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Dr. Ph. Reiß, im Juli 2007

-~

......,.__~/

Fachbereich eHE M I E der Fhilipps-Universität l':arburg

Protokoll zum 1. Experimentalvortrag vom 03.06.1980

Thema des Vortrags: PRO TEl N E

Rudolf Bochskanl

Feldweg 5

3550 Marburg/Cappel

Chemie in der Schule: www.chids.de

G 1 i e der u n g

1. Vorkommen

2. Bau und Struktur

a) Elementare Zusammensetzung

b) Zusammensetzung des Peptidfadens: Primärstruktur

c) Räumliche Anordnung Sekundärstruktur

d) Molekülgröße und -gestalt Tertiärstruktur

J. Eigenschaften

a) Art und Struktur des Froteins

b) Art des Lösungsmittels

c) pH-Wert der Lösung

d) Veränderung der Tertiärstruktur

Literaturverzeichnis

Anhang


- 1 -

1. Vor kom m e n

Die Materie der lebenden Welt besteht aus einer großen Vielfalt

organischer Verbindungen, von denen sehr viele makromolekularen

Charakter haben. Im pflanzlichen Bereich handelt es sich dabei

vorwiegend um Polysaccharide, im tierischen um Eiweiße oder

Proteine.

Der Name "Frotein", von BERZELIUS geprägt und zuerst in M(fL/D:f:RS' s

Lehrbuch (1840) gebraucht, ist abeeleitet vom eriech. protos

das Erste, Ursprüngliche. Diesen Namen tragen die Froteine zu

Recht, denn zahlreiche Lebensfunktionen sind anspezifische

Proteine gebunden; ja wir kennen kein Lecen ohne Froteine.

So ist jeder heterotrophe Organismus, sprich jedes Tier, zur

Aufnahme von Froteinen mit der Nahrung gezwungen, die er über

Assimilationsprozesse in körpereigene Proteine umbaut.

Als Beispiele proteinhaltiger Nahrungsmittel seien als pflanz

liches ~rodukt Sojamehl (40 % ~roteingehalt) und Hühnereiklar

(12 % Proteingehalt) als tierisches Frodukt vorgestellt, in

denen durch die sog. 'Xanthoproteinreaktion' die Anwesenheit

von ~roteinen nachgewiesen werden kann. - Der Name 'Xantho

proteinreaktion' enthält das grieche Wort 'xanthos' - gelb,

blond; es ist also mit einer Gelbfärbung des Reaktionsgemisches

zu rechnen:

Versuch 1: Xanthoproteinreaktion

2 ml einer proteinhaltigen Lösung werden in einern

HG mit 2 ml c on c , Hl'~CIJ versetzt. Dann wird das

Reaktionsgemisch lanesam gekocht, bis die zunächst

auftretende Fällung wieder verschwindet.

Nach dem Abktihlen gibt man vorsichtig conc. NaOH

hinzu. Im alkalischen Bereich schlägt die gelbe

Farbe nach orange um.

Der Chemismus dieser Reaktion wird aus methodischen Gründen

an anderer Stelle nachgeholt.

2. Bau und S t r u k t u r

a) Elementare Zusammensetzung

Wie oben bereits angesprochen, handelt es sich bei den Froteinen

um biologische Makromoleküle, denen L-Aminosäuren als Bausteine


. \..-/

- 2 -

zugrunde gelegt sind; man kennt heute 20 dieser Aminosäuren.

Die Verkntipfung der Aminosäuren zu einern Protein verläuft stets

geordnet, über die sog. Peptidbindung, zu Polyarninosäuren oder

Proteinen, falls diese aus mehr als 100 Aminosäuren bestehen,

wie man als Richtgröße festgelegt hat. Dabei erstreckt sich das

Spektrum der Molekulargewichte von froteinen von wenigen Tausend

bis zu mehreren Millionen. (Folie 1,.oben).

Trotz der Vielfalt der ~roteine (201 = 2,4x1018

Verknüpfungs

möglichkeiten der 20 Aminosäuren) ist ihre Zusammensetzung auf

lallend gleichförmig; sie vermag daher über die Eigenschaften

eines Froteins nicht viel auszusagen.

Proteine enthalten meist im selben Ausmaß: (Folie " unten).

Wie sofort auffällt, nimmt der Stickstoff, mit einem prozentualen

Anteil von 1;-18 %, eine wesentliche Stellung ein, wodurch sich

die Froteine von den anderen biologischen Makromolekülen wie

den Kohlenhydraten und den meisten Lipiden grundsätzlich unter

scheiden.

Neben diesen genannten Elementen enthalten viele Froteine noch

Spuren von: Pt Fe, Cu, Zn, 1'1n, Cl, Er, J.

b) Zusammensetzung des Peptidfadens: Frimärstruktur

Um den Aufbau eines Froteins besser verstehen zu kannen, ist es

notwendig, sich genauer mit der Verknüpfung der Aminosäuren zu

einem Frotein auseinanderzusetzen: (Folie 2, oben).

Im Protein ist am ~-C-Atom die Carboxylgruppe einer Aminosäure

mit der Aminogruppe am ~-C-Atom einer zweiten Aminosäure durch

eine Peptidbindung - auch Amidbindung genal~t - kovalent ver

knüpft. Zwei Aminosäuren können formal unter Wasserabspalt~ng

zu einem Dipeptia kondensieren.

Das Gleichgewicht dieser Kondensation liegt bei Raumtemperatur

allerdings ganz auf der Seite der Edukte - die Feptidbindung ist

also endergonisch, da die Aminogruppe viel zu schwach nucleo

phil ist, um direkt mit der Carboxylgrup~e ein Amid zu liefern.

Bei der synthetischen Bildung von Feptiden und ~roteinen müssen

deshalb des reaktiven Gruppen zuerst "aktiviert", d v h , in eine

reaktionsfähigere Form gebracht werden, indem man z.B. die

Carboxylgruppe zunächst in eine Acylhalogenidgruppe überführt.

Durch fortgesetzte Kondensation bilden sich Tripeptide, Tetra

peptide und schließlich folypeptide, kettenförmige, aus Amino-


- J -

säuren aufgebaute Makromoleküle. Dem auf diese Weise ent

standenen langgestreckten Molekül teilt man die Bezeichnung

Frimärstruktur zu: (Folie 3).

Zum besseren Verständnis dieses Sachverhaltes soll hierzu das

Modell einer Peptidkette, genauer, eines Fentapeptids, dienen,

das aus den Aminosäuren Cystein, Tyrosin, Glutaminsäure, Arginin

und Histidin aufgebaut ist. An diesem Peptidfaden kann man auf

grund der Feptidbildung zwei verschiedene freie Enden unter

scheiden: Einmal das Ende mit der freien Aminogruppe oder das

N-terminale Ende und andererseits das Ende mit der freien

Carboxylgruppe oder das C-terminale Emde. Auch am Modell wird

deutlich, daß die Aminosäure-Reste an der Feptidradenbildung

nicht beteiligt sind, sondern als voluminöse Reste seitlich

herausragen. Um möglichst große Abstände zwischen den Resten

zu erhalten, ist der reptidfaden jeweils am ~C-Atom gewinkelt

(1100

) ,

Da eine synthetische Peptidbildung über mehrere Reaktions

schritte verläuft und einen enormen Zeitaufwand erfordern würde,

soll auf einen Modellversuch zurtickgeriffen werden, der eben

falls eine Verknüpfung kleiner Bausteine zu einem Polymerisat

über Feptidbindungen zeigt:

Versuch 2: Darstellung von ~ylon 6,10 (Modellversuch)

Man füllt eine Lösung von 1,5 ml Sebacinsäuredi

chlorid im 50 ml CC1 4 in ein Becherglas. Darüber

schichtet man eine Lösung von 2,2 g Hexamethylen

diamin und 4 g ~a2coJ in 50 ml Aq. desto desto

Mit einer }inzette wird der sich bildende Grenz

flächenfilm in der Mitte der Oberfläche erfaßt und

als laufend sich bildender Faden aus dem Becherglas

abgezogen.

Der dabei ablaufende Kondensationsprozeß unter Freisetzung von

Hel ist auf Folie 2, unten dargestellt. Der Zusatz von Na 2CO Jbewirkt das Abfangen von Hel unter Freisetzung von CO2•

Der Nachweis, daß Froteine nun wirklich peptidarti~ verknüpft

sind, soll durch eine spezifische Nachweisreaktion für gebundene

Aminogruppen, der sog. Biuretprobe, erbracht werden:


- 4 -

Versuch J: Biuretprobe: Na c hw e d s der Fept idbindung

Wenige ml verdürmter

a) Biuret-,

b) Eiklar-,

c) Glycinlösungen (= Glykokoll)

werden mit demselben Volumen 2 N NaOH und wenigen

Tropfen 0,1 %iger CuS04-Lösung versetzt. - Bei einem,. 2+ ( )Vberschuß an Cu -Ionen in jeder ~robe fällt Cu OH 2

in feinen, hellblauen Flocken aus.

Es bildet sich in den ~roben a) und b) sofort ein

intensiv violett gefärbter Komplex, während in Frobe

c) eine intensive Blaufärbung zu beobachten ist.

In allen drei Fällen beruht die Färbung auf einer

Komplexierung der Cu2+-Ionen.

Wie Folie 4 deutlich zeigt, bildet sich in den Froben a) und b)

der Biuretkomplex (violett), dagegen in Frobe c) der Arnino

glykokollkomplex (blau).

Verwendet man jedoch für die Biuretprobe eine Eiklarlösung, die

ca. JO Min. mit 2 N NaOH gekocht wurde, so fällt zunächst die

Braunfärbung der Lösung auf. Diese beruht auf der Anwesenheit

von Huminfarbstoff, einern C40-Molekül, das sich aus Zuckern Ce

bildet hat, die im Eiklar vorhanden sind. hach Zusatz von CuS04

Lösung müßte eich die Lösung blau gefärbt haben, die jedoch von

der Farbe des Huminfarbstofrs, trotz starker Verdünnung mit

Wasser, überdeckt wurde. Diese Reaktion ist dadruch zu erklären,

daß die Proteine im Eiklar hydrolytisch gespalten wurden, wodurch

die einzelnen Aminosäuren freieesetzt wurden.

Man kann also daraus schließen, daß sich die Spezifität der

Biuretprobe nur auf Peptidbindungen erstreckt, nicht aber auf

freie Aminosäuren.

Wie der letzte Versuch deutlich gezeigt hat, dürfte auch ex

perimentell die hohe Stabilität der kovalenten Feptidbindung

bewiesen sein, die erst nach längerem Kochen - hier: alkalische

Hydrolyse - gespalten wurde.

Diese Reaktion mach~man sich in der analytischen Biochemie zu

nutze; hier verfährt man in der Weise, daß man die Proteine

entweder durch Säure hydrolysiert oder durch Enzyme, was inso

fern von Vorteil ist, als hierbei keine Aminosäuren zerstört

werden.

Als Beispiel einer sauren Hydrolyse soll die Hydrolyse von Eiklar


. \.-,/

- -5 -

demonstriert werden:

Versuch 4: Saure Hydrolyse und Dünnschichtchromatographie von

Eiklar

10 g Hühnereiklar werden 24 h mit 40 ml 6 N HCI am

Rückflußkühler bei 110°C gekocht.

Am Rotationsverdarnpfer wird das Gemisch fast bis zur

Trockene eingedampft und anschließend zweimal mit

Wasser aufgenommen und der Vorgang wiederholt, um

die überschüssige Salzsäure zu vertreiben.

Dieses Hydrolysat wird chromatographisch untersucht:

Als Trägermaterial verwendet man DC-Flatten (20x20 cm)

Auf einer Ecke der ~latte, etwa 2 cm von den Rändern

entfernt, wird die Lösung des Eiweißhydrolysates mit

einer Mikropipette auIgetragen. Die Auftragung wird

7-8x wiederholt, jedoch erst dann, wenn der Fleck an

der Luft eingetrocknet ist.

Als Fließmittel verwendet man zwei verschiedene Ge-

mische:

1. F 1 i e ß mit tel: n - E u t an 0 1 : Eis e s s i g : }I20 = 4: 1 : 1

2. " Phenol: H20 = 4:1

Zur Entwicklung des Chromatogramms besprüht man mit

einer 0,1 %igen an Wasser gesättigten Lösung von

IJinhydrin in n-Butanol, der einiEe Tropfen Eisessig

zugesetzt wurden. Das Chromato€rarnm wird bei 105°C

im Trockenschrank getrocknet.

Die Reaktionsmechanismen der Hydrolyse entsprechen den Mech

anismen der Esterspaltung. Die Ninhydrinreaktion beruht auf

der Komplexierung der Aminstickstoffs der Aminosäuren.

Eine weitere Möglichkeit qualitativ zu überprüfen, welche

Aminosäuren am Aufbau eines Froteins beteiligt sind, liegt

darin, daß man spezifische Nachweisreaktionen der Arninosäure

Reste gefunden hat. Als ein Beispiel sei die spezifische Nach

weisreaktion auf den Aminosäure-Rest von Tryptophan demonstriert,

indem zwei verschiedene Froteine, nebst Tryptophan als Blind

probe, untersucht werden:

Versuch 5: Tryptophan-Nachweis nach HOfKINS & COLE

2 rnl verdünnter

a) Tryptophan-


- 6

Versuch 5: (Fortsetzung)

b) Eiklar-

c) Gelatinelösungen

werden mit 1 ml Glyoxylsäurelösungen (10 %ig) ver

mischt. Anschließend wird das Stoffgemisch vor

sichtig mit cone. H2S04 unterschichtet.

Es bilden sich zwei Phasen, an deren Berührungs

fläche ein violetter Ring entsteht. Gewisse Verun

reinigungen können eine Verschiebung des Farbtons

nach Braunviolett hervorrufen.

Dieser violette Ring ist jedoch nur in den Froben a)

(Blindprobe) und b) zu beobachten. Frobe c) zeigt

keine Farbveränderung.

Hieraus läßt sich der Schluß ziehen, daß Tryptophan am Aufbau

der froteine im Hühnereiklar beteiligt ist, im Gegensatz zur

Gelatine.

Reaktionsmechanismus: Folie 5.

An dieser Stelle bietet sich die Erklärung der anfangs durch

geführten Xanthoproteinreaktion an, da diese ebenfalls auf dem

~achweis bestimmter Aminosäure-Reste beruht: Folie 6.

Es handelt sich bei dieser Reaktion um eine elektrophile Sub

stitution, und zwar werden aromatische Ringsysteme dabei nitriert,

die charakteristisch gelbe Farbverbindungen bilden. Nach Zugabe

von conc. NaOH wird diese nitrierte Seitenkette in eine aci

Nitroverbindung tibergefUhrt, die orange gefärbt ist.

Diese Reaktion kann also nur stattfinden, wenn sich in dem nach

zuweisenden Protein Aminosäuren mit einem aromatischen Ring be

finden, wie bei Tyrosin, Tryptophan und Fhenylalanin.

c) Räumliche Anordnung: Sekundärstruktur

Da Froteine ein Molekulargewicht bis zu mehreren Millionen auf

weisen können, tritt nun die Frage auf, ob es sich bei der Foly

peptidkette um eine randorn chain (zufällige Verknäuelung) handelt

oder um eine geordnete sich wiederholende Struktur?

Aus der Tatsache, daß sich die meisten }roteine in kristalliner

ro r m gewinnarl La s s e n , geht h e r-v o r-, daß die Larige r, ~ept idke t t en

eine gesetzmäßige Anordnung im Raum aufweisen müssen. Die grund

legenden Uri t e r-s u c hu.ng e n von PAULING & COREY haben zu dem Schluß


- 7 -

geführt, daß die ~eptidketten entweder in Form eines ß-Falt

blattes (= pleated sheet) (Folie 7) oder einer ~ -Helix (Folie 8)

vorliegen; diesen beiden Konformationen ordnet man den Begriff

Sekundärstruktur zu.

Beim ß-Faltblatt handelt es sich u~ eine parallele Anordnung

zweier oder mehrerer Folypeptidketten, die durch Wasserstoff

Brücken zwischen dem Peptid-Stickstoff der einen Kette und dem

Carbonyl-Sauerstoff einer anderen Kette gebildet werden, wo

durch sich ein flächiges Gerüst bildet. Dabei stehen die Amino

säure-Reste jeweils senkrecht zur Faltblattebene.

Während beim Faltblatt die Wasserstoff-Brücken zwischen Gruppen

verschiedener Ketten auftreten, besteht durch die Bildung einer

Helix die Möglichkeit der Ausbildung von H-Brücken zwischen

solchen Gruppen ein und derselben Kette, wie dies nach jeder

vierten Aminosäure der Fall ist.

Als weitere Stabilisierung der Sekundärstruktur wirkt die Pep

tidbindung selbst, die eine freie Rotation um die Bindung zwischel

dem C- und N-Atorn nicht zuläßt, da diese Bindung partiellen

Doppelbindungscharakter besitzt:

Mesomere Grenzformeln der ~eptidbindung:

oI.

-C-N-,H

-Q19' 0

~-~ -C=lJI

H

.~

d) Molekülgröße und -gestalt: Tertiärstruktur

Von noch größerer Bedeutung für die Stabilität von Proteinen

als die H-Brücken un der Doppelbindungscharakter der ~eptid

bindung sind die Seitenkettenwechselwirkungen der Aminosäure

Reste, wodurch es zur Ausbildung der sog. Tertiärstruktur kommt:

(Folie 9). Durch dieses Zusammenspiel der einzelnen Bindungen

und Bindungskräfte, die allein durch die Frimärstruktur, d.h.

Aminosäure-Sequenz, vorherbestimmt sind, bilden Proteine drei

dimensionale Moleküle von wohl definierter Beschaffenheit:

(Folie 10). Die treibende Kraft ist das Bestreben der Poly

peptidkette, ihre Konformation mit maximaler Zufälligkeit oder

Entropie zu rinden. Aufgrund ihrer Molekülgröße und Dissozia

tion der aus dem Molekül herausragenden Aminosäure-Reste in

wäßriger Lösung besitzen die Froteine (Ausnahmen) Kolloid

charakter, wie im Versuch gezeigt wird:


. \...-/

- 8 -

Versuch 6: Kolloidnatur von Froteinen: TYNDALL-Effekt

Eine Glasküvette mit einer Eiklarlösung wird von

dem Licht eines Projektors durchstrahlt: TY~DALL

Effekt.

Den makromolekularen Charakter von Pz-o t e Lrien macht man sich bei

der Trennung von Froteingemischen in der Biochemie zunutze,

indem man sie über einer "Säule" mit einem Folydextrangel, wie

z.B. Sephadex, trennt.

Versuch 7: Trennung von Proteinen durch Gelfiltration

Ein Gemisch aus Hämoglobin (68 000), Cytochrom c

(17 500) und Nitro-Tyrosin (227) - ~itrierung der

Aminosäure zur Sichtbarmachung - wird auf eine

Sephadex-Säule aufgetragen und durch Elution der

Säule mit Tris-Puffer (pH 8,2) getrennt.

Nach ca. JO Min. erkennt man in der oberen Gelzone

die gelb gefärbte Aminosäure, in der Mitte das rot

orange gefärbte Cytochrom c und unten des rot-braune

Hämoglobin.

Die Ursache dieser Auftrennung liegt in der Struktur des Gels

begründet. Sephadex besteht aus einem dreidimensionalen Netz

werk von Polydextranmolekülen, das durch Quervlnetzen mit Epi

chlorhydrin hergestellt wird. Proteinmolektile, die gr6ßer als

die größten Poren im gequollenen Sephadex sind, können nicht

in die Gelperlen eindringen. Sie wandern an ihnen vorbei und

verlassen die Säule zuerst mit der Elutionsfront. Kleineren

Molekülen sind um so mehr }oren im ~el zugänglich, je kleiner

sie sind. Sie dringen daher in die Gelperlen ein und wandern

entsprechend verzögert in der Elutionsfront. Im Eluat erscheinen

sie daher in der Reihenfolge abnehmender Molekülgröße: (Folien 11,12) •

J. E i gen s c h a f t e n

a) Art und Struktur des Pro teins

Aus der bislang erfolgten Charakterisierung der Proteine ist

hervorgegangen, daß sich viele Eigenschaften stark von der

Molekülgröße und mehr noch von der Molekülgestalt, d.h. der

Tertiärstruktur, ableiten lassen.

Ein Beispiel hierfür soll das Lösungsverhalten verschiedener


- 9 -

Froteine in Wasser sein:

Versuch 8: Lösungsverhalten von Albumin und Collagen in Wasser:

Albumin und Collagen (hier: Stück einer Sehne) werden

in RG vorgegeben und in Wasser zu lösen versucht.

Albumin löst sich vollständig, während sich beim

Collagen keinerlei Anzeichen deutlich machen. Eine

Überprüfung erfolgt mittels Biuretprobe.

Die Ursache für das fehlende Lösungsvermögen von Collagen in

Wasser liegt zum einen in seiner Struktur (Fasermolekül, Tripel

helix) (Folie 13) und zum anderen in der Aminosäure-Sequenz be

gründet. Collagen wird vorwiegend aus den Aminosäuren Hydroxy

prolin und Glycin aufgebaut, die beide über unpolare Seiten

ketten verfügen, wodurch die äußerst schlechte Löslichkeit in

Wasser erklärt wird. Anders liegen die Verhältnisse beim Al

bumin. Dieses Protein besitzt eine kugelförmjge Konformation,

in der die unpolaren Reste ins Molekülinnere verlagert sind

und die polaren Reste quasi die "Proteinhülle" bilden, was eine

Lösung in Wasser ermöglicht.

b) Art des Lösunesmittels

Daß neben der Struktur des Froteins auch das Lösungsmittel

selbst für dessen Löslichkeit verantwortlich ist, zeigt der

nächste Versuch:

Versuch 9: Herabsetzung der Löslichkeit von Froteinen durch

organische Lösungsmittel

Eine Albuminlösung wird mit abs. Ethanol versetzt.\ULtJ

Es kommt zur Au s f ä Ll urrgvd arnd t zur Dena turierung des

Proteins, die jedoch durch Wasser im Überschuß z.T.

wieder rückgängig gemacht werden kann.

Die Zugabe von Ethanol bewirkt eine starke Herabsetzung der

Dielektrizitätskonstante des wäßrißen Milieus. Wasser bat eine

Dielektrizitätskonstante von 81, Ethanol von 26. Dies hat eine

starke Zurückdrängung der Dissoziationsvorgänge der Aminosäure

Reste zur Folge; das Molekül wird dadurch partiell oder voll

ständig entladen. Dies führt zur Abnahme der Hydratation, was

wiederum mit einer Abnahme der Löslichkeit der Iroteine kor

reliert ist. Man sagt, die Froteine werden denaturiert, d.h.


- 10 -

der native Zustand wird verändert.

Durch Wasserzugabe werde~ die Dielektrizitätskonstante wieder

erhöht und die Dissoziationsvorgänge versträkrt. Die Löslich

keit nimmt zu, d.h. die Denaturierung wird aufgehoben, wenn

auch nicht vollständig, was darauf zurückzuführen ist, daß

einige Proteinmoleküle irreversibel geschädigt sind.

c) pH-Wert der Lösung

Eine weitere MBglichkeit den Ladungszustand eines Protein

moleküls und damit seine Löslich~eit in wäßrigem Milieu zu

beeinflussen besteht in der Veränderung des pH-Wertes der

Lösung.

Versuch 10: Bestimmung des IEP von Casein

250 mg reines Casein wird in 20 ml Aq. dest sus

pendiert und mit 5 ml 1 N NaOH versetzt. Nach er

folgter Lösung wird mit 5 ml 1 N Essigsäure neu

tra2isiert und mit Aq. dest. zu 50 ml aufgefüllt.

Herstellung der Essigsäure-Casein-Gemische (10 ml)

RG-Nr.: 1 2 J 4 5

0,01 N HOAc (mI)

0,1 N HOAc (mI)

1 , 0 1\1 HOAc (mI)

Aq. dest. (mI)

Caseinlsg. (mI)

zu erwartendespH des vollsteAnsatzes

0,6

8,4

1 , 0

;,9

2,5

6,5

1 • 0

5,J

1 ,0

8,0

1 , 0

4,7

4,0

5,0

1 ,0

4 , 1

1 , 6

7,4

1 J 0

3,.5

Reaktion klareLsg.

schw.Trb.

starkestarke klareAusfl.Trüb. Lösung

Die Erklärung dieses Phänomens läßt sich wieder durch die ver

schiedenen Seitenketten der einzelnen Aminosäuren im Frotein

begründen. Da sowohl basische wie saure Seitenketten auftreten,

besetzen Froteine ebenso wie die freien Aminosäuren Ampholyt

charakter, d.h. je nach pH-Wert der Lösung liegen die Froteine

als ~ation, mit einem Überschuß an positiver Ladung, oder als

Anion, mit einem Uberschuß an negativer Ladung, vor. In beiden

Fällen zeigt es also geladene Gruppen und ist somit im polaren

Lösungsmittel Wasser löslich. Im isoelektrischen Funkt (IEl) da

gegegen heben sich die Summe aller Ladungen statistisch gesehenChemie in der Schule: www.chids.de

- 11 -

auf, das ~roteinmolekül liegt als Zwitterion vor und kann uem

entsprechend keine Hyd r-a t lrü Ld e rne hz- aufbauen, es fällt aus.

Zwischen diesen drei angesprochenen Extrema gibt es natürlich

fließende Ubergänge, wie im Versuch gezeigt wurde. Der IEF von

Casein liegt bei pH = 4,7. (Folie 14).

d) Veränderung der Tertiärstruktur

Haben die beiden letzten Versuche die ~roteine als kolloidal

gelöste Ionen demonstriert, so sollen im folgenden Beein

flussungen der Tertiärstruktur nachgewiesen werden.

Versuch 11: Denaturierung durch Hitze: irreversibel

" " Kälte: reversibel

\..-)

.'0

Unverdünntes Eiklar in zwei RG wird einmal durch

Hitze (Wasserbad) und 4urch Kälte (flüssige Luft)

denaturiert. In beiden Fällen wird das Eiklar rest

und weiß. Nach etwa 5 ~in. bei Raumtemperatur zeigt

die durch Kälte behandelte Eiklarprobe wieder ihre

Ausgangsform; Vergleich mit einer unbehandelten

Frobe. Die durch Hitze behandelte Frobe bleibt un-

verändert weiß und fest,sie wurde irreversibel de

naturiert: gekochtes Ei.

Die Ursache der irreversiblen Denaturierung ist zum einen, daß

durch das Erhitzen die Hydratation der Froteine vermindert wurde

und zum anderen, daß die kinetische Energie der Moleküle ver

mehrt wurde, wodurch die funktionellen Gruppen der Aminosäure

Reste durch Auflösung der intermolekularen Bindungen aktiviert

wurden. Das führte dazu, daß sich die feptidketten weitgehend

entfaltet haben und sich zu einer random chain angeordnet haben,

was mit einem Anstieg der Viskosität verbunden ist.

Anders liegen die Verhältnisse in der Kälte: Durch das Einfrieren

ist die kinetische Energie stark herabgesetzt worden, wobei je

doch die Kettenkonformationen der Froteine nicht verändert

wurden; deshalb konnte die Denaturierung durch vorsichtiges Er

wärmen wieder rückgängig gemacht werden.

Ähnlich liegen die Verhältnisse bei der Denaturierung durch

Metallionen:


- 12 -

Versuch 12: Denaturierune durch Metallionen:

a) Schwermetallionen: irreversibel

b) Eralkalimetallionen: reversibel

Man gibt zu zwei HG mit Eiklarlösung Cu 2+-ronen durch

eine CuS04-Lösung bzw. Ca 2+-Ionen durch eine CaC12

Lösung. In beiden Fällen tritt sofort eine Dena

turierung der Fr-o t e a n e ein, die durch einen Lber

schuß an Wasser bei der Probe mit Ca2+-Ionen wieder

rückgängig gemacht werden kann, im Gegensatz zur

Cu 2+-haltigen ~robe.

Festzustellen gilt, daß in beiden Fällen den Froteinen die

Hydrathülle entzogen worden ist, was mit einer Entropiezunahme

verbunden ist, die durch die Fällung sichtbar wurde.

Die Tatsache jedoch, daß nach Wasserzugabe im Überschuß nur die

Proteine in der Frobe mit Ca-Ionen wieder in Lösung gehen, d.h.

ihre Hydrathülle wieder aufbauen, läßt auf eine weitere Reaktion

schließen. Die Ursache fUr die irreversible Denaturierung durch

Cu-Ionen liegt darin begrlindet, daß neben einer Zerstörung der

H-Brücken eine Komplexierung der Peptidkette erfolgte.

In einem letzten Beispiel soll eine Veränderung der Tertiär

struktur gezeigt werden, die auf der Grundlage beruht, daß die

meisten }roteine in wäßriger Lösung als Anionen vorliegen, was

auf die Zusammensetzung der Aminosäure-Reste zurückzulühren ist.

Versuch 1): Denaturierung durch elektrische Felder:

a) Wechselspannung: reversibel

b) Gleichspannung= irreversibel

Eine Küvette wird mit Hühnereiklar gefüllt. In das

Eiweiß werden zwei Kupferdrahtelektroden gehängt,

an die

a) eine Wechselspannung von 25 v,b) eine Gleichspannung von 25 V

angelegt wird.

ad a) Zwischen den Elektroden entsteht eine schwache

Denaturierung, die nach Abschaltung der Spannung sich

langsam aufheben würde.

ad b) An der Anode ist eine starke Eiweibdenaturieruni

zu beobachten, die nach Abschaltung der Spannung

bleibt.


. ''-.,/

- 1) -

Durch die Wechselspannung wird der Eiklarlösung Energie zuge

führt, wodurch die kinetische Energie der Proteinmoleküle erhöht

wird. Als Folge davon kommt es zu einer Verkntipfung einzelner

Moleküle und dadurch zur Makromolekularbildung. Da hierbei aber

weder die Hydrathülle, noch die Tertiärstruktur der Froteine

wesentlich verändert wurde, verläuft die Denaturierung nach

Aufhebung des elektrischen Feldes reversibel.

Durch Gleichspannung kommt es zur Entmischung der Eiwei131ösung.

Da die Froteine einen negativen Ladungsüberschuß aufweisen,

reichern sie sich an der Anode an, wo sie entladen werden.

Durch die Entladung kommt es zur Verminderung der Hydratation

und zur Veränderung der Bindungen innerhalb der Tertiärstruktur.

Die im Anodenraum auftretende Denaturierung ist deshalb auch

nach Aufhebung des elektrischen Feldes irreversibel •


1"-,,

-'0

- 14 -

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Kügelchen eindringen


Das Proteingemischbeginnt,in die Säuleeinzudringen.

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PoröseScheibe

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Die Proteinebeginnen sichvoneinanderzu trennen.Die kleinerenMoleküledurchdringendie SephadexPartikel undwerden zurückgehalten.Die großenMoleküle

werden ausgeschlossen unddurchlaufen deshalb die Säuleschneller

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Die beidenProteinesind

voneinandergetrenntund könnenim Eluatgesammeltwerden

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Chymotry psin

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est er asen , D ie H ydrolyse k ann als e in Ar ylt ransfcr an1;1'5l'h en we rden, b ei der e in Acyl-Rcst von ei ne r /I .m o-C ruppc [I 'r ot ea scn ) Olle re in er H y drc xy -C ru p pe ([ S ler.l ~ ell ) .1\1 ~Va s scr üb er t r .igc u wi rd . Ans te lle d e s int c rmr-d ia rc n 0 -", vl -S c rin -De riv atr- , ki i n nt' l1 r.,.j Fn zy m cn mit Cy~.k i l1 im aktiven Zr-ntrum in J na k 'l;er \\'l' i,e S'r\ cy l-Cyst c in - D c rivute den reakti o n sfähigen Zwi sch en z ust.md bilden (Schema 20) .

Schema 19 , Am inosä u rc-Scq uc u zcn um Jen Seri n-Rest im akti ven Zentrum vo n Se r in -Pro teas en

2.3 .1.1. ß cdl'ulll/lg einz elner Aminos .iuren {iir den Mecl1arlis-/IlItS der cll zymJ..-1l1111ysi erlell Reaktion

Die Bede ut u ng e inzelner Am in o säuren Für d a s akt iv e Zentrum undd .l ~ Z lI<" llI1l1lcw;rid d e r Amino sa u re n fü r J en Rca k t ionsmech anisrnusist a ru b est e-n 1>"i d en Hydrola sen untersu ch t. Seh r h ä ufig ist e in S er in-Res ] unter BilJung ei n es cov alen ten Ov Acvl-Derivates a m hyd rolyt isch en V o rg .l ng b et e il igt (S cherna 11\, S. 28 ) :' w :ih re n d e in H istid inR est und b ei e in igen En zy me n zu s.i tz lich ei n A s par ag in s .iu re-Rcs tdurch \ \'a s '> crst l lftbrii rken d ie rcaktion vf.ihigen Z w isch enzu st ände(tran s it ion !;ta ll' ) b ild en. D ie se En zy m e w e rd en al s Ser in -H ydrola sen(S e r in -Pro tc.r se n) bezeic h ne t . Zu ih ne n g ehö re n t: ß. TrYP::;I1, ClryTt! o /ry /, s ill , Ela~/t1 s e, T hrombin, {' ['ls m il1 , 5 111J tili:;;I1 , d ie alle in d erAminosau re-Seq ue n z um d ie sen akt iven Scrin-Re st g roße Überei n s t im m u n gen zei g e- n (Schema 19), so w ie d ie m e ist e n der Carbo xy -

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Z u r B,··;(hrr·ihung der f un ktionen d es A kt iven Z e ntrum s kann es inm ch rr-rv S uhn'lI t re ll [su b vit c s) unterteilt we rd e n . M <l n untersch e id etd -,l ~ [l ! n lh n ;.; ~ :! ('nt rum (L inJi ng ,ik) d .rs nur für d ie Bin,Jung d es Su bstral cs a n .1 .\ 5 En zym verantwortl ich is t, so w ie da s k J L1]yt islhe Ze n tru m (Cll.1I)-' II< s itc }, cl , I S d in -kt a n '! ('r k .1 1al yti sc1wn R,' ., k tin n b e te iligl j .; l. D ie A m in o s.iurcn des k a ta ly t ischen Z entru m s können b e ieini ge-n En zymcn unt e r te il! werden in so lch e, d ie im Verl auf d ere n zym.rtis clu -n Reak tion ei ne co va lc ntc Bindung m it d em S u bs t r a tei ngl'hen , lind andere, die nur üb er nicht -covalente Bindung en a n derR ea kti on teilnehmen.

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Bei ei ne r Gruppe w cite rcr H yJrolasen sind C a rboxy -Cr uppcn durchcova lcn tc Bindung en an J ('r Re.lkt io n beteil igt. Im Fa lle vo n Pro tea se n Irpten da b ei .IIs Zwi schenzus tä nJe gemisch te A n hyd r ide .1U f, d iein ei ne r FoIgere <1 kt io n h yd rolys io r j w erd en (SdH'm.l 21 , S . 3 1). Be isp iele da für sind die Car /JoxYT'ep lidllse und d .l ~ Pep sin , Im Falle desrc p~ i n s erfol);t jed o ch n icht nur eine an h yJriJart ige Bin d u ng derCollboxy -Kompnnen te , son dern an ei n e r zweite n Carboxy-G ruppew ird .ludI d ie A mi no-Kom pone n te a m id .irtig geb unde n (Sch ema 22,S . J2) . D u rch di e se räuml iche Fix ie run g der Ami no-Kompone n te wi rdd ie r ückl ä u fig e Reak tio n , die Bildung ei ner I' c'pliJ -BinJ lIn g , w escnt Ii." e rleich te r t. Dami t k önnen d ie be im Pepsin be ka nnten Transpep tid ie r u ng s-Reakr ionen erklä rt werden.

D e r Mech a nis m us der durch R iv ol/llc/cl/se k at al y s iert en S pa ltu ng vonNuclei n sa ure n verl äuft übe r ei nen cy cl ische n 2·,3'- f'ho~phor s ;i ure.evl cr (Sche m a 23, S . 3 3) . A n der Reak t ion sind zwe i H bt iJ in -ResteJ c ~ [ n zYllls bc tci lig t . ( D ie A rnin o sa u rr-n des ak tive n Ze n tru ms s indülu -r ei ne n wei ten Be reic h d er A mi nos.iu re-Sequcnz ver te ilt : Sc!H'l ua2-1. S . J .t. ) S pPL.Hische S u b s t r a te d es Ly so':Y/II s s ind I'olyscccha r id«, d iea lt er nie re n d d ie Z ucker- R e s te N -A cetyl -glu co sa m in u nd N -'\cet yl mu r ~ m in s :i ure e ntha lt e n (Sch ema 25.5.35). wobei eine gl ykos idischeBin d un g zwischen einem Muram in sau re - u nd ei nem C I U Co~,l lllin- Reslg e,pa lle n wird . Zur Sp.l lt u ng mu ß min .Ies tc n -, ei n He xa saccha r id vori iq ;en . I:.i n nur .IUS N-Accty l ··g ll1co~amin Resten be st eh en d es Trisacch a rid wi rd von de m En zy m n ur geb u nden, aber ni cht ge spalten(\..c1m p C't it iver Inh ib itor, s . S . 59 ). D ie Rönt gen slrukturan.ll yse d iesesk ri s t .rl livie rbarcn Kom plcxcs liefr-rt e wi , h tigl' Il in w C' bc über Ja s a kt ive Ze n t rum d e s Ly so zyms lind übe r d ie B i nJ u n~wcrhJltn i s sc arnS u h, t r.l!/ [ n zy rn -Ko m p le x. An d er S pa ltu ng der Uindllnp; w ir ken imk.lt.lly ti sch e n Zen trum C lu tamin s .iurc in I' o sif ion 35 und A sparag ins :iu re in Pos it ion 52 mit. Das Bindu ngSlell t ru m des Ly so zym s vertei lts i<!t iih t' r eine 1.1111;(' R iI1(', d ie an der :\ uE e!1';l ' ite de r T('rt i :ir ~tl uk t u rch, s Enzyms lie gt . An d er S ubs tr a tb in du ng si n d mindesten s 12 A m inosa u re- n be tcrlig ! (Schem a 25) ,

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.5d-.<!ma 22. Mechanismus der Pr ot eolyse und der T ranspep tid ierung bei Peps in -k.. talysier ten Rca:" ' ;o nen

Schema 23. M echanismus der Ribonuclease-k a talysierten Spaltung von Ribonu cleins äuren

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