herbicide (sredstva za suzbijanje korova).

Oštra granica između pojedinih grupa pesticida ne postoji, jer pojedini pesticidi mogu

istovremeno da deluju na više različitih štetočina.

Veliki broj pesticida pripada grupi heterociklicnih jedinjenja. U njima su pored ugljenikovih

atoma zastupljeni i atomi azota, sumpora, kiseonika.

Takođe u sastav ovih pesticida ulaze atomske grupe (-NH2, -NH, -CO, -COOH, -NO2, -OH, -

CH3, -CH2 i dr.) i ove grupe određuju pripadnost pesticida klasi organskih jedinjenja.

Postojanje azota u nekim pesticidima u obliki nitrozo (-NO) i nitro (-NO2) grupe daje ovim

jedinjenjima karakter otrova sa izraženim delovanjem.[3]

Na osnovu hemijskog sastava pesticidi se mogu podeliti na organske i neorganske.

17

Organskim pesticidima pripadaju:

organofosfati

karbamati

tiokarbamati

ditiokarbamati

halogeni derivati ugljovodonika

sintetski piretrini

aromatična nitro jedinjenja

derivati uree i tiouree

derivati fenoksisirćetne kiseline

derivati alifatičnih karbonskih kiselina

ftalimidi

triazini

triazoli

jedinjenja dipirididina

jedinjenja žive

U grupu neorganskih pesticida spadaju:

soli bakra,

soli sumpora,

hlorati,

fosfidi,

talijum-sulfat,

barijum-sulfidi,

jedinjenja fluora,

jedinjenja arsena,

jedinjenja žive.

2.4.1 Insekticidi

Insekti predstavljaju čovekov problem od davnina, jer mu uništavaju namirnice, uništavaju

poljoprivredne kulture, mogu da napadaju i čoveka i domaće životinje izazivajući različita oboljenja

18

i ugrožavaju zdravlje ljudi. Iz tih razloga, u današnje vreme, kad je prinos najvažniji kriterijum i

imperativ proizvodnje, čovek vodi intenzivnu borbu, u kojoj, kao u svakoj borbi, ,i sam trpi

posledice.

Insekticidi prema specificnom dejstvu na pojedine faze razvića insekata se dele na:

ovicide (za suzbijanje jaja insekata)

larvicide (za suzbijanje larvi insekata)

adulticide (za suzbijanje odraslih insekata)

Prvi insekticidi koji su se pojavili bila su neorganska jedinjenja olova, bakra, arsena i sumpora.

Bordo mikstura (bakar-sulfat i kalcijum-hidroksid) se sporadično i danas koristi. Olovo-arsenat se

još uvek negde koristi protiv krompirove zlatice, pošto ne zaostaje u samom krompiru.

Pb(NO3)2 + H3AsO4 → PbHAsO4 + 2HNO3

Prvi insekticidi su obuhvatali i prirodna organska jedinjenja, poput nikotina, piretrina i

rotenona.

Primenjivan je i petroleum i njegove frakcije. Ovim proizvodima se priključuju, takođe, i

arsenovi preparati, danas skoro napušteni u mnogim delovima sveta, usled sporog biološkog

razlaganja, kao i cijanovodonična kiselina, koja se primenjuje još, prvenstveno, u zatvorenom

prostoru.

19

Tokom 1950-ih druga generacija insekticida beleži značajan rast a obuhvata 3 velike grupe:

hlorovane ugljovodonike, organofosforna jedinjenja i karbamate.

Veliki značaj u domenu insekticida dobili su i radovi Gerharda Schradera, otpočeti

polovinom tridesetih godina ovog veka, na istraživanju organofosfornih jedinjenja, čiji ie vrhunac

predstavljao pronalazak parationa, 1944. godine.

Dalja istraživanja ove grupe insekticida dala su i mnoge druge proizvode s jakim

delovanjem, koji su po univerzalnosti dejstva i ekonomičnosti proizvodnje ostali u senci parationa.

Među organofosfornim insekticidima, poznata su od 1950. godine i jedinjenja sa

sistematskim delovanjem, koja biljkama pružaju unutrašnju terapijsku zaštitu.[2]

2.4.2 Organofosforni insekticidi

Istraživanje organofosfornih insekticida otpočelo je pre više od sto godina, a naročito veliki

zamah beleži se poslednje četiri decenije, kad su ova jedinjenja dobila i ogroman praktični značaj.

Među značajnim ispitivanjima u ovoj oblasti je sinteza tetraetil-pirofosfata (TEPP), koju je

izveo Moschnin 1850. godine.

Interes za organofosforna jedinjenja je porastao pred drugi svetski rat, kad je Schräder sa

saradnicima sintetizovao veći broj ovih jedinjenja od kojih su neki bili predviđeni i kao, eventualni,

bojni otrovi.

Brojna ispitivanja insekticidnih svojstava ovih proizvoda radi praktične primene, s ciljem

suzbijanja insekata, nisu ni dan-danas lišene mogućnosti primene i u ratne svrhe.

Hiljade sinteza i ispitivanja organofosfornih jedinjenja bile su potrebne radi dobivanja

proizvoda s najpovoljnijim osobinama. Potrebno je bilo utvrditi efikasnost prema raznim štetnim

biološkim agensima različitih kultura u zavisnosti od razvojnog stadijuma, klimatskih uslova,

20

problema rezistencije, načina primene i toksičnosti prema toplokrvnim životinjama i drugim

korisnim organizmima.

Toksikološki značaj ovih jedinjenja je veliki, naročito u oblasti poljoprivrede, radi suzbijanja

štetnog delovanja insekata na biljke, kao i usled toksičnog delovanja organofosfornih jedinjenja na

čoveka, pri čemu je poseban problem njihovo zadržavanje u namirnicama.[1]

X,Y,Z - alkil grupa, amidna grupa,aril grupa,alkoksi grupa, kiselinski

ostatak,fenolna, enolna grupa, CN, F

Prema Schrederu da bi neko organsko jedinjenje fosfora bilo biološki aktivno treba da ima:

1. kiseonik ili sumpor koji su vezani dvostrukom vezom za petovalentni fosfor

2. X i Y (R i R1) grupa predstavljaju radikale koji su vezani za fosfor preko kiseonika (alkoksi -

OR), preko azota (amido -NR2 ili direktno alkil -R, aril-Ar)

3. acil (Z ) grupa je uglavnom anjon neorganske ili organske kiseline (F, CN, SCN, RCOO ) kao i

neki kiselinski ostatak (enol grupa ili merkapto grupa).

Organofosforna jedinjenja su, najčešće, tečnosti, ređe čvrste supstance, s povećanim

naponom pare, usled čega deluju putem inhalacije, a mogu se izdvajati iz organskog materijala

povlačenjem vodenom parom. Ukoliko nemaju hidrofilne grupe, slabo su rastvorljiva u vodi, ali,

ipak, dovoljno da bi rastvor bio toksičan. Organofosforna jedinjenja su nerastvorljiva u petroletru,

ali su dobro rastvorljiva u mnogim organskim rastvaračima, kao i u mastima, što omogućuje

njihovo prodiranje kroz kožu.

U odnosu na druge insekticide, ova jedinjenja imaju prednost: u zemlji su nestabilna, u

alkalnoj sredini se, relativno, brzo razlažu na netoksične proizvode, usled čega se neznatno

zadržavaju u biljkama, a i nestaju iz kontaminiranih proizvoda.

P

O

XY

Z

21

Neka od organofosfornih jedinjenja, međutim, stabilna su u alkalnoj sredini a nestabilna u

kiseloj sredini (na primer, diazinon). Hemijska struktura organofosfornih jedinjenja je slična; mogu

se smatrati derivatima fosforne kiseline, a njihovo delovanje se svodi na inhibiciju holinesteraze, s

tim što im je toksičnost različita.

Osnovno delovanje ovih jedinjenja, kod sisara, svodi se na inhibiciju enzima

acetilholinesteraze, usled čega dolazi do nagomilavanja acetilholina. Fiziološka uloga prave

holinesteraze je u katalitičkom delovanju, u hidrolizi acetilholina na holinergičnim sinapsama.

Ozbiljnost trovanja organofosfornih jedinjenja, pored stepena inhibicije acetilholinesteraze,

zavisi i od brzine inhibicije; pri stalnom izlaganju parationu — hronićno trovanje može doći do

progresivnog smanjenja aktivnosti holinesteraze za oko 25% od početnih vrednosti, bez pojava

kliničkih znakova trovanja. Isti stepen inhibicije holinesteraze, ali tokom samo nekoliko časova,

može, međutim, da dovede do teških simptoma trovanja.[2]

2.4.2.1 Malation

Slika 3. Strukturna formula malationa

Sistematsko ime: Dietil 2-[(dimetoksi fosfortiol)sulfonil]sukcinat

Mogućnost adicije dialkilditiofosfornih kiselina na nezasićena jedinjenja dovela je do sinteze

malationa, koji je nastao iz dimetilditiofosforne kiseline i dietilestra maleinske kiseline.

22

Sintetizovao ga je 1950. godine American Cyanamid Co., kao probni insekticid s oznakom

T.M.4049, a od 1953. godine poznat je kao malation. Nezavisno od ovog, sintetizovan je u

Sovjetskom Savezu 1952. godine i nazvan karbofos. Spada među najpoznatije organofiosforne

insekticide.

Isparljivost malationa, pri sobnoj temperaturi, relativno je visoka, te deluje i u gasovitom stanju.

U zatvorenoj staklenoj, polietilenskoj ili ambalaži od nerđajućeig čelika, stabilan je, čak, i pri

svetlosti.

Malation je prvi ditiofosforni estar, koji je u praksi našao primenu. Insekticid i akaricid s

kontaktnim, digestivnim i slabijim inhalacionim delovanjem našao je primenu u poljoprivredi,

šumarstvu i oblasti higijene. Najznačajniju primenu malation nalazi kao sredstvo za suzbijanje

lisnih vašiju i pregalja (deluje samo na pokretne oblike) a u suptropskim i tropskim predelima kao

sredstvo za suzbijanje voćnih insekata. Malationom se zaprašuju i prskaju žitarice, mahunasti

plodovi i semenje — već pri samoj žetvi, a i pri utovaru i istovaru u transportnim sredstvima, zatim,

skladištima i silosima; ovim se zalihe obezbeđuju, više meseci, od štetnog delovanja insekata. Kao

komercijalan proizvod može se kupiti u obliku tečnog ili praškastog etiola. Etiol tečni je kontaktni

insekticid za primjenu u staklenicima, plastenicima, na otvorenom i u skladištima. Djeluje

kontaktno, respiratorno i digestivno. Karenca: za krastavac u polju 7 dana, jabuka i lisnato povrće

21 dan.

Slika 4. Komercijalni proizvod „Etiol tečni“

Malation spada u slabe inhibitore holinesteraze i slabo je toksičan. U poređenju s parationom

inhibitorno delovanje na holinesterazu mozga miševa, in vitro, iznosi oko 1,7% od aktivnosti

parationa. Njegova relativno visoka toksičnost za insekte i slaba za homeoterme (organizmi koji

23

imaju sposobnost održavanja stalne telesne temperature a tu spadaju ptice,gmizavci i sisari)

objašnjava se metabolizmom; proizvod metabolizma kod insekata je vrlo toksičan malaokson, jak

inhiibitor holinesteraze, dok su proizvodi metabolizma kod homeoterma biološki mnogo manje

aktivni.

Postojeći podaci o eventualnoj štetnosti preparata malationa, koji se aplicira na kožu kao i

primena 1% malationa u obliku praha, protiv vašiju kod čoveka, pokazuju da ne dovodi do štetnih

posledica. Propisana primena preparata malationa za uništavanje insekata u zatvorenim

prostorijama — aerosol — smatra se, prema postojećim podacima (ispitivanjem na ljudima i

životinjama ) bezopasnom.

2.5 Hromatografija

Pod hromatografijom se danas podrazumeva skup analitičkih metoda za analizu uzoraka,

koji su po svojoj prirodi smeše komponenata, čija hemijska priroda može biti slična, ali i vrlo

različita. Pod analizom ovakvih uzoraka se do skora podrazumevalo samo razdvajanje uzorka-

smeše na njene sastavne komponente, ali je uvodenje najsavremenijih tipova detektora proširilo

osnovno značenje hromatografije.

Danas hromatografske metode služe ne samo za pročišcavanje složenih uzoraka, vec i za

analizu razdvojenih komponenti smeše.

U zavisnosti od tipa raspodele hromatogarfija se deli na:

1. Tečno-tečna hromatografija

2. Tečno-čvrsta hromatografija

3. Hromatografija zasnovanu na razmeni jona

4. Gel hromatografija

1. Tečno-tečna hromatografija ili podeona hromatografija ima tečnu stacionarnu fazu koja je

različitog sastava od tečne mobilne faze i međusobno se ne mešaju. Razdvajanje molekula

se zasniva na raspodeli izmenu dve tečne faze.

2. Čvrsto-tečna ili adsorpciona hromatografija ima čvrstu stacionarnu fazu koja se sastoji od

čestica velike površine i tečnu mobilnu fazu.Razdvajanje molekula je zasnovano na

različitom vezivanju za stacionarnu fazu.

24

3. Hromatografija zasnovana na razmeni jona (ion-exange chromatography) – stacionarna

faza sadrži funkcionalne grupe kao što su SO3-

zajedno sa suprotno naelektrisanim jonima

(npr. Na+) koji su normalno prisutni u mobilnoj fazi u formi soli. Zadržavanje molekula koji

ima X+ vrši se na principu razmene jona:

X+ + -SO

3-Na

+ Na

+ + SO

3-X

+

4. Gel hromatografija ima kolonu pakovanu sa poroznim materijalom koji ima odrenenu

veličinu pora. Molekule veće molekulske mase će prolaziti kroz kolonu dok će se manje

zadržavati.

Pesticidi se u svetu odredjuju u različitim uzorcima (voću, povrću, vodi, vazduhu, zemljištu kao i u

biološkim materijalima) mnogim metodama. Od analitičkih metoda najviše se koriste

hromatografske- HPLC i GC.

2.5.1 Tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC)

Tečna hromatografija pod visokim pritiskom - HPLC (High Presure Liquid Chromatography) ili

se još i naziva tečna hromatografija visokih mogućnosti (High Performance Liquid

Chromatography) jer visoki pritisak omogućava kontinuiran protok mobilne faze i uspostavljanje

„kvalitetne“ dinamičke ravnoteže sa stacionarnom fazom, koja je uslov dobre selektivne raspodele

komponenti datog uzorka .

Slika 5. HPLC aparat Agilent 1200

HPLC hromatografija je doživela nagli uspon u poslednjih dvadeset do trideset godina i sa

sigurnošću se može reći da predstvalja vodeću istraživačku tehniku, i to ne samo među podeonim

25

hromatografijama nego i u svim hromatografijama uopšte. HPLC hromatografija uglavnom rešava

većinu problema vezanih za razdvajanje velikih bioloških molekula.

U zavisnosti od svoje hemijske strukture, sastojci smeše pokazuju veću ili manju sklonost da

se zadržavaju na nepokretnoj fazi, tako da provode različito vreme u koloni.

Posle toga sledi njihova detekcija u obliku električnog signala (pomoću odgovarajućeg

detektora), pri cemu se dobija hromatogram-kriva zavisnosti jačine signala od vremena. Površina

zavisnosti direktno je zavisna od koncentracije jedinjenja, a njegov položaj na hromatogramu -

vreme zadržavanja, određen je fizičko-hemijskim svojstvima jedinjenja. Površina zavisnosti

direktno je zavisna od koncentracije jedinjenja, a njegov položaj na hromatogramu - vreme

zadržavanja, određen je fizičko-hemijskim svojstvima jedinjenja.

HPLC aparat se sastoji od rezervoara mobilne faze, pumpe, injektora, kolone, detektora i računara.

Slika 6. Struktura aparat

Glavni deo aparat je kolona. U zavisnosti od cilja analize koriste se analitičke i preparativne

kolone. Postoje kolone različitog prečnika i veličine zrna u zavisnosti od namene. Najčešće su

ispunjene silikatnim česticama, koje igraju ulogu nosača, a na njihovoj površini je hemijski vezan

tanak film molekulskih dimenzija, koji igra ulogu tečne stacionirane faze.

Mobilnu fazu predstavlja rastvarač ili smeša rastvarača. Koristi se : voda, metanol,

acetonitril itd, pojedinačno ili u smeši HPLC čistoće. Korišćena mobilna faza treba da je što više

UV/VIS transparentna, mada nije znatnija apsorpcija mobilne faze ne utiče značajnije na kvalitet

razdvajanja. Mnogo je bitnije da se pre injektiranja uzorka u sistem postigne što je moguća bolja

26

fazna ravnoteža u koloni, odnosno nalaženje što optimalnijeg protoka mobilne faze. Eluiranje može

biti:

-izokratsko: sastav mobilne faze se ne menja tokom trajanja analize

-gradijentno: sastav mobilne faze se menja tokm eluiranja.

Na brzinu eluiranja utiče pH, zbog mogućnosti promene polarnosti supstance. Zbog toga se često u

mobilnu fazu dodaju puferi. Kolone za RP-HPLC ne bi trebalo koristiti sa jakim bazama, zbog

mogućnosti razgradnje silikatnih čestica.

Na osnovu hromatograma može se saznati sledeće:

- koliko komponenata sadrži analizirana smeša (na osnovu broja signala)

- kolike su koncentracije pojedinih sastojaka (kvantitativno na osnovu relativne površine signala)

- koja su jedinjenja prisutna (kvalitativna analiza na osnovu vremena zadržavanja tr )

2.5.2 Gasna hromatografija

Razdvajanje komponenata iz smeše gasnom hromatografijom zasniva se na razlici u

koeficijentima raspodele između stacionarne tečne i mobilne gasovite faze (gas nosač). Tehnika se

primenjuje samo za ona jedinjenja koja se nalaze u gasovitom stanju, ili se pogodnim metodama

mogu prevesti u gasovito stanje.

U zavisnosti od vrste primenjene nepokretne faze, gasna hromatografija se deli na

hromatografiju gas – čvrsto (Gas Solid Chromatography GSC) i hromatografiju gas – tečnost (Gas

Liquid Chromatography GLC).U oba slučaja kolona je napunjena apsorbensom ujednačene

krupnoće (silika gelom, aluminijum oksidom, aktivnim ugljem, molekulskim sitima itd.)na kojima

se jedinjenja razdvajaju putem selektivne apsorpcije. Kod hromatografije gas-tečnost nepokretna

faza je kapilarni sloj tečnosti ravnomerno raspoređen po inertnom nosaču( pakovane kolone) ili po

unutrašnjem zidu kolone( kapilarne kolone). Do razvijanja dolazi usled različitih rastvorljivosti para

ispitivanjih jedinjenja u datoj tečnoj fazi. Ovaj vid hromatografije primenjuje se samo za analizu

svih jedinjenja koja se mogu bez degradacije prevesti u parno stanje.

Osobine gasa nosača utiču na efikasnost razdavajanja, vreme analize i osetljivost detektora,

pa se njegovom odabiru posvećuje velika pažnja. Bitno je da sve karakteristike gasa nosača ostanu

konstantne (što je moguće više) tokom kretanja kroz aparaturu. Gas struji kroz kolonu i sa sobom

nosi uzorak u gasovitom stanju. Pri proticanju se, zbog različitih koeficijenata raspodele,

komponente iz smeše razdvajaju i kao takve dospevaju u detektor .

27

Kao gasovi nosači koriste se: helijum, azot, argon i vodonik, ređe ugljen-dioksid, kiseonik i

vazduh. Gasovi moraju biti permanentni, hemijski inertni prema analitima, malog viskoziteta, niske

cene i odlikovati se velikom čistoćom (99,99%).

Prilikom gasno gromatografske analize preko injektora se u kolonu sa mikro špricem

ubacuje tačno poznata zapremina uzorka (zapremina je izražena u mikrolitrima (µL)). Dalju ulogu

nosioca preuzima gas-nosač, koji uzorak prenosi kroz kolonu. Protok gasa nosača je i dalje stabilan

ali uzorak se razlaže na sastavne delove zbog različitih adsorpcionih sposobnosti pojedinih

komponenti uzorka. Povećanjem dužine kretanja pojedinih komponenti kroz kolonu, povećava se i

distanca izmedju njih, tako da u idealnom slučaju, prilikom izlaska uzorka iz kolone i stizanja do

detektora, sve komponente uzorka su jasno razdvojene i svaka posebno nailazi na detektor. Pomoću

detektora i vremena izlaženja se identifikuje svaka pojedina komponenta i koncentracija svake u

datom uzorku. [16]

Delovi gasnog hromatografa su: bica sa nosećim gasom, ventil regulator pritiska, injektor,

peć regulator temperature, kolona, detektor, monitor ili štampač.

Slika 7. GH/MS aparat Agilent Technologies

Po izlasku iz kolone, razdvojena jedinjenja prolaze zajedno sa nosećim gasom kroz detektor

gde se registruje kao električni signal čiji su intenziteti proporcionalni njihovim koncentracijama u

nosećem gasu. Ovi signali se pojačavaju i beleže pisačem u zavisnosti od vremena. Kriva

zavisnosti jačine signala od vremena naziva se gasni hromatogram. U uslovima kada je postignuto

dobro razdvajanje svaki signal (maksimum) u gasnom gromatogramu odgovara jednom hemijskom

jedinjenju i okaraktersan je vremenom zadržavanja ( retencionim vremenom) i površinom.

28

Vreme zadržavanja nekog jedinjenja predstavlja vreme koje protekne od ubrizgavanja smeše

do pojave maksimuma njegovog signala. Ono je pod datim radnim uslovima ( temperatura kolone,

protok nosećeg gasa, veličine kolone, količina tečne faze itd.) karakteristično za to jedinjenje i

primenjenu tečnu fazu. Istovremeno površina signala nekog jedinjenja proporcionalana je njegovoj

koncentraciji. Prema tome budući da gasni gromatogram pruža podatke o broju komponenti u smeši

( na osnovu broja maksimuma), kao i o njihovoj prirodi (često je moguća potpuna identifikacija

nepoznatog jedinjenja na osnovu retencionog vremena), ova metoda nalazi veoma široku primenu u

kvantitativnoj i kvalitativnoj analizi.

29

3 EKSPERIMENTALNI DEO

30

3.1 Pribor i aparatura

Snimanje uzoraka je vršeno na:

Apsorpcioni spekti uzoraka su snimljeni na aparatu UV/Vis spektrofotometar 8453 Agilent

sa kivetom dužine optičkog puta 1 cm;

Za HPLC analizu je korišćen visokoefikasni tečni hromatograf, HPLC (High Performance

Liquid Chromatography) system Agilent 1200, sa kvaternernom pumpom G1354A,

automatskog injektora G1329A, termostatirane kolone G1316A, Eclipse XDB-C18 (4,6 mm

x 150 mm), UV/Vis DAD dedektora G1315D;

Za GH analizu je korišćen gasni hromatograf sistem Agilent Technologies 6890N (Network

GC System) sa MS detektorom Agilent Technologies 5875C , kolona Model J&W 122-5532

DB 5ms

Primenjen je microMed vodeni sistem TKA GmbH za dobijanje demineralizovane vode i

Analitička vaga Mettler Toledo AB-204-S za odmerivanje uzoraka.

Korišćen je sledeći pribor:

- Laboratorijske čaše, 50,100, 250 i 400 ml

- Normalni sudovi, 10, 50 ml

- Menzure,50 i 100 ml

- Pipete,2 i 5 ml i propipete

- Automatske pipete

3.2 Uzorci i reagensi

Prilikom izrade ovog rada korišćen je komercijalni proizvod Etiol tečni, nabavljeni u

poljoprivrednoj apoteci.

Od reagenasa korišćeni su: malation (Sigma, Aldrich, Nemačka), acetonitril (ACN), etanol, n-

heksan, dihlormetan i H3PO4 , analitički čisti .

31

Hemijski čist malation je tečnost, skoro bez boje, sa slabim mirisom, dok je tehnički proizvod

žute do tamnokestenjaste boje, neprijatnog mirisa.

Tačka topljenja + 2,85°C

Tačka ključanja pri 0,05 mm Hg 96°C, pri 0,5 mm Hg 136°C

Napon pare pri 20°C 1,25x10-4

mm Hg, pri- 30°C 3,2x10-4

mm Hg

Isparljivost pri 20°C 2,26 mg/m3, pri 30°C 5,60 mg/m3

Rastvorljivost u voda, pri soibnoj temperaturi, 145 mg/l.

U većini organskih rastvarača lako se rastvara, izuzev u petroletru.

3.3 Priprema radnih rastvora uzoraka

3.3.1 Pesticidna formulacija Etiol tečni i malation

Za kvantitativno određivanje malationa u Etiol tečnog napravljeni su sledeći radni rastvori:

A) Izmereno je 0.0682 g preprata koji se rastvara u 10 ml smeši rastvarača n-heksana i

dihlormetana (80:20) i meša 15 min u ultrazvučnom kupatilu;

B) Ista masa preparata je rastvorena u 10 ml smeši rastvarača n-heksan i aceton (4:1).

Supstanca malationa koncentracije 1,73 μg/ml, takođe je rastvorena u smeši rastvarača n-heksan i

dihlormetan (80:20) . Nakon toga je izvršeno injektirane u HPLC aparatu.

.

3.4 UV/VIS analiza

UV/VIS spektri malationa i Etiola tečnog su snimljeni u smeši rastvarača n-heksan/dihlormetan

(80:20) i u acetonitril /voda ( 50:50).

32

3.5 HPLC analiza

Snimanje HPLC dijagrama aktivne komponente i pesticidna formulacija je izvršeno primenom

sledećih radnih uslova:

-Mobilna faza acetonitril i voda u različitim odnosima.

- Temperatura od 25 do 40 oC;

- Talasna dužina DAD detektora: 200, 210, 220, 230 i 250 nm;

- Zapremina injektiranja od 5 do 20 µl;

- Protok mobilne faze bio je konstantan i iznosio je 1ml/min i

- Vreme snimanja od 7 do 15 min.

3.6 GH analiza uzoraka

Snimanje GC dijagrama izvršeno je primenom sledećih radnih uslova:

- noseci gas He

- temperatura 50 oC 2min

- temperatura 20-280 oC 20min

- protok 0.8 ml/min

- MS detektorom Agilent Technologies 5875C , kolona Model J&W 122-5532 DB 5ms

33

4 REZULTATI I DISKUSIJA

34

Kao što nam je poznato komercijalni pesticidni preparati u poljoprivrednim apotekama se

čuvaju pod različitim uslovima, ne uvek preporučljivih od strane proizvođača. I to, umesto

skladištenje da bude na tamnom i hladnom mestu, oni su izloženi po izlozima i rafovima na

temperaturi do 40 0C, što nije preporučljivo. Zbog toga, cilj ovog rada je bio da izvršimo analizu

aktivne supstance u najčešće upotrebljenim pesticidnim formulacijama dostupnim u

poljoprivrednim apotekama , primenom hromatografskih metoda.

Da bi smo hromatografski ispitali uticaj spoljnih faktora na stabilnost komercijalnog

pesticida, najprije smo izvršili snimanje UV/VIS spektara malationa i ‚‚Etila tečnog‚‚, da bismo

izabrali talasne dužine.

UV spektri su snimljeni u istim smešama kako što će biti eluirani u HPLC aparatu, kao što

je dato u Eksperimentalnom delu i pokazuju apsorpcioni maksimum na 210 nm.

Analiza HPLC/DAD rezultata je pokazala da malation, pod našim eksperimentalnim

uslovima ima retenciono vreme 2,65 min .

Takođe, utvđeno je da smeša rastvarača A: n-heksan/dihlormetan u odnosu 80:20 se

pokazala kao odgovarajuća za oba ispitivana uzorka u poređenju sa smešom rastvrača B: ACN/voda

u donosu 55:45. Takođe, i eluent u mobilnoj fazi ACN/voda u odnosu 70:30 je izvršio bolje

razdvajanje nego ista smeša u odnosu 55: 45.

Na slici 8. je prikazan hromatogram Etiola tečnog na 220 nm snimljenog primenom mobilne

faze ACN/voda (70:30), protokom od 1 mL/min, na konstantnoj temperaturi od 25 0C i

injektovanom zapreminom od 5 µL. Iz hromatograma može da se vidi da pored aktivne komponente

malationa prisutne su i druge komponente kao što je prikazano u sledećoj tabeli:

Tabela 1. Hromatografski pikovi u HPLC dijagramu za pesticidne formulacije „Etiol tečni“

Retenciono vreme

(min)

Hromatografski

pikovi (A) (%)

Hromatografski

pik ovi (B) (%)

1,38 1,56 1,56

1,53 3,08 3,09

2,65 80,68 77,63

2,86 12,18 15,23

3,02 2,49 2,49

35

U svim ispitianim rastvorima pokazalo se da pored aktivne komponente malationa prisutne

su i druge supstance čija se koncentracija menja u zavisnosti od vremena čuvanja i snimanja HPLC

dijagrama, što se vidi iz različitih procentnih vrednosti dobijenih hromatografskih pikova(na

retencionim vrednostima 1,38 min u vrednosti od 1,56%, na 1,53 min vrednost od 3,09%, na 2,86

min u vrednosti od 12,18% i na 3,02 min 2,49min). Ovo nam ukazuje da je došlo do delimična

degradacija aktivne komponente i nastajanje nekih degradacionih proizvoda, kao što je prikazana na

sedećoj slici:

Slika 8. HPLC/DAD dijagram insekticida „Etiol tečnog“ u smeši n-heksan/dihlormetan

Identifikacija malationa u pesticidnoj formulaciji Etiol tečni je izvršena upoređivanjem

retencionih vremena analita standardnog jedinjenja i samog uzorka pesticida, a potvrđena je

apsorpcionim spektrima čiste aktivne komponente i pesticidne formulacije. Pokazalo se da su

apsorpcioni spektri identični, što ukazuje da je pik od iste supstance .

Dobijena vrednost sadržaja malationa u pesticidnoj formulaciji Etiol tečni se menja u

zavisnosti uslova čuvanja i snimanja hromatografskih dijagrama. U deklarisanom komercijalnom

proizvodu nalazimo podatak da prisustvo aktivne komponente malation iznosi 95%. Međutim, naša

analiza je pokazala da pored aktivne komponente prisutne su i druge nepoznate supstance, čije se

koncentracija menja u zavisnosti od uslova skladištenja kao i vremena snimanja dijagrama, kao što

36

je prikazano u tabeli 1. Ovo nas navodi da pretpostavimo da je došlo do izvesnih degradacionih

transformacija aktivne komponente unutar pesticidne formulacije i nastajanje nepoznatih

degradacionih proizvoda.

Poznato je da organofosfatni pesticidi podležu prirodnoj degradaciji koja se u najvećoj meri

odigrava putem homogene i heterogene hidrolize. Hidroliza se dešava na nekoliko reaktivnih

centara u molekulu, homogenim mehanizmom gde se H2O i OH– (ređe H

+) ponašaju kao nukleofili,

zbog čega ova reakcija jako zavisi od pH vrednosti i najefikasnija je u jako baznoj sredini. Prisustvo

rastvorenih metalnih jona, mikroorganizama i drugih jedinjenja prisutnih u zemljištu povećava

brzinu hidrolize.

Heterogene površine (oksidi gvožđa i aluminijuma i različite gline) takođe mogu ubrzati

proces hidrolize obezbeđujući mesta na površini na kojima nukleofil i organofosfat reaguju . Kako

molekuli organofosfata imaju maksimum apsorpcije u UV oblasti (220–310 nm), svetlost može

indukovati njihovu degradaciju koja se može odigrati direktnom ili indirektnom fotolizom.

U direktnoj fotolizi molekul apsorbuje UV svetlost i zatim reaguje sa jedinjenjima u okolini

ili se sam razgrađuje. Indirektna fotoliza je češća i prouzrokovana je kiseonikom i hidroksi ili

peroksi radikalima, koji nastaju fotolizom organskih ili neorganskih jedinjenja. Organofosfatni

insekticidi (najveći broj komercijalnih formulacija su tio organofosfati sa P=S grupom), mogu lako

da se oksiduju do oksona usled prisustva prirodnih oksidanata i UV svetlosti. Smatra se da se

oksidacija odigrava putem oksidativne desulfuracije napadom OH• radikala na tiono grupu ili preko

oksidativnog mehanizma koji se odigrava direktno na molekulu tio organofosfata. Oksoni su u

poređenju sa tio jedinjenjima polarniji, rastvorljiviji u vodi i manje se adsorbuju na zemljištu.

Znatno su jači inhibitori AChE, a neki su postojaniji u životnoj sredini od tio analoga.

Tako da fotolitičkom i termičkom oksidacijom malationa nastaje mnogo tosičniji

malaokson, mono i dikarbonske kiseline: [1]

37

(CH3O)2P S CH COOC2H5

CH2 COOC2H5

S

malation

COOC2H5CH2

COOC2H5CHSP(CH3O)2

O

malaokson

O

(CH3O)2P S CH

CH2 COOC2H5

COOH i

S

CH2

COOC2H5CHSP(CH3O)2

COOH

CH2

CHSP(CH3O)2

O

COOH

COOH

Daljom razgradnjom nastaju:

(CH3O)2P

S

OH ;

HS CH

CH2 COOC2H5

COOC2H5

; (CH3O)2P

O

SH ;

(CH3O)2P

O

OH

38

Takođe, izvršena je analiza komercijalnog pesticida Etiol tečni gasnom hromatografijom primenom

GH/MS aparatu pod uslovima kao što su dati u Eksperimentalnom delu. GH dijagram je prikazan na

slici:

Slika 9. GH/MS hromatogram pesticidne formulacije‚‚Etiol tečni‚‚

Analiza ovog dijagrama je pokazala da ovaj proizvod snimljen nakon mesec dana od snimanja

HPLC dijagrama ukazuje na još veče degradacije aktivne komponente. Prisustvo malationa je

nađeno na retencionom vremenu od 12,64 min i iznosi 74,73% od početne koncentracije. Ovaj

podatak potvrđuje da je izvršena termooksidaciona degradacija aktivne komponente u

komercijalnom proizvodu.

39

5 ZAKLjUČAK

40

Kako je cilj ovog rada bilo ispitivanje stabilnosti komercijalnog pesticidnog preparata „Etiol

tečni“ koji se najčešće koristi za zaštitu bilja u poljoprivredi, odnosno prisustvo aktivne supstance

malationa primenom hromatografskih metoda, izvršena su snimanja uzoraka uzetih iz različitih

poljoprivrednih apoteka u Nišu na HPLC/DAD i na GH/MS aparatima koji su pokazali da način

skladištenja i čuvanja, odnosno povećanjem spoljne temerature u toku letnjeg perioda i pod

dejstvom svetlosti došlo je do delimične degradacije aktivne komponente malation i nastajanje

nekih drugih proizvoda. Identifikacija nastalih proizvoda nije bilo moguće izvršiti u toku ovog rada,

ali je preporuka za dalja istraživanja.

Možemo zaključiti da je način skladištenja i čuvanja pesticidnih formulacija u

poljoprivrednim apotekama bitan za delovanje njihovih aktivnih komponenata.

41

6 LITERATURA

42

1. D. R. Soldatović i saradnici, Toksikologija pesticida s analitikom, Privredni pregled,

Beograd, 1980.

2. V. Janjić, Mehanizam delovanja pesticida, Akademija nauka i umetnosti Republike

Srpske, Banja Luka, 2009.

3. A. Stanković, Fitofarmacija, Društvo za zaštitu bilja SR Srbije, Beograd, 1972.

4. M. Zlatanović, M. Jovanović, D. Djordjević, S. Vučinić, Brzo simultano određivanje

organofosfornih pesticida u humanom serumu i urinu metodom tečne hromatografije

sa masenom spektrometrijom, Vojnosanitetski pregled 67/ 9 , 717, 2009

5. R. Đurović, Procesi koji određuju sudbinu pesticida u zemljištu, Pestic. fitomed. 26/1,

9-22, 2011

6. T. Stamenković, M. Petrović, T. Andjelković, A. Zarubica,Pesticidi – Fotoliza i

fotokataliza‚ Hemijski pregled, 54/ 3, 66, 2013.

7. N. Tiwari, A. Asthana, A Catalytic Kinetic Spectrophotometric Determination of

Organophosphorus Pesticides in Vegetable Samples, J. Braz. Chem. Soc., 23/2, 322-

327, 2012

8. M. Čolović, D. Krstić, V.Vasić, A. Bondžić, G. Ušćumlić, S. Petrović

‚‚Organofosfatni insekticidi: toksični efekti i bioanalitički testovi za evaluaciju

toksičnosti tokom procesa degradacije, Hem. Ind. 67/2, 217–230, 2013

9. C.K. Jain I. Ali, Determination of pesticides in water, sediments and solid by gas

chromatography, Intern. J. Environ. Anal. Chem., 68 83-101, 1997

10. S.C.N Queiroz, K. Lazou, P. Sandra, I.C.S.F. Jardim, Determination of pesticides in

water by liquid chromatography –(elktrospray ionization)- mass spectrometry (LC-

ESI-MS), Pesticides: R. Ecotox. Meio Ambiente 14, 53-60, 2004

11. http://www.golictrade.com/proizvod/etiol-tecni-82