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MACROPROLACTINEMIA: EXPERIENCIA EN SCREENING Y CONFIRMACIÓN CON CROMATOGRAFIA DE FILTRACIÓN EN GEL
XVI Congreso Uruguayo de Patología Clínica
Montevideo, 08 noviembre 2016
José Gilberto H. Vieira Professor Afiliado, Disciplina de Endocrinologia, EPM/UNIFESP
Médico Assessor, Grupo Fleury
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AGENDA DE LA PRESENTACIÓN
• Formas Circulantes de la Prolactina
• Ensayos para la Medida de Prolactina Sérica
• Concepto de Macroprolactinemia
• Influencia de la presencia de Macroprolactina
– Importancia Clínica
• Métodos de Pesquisa y cuantificación de Macroprolactina
• Resumen y Conclusiones
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FORMAS CIRCULANTES DE PROLACTINA
• Formas Glicadas – Cromatografia de afinidad
• Formas que varian de acuerdo con el peso molecular: – Monómeros – Dímeros – Macroprolactina
• Identificación – precipitación selectiva – Presencia de IgG – Definición por Cromatografia
de gel filtración
0 10 20 30 400
10
20
30
40
V0
tubo (mL)P
rl n
g/m
L
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HIPERPROLACTINEMIA INDUCIDA POR EL USO DE MEDICACIÓN
• Causa comun de hiperprolactinemia
• Drogas relacionadas: – Antipsicotrópicos (neurolépticos, bloqueadores del
receptor de Dopamina): fenotiazidas
– Antidepresivos: tricíclicos, tetracíclicos, inhibidores de la recaptura de serotonina
– Opiáceos y cocaína
– Bloqueadores del canal de cálcio (Verapamil)
– Metoclopramida, Domperidone
– Estrógenos
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ESTRES E HIPERPROLACTINEMIA ESTUDIO DE LA RESPOSTA DE 157 INDIVÍDUOS SELECCIONADOS CON PRL >40 g/L
SUBMETIDOS A REPOSO DE 30 MIN ANTES DE LA COLECTA DE NUEVA MUESTRA Y RE-DOSEA MIENTO DE PROLACTINA
Sin Reposo Con Reposo 0
25
50
75
100
"no respondedores"
"respondedores"
Pro
lact
ina
g
/L
74,5%
25,5%
Vieira JG, et al. Arq Bras Endocrinol Metab 50 ;569-70, 2006
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QUE ÉS MACROPROLACTINA?
• Predominancia en circulación de formas de Prolactina de alto peso molecular
• Prolactina ligada a una proteína cargadora o un receptor solúble? Agregados?
• Prolactina ligada a la IgG – Anticuerpo anti-prolactina? – Ligación no-específica?
• Por que la concentración total de prolactina es, en general, elevada en pacientes con macroprolactinemia? – Media-vida prolongada – Formas monoméricas “libres” en cantidad normal
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CONCEPTO DE ENSAYO INMUNOMÉTRICO (NO COMPETITIVO) ACTUALMENTE EMPLEADO EN RUTINA
DIAGNÓSTICA PARA LA MEDIDA DE PROLACTINA
Anticuerpo de Captura
Fase Sólida
Anticuerpo Señalizador
Prolactina
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PRINCÍPIOS DE LA GEL FILTRACION
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MÉTODO CROMATOGRÁFICO DE CONFIRMACIÓN
• Columna 0,9x30 cm
• Gel: Superdex 200
• Muestra: 0,5 mL soro
• Velocidad de eluición: 1 mL/min
• Colecta 1 mL/tubo
• Dosage de Prolactina em los tubos 5 a 30
0 1 0 2 0 3 0 4 0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
V 0
tu b o (m L )
Prl
ng
/mL
MONOMERO DÍMERO
MACRO
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VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE PRECIPITACIÓN CON PEG COMO SCREENING PARA MACROPROLACTINEMIA
Vieira JG et al. Clin Chem 44:1758-1759, 1998
250 uL de suero + 250 uL PEG 6000 25% Determinación de Prl em el sobrenadante:
•Recuperación >65%: monomérica •Recuperación entre 65 e 30%: cromatografia •Recuperación <30%: macroprolactina
Período de 12/96 a 08/99: 55.488 dosages 3.581 muestras >25 ng/mL (6,5%) Monoméricas: 52,0% Indeterminado: 13,5% Macroprolactina: 34,5%
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POTENCIALES DIFICULTADES TÉCNICAS EM LA DETERMINACIÓN DE TSH SÉRICO
• Presencia de anticuerpos heterofílicos
• Presencia de anticuerpos endógenos anti-TSH (MacroTSH)
– Vieira JG et al. Arq Bras Endocrinol Metab 50:445-449, 2006
• Diferencias significativas entre bio e imunoafinidade
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MACROPROLACTINA ES BIOLÓGICAMENTE ACTIVA?
• Trabalho de Glezer A et al, J Clin Endocrinol Metab, 2006; 91:1048-55;
• Estudio de la actividad “in vitro” de las formas de prolactina de alto peso molecular
• En bioensayo con células Nb2 es activa, en BaF/LLP no;
0 10 20 30 400
10
20
30
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V0
tubo (mL)
Prl
ng
/mL
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CORRELACIÓN ENTRE ENCUENTROS DE ESTUDIOS DE IMÁGENES (CT/MRI) Y PESQUISA DE MACROPROLACTINA
Hauache OM, et al. ClinEndocrinol (Oxf)57:327-331, 2002
0
100
200
300
400
500
normal
microadenoma
macroadenoma
Negative Positive
Image Finding
n=46 n=42
Macroprolactin Screening
Pro
lacti
n n
g/m
L
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DIFERENCIAS EN EL RECONOCIMIENTO DE MACROPROLACTINA POR LOS DIFERENTES ENSAYOS COMERCIALES
Fahie-Wilson, MN. Clin Chem 46:2022-3, 2000
Basado en el programa de control de cualidad británico (UKNEQAS), muestra con 93% de macroprolactina y monomérica de 7,1 ng/mL
0
25
50
75
100
125
150
175
200
Prl
ng
/mL
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0
1
2
3
4
5
6
% Prl >25 ng/mL
% MacroPrl +
1o Trimestre 20089.979 amostras
IFMA Wallac
1o Trimestre 201012.002 amostrasICMA Beckman
% d
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DIFERENCIA EM EL RECONOCIMENTO DE MACROPROLACTINEMIA POR PRECIPITACIÓN CON PEG EMPLEANDO ENSAYOS COMERCIALES TRADICIONALES
Y CON MENOR “REACTIVIDAD” CONTRA MACROPROLACTINA Vieira JG, Tachibana TT, Ferrer CM, Sá J, Biscolla RP, Hoff AO, Kanashiro I, Hyperprolatinemia: new assay more specific for the monomeric form does not eliminate screening for macroprolactin with
polyethylene glycol precipitation. Arq Bras Endocrinol Metab 54:856-857, 2010
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1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
0
2
4
6
8
1 0
t u b o
Pr
l n
g/m
L
A m o s t r a 2 3 : P r l 3 1 0 / p p t 1 4 . 5 / r e c 5 %
M a c r o 5 8 %
D im e r o 7 %
M o n o m e r o 3 5 %
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
0
5
1 0
1 5
2 0
t u b o
Pr
l n
g/m
L
A m o s t r a 2 4 : P r l 1 8 4 / p p t 1 4 0 / r e c 7 6 %
M a c r o 5 %
D im e r o 7 %
M o n o m e r o 8 8 %
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA DE GEL-FILTRAÇÃO DE UM CASO POSITIVO Y UN NEGATIVO PARA LA
PESQUISA DE MACROPROLACTINA
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ALGUNAS OBSERVACIONES PRÁCTICAS
• Es fundamental la pesquisa de macroprolactinemia en muestras con resultados inesperadamente elevados. – Soarez PC, Souza SC, Vieira JG, Ferraz MB. The effect of identifying macroprolactinemia on health-
care utilization and costs in patients with elevated serum prolactin. Value Health 12:930-934, 2009
• Diferentes métodos de ensayo de prolactina pueden presentar resultados poco comparables
• Ensayos que presentam menor reconocimento de macroprolactina no eliminan completamente el problema
• Pesquisa por precipitación con PEG es el método mas simple y barato, desde que validado para el método utilizado para la medida de prolactina total en uso
• El método cromatográfico deve ser restricto a casos donde la correlación clínica es problemática y la precipitación con PEG también deja dudas
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RESUMEN
• La prolactina es una hormona que presenta heterogeneidad quanto a sus formas circulantes
• El reconocimiento de esas diferentes formas circulantes es método-dependiente y es clinicamente relevante pues aparentemente sólo la forma monomérica presenta actividad biológica
• Su reconocimiento inicial y discriminación tiene alto costo-benefício para el paciente, el médico y el sistema de salud
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0.1 1 10 100 1000 10000 100000100
1000
10000
100000
1000000
10000000
Prolactina g/L
cp
s
FENÔMENO DO “GANCHO”
• Condição restrita a ensaios imunométricos
• Excesso de antígeno satura os dois monoclonais e não permite a formação do “sanduiche”
• Resultado falsamente baixo • Alcance da curva e
concentração de prolactina ditam a importância do fenômeno
• Nos ensaios disponíveis comercialmente: valores acima de 100 ng/mL devem ser confirmados com diluição 1:10
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HIPERPROLACTINEMIA INDUZIDA PELO USO DE MEDICAÇÃO
• Causa comum de hiperprolactinemia
• Drogas relacionadas: – Antipsicóticos (neurolepticos, bloqueadores do
receptor de Dopamina): fenotiazidas
– Antidepressivos: tricíclicos, tetracíclicos, inibidores da recaptura de serotonina
– Opiácios e cocaína
– Bloqueadores do canal de cálcio (Verapamil)
– Metoclopramida, Domperidone
– Estrógenos