T.C

ÇUKUROVA ÜNĠVERSĠTESĠ

TIP FAKÜLTESĠ

ÇOCUK SAĞLIĞI VE HASTALIKLARI

ANABĠLĠM DALI

HĠPOKSĠK-ĠSKEMĠK SEREBRAL HASAR

OLUġTURULAN YENĠDOĞAN RAT MODELĠNDE

ALLOPÜRĠNOLÜN KASPAZ 3 VE KASPAZ 8

AKTĠVĠTESĠ ĠLE NÖROPROTEKTĠF ETKĠSĠNĠN

DEĞERLENDĠRĠLMESĠ

YAN DAL UZMANLIK TEZĠ

TEZ YÖNETĠCĠSĠ

Prof. Dr. Mehmet Satar

Uz. Dr. Kenan Özcan

ADANA-2009

II

Bu çalıĢma TIP.2005.LTP21 nolu proje ile Çukurova Üniversitesi AraĢtırma Fonu

tarafından desteklenmiĢtir.

III

TEġEKKÜR

Bu çalışmanın yapılması sırasında yakın ilgi ve desteklerini gördüğüm, başta tez

danışmanım Prof. Dr. Mehmet Satar olmak üzere Prof. Dr. Nejat Narlı‟ya, Doç. Dr.

Hacer Yapıcıoğlu Yıldızdaş‟a, Dr. Ferda Özlü‟ye, Dr. Erdal Taşkın‟a, Dr. Necmiye

Canacankatan‟a, Yenidoğan Yoğun bakım Ünitesi çalışanlarına, Vet. Dr. Kenan

Dağlıoğlu‟na, DECAM Laboratuvar çalışanlarına ve her zaman yanımda olan aileme,

eşim ve çocuklarıma içtenlikle teşekkür ederim.

Dr. Kenan Özcan

IV

ĠÇĠNDEKĠLER

SAYFA

NO

TEŞEKKÜR II-III

İÇİNDEKİLER IV-V

TABLO LİSTESİ VI

ŞEKİL LİSTESİ VII

KISALTMALAR VIII

ÖZET ve ANAHTAR SÖZCÜKLER IX

ABSTRACT ve KEYWORDS X

I. GİRİŞ ve AMAÇ 1

II. GENEL BİLGİLER 3

2.1. Perinatal Asfiksi Ve Hipoksik İskemik Ensefalopati 3

2.1.1. Tanım 3

2.1.2. İnsidans 4

2.1.3. Asfiksi tipleri 4

2.1.3. 1. Kronik kısmi asfiksi 5

2.1.3.2. Akut tama yakın asfiksi 6

2.1.4. Patoloji 7

2.1.5. Prematür ve Matür Yenidoğanlarda Perinatal Hipoksik-

İskemik Beyin Hasarının Patogenezi

8

2. 1.5.1. Hipoksemi 11

2.1. 5. 2. Hipoksi-İskemi 11

2. 1.5.3. Beyin hasarında hücresel mekanizma 12

2.1.5.3.1. .Enerji Dönüşümü 12

2.1.5.3.2. Serbest Radikal Oluşumu 14

2.1.5.3.3. Eksitatör aminoasitlerin salınması 14

2.1.5.3.4. İntrasellüler kalsiyum yüklenmesi 15

2.1.5.3.5. Nitrik Oksit Toksisitesi 16

2.1.5.3.6. İntrasellüler Asidoz 16

2.1.5.3.7. Apopitosis 17

V

2.1.5.3.8. İnflamasyon 17

2.1.5.3.9. Sitokinler 18

2.1.6. Hipoksik İskemik Beyin Hasarının Önlenmesindeki

Mevcut Değerli Girişimler

18

2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması 19

2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu 19

2.1.6.3. Glutamat alınımındaki bozukluğun iyileştirilmesi 20

2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi 20

2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu 20

2.1.6.6. İntrasellüler Olayların Akışının Bloke Edilmesi 21

2.2. Kaspazlar; programlanmış hücre ölümlerinde anahtar oyuncular 24

2.2.1. Apoptoziste Kaspaz-3‟ün Yeri ve Önemi 26

2.2.2. Kaspazların Aktivasyonu 27

2.2.3. Mitokondri/Sitokrom-C Aracılı Apoptozis Oluşturulması 28

2.2.4. Dış Sinyallerle Apoptozisin Tetiklenmesi 30

2.2.5. Endoplazmik Retikulum Aracılı Apoptozis Oluşturulması 31

2.3. Allopurinol 33

2.3.1. Özellikleri 33

2.3.2. Famakokinetik Ve Metabolizma 34

2.3.3. İlaç Etkileşimleri 35

2.3.4. Terapötik Kullanımlar 35

2.3.4. Toksik Etkiler 36

III. GEREÇ ve YÖNTEM 37

3.1. Kaspaz 3 ve Kaspaz 8 Ölçüm Yöntemleri 39

3.2. İstatistiksel analiz 39

IV. BULGULAR 40

V. TARTIŞMA 44

VI. SONUÇLAR 48

VII. KAYNAKLAR 49

VIII. ÖZGEÇMİŞ 55

VI

TABLO LĠSTESĠ

Sayfa No

Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri 4

Tablo 2. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı 8

Tablo 3. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki değerli girişimler 23

Tablo 4. Belli başlı kaspazlar. 25

Tablo 5. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-3 aktiviteleri 41

Tablo 6. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-8 aktiviteleri 43

VII

ġEKĠL LĠSTESĠ

Sayfa No

ġekil 1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakış. 10

ġekil 2. Kaspazların aktivasyonu. 26

ġekil 3. Mitokondri/sitokrom-c aracılı apoptozisin tetiklenmesi. 29

ġekil 4. Apoptosom. 29

ġekil 5. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis oluşturulması. 30

ġekil 6. Dış sinyallerle apoptozisin tetiklenmesi. 31

ġekil 7. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-3 aktiviteleri 41

ġekil 8. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-8 aktiviteleri 43

VIII

KISALTMALAR

ADP :Adenozin difosfat

AMP :Adenozin monofosfat

ATP :Adenozin trifosfat

CP :Serebral palsi

ER :Endoplazmik retikulum

FADH :İndirgenmiş flavin adenid dinükleotid

FPK :Fosfofruktokinaz

GH :Büyüme hormonu

GHR :Growth hormon reseptörü

GP :Glutatyon peroksidaz

GSH :Glutatyon

H-I :Hipoksik iskemi

HK :Heksokinaz

H2O2 :Hidrojen peroksit

HİE :Hipoksik iskemik ensefalopati

IGF-1 :İnsulin benzeri growth faktör

IL1 Beta :İnterlökin-1 beta

LDH :Laktik dehidrogenaz

NAD :Nikotinamid adenid dinükleotid

NADH :İndirgenmiş nikotinamid adenid dinükleotid

NMDA :N. metil D.aspartat

NO :Nitrik oksit

O2 :Oksijen

PO2 :Parsiyel oksijen basıncı

PCr :Fosfokreatin

PAF :Platelet aktive edici faktör

PK :Piruvat kinaz

PV-İVK :Periventriküler- İntraventriküler kanama

PUFA :Çoklu doymamış yağ asidleri

PVL :Periventriküler Lökomalazi

QA :Quisqualik asit

SOR :Serbest oksijen radikalleri

SOD :Süperoksit dismutaz

TNF-alfa :Tümör nekrosis faktör-alfa

IX

ÖZET

Hipoksik-Ġskemik Serebral Hasar OluĢturulan Yenidoğan Rat Modelinde

Allopürinolün Kaspaz 3 Ve Kaspaz 8 Aktivitesi Ġle Nöroprotektif Etkisinin

Değerlendirilmesi

Amaç: Hipoksi-iskemi (H-İ) sonrası reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde küçük

damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan siklooksijenaz ve

ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir. Açığa çıkan serbest radikaller

lökosit, platelet ve endotel hücrelerindeki adezyon moleküllerini aktive ederek

lökositlerin adezyonu ve ekstravazasyonunu sağlar. Ksantin oksidaz inhibitörü olan

allopürinolün hipoksik sikemik ensefalopatide (HİE) nöroprotektif olabileceği

gösterilmiştir. Kaspaz 3 ve kaspaz 8 nöronal apoptozisde önemli bir role sahiptir. Biz

hipoksik-iskemik ensefalopatili yenidoğan ratlarda farklı doz allopurinolün kaspaz-3 ve

kaspaz-8 üzerine etkilerini araştırmayı amaçladık.

Materyal ve Metod: Bu çalışmaya 10 günlük yenidoğan ratlar alındı. Çalışma modeli

olarak Rice‟ın hpoksi-iskemi modeli kullanıldı. Ratların sol karotid arterleri bağlandı ve

%8 oksijen ile %92 nitrojenli ortamda 2.5 saat bekletildi. Hİ sonrası allopurinol

uygulanarak beyin dokusunda her iki hemisferde apopitozis öncül proteinleri olan

kaspaz 3 ve 8 ölçümü yapıldı. Allopürinol AL48 tedavi grubuna, ratlar hipoksiye maruz

kaldıktan 30 dakika ve 12 saat sonra, 24 mg/kg olmak üzere iki eşit dozda, AL72 tedavi

grubuna ratlar hipoksiye maruz bırakıldıktan 30 dakika, 12 saat ve 24 saat sonra aynı

dozlarda intraperitoneal olarak uygulandı. Son ilaç uygulanmasından 12 saat sonra ratlar

dekapite edildi. Diğer gruplar sham ve Hİ grubuydu.

Bulgular: Her bir grupta 10 rat vardı. Gruplar arasında cinsiyet ve ağırlık farkı yoktu

(p>0.05). Hİ, AL48 ve AL72 gruplarında kaspaz 3 ve kaspaz 8 düzeyleri sham grubu ile

karşılaştırıldığında belirgin yüksekti (her biri için p= 0,0001). Hİ ve AL48 grupları

arasında kaspaz aktivitelerinde farklılık olmamasına rağmen (p>0.05) kaspaz -3 ve

kaspaz-8 aktiviteteleri HI ve AL48 gruplarıyla kıyaslandığında AL72 grubunda daha

düşüktü (her biri için p=0,001).

Sonuç: Sonuçta AL72 grubunda kaspaz 3 ve kaspaz 8 aktivitelerinin azalması yüksek

doz allopurinolün nöronal apopitozisin azalmasında etkili olabileciğini

düşündürmektedir.

Anahtar kelimeler: Hipoksik iskemi, yenidoğan ratlar, kaspaz 3, kaspaz 8, allopürinol

X

ABSTRACT

Allopurınol’s Effect On Caspase-3 And Caspase-8 In Hypoxıc-Ischemıc Newborn

Rats

Aim: During reperfusion period of hypoxia-ischemia, cyclooxygenase and xanthine

oxidase pathways are induced. Free oxygen radicals activate adhesion molecules on

leukocytes, platelets and endothelial cells and activate leucocytes‟ adhesion and

extravasation. A xanthine oxidase inhibitor, allopurinol has been shown to be

neuroprotective in hypoxic- ischemic encephalopathy. Caspase-8 and caspase-3 have a

key role in neuronal apoptosis. We aimed to investigate different dosages of

allopurinol‟s effect on caspase-3 and caspase-8 activities in newborn rats with hypoxic-

ischemic encephalopathy.

Material and method: 10 days old newborn rats were enrolled to the study. Rice‟s

hypoxia-ischemia model were used. Left carotid artery was ligated and rats were

perfused with 8% oxygen and 92% nitrogen for two and half hours (HI group). Rats

were treated with allopurinol and caspase- 3 and caspase- 8 activities were measured in

both hemispheres. AL48 group was treated with 24 mg/kg intraperitoneal allopurinol 30

minutes and 12 hours after hypoxic- ischemic insult; while AL72 group was treated with

same dose after 30 minutes, 12 hours and 24 hours. Twelve hours after last dose, rats

were decapitated. The others groups were sham and non- treated hypoxic- ischemic (HI)

group.

Results: There were 10 rats in each group. There was no significance between gender

and weights among groups (p>0.05). Caspase-3 and 8 activities were significantly

higher in HI, AL48 and AL72 groups compared to sham group (p=0,0001, for all,

respectively). Although caspase activities were not different in HI and AL48 groups

(p>0.05), the activities were lower in AL72 group compared to HI and AL48 groups

(p=0,0001, for each).

Conclusion: Decreased activities of caspase- 3 and 8 in AL72 groups may suggest that

high dose of allopurinol may be effective for reducing neuronal apoptosis.

Keywords: Hypoxic-Ischemia, newborn rats, caspase-3, caspase-8, allopurinol

1

1- GĠRĠġ ve AMAÇ

Neonatolojinin önemli sorunlarından biri olan perinatal asfiksi ve buna bağlı

olarak gelişen hipoksik iskemik ensefalopati (HİE), doğuma yakın dönemde, doğum

sırasında veya doğumdan sonra bebeğin hipoksi-iskemide (H-İ) kalmasına bağlı olarak

gelişir. Hipoksik iskemik ensefalopati bazı bebeklerde hafif olmakla birlikte vakaların

çoğunda ağır seyretmekte ve sekeller bırakabilmektedir.1

Son yıllarda yapılan çalışmalarda hipoksi-iskemide olay ve hücre ölümü arasında

geçen dönemin çok önemli olduğu görülmüş ve bu dönem „‟terapötik‟‟ pencere olarak

isimlendirilmiştir. Bu dönemde hücre ölümüne neden olan moleküler olayların

sonlandırılması çok önemlidir. Hipoksi-iskemide enerji metabolizmasının belirgin

olarak etkilendiği; ilk dakikalardan itibaren adenozin trifosfat (ATP), total adenin ve

fosfokreatin (PCr) düzeylerinin düştüğü, aerobik glikolizin anaerobik glikolize kaydığı

ve oksidatif fosforilasyon ile 38 ATP üretilirken, anaerobik ortamda sadece 2 ATP

üretildiği, glikolitik yolağın enzimlerinde artış gözlendiği bilinmektedir.1

Değişik

dokularda hipoksi ve iskemide heksokinaz (HK), piruvat kinaz (PK), laktik

dehidrogenaz (LDH) ve glikolitik yola ait diğer enzimlerin koordine bir şekilde arttığı

gösterilmiştir.2-4

Aerobik ortamda, hücrede metabolizma sonucu serbest oksijen radikalleri (SOR)

oluşmakta ve hücrenin antioksidan enzimleri savunma mekanizmalarını

oluşturmaktadır; Enzimatik savunma mekanizmalarını glutatyon peroksidaz, katalaz ve

superoksit dismutaz enzimleri olusturmaktadır. Serbest oksijen radikalleri fazla

oluştuğunda oksidatif strese neden olurlar ve yüksek reaktivitelerinden dolayı

proteinlerde yapısal ve fonksiyonel değişikliklere, genetik mutasyonlara ve lipit

peroksidasyonuna yol açarlar.5

Hücredeki antioksidan enzim sisteminin önemli

enzimlerinden biri olan süperoksit dismutaz (SOD) süperoksit anyonunun hidrojen

perokside dönüşümünü sağlar.6 Hidrojen peroksit hücre membranından rahatça

geçebileceği ve hidroksil radikaline dönüşebileceği için glutatyon peroksidaz (GP) ile

indirgenmesi önemlidir. Bu reaksiyonda glutatyon (GSH) kullanılır. Yenidoğan

beyninde H-İ sırasında hücre içine kalsiyum göçü sonucu SOR‟lerinin arttığı ve

2

reperfüzyon sonrası oksijenin yeniden ortamda olması nedeni ile oldukça fazla oranda

sitotoksik olan oksidanların geliştiği bilinmektedir.7

Ksantin oksidaz, serbest radikaller için önemli bir kaynak olabilir. Allopürinol,

ksantin oksidaz enzimlerinin önemli inhibitörü olup hipoksantinden ksantinin sentezini

engeller ve serbest radikal süper oksidinin oluşumundan korur. Apopitotik

mekanizmaların özellikle immatür beyinde H-İ‟den sonra önemli olduğu görünmektedir.

Serebral H-İ matür rat ile karşılaştırıldığında immatür rat beyninde daha az nöron

nekrozuna neden olmaktadır. Bunun yerine elektron mikroskobisinde H-İ‟nin

apopitosise ve nekroza yol açtığı ara grup „hibrid‟ hücrelerde apopitotik-nekrotik

devamlılığın sürdüğü gösterilmiştir. En önemli apopitotik olay olan kaspaz-3

aktivasyonu olaydan sonraki 24 saat-7 gün içinde oluşur; bu durum apopitosisin

neonatal serebral hasardaki uzamış rolünü göstermektedir.8

Bu çalışmada serbest oksijen radikal sentez inhibitörü olarak ksantin oksidazı inhibe

eden allopürinolün HİE‟de nöroprotektif etki sağlayabileceği hipotezi öne sürülmüş ve

bu amaçla HİE oluşturulan 7-10 günlük rat modelinde kullanımının tedavideki

etkinliğini değerlendirebilmek için beyin dokularından kaspaz-3 ve kaspaz-8 düzeyi

çalışılmıştır.

3

2. GENEL BĠLGĠLER

2.1. Perinatal Asfiksi Ve Hipoksik Ġskemik Ensefalopati

2.1.1. Tanım

Fetal ve neonatal hipoksi ve asfiksi özellikle az gelişmiş ülkelerde sık

karşılaşılan bir sorundur. Perinatal hipoksi-iskemide kan ve dokulardaki oksijen

konsantrasyonu, pH değişiklikleri ve glikoz gibi metabolize edilebilen substratların

konsantrasyonlarındaki değişikliklere bağlı olarak gelişen bir takım olayların tanımına

ihtiyaç vardır. Hipoksi (anoksi), bir veya birkaç organda oksijenin kısmi veya tam

yokluğu, hipoksemi ise kanda oksijen konsantrasyonunun azalmasıdır. Asfiksi plasental

veya pulmoner gaz değişiminin kesilmesi sonucu hipoksemi ve hiperkapninin birlikte

olduğu durumdur. Perinatal asfiksi tanımı hemen her yerde farklı anlamlarda

kullanılmaktadır. Asfıksinin kelime anlamı "nabızsızlık" olup; ancak çok ağır hipokside

görülen kalp yetmezliğini tarifler. Ancak genel olarak perinatal asfiksi, dokuya sunulan

oksijenin doku zedelenmesine yol açacak boyutta azalması (hipoksi-iskemi) sonucu

hipoksemi ve hiperkapninin birlikte olmasıdır. İskemi ise bir organdaki kan akımının

azalması veya kesilmesidir. Bu durumda sadece O2 değil, diğer substratlar da dokuya

erişemez. Fetus veya yenidoğandaki iskemi genellikle sistemik hipoksi-asidoz

sonucunda meydana gelir. Ayrıca kardiyovasküler fonksiyonun deprese olduğu

durumlarda veya okluzif vasküler hastalıklarda da iskemi oluşabilir. Perinatal hipoksi-

iskemiye maruz kalan yenidoğan bebeklerde santral sinir sisteminde belirgin olmak

üzere bir veya birden fazla organ tutulumu olur.1

Yenidoğanda H-İ, çoğunlukla HİE şeklinde bulgu verir ve yenidoğan bebeğin

tüm hayatını etkileyebilen en önemli sorunlardan biridir.

4

2.1.2. Ġnsidans

Sistemik asfiksi insidansı matür bebeklerde % 0,2-0,4 arasındadır. Asfiktik

doğan bu bebeklerin % 20-50‟si yenidoğan döneminde kaybedilmektedir. Yaşayanların

% 25‟inde mental retardasyonun da eşlik edebildiği serebral palsi (CP), öğrenme

güçlüğü veya epilepsi gibi kalıcı nörolojik hasarlar olmaktadır.1

2.1.3. Asfiksi Tipleri

Perinatal asfiksi iki tablo halinde "kronik kısmi" veya "akut tam" asfıksi şeklinde

ortaya çıkmaktadır. Bu iki durum birbirinden klinik ve patolojik özellikler ile ayırt

edilebilir.9 (Tablo 1).

Tablo 1. Perinatal kronik kısmi ve akut tam asfiksinin özellikleri

Kronik – Kısmi Akut - Tam

Riskli durumlar Ablasyo plasenta

Plasental hipoperfüzyon

Uterusta hipertonisite

Ablasyo plasenta

Uterus rüptürü

Kordun tam obstrüksiyonu

Annenin kardiyo-respiratuvar arresti

Asfiksi oluşması için geçen süre 1-3 saat > 10 dk

Serebral kan akımında yeniden

düzenleme

Oluşmuş

Yetersiz

Klinik bulguların çıkışı için

geçen sessiz dönem (6 – 48 saat)

Var

Yok

Beyin ödemi Var Yok

Konvülziyonlar Var Var/Yok

Beyin sapı bulguları Yok Var

5

2.1.3.1. Kronik Kısmi Asfiksi

Hayvanlar üzerinde yapılan çalışmalarda maternal plasental hipoperfüzyon,

uterus hipertonisitesi, ablasyo plasenta, umblikal kord obstrüksiyonu ve fetal

hipoperfüzyon gibi nedenlerle oluşan plasental perfüzyon bozukluklarında, olay bir saat

veya daha uzun sürmüşse fetusta progresif hipoksemi ve asidoz gelişmektedir. Bu

durumu kompanse etmek için vücuttaki kan akımı yeniden düzenlenmekte; kan akımı

vital olmayan organlardan (böbrekler, gastrointestinal sistem, karaciğer, kas ve deri),

vital organlara (kalp, beyin ve adrenaller) yönlendirilmekte ve beyine giden kan akımı

belirgin şekilde artmaktadır. Bu uyum sırasında serebral perfüzyon oldukça iyi

korunmaktadır. Ancak fetal hipoksemi bir süre daha devam ederse, böyle bir

kompansasyon ile sağlanan serebral perfüzyon yetersiz kalmakta ve santral sinir

sistemine giden kan akımında yeni bir düzenleme ortaya çıkmaktadır.9

Serebral hemisferlerde kan akımında azalma olurken, bazal metabolizmanın en

fazla olduğu talamus, beyin sapı ve serebelluma daha fazla kan gönderilmeye çalışılır

(intraserebral şant). Bu durumda serebral hemisferler, özellikle perfüzyonun en uç

noktaları olan parasagittal korteks ve bunun altındaki beyaz cevher hipoksemiden

etkilenmeye başlar, küçük infarktlar veya lokal konvülziyon odakları gelişir, olay daha

da ilerlerse bütün serebral hemisferleri etkileyen infarkt alanları ortaya çıkar.10

Yenidoğan bebeklerde ortaya çıkan klinik bulgular kan akımındaki bu

değişikliklere bağlı olmakta, birçok organda hipoksik-iskemik zedelenme

görülmektedir. Olguların üçte ikisinde beynin yanı sıra en az iki organ da etkilenmiştir.

Kliniğimizde 1995-1999 yılları arasında izlenen 205 HİE‟li bebeğin % 40,5‟inde

böbrek, % 30,7‟sinde karaciğer, % 20‟sinde akciğer ve % 5‟inde de kardiyovasküler

sistemde etkilenme olduğu görülmüştür.11

Nörolojik bulgular, hipoksik-iskemik zedelenmenin derecesine, süresine ve

dağılımına bağlıdır. Bebek doğumdan hemen sonra beyin zedelenmesi ve metabolik

asidoz nedeni ile depresedir. Hipotoni, letarji ve konvülziyonlar görülebilir. Hipotoni

çok ağır olabilir. Ancak dakikalar veya saatler içinde bebeğin aktivitesi ve tonusunda

artma olur, spontan ve uyarılarla tremorlar görülebilir. Konvülziyonlar genellikle 6-12

saat sonra ortaya çıkar, hemen her zaman hayatın ilk günü içinde görülür.

6

Konvülziyonların sıklığı giderek artar ve başlangıçta genellikle tedaviye dirençlidir. 2-5

gün sonra konvülziyonlar azalır veya tamamen ortadan kalkar ve ilaçla kontrol edilebilir

duruma gelir. Ağır zedelenme olan vakalarda şiddetli beyin ödemi bulguları vardır. Kafa

içi basınç artmasının bulguları (fontanelde bombeleşme, suturalarda açılma gibi)

genellikle 24 saat sonra başlar, 48. saatte en şiddetli düzeydedir. Bu hastalarda yeniden

hipotoni gelişir, bebeğin hareketleri azalır veya ortadan kalkar. Beyin sapı disfonksiyonu

bulguları (sabit pupiller ve apne gibi) vardır.9

Serebral hemisferlerdeki infarkt yaygınsa, özellikle beyin ödemi bulguları varsa,

lateral ventriküller kompresedir, serebral beyaz cevher ekojenitesinde yaygın artış olur,

serebral gri cevher (korteks ve bazal ganglionlar) ile beyaz cevher arasındaki görünüm

farklılığı ortadan kalkar. Bir iki hafta sonra hemisferlerdeki nekroz alanları belirginleşir

ve sonunda multikistik ensefalomalazi veya serebral hemisferlerin total obliterasyonu

olur. Talamus, beyin sapı ve serebellum ise daha iyi korunmuştur.9

2.1.3.2. Akut Tama Yakın Asfiksi

Bu durumda olay akuttur, hipoksemi ani ve şiddetlidir. Olay hızlı geliştiğinden

organlar arası ve beyin içindeki kan dolanımının yeniden düzenlenmesi yetersizdir.

Buna bağlı olarak hipoksik-iskemik zedelenme bulguları, metabolik aktivitenin fazla,

enerji depolarının az olduğu yerlerde daha fazla görülür. Talamus ve beyin sapı

nükleusları belirgin derecede etkilenirken, serebral hemisferler daha iyi korunmuştur,

beyin ödemi görülmez. Kısmi asfiksidekinin tersine nörolojik bulguların (konvülziyon

ve beyin ödemi) ortaya çıkması için nisbeten sessiz geçen dönem görülmez. Hayvanlar

üzerinde yapılan çalışmalarda, olay on dakikadan kısa sürerse, beyin zedelenmesi

bulgularının tamamen düzeldiği gösterilmiştir. 10-25 dakika kadar sürdüğünde talamus

ve beyin sapı nükleuslarında ağır zedelenme görülür. 25 dakikadan uzun süren

durumlarda ise ağır kardiyak zedelenme de olduğu için geriye dönüşümsüz vasküler

kollaps gelişir.9

İnsanlarda tama yakın asfıksi çok seyrektir; ancak tam ablasyo plasenta, akut tam

kord obstrüksiyonu, uterus rüptürü, maternal kardiyorespiratuvar arrest gibi durumlarda

görülebilir. Bazı vakalarda ise hiç bir neden bulunamaz. Bununla birlikte bu vakaların

7

bir çoğunda daha önceden başlamış kısmi asfıksi bulguları da vardır. Ağır derecede

etkilenmiş bebekler doğduklarında deprese ve bradikardiktir, resüsitasyon gerekir.

Spontan solunumları uzun süre yoktur. Konvülziyonlar ve uzun süren stupor görülür.

Beyin ödemine bağlı kafa içi basınç artışı bulguları yoktur. Beyin sapı disfonksiyonu

bulguları 24 saat kadar sonra ortaya çıkar. Sabit pupiller, okulosefalik refleks yokluğu

(orta-beyin, pons zedelenmesi), kornea refleksi yokluğu (pons zedelenmesi), öğürme

refleksinin kaybı, dilde fasikülasyonlar (medulla spinalis zedelenmesi) görülebilir. Bu

bulgular bebek uyanık iken biraz düzelme gösterse bile genellikle kalıcıdır. Öğürme

refleksinin azalması nedeni ile beslenme ve yutma bozuklukları görülür, nasofarenkste

biriken sekresyonlar sorun olur ve bu nedenle bebeğin entübe edilmesi gerekebilir.

Beyin dışı organlardaki zedelenme bulguları daha hafiftir.9

2.1.4. Patoloji

Hipoksi-iskemi‟den sonra, beyinde tek tip patolojik lezyona rastlanmaz.

Hücrelerin metabolik ihtiyacı zamanında karşılanamadığında “hücre ölümü” meydana

gelir. Beyindeki hasarın şekli bazı faktörlere bağlıdır:

1. Asfiksiye yol açan olayın şiddeti (tam veya kısmi)

2. Etiyolojik faktörün zamanı ve süresi (akut veya kronik)

3. Beynin gelişimsel olgunluğu (prematüre veya matür)

4. Beyinde bölgesel duyarlı bölümler (vasküler faktörler ve N-metil-D-aspartat

(NMDA) reseptörlerinin dağılımı).12

Beyin zedelenmesinin ne zaman olduğu ile ilgili yapılmış çalışmalar az olmakla

birlikte histolojik incelemelerle lezyonun yaşı konusunda bilgi edinilebilir.9 (Tablo 2).

Hipoksik iskemik ensefalopati‟de gelişebilen başlıca serebral lezyonlar:

1) Selektif nöronal nekroz

2) Bazal ganglion ve talamusta status marmoratus şeklinde lezyon

3) Parasagital serebral hasar

4) Periventriküler lökomalazi (PVL)

5) Periventriküler- İntraventriküler kanama (PV-İVK)

6) Fokal ve multifokal iskemik beyin hasarıdır (10)

8

Tablo 2. Fetus veya yenidoğan beyninin hipoksik-iskemik hasara cevabı

Bulgu Gün

Reaktif astrositozis 0,5 – 4

Mikroglial proliferasyon 0,3-3

Nöronal karyoreksis 0,5-2

Makrofaj infiltrasyonu 4-6

Kapiller endotelyal reduplikasyon 5

Fibriller gliosis 6

Kist oluşumu 10-42

Matür bebekte görülen hipoksik-iskemik beyin hasarında selektif nöron nekrozu,

parasagittal zedelenme ve fokal iskemik beyin nekrozu görülür. Bunların arasında esas

olan selektif nöron nekrozudur. Prematür bebekte görülen oligodendroglial/beyaz

cevher hasarı matür bebekte de görülmekle birlikte nöron hasarı daha baskındır.

Hipoksik iskemik ensefalopati esas olarak matür bebeklerde geliştiği için burada daha

çok nöron nekrozuna neden olan patolojik biyokimyasal olaylardan bahsedilecektir.

2.1.5. Prematür ve Matür Yenidoğanlarda Perinatal Hipoksik-Ġskemik

Beyin Hasarının Patogenezi

Hipoksi-iskemi prematür ve matür bebeklerde değişik nöropatolojik olaylara yol

açar. Matür bebeklerde esas olay nöron hasarı iken prematür bebeklerde

oligodendroglial/beyaz cevher hasarı daha hakimdir. Hipoksik-iskemik hasardan sonra

ortaya çıkan, hücre yıkımına yol açan biyokimyasal olayları anlamak bu hasarın

önlenmesi için önemlidir.

Hipoksik-iskemik olaylardaki nöron hasarına yol açan olayların patogenezi Şekil

1‟de gösterilmiştir. İlk oluşan olay glikoz ve oksijenin azalmasıdır. Hücre ölümüne

neden olan olaylar hipoksik-iskemik olayın sonlanmasından sonra ve reperfüzyon

sırasında enerjide çok da fazla düşüş olmasını beklemeden olur ve bunu glutamat

9

reseptörlerinin aktivasyonu izler. Nöron ölümüne neden olan diğer olaylar sitozolik

kalsiyumun artması ve kalsiyuma bağlı süperoksit anyon, hidroksi radikaller gibi serbest

radikallerin ve nikrik oksit derivelerinin oluşması gibi çeşitli zararlı olayların aktive

olmasıdır. Nöron ölümüne neden olan olaylar kaskadı hipoksik-iskemik hasarın

sonlanmasından birkaç saat sonra oluşur. Bu nedenle bu dönemde beyin hasarını

azaltabilecek veya daha kötü olmasını engelleyebilecek önemli girişimler yapılabilir.13

10

ġekil-1. Hipoksik-iskemik serebral hasar patogenezine genel bakış

Ca↑

ADENOZĠN

HĠPOKSANTĠN

KSANTĠN

KSANTĠN OKSĠDAZ

ATP BAĞIMLI CA KANALLARI SĠSTEMĠ VE

OKSĠDATĠF FOSFORĠLASYON

NĠTRĠK OKSĠT SENTAZ

LĠPAZ

PROTEAZ MĠKROTÜBÜL AYRIMI

NÜKLEAZ

SERBEST RADĠKALLER

MEMBRAN HASARLANMASI

ARAġĠDONAT

MĠKROFLAMENT AYRIġMASI

HÜCRE ÖLÜMÜ

EKAZANOĠDLER

ĠSKELET AYRIġMASI

ATP↓

11

2.1.5.1. Hipoksemi

Intrauterin dönemde fetus, parsiyel oksijen basıncının (PO2) 22-28 mmHg arasında

olduğu fizyolojik hipoksemik bir ortamda yaşar. PO2 15 mmHg‟e kadar düştüğü

değerlerde normal kardiyovasküler fonksiyonun bir kaç saat devam edebildiği, kalp

hızının ve sistemik kan basıncının düşmesi ile birlikte ilerleyici laktik asideminin oluştuğu

gösterilmiştir. Dokuda yüksek enerjili fosfat rezervleri (özellikle ATP), hipoksemi

esnasında oldukça iyi korunur. Ancak sistemik hipotansiyona hipoksemi eşlik ediyorsa ve

serebral iskemi oluşmuşsa beyin hasarı olma şansı yüksektir.1

2.1.5.2. Hipoksi-Ġskemi

Hipoksinin meydana getirdiği beyin zararlanmasında doku O2‟nin azalmasına ek

olarak bir veya daha fazla faktörün rol oynadığı düşünülmektedir. Hayvanlardaki ilk

çalışmalar Myers ve ark.14,15

tarafından yapılmıştır. Annelerinin abdominal aortası

sıkıştırılarak asfiksi yaratılan miadındaki maymun fetüslerde iyileşmeyi takiben esas

olarak serebral hemisferlerde zararlanma olduğu gösterilmiştir. Kortikal gri cevherde

atrofi, beyaz cevherde skleroz ve bazal gangliyonlarda status marmoratus şeklinde

hasarlanma gözlenmiştir. Benzer lezyonlar perinatal periyotta serebral H-İ gelişen yaşayan

bebeklerde de saptanmıştır. Bu çalışmalara ek olarak Brann ve Myers, gaz anestetik ve

haloten ile annelerinde hipotansiyon yaratarak parsiyel intrauterin asfiksiye maruz

bıraktıkları miadındaki maymun fetüslerinde ağır hipoksemi ile birlikte kombine

metabolik ve respiratuvar asidoz olduğunu tespit etmişlerdir. Doğumu ve resüsitasyonu

izleyerek maymunların mekanik ventilasyona gereksinim duydukları, konvülziyon

geçirdikleri ve 96 saatten önce stabilize olmadıkları görülmüştür. Yapılan nöropatolojik

analizlerde yaygın beyin ödemi ve soluklukla birlikte, hemorajik nekrozun özellikle

serebral korteks ve subkortikal beyaz cevherde oluştuğu gösterilmiştir. Sistemik kan

basıncı daha düşük olan maymunlarda asfiksinin daha ağır beyin zararlamasına yol açtığı

görülmüştür.16

Hipoksik kardiyovasküler depresyon sonucu sistemik hipotansiyon

oluşması için O2 basıncının veya içeriğinin % 40 veya altında olması gerekmektedir.

Hipoksemi esnasında kan basıncı daha düşük olduğunda serebral iskemi daha da artmakta

ve beyin hasarı daha ağır olmaktadır.1

12

Beyinde hasarının oluşabilmesi için serebral H-İ‟nin en az ne kadar sürmesi

gerektiği sorusu en önemli sorudur. Bu sorunun yanıtı serebral H-İ‟nin ağırlığına, olayın

olduğu zamanki beynin anatomik ve fonksiyonel maturasyonuna bağlıdır. Hipoksi-iskemi

esnasında daha matür hayvanlarda beyin hasarı daha kısa total asfiksi süresinde meydana

gelmektedir. Kısmi serebral H-İ‟de bu süre daha uzun olmaktadır. Hayvanlarda yapılan

deneylerde bu süre muhtemelen üç saatten daha fazla değildir. Üç saatten daha az H-İ‟ye

maruz kalan hayvanların başarılı bir şekilde canlandırıldığı görülmüştür.1

Sistemik hipoksemiye bağlı serebral iskeminin meydana getirdiği beyin hasarı

deneysel verilere ek olarak klinikte de radyografik bulgular, prognoz ve postmortem

sonuçlar ile değerlendirilmiştir. Yapılan çalışmalarda hipoksemi ile birlikte sistemik

hipotansiyonun özellikle prematür bebeklerde subkortikal veya PVL‟ye neden olduğu

tespit edilmiştir. Miall-Allen ve arkadaşları17

, 31 haftanın altındaki 33 yenidoğan bebekte

ortalama arteriyel kan basıncının bir saatten daha fazla 30 mmHg‟nın altında seyretmesi

durumunda periventriküler beyaz cevherde ağır hemorajik infarkt veya iskemi geliştiğini

göstermiştir. Ortalama arteriyel kan basıncı 30 mmHg üzerinde olan bebeklerde ise daha

az lezyon gelişmiştir.

2.1.5.3. Beyin Hasarının Patogenezinde Hücresel Mekanizma

2.1.5.3.1. Enerji DönüĢümü

Serebral hipoksi-iskemisi olan hayvan ve insan yenidoğanlarında H-İ sırasında

serebral enerji yetmezliği bifaziktir. Hipoksi-iskemi sırasında primer enerji

yetmezliğinin ardından gelişen ve enerjinin kısmen geri kazanıldığı bir reperfüzyon

devresi vardır. Ancak yaklaşık 24 saatlik bir latent süre sonunda yeterli serebral

perfüzyon ve oksijenizasyon olmasına rağmen ikinci bir enerji yetmezliğinin olduğu

dönem gelişir. Latent faz döneminde gecikmiş hücre hasarı oluşur. Bu dönem

çalışmaların yoğun olarak yapıldığı ilgi çeken bir dönemdir.13

ATP tüm hücrelerde olduğu gibi nöronlarda da primer enerji kaynağıdır. İki yüksek

enerjili fosfat bağı biyokimyasal reaksiyonlar ve fizyolojik olaylarla yakından ilişkilidir.

ATP enerji tüketen reaksiyonlarda ve iyon pompalanması gibi fizyolojik işlemlerde

13

önemli rol oynar. Böylece hücresel serbest enerji ile nöronal canlılık ve spesifik

fonksiyonlar sağlanır. Fizyolojik şartlar altında hücresel ATP stabil halde bulunur. ATP

tüketim hızı ATP üretim hızı ile tam bir denge halindedir. Hücrenin ATP içeriğini devam

ettirme yeteneği enerji ihtiyacının arttığı durumlarda bile biyokimyasal işlemlerle ATP

üretimine imkan verir. ATP üretimi en fazla nikotinamid adenid dinükleotid‟in (NAD)

oksidatif fosforilasyonu ile oluşur. Bu olay mitokondrilerin içinde gerçekleşir. Ayrıca

substrat fosforilasyonu ile mitokondri ve sitozol içinde de küçük miktarlarda ATP oluşur.

Hücresel ATP‟yi sabit tutan diğer iki mekanizma, birbirleri arasında basit enerji

transferinin olduğu kreatinin fosfokinaz ve adenilat kinaz eşitliğidir.1

Doku O2 basıncı kritik bir değer altına indiğinde (<0.1 mmHg) mitokondrinin

sitokrom sistemleri ansatüre hale gelir. Redükte ajanlar (NADH, flavin adenin

dinükleotid) birikmeye başlar. Oksidatif fosforilasyonla oluşan ATP üretimi durur.

Hücresel adenozin difosfat (ADP) ve adenozin monofosfat (AMP) seviyeleri artar. ADP

ve AMP‟nin yükselmesi, anahtar regülatuvar enzim olan fosfofruktokinazı (FPK) aktive

ederek glikolizi stimüle eder. Oksidatif fosforilasyonda bir glikozun yıkımı ile 36 mol

ATP üretilirken, subtrat fosforilasyonu ile 2 mol ATP üretilir. ATP üretimi 18 kat azalmış

olur. Glikoliz maksimum olarak stimüle olduğunda, kapasite en çok 4-5 kat artar, bu

sırada biriken NADH‟tan ortaya çıkan H+ iyon birikimi PFK aktivitesini inhibe eder.

1

Böylece glikoliz, parsiyel oksijen yokluğunda oksidatif fosforilasyonu stimüle

edebilmesine karşın, hiçbir zaman mitokondriyal oksidasyonun yerini dolduramaz.

İrreversibl doku hasarı sonucu oluşan serebral H-İ‟de beynin enerji durumunda

genellikle belirgin değişiklikler söz konusudur. Değişiklikler sadece adenin nükleotidlerde

oluşmaz, ayrıca fosfokreatininde de meydana gelir. Böylece ATP, ADP ve AMP‟de de

değişiklikler oluşur. Hipoksi-iskemi esnasında erken dönemde doku yüksek enerjili fosfat

rezervlerinin konsantrasyonunda değişiklikler meydana gelir ve iyileşme periyoduna

kadar sürer. ATP ve total adenilat bileşiklerinin konsantrasyonları resüsitasyondan sonra

tamamen normal seviyeye gelmez. Doku hasarına bağlı olarak kısmi eksiklik devam eder.1

Hipoksi-iskemi esnasında hücrede ATP‟nin azalması enerji gerektiren diğer

metabolik olayları da etkiler. ATP‟ye bağımlı Na pompası ve değişimi, Na‟un hücre içinde

birikimine neden olarak sitotoksik ödeme yol açar.1

14

Beyin hücrelerinin gecikmiş hasarında mitokondrilerin disfonksiyonu önemli rol

alır. Serebral H-İ‟den hemen sonra mitokondriyal solunum hızı deprese olur ve ancak

olaydan 8 saat kadar sonra, kısmen düzelir. Enerji yetmezliğinin başlangıcında nöron

markırı olan mikrotübül-ilişkili protein‟de (microtubule-associated protein) orta

derecede bir azalma fakat kaspaz-3 aktivasyonunda minimal bir artış vardır.

Mitokondriyal solunum hızındaki gecikmiş düşüş olaydan 24 saat sonra en alt düzeye

iner ve belirgin kaspaz-3 aktivasyonuna ve nöronal zedelenmeye yol açar. Kaspaz-3‟ün

aktivasyonu ile mitokondriyal disfonksiyon ve apopitosis arasında önemli bir ilişki

olduğu gösterilmiştir.18

2.1.5.3.2. Serbest Radikal OluĢumu

Beyin, özellikle çoklu doymamış yağ asidleri (PUFA) açısından zengin olup

serbest radikal atıklarına karşı oldukça duyarlıdır. Serbest demir ve nitrik oksit (NO)

önemli oksidatif maddeler olup daha toksik serbest radikal üretimine yol açabilirler. Bu

reaksiyonlar sonucu oluşan ürünlerin eliminasyonu hidrojen peroksit (H2O2), superoksit

veya katalist reaksiyonu ile sağlanır.1

Serbest oksijen radikalleri (SOR) hipoksi-iskemi esnasında bir kaç yolla meydana

gelir. Kısmi H-İ esnasında dokuda düşük konsantrasyondaki O2 sitokrom oksidaz ile

elektron alışverişine girerken proksimal basamaklarda serbest radikal oluşturur. Oluşan bu

O2 serbest radikalleri, mitokondri ve sitoplazma tarafından tüketilemez. Yenidoğanların

özellikle prematüre bebeklerin superoksit dismutaz ve glutatyon peroksidaz gibi

antioksidanları beyinde rölatif olarak eksiktir. Beyin bu nedenle serbest radikal hasarından

daha fazla etkilenir. Prematüre bebeklerde ayrıca glutatyon seviyeleri düşüktür ve demiri

sekestre edecek yeterli transferrin yoktur.1

2.1.5.3.3. Eksitatör Nörotransmitterlerin Nörotoksisitesi

Son zamanlarda yapılan in-vitro ve in-vivo çalışmalarda hipoksik-iskemik hasarın

oluşumundaki major faktörlerden birinin glutamat toksisitesi olduğu gösterilmiştir. Bu

özellikle glutaminerjik nöronlar ile inerve edilen sinir hücrelerinde belirgindir.1

15

İmmatür ve erişkin beyninin belirli bölgelerinde glutamata yanıt veren özel

reseptörlerin bulunduğu yerler tanımlanmıştır. Bu bölgeler: serebral korteksin orta

tabakaları, striatum ve özellikle hipokampusun CA1 bölgeleridir. Glutamat tarafından

aktive edilebilen en az üç membran reseptörü vardır. Bunlar kainik asit, quisqualik asit

(QA) ve NMDA‟dır. Son zamanlarda bulunan bir diğer reseptör QA reseptörünün bir

benzeri veya subtipi olan alfa amino 3-OH 5-metil 4 isoksazol propronat reseptörüdür. Bu

reseptör ve bunların subünitleri plazma membranı boyunca elektrokimyasal gradientten

bağımlı veya bağımsız olarak iyon geçişine izin vererek kanalların çalışmasını sağlar.

Eksitatör aminoasitlerin toksik etkisi kısmen nöronal plazma membranı boyunca iyon

geçişini değiştirmesinden kaynaklanmaktadır.1

2.1.5.3.4. Ġntrasellüler Kalsiyum Yüklenmesi

Kalsiyum, bir çok yerde bulunduğu için intrasellüler ikinci bir messenger olarak

düşünülür. Bu iki değerlikli katyon, çeşitli hücresel reaksiyonlarda kofaktör olarak rol alır.

İntrasellüler Ca+2

dengesinin bozulmasının, nöronal metabolizma ve fonksiyon üzerine

belirgin etkisi vardır.

Hücre içinde kalsiyum konsantrasyonu sıkı bir şekilde regüle edilir. Kalsiyumun %

100‟e yakını subsellüler organellere bağlıdır. Normalde serbest Ca+2

çok düşük

düzeylerdedir. Kalsiyumun fizyolojik ekstrasellüler seviyeleri plazma membranı boyunca

serbest kalsiyumun hücreye giriş çıkışına imkan verir. Primer olarak intrasellüler Ca+2

‟un

bağlandığı yerler mitokondri ve endoplazmik retikulum, daha az miktarda nöronun plazma

membranı ve nükleusudur. Bağlanma enerjiye (ATP) bağımlı ve intrasellüler pH‟dan

etkilenen bağımsız olaylar ile oluşur. Ayrıca sitozol içinde Ca+2

bağlayan spesifik

proteinler de bulunur ve bunlar serbest Ca+2

konsantrasyonlarının düşük olmasını sağlar.1

Hipoksi-iskemi‟de serbest Ca+2

‟un sitozolde konsantrasyonu artar. Bu

yükselmenin iki kaynağı olduğu sanılmaktadır:

1. Kalsiyumun intrasellüler depolardan serbest hale geçmesi

2. Plazma membranı boyunca geçişinin artması

Bu nedenlerle sitozolik serbest Ca+2

toksik seviyelere erişir. Kalsiyum

dengesindeki değişikliklerde meydana gelen bu mekanizmalar Ca+2

ile ilgili biyokimyasal

16

reaksiyonlarda bozukluklara neden olur ve nöronun canlılığının devamı etkilenir. Bu

reaksiyonlar arasında çeşitli lipaz, proteaz ve endonükleaz reaksiyonlarının etkilenmesi

sayılabilir. Ayrıca fosfolipaz C‟nin aktivasyonu oldukça önemlidir. Kalsiyum, ksantin ve

prostoglandin oluşumu ile serbest O2 radikallerinin oluşumuna da yardım eder. Nihayet

intrasellüler serbest Ca+2

‟un yüksek konsantrasyonları mitokondride oksidatif

fosforilasyonun kesintiye uğramasına neden olur. Fazla miktarda Ca+2

birikiminin toksik

etkileri nöron ölümü ve membran bütünlüğünün bozulması için bir nedendir.1

2.1.5.3.5. Nitrik Oksit Toksisitesi

Yeni deneysel çalışmalar NO gibi serbest radikal gazların, hipoksik-iskemik beyin

hasarının oluşmasına neden olan veya yol açan metabolik olayların gidişini etkilediğini

düşündürmektedir. Nitrik oksit, katalitik sitozolik bir enzim olan NO sentetaz ile L-

arginin‟in sitrulin‟e dönüşümü esnasında oluşur. Beynin seçilmiş nöronlarında üretilir.

Nitrik oksit üretimi glutamatın NMDA reseptörleri gibi, eksitatör amino asit yüzey

reseptörlerinin aktivasyonu ile ilişkilidir. Bunların aktivasyonu Ca+2

‟un hücre içine

girişine neden olarak kalmoduline bağlanmasını sağlar. Nitrik oksit çeşitli metabolik

olayları, primer olarak da siklik guanozin monofosfat‟ın oluşumu ile guanilat siklaz gibi

ikincil messenger enzimin aktivasyonunu bozarak etkiler. Nitrik oksit yüksek

konsantrasyonlarda nörotoksik bir ajan gibi rol alır ve beyinde amino asit eksitotoksitesi

için son yolu oluşturur. Nitrik oksit glikolitik enzimlerden gliseraldehid 3 fosfat

dehidrogenazı inaktive eder. Glikolitik yoldaki kesinti ATP‟nin sitozolik üretimini azaltır,

daha sonra mitokondride enerji üretimi için kullanılacak olan substrat üretimi de azalmış

olur. Nitrik oksit ayrıca mitokondriyal elektron transport zincirini ve Krebs siklusu enzimi

olan akonitazı inhibe ederek oksidatif metabolizmayı bozar.1

2.1.5.3.6. Ġntrasellüler Asidoz

Beyinde hasar oluşturacak kadar yeterli H-İ, hemen daima doku asidozu ile

birliktedir. Bunun nedeni laktik asid birikimidir. İntrasellüler laktik asidoz, glikozun

oksidatif metabolizmasının kısmi veya total anaerobik glikolize dönüşümü sonucu oluşur.

17

Bu olay esnasında doku O2‟i çok düşük seviyelere iner. Bunun yanında bazı araştırıcılar

beyindeki laktik asidozun hipoksik-iskemik hasarın major nedeni olduğunu, irreversibl

hasarın oluşması için beyin dokusunun her kilogramı başına minimum 15-20 mmol laktat

oluşması gerektiğini öne sürmüşlerdir. Ancak yapılan bazı araştırmalarda immatür

hayvanlarda serebral laktik asidozun beyin hasarı oluşmasında kritik rolününün

bulunmadığı yönünde bulgular da elde edilmiştir.1

Hipoksi-iskemide laktik aside ek olarak H+ iyon kaynakları da hücresel asidoza

neden olmaktadır. İndirgenmiş ekivalanların major kaynağını, ATP‟nin asit hidroliz

ürünleri ve hücresel enerji kaybı ile biriken NADH ve H+

oluşturmaktadır.1

Hipoksi-iskemi esnasındaki hücresel asidoza bağlı nöronal nekrozdan değişik

mekanizmalar da sorumlu olabilir. Bunlar arasında mitokondriyal fonksiyonun

inhibisyonu, iyon dengesinin bozulması, Ca+2

birikimi ve ödem oluşumunun artışı

sayılabilir.1

2.1.5.3.7. Apopitosis

İmmatür kemiricilerde son yıllarda yapılan çalışmalarda gecikmiş hücresel hasar

çalışılmıştır.19

Nekrotik ve apopitotik mekanizmalar arasındaki ayrım tam olarak

yapılamamıştır, olayın daha önce sanılandan çok daha karmaşık olduğu görülmüştür.

2.1.5.3.8. Ġnflamasyon

Hipoksik-iskemik olay beyaz cevher hasarında iyi tanımlanmış bir neden

olmasına rağmen son yıllarda özellikle prematürelerde yapılan epidemiyolojik ve

deneysel çalışmalardan inflamasyon ile PVL ve serebral palsi arasında yakın ilişki

olduğu görülmüştür. Hipoksi-iskemide de olduğu gibi sitokinlerden en fazla zarar

görenler immatür oligodendrositlerdir.20

18

2.1.5.3.9. Sitokinler

Proinflamatuvar sitokinler birkaç değişik mekanizma ile beyin hasarına neden

olurlar. İnflamatuvar sitokinler direk serebral sitotoksik etki göstererek oligodendrosit

öncüllerinin farklılaşmasını önlerler, oligodendrosit apopitosisini stimüle ederler ve

vakuoler myelin dejenerasyonuna neden olurlar. Sitokinlerin uzun süren vazomotor ve

vazooklusif etkileri olabilir.20

Dolaşımdaki sitokinler maternal, fetal ve neonatal

enfeksiyon ve iskemi sonucunda oluşabilirler. Son çalışmalar sitokin toksisitesinin

glutamat transportundaki bozukluklar nedeni ile olabileceğini göstermiştir.21

Astrositler

glutamatı 1000 kat konsantre etme yeteneğine sahip oldukları için ekstrasellüler

glutamat regülasyonunda önemlidir. Glial kültürlerde proinflamatuvar sitokinlerden

interlökin- 1β (IL-1β) ve Tümör Nekrozis Faktör- α‟nın (TNF-α) glutamat

transportörünün fonksiyonunu bozdukları ve glutamat aracılıklı oksidatif stresi

arttırdıkları gösterilmiştir.21

Buna karşın bu etkiyi, anti-inflamatuvar olan IL-4 ve IL-10

pro-inflamatuvar sitokinlerin üretimini engelleyerek indirek yoldan inhibe eder.

Astrositlerin glutamatı temizleme kapasitesindeki bozukluk antioksidanlar, vitamin-E ve

glutatyonlar ile düzeltilebilir. Bu durum, astrositik glutamat transportörlerinin serbest

radikaller ile kısmen de olsa hasarlandığını göstermektedir.20

2.1.6. Hipoksik Ġskemik Beyin Hasarının Önlenmesindeki Mevcut Değerli

GiriĢimler

Son çalışmalarda H-İ‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen sürenin çok kritik

olduğu görülmüş ve bu dönem terapötik pencere olarak adlandırılmıştır. Bu dönemde

oluşan hücre ölümüne neden olan moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte

çok yararlıdır. Fetüste ve yenidoğan bebekte olayın başlangıç zamanını ve ağırlığını

bilmek zordur. Miadındaki yenidoğanda H-İ‟e neden olan intrauterin asfiksinin ne

zaman beyin hasarına yol açtığını belirleyen bir metot henüz yoktur. Benzer şekilde

beyin hasarlarının daha çok postnatal dönemde olduğu prematürelerdeki beyin hasarı

genellikle bulgu vermez veya sessizdir. Bu nedenle hem prematürelerde hem de term

bebeklerde beyin hasarının geç tespit edilmesi terapötik pencere döneminin

kaçırılmasına neden olur.13

19

Tablo 3‟de hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesinde değerli olan mevcut

girişimler gösterilmiştir.13

2.1.6.1. Enerji kaybının azaltılması

Enerji kaybı çok ciddi olmasa dahi iskemiden sonra nöron ölümüne yol açan

kaskadı başlatan olaydır. Bu nedenle glikozun fizyolojik düzeylerde tutulmasının önemi

büyüktür. Ancak yüksek düzeyde glikoz seviyelerinin de zararlı olduğu gösterilmiştir.

Glikoz düzeyleri normal değerlerin çok üstüne çıktığında serebral laktat düzeyleri

yükselmektedir. Yüksek doz barbitüratın serebral metabolik hızı azalttığı ve böylece

enerjinin korunmasını arttırdığı bilinmektedir.22

Hafif hiperkapninin de hayvan

modellerinde enerji kaybının azaltılmasında koruyucu etkisinin olduğu gösterilmiştir.23

Enerji tüketiminin azaltılmasında en umut verici girişim hafif hipotermi gibi

görünmektedir. Hafif hipoterminin H-İ‟deki yararlı etkisi bir çok çalışmada

gösterilmiştir.13

Hemen hemen tüm çalışmalarda hipotermi H-İ sırasında veya

reperfüzyondan hemen sonra veya her iki dönemde birden uygulanmıştır. Hafif

hipoterminin reperfüzyondan saatler sonra gelişen ikincil enerji yetersizliğini de azalttığı

gösterilmiştir.24

2.1.6.2. Glutamat salınımının inhibisyonu

Glutamatın ekstrasellüler birikimi hem nöronal hem de oligodendroglial hücre

ölümünde önemli olduğu için artmış glutamat salınımı H-İ‟de önemlidir. Glutamat

salınımı presinaptik sinir uçlarından kalsiyum aracılığı ile olur ve magnezyum bu olayı

bloke eder. Kalsiyum kanal blokörleri veya magnezyum bu basamakta yararlı olabilir.13

Kültüre edilmiş nöronlarda ve yenidoğan domuzlarda yapılmış çalışmalarda hafif

hipoterminin nöroprotektif etkisinin bir kısmından sinaptik sinir uçlarından glutamat

salınımının inhibe edilmesi sorumlu bulunmuştur ancak başka çalışmalarda böyle

olduğu gösterilememiştir.13

Serbest radikal tutucularının nöroprotektif etkisi, kısmen glutamat salınım

düzeyinde etki göstermesine bağlıdır. Çünkü bazı modellerde serbest radikallerin

nöronal glutamat salınımını arttırdığı görülmüştür.13

Ayrıca fenitoin ve lamotrijinin de

20

H-İ‟de yararlı etkisinin görülmesi bu antikonvülzanların glutamat salınımını inhibe

etmesinden kaynaklanmaktadır.25,26

2.1.6.3. Glutamat alınımındaki bozukluğun iyileĢtirilmesi

Hipoksi-iskemi‟de ekstrasellüler glutamat artışının nedeni sadece artmış salınım

değil aynı zamanda astrosit ve presinaptik sinir uçlarından alımın bozulmasıdır.

Hipotermi, iskemi nedeni ile astrositlerde enerji bağımlı glutamat alımındaki bozukluğu

azaltarak bir miktar nöroprotektif etki gösterebilir.13

2.1.6.4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi

NMDA reseptör antagonistlerinden özellikle MK-801, magnezyum; ketamin ve

destrofan‟ın iskemik nöron hasarının değişik modellerinde hem kültür hem de in-vivo

şartlarda nöroprotektif etkisi olduğu gösterilmiştir. Benzer şekilde bazı modellerde non-

NMDA (AMPA/kainate) antagonistlerinin (örn.NBQX, CNQX) kullanımı ile ek yararlı

etki gösterilmiştir. Bu ajanlar hasardan birkaç saat sonra veya hasarın sonlanmasından

hemen sonra uygulandığında nöroprotektif özellikleri belirgindir.13

Non-NMDA reseptörlerin inhibisyonu sadece nöronal zedelenmeyi değil aynı

zamanda oligodendroglial zedelenmeyi de inhibe eder. Son çalışmalar AMPA/kainate

reseptörlerinin aktivasyonunun kültüre oligodendrositlerin ve in-vivo çalışmalarda

oligodendrogliaların ölümüne neden olduklarını göstermiştir. Bu bulguların hepsi birden

değerlendirildiğinde glutamatın hem reseptör hem de non-reseptör aracılıklı

mekanizmalar ile immatür oligodendroglialara toksik etki gösterdiği görülmektedir.13

2.1.6.5. Lökosit/mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu

Lökosit adherasyonu, mikroglial aktivasyon ve sitokin etkisi hipoksik-iskemik

beyin hasarında önemli görünmesine rağmen perinatal modellerde bu düzeyde

nöroproteksiyon ile ilgili çalışmalar azdır. İn-vivo perinatal hipoksik iskemik hasarda,

H-İ öncesi yaratılan nötropeninin yararlı etkisi olduğu gösterilmiştir. İskemi/reperfüzyon

21

ile artan, platelet aktive edici faktör (PAF) lökosit adezyonunda ve daha sonra gelişen

inflamatuvar kaskatta önemlidir. İmmatür ratta PAF antagonistinin hem tedavi öncesi

hem de tedavi sonrası örn. reperfüzyondan sonra uygulanmasının infarkt sahasını

azalttığı gösterilmiştir. Erişkin hayvanlarda yapılan çalışmalarda lökosit adezyon

moleküller veya değişik sitokinler üzerine etki eden antikor veya ilaçların önemli

nöroprotektif etkisi olduğu görülmüştür.13

Mikroglia/makrofajların önemli bir ürünü IL-

1β‟dır. IL-1β, TNF-α‟yı da içeren diğer proinflamatuvar sitokinlerin salınımını sağlar.

Yenidoğan ratta H-İ‟de IL-1β reseptör antagonistinin olaydan önce ve reperfüzyon

sırasında kullanılmasının yararlı etkileri olduğu gösterilmiştir.27

Benzer şekilde, bir

fosfodiesteraz inhibitörü olan, H-İ‟den sonra beyinde arttığı bilinen ve TNF-α üretimini

inhibe eden pentoksifilin‟in H-İ‟den hemen önce uygulandığında hipoksik-iskemik

hasarı azalttığı görülmüştür.28

2.1.6.6. Ġntrasellüler Olayların AkıĢının Bloke Edilmesi

Hücre ölümüne neden olan intrasellüler biyokimyasal olaylar kalsiyumun

artması, serbest oksijen radikallerinin oluşumu, nitrik oksit sentezi ve apopitotik ve

nekrotik hücre ölümüdür. Hipotermi bu kaskatta bir çok düzeyde etki eder ancak bu

etkiler arasında en belirgin olanları serbest radikal oluşumu ve nitrik oksit sentezindeki

azalmadır. Değişik H-İ modellerinde nöroprotektif olduğu gösterilen serbest radikal

inhibitörleri; ksantin oksidazı inhibe eden allopürinol, siklooksijenazı inhibe eden

indometazin, Fenton reaksiyonu ile hidroksil radikallerin üretimini azaltan demir

şelatörleri ve lipit peroksidasyonunu inhibe eden magnezyum‟dur. Serbest radikal

tutucularının (vitamin E, 21-aminosteroidler, idebenon) nöroprotektif etkilerinin olduğu

gösterilmiştir.9

Büyüme faktörleri ve diğer nörotrofik maddelerin somatotropik aksın nöral

gelişim, nöral hasar ve hastalıklarında çok önemli olduğu artık bilinmektedir. Growth

hormonun (GH) normal beyine girişi her ne kadar sınırlı ise de beyinde GH reseptörleri

yaygın olarak bulunmaktadır.29

Growth hormonun etkisi primer olarak insulin benzeri

growth faktör (İGF-1) aracılığı ile olur. Growth hormon reseptörünün (GHR) beyinde

yaygın olarak bulunması nöral GH aksisinin varlığını doğrulamaktadır. Son çalışmalarda

22

beyin hasarının iyileşme döneminde beyinde nöral GH ve reseptörlerinin arttığı ve nöral

GH sisteminin aktive olmasının nöroprotektif olduğu görülmüştür. Endojen sistem

beyinde spesifik nöronlar ve reaktif mikroglialar üzerine etkilidir. Makrofaj benzeri

olan bu reaktif mikroglialar beyindeki İGF-1‟in hasardan sonraki ana kaynağıdır.

Growth hormon hipokampus ve talamusta; İGF-1 reseptörü az olan bölgelerde ve İGF-1

tedavisine cevapsız bölgelerde nöroprotektif etki gösterebilir.29

Growth hormon ve growth faktörler genellikle apopitotik hücre ölümünü

engellerler. Bunlar arasında İGF-1, sinir growth faktör, beyin kaynaklı nörotrofik faktör

ve GH vardır.13

Özet olarak nöral somatotropik aks hem MSS gelişimi hem de nöral

hasarlanma sonrası belirgin olarak olaya iştirak etmektedir.

23

Tablo 3. Hipoksik-iskemik beyin hasarının önlenmesindeki değerli girişimler

1. Enerji kaybının azaltılması

Glikoz

Hipotermi

Barbitürat

Hiperkapni (hafif)

2. Glutamat salınımının inhibisyonu

Kalsiyum kanal blokörleri

Magnezyum

Adenozin/adenozin agonistleri

Hipotermi

Serbest radikal tutucuları

Lamotrijin

Fenitoin

3. Glutamat alım yetersizliğinin düzeltilmesi

Hipotermi

4. Glutamat reseptörlerinin bloke edilmesi

NMDA reseptör antagonistlerinin (MK-801, magnezyum, ketamin, dekstrofan) verilmesi

Non-NMDA reseptör antagonistlerinin (NBQX, CNQX) verilmesi

5. Lökosit/ mikroglial/sitokin etkilerinin inhibisyonu

Nötropeni

PAF

IL-1 reseptör antagonistleri

Anti-ICAM-1 antikoru

Antisitokin antikorları/ilaçları

6. İntrasellüler olayların akışının bloke edilmesi

Hipotermi

Serbest radikal sentez inhibitörleri (allopürinol, indometazin, demir şelatörleri,

magnezyum)

Serbest radikal tutucuları (vitamin E, 21-aminosteroidler)

NOS inhibitörleri/tutucuları (nitroarjinin deriveleri)

Büyüme faktörleri, İGF-1, beyin kaynaklı nörotrofik faktör, GH, sinir growth faktörü

içeren anti- apopitotik ajanlar

Monosialogangliosidler (GM-1)

24

2.2 Kaspazlar; programlanmıĢ hücre ölümlerinde anahtar

oyuncular

Apoptosisle ilgili araştırmalar, kaspazların temel rollerini ortaya çıkarmıştır. Son

günlerde kaspaz 1, kaspaz 3 ile birlikte kaspaz 8‟e yönelik biyokimyasal çalışmalar; bu

enzimlerin yapısını, fonksiyonunu ve spesifisitesini anlamamızı sağlamıştır. Bu

çalışmalar, kaspazların biyolojik rolünün gelecekteki araştırmalarına temel sağlayacaktır

ve kaspaz ile ilişkili hastalıkları tedavi etmek için öncülük edecektir.

Apoptosis, çok hücreli organizmaların homeostazisi ve gelişimi boyunca

istenmeyen hücreleri yok etmek için gerekli bir mekanizmadır. Oldukça karmaşık olan

bu süreç, DNA fragmantasyonunu, hücresel membranlardaki değişik reaksiyonları içerir.

Bu hücreler fagositozla elimine edilirler. Düzensiz hücre ölümleri, klinik hataların

arttığının belirtisidir.

Kanser ve otoimmün hastalıklar gibi durumlara yetersiz apoptosis neden olurken,

kontrolsüz apoptosis iskemik hasarlara ve nörodejeneratif bozukluklara neden olabilir.

Bu kontrol altına alınmış hücre ölüm yolları hala tamamen belirlenememesine

rağmen, biyokimyasal ve genetik yaklaşımların, sistein proteazlar olan kaspazların

apoptotik sürecin çeşitli evrelerinde önemli rol oynadığı fikri yerleşmiştir. Son

zamanlarda, kaspazın yer aldığı iki önemli yol olduğu belirtilmektedir. İlki hücre

yüzeyinin uyarılmasına dayanmakta ve ekstrinsik yol olarak bilinmektedir. Ölüm

sinyalleri, tümör nekrosis faktör (TNF) gibi aynı köklü reseptörleri ve TNF reseptörüne

bağlı hücresel ölüm ligandına doğru gönderilir. Ekstrinsik yolun apikal proteazları

kaspaz 8 ve 10 olup, hücre içerisine doğru sinyal gönderirler. İnstrinsik yol, hücresel

hasar sonucu olarak ortaya çıkar ve mitokondrindeki sitokrom c tarafından başlatılır. Bu

durumda, kaspaz 9 aktive edilir. Tüm bu yollar, sırasıyla kendi spesifik hücresel

proteinleri ile inaktif ya da aktif durumunda olan ölümcül kaspazların aktivasyonuna

neden olur.

Son yıllarda yapılan araştırmalarda kaspazların fonksiyonları ve yapısı üzerinde

durulmuştur. Kaspazların substrat bölünmesi, spesifitesi, inhibisyonu, biyolojik rolü ve

hastalıklardaki potansiyel rolleri ile ilgili bilgiler araştırılmaktadır.

Apoptozisin tam mekanizması anlaşılamamasına rağmen apoptozis ile bağlantı

kurulan en önemli olay kaspazların aktivasyonudur. Kaspazlar, (cysteine dependent

25

aspartate spesific proteases) kalsiyumdan bağımsız hücreiçi sistein proteaz sınıfının en

önemli bölümünü oluştururlar. Bu endoproteazlar inaktif olarak hücre sitoplazmasında

bulunurlar ve bir çoğu proapoptotiktir. Kaspaz-9, bcl-2 ailesi tarafından stimüle veya

inhibe edilir. Kaspaz-2 ve kaspaz-8, TNF– α gibi sitokinler tarafından aktive

edilir.Günümüzde kadar 14 memeli kaspazı tespit edilmiş olup, hayvanlarda bulunan

kaspaz-11 ve kaspaz-12'nin insandaki karşılığı hala gösterilememiştir (Tablo 4).

Kaspazlar apoptozisi aktive eden sinyaller tarafından tetiklenip, apoptozisin her üç

yolunda da aktif olarak görev alırlar

Tablo 4. Belli başlı kaspazlar

Kaspazlar 3 subunit içeren prokaspazlar (30-50 kD) olarak sentezlenir: Bunlar NH2

terminal subunit, geniş subunit, (~ 20 kD veya p20) ve küçük bir subunittir (~ 10 kD

veya p 1O). Kaspazlar biyolojik fonksiyonlarına göre 3 grupta incelenmektedir.

a- Sitokin aktivasyonu yapanlar: Kaspaz -1, -4, -5, -11, -12, -13 ve -14'ü

içermektedir. Sitokin sekresyonu ve inflamasyondan sorumludurlar. Ayrıca kaspaz -1, -

4, -5 tetrapeptid olup kendi kendilerine aktive olabilmektedir.

b- Apoptozisi başlatanlar: Kaspaz-2, -8, -9 ve -10'u içermektedir.

c- Apoptozisi yürütenler (efektör grup): Kaspaz-3, -6, -7'yi içeren efektör grup.

Kaspaz 14'ün dışında tüm inflamatuar ve başlangıç kaspazları uzun bir subunite

sahiptir. Uzun subunit “Death Effector Domain (DED)” veya “Kaspaz Recruitmend

Domain (CARD)” kapsar. Bu alanlar prokaspazlar arasında protein-protein aracılı

etkileşime neden olur ve prokaspazların aktivasyonunda önemli rol oynar. Aktif

26

kaspazların 3 boyutlu yapısı tespit edilmiş olup 2 heterodimer, 2 geniş subunit

tarafından çevrelenmiş 2 komşu küçük subunitle karşı yönde bir tetramer oluşturur. Her

bir heterodimer substratın bağlanması ve katalizisi için gerekli küçük ve geniş subunitler

içerir (Şekil 2).

ġekil 2. Kaspazların aktivasyonu

2.2.1. Apoptoziste Kaspaz-3’ün Yeri ve Önemi

Kaspazlar iskemi sonrasında ve genetik kontrolle aktive olurlar. Geçici

iskeminin in-vivo modellerinde kaspazları inhibe eden ajanlar yaralanmayı azaltmada

oldukça etkilidir. Kaspaz-1 ve kaspaz-3 iskemide başlayan hücre ölüm ile ilgili kaskadın

en önemli mediatörleridir. Chen ve ark.kaspaz-3‟ün gecikmiş nöronal ölüme aracılık

ettiğini rapor etmişler ve kaspaz-3 inhibitörlerinin hücre ölümü üzerine etkilerinin

kaspaz-1 inhibitörlerine göre daha etkili olduğunu bildirmişlerdir.30

Diğer kaspazlar gibi

kaspaz-3‟te prokaspaz olarak sentez edilir. Nöronlarda apoptotik hücre ölümü

kaskadında aktif forma dönerler . Kaspaz- 3, kaspaz-6, kaspaz-8, kaspaz-9 ve kaspaz-10

27

birlikte aktive edilir. Kaspaz-3‟te kaspaz-6 ve -7‟yi aktive eder. Apoptozisin efektör

fazında önemli rol oynayan kaspaz-3‟ün nöronal gelişim ve yaralanmada oldukça

önemli olduğu gösterilmiştir. Bu proteazın bozulması nörolojik defektlere yol açar.

Deneysel iskemi ve travmatik beyin hasarlanması sonucunda nöronal hücre ölümüne

kaspaz-3 aktivitesi katkıda bulunur. Bu iki yaralanmada da kaspaz inhibitörleri

apoptozisi azaltmakla kalmayıp ayrıca hayvanlarda fonksiyonel iyileşme ile

sonuçlanmıştır.31

DNA fragmantasyonunda, DNAase aktivasyonuna sebep olan kaspaz-3 „ün direk

rolü olduğu düşünülmektedir. Kaspaz-3 geni yeteri kadar açığa çıkmamış olmakla

beraber kromozom 8 üzerinde lokalize olduğu bilinmektedir. Bu gen embriyonik 4.

günden itibaren gelişimden sorumludur. Kaspaz-3‟teki eksiklik ciddi nörolojik gelişim

problemlerine hatta 3 haftalık embriyoda ölüme neden olabilmektedir.31,32

2.2.2. Kaspazların Aktivasyonu

Kaspazların en az 3 yolla aktive olduğu gösterilmiştir: Otoaktivasyon,

ransaktivasyon ve non-kaspaz proteazlar ile proteoliz. Prokaspazlar düşük fakat

saptanabilir bir proteolitik aktiviteye ve belli koşullar altında otoaktivasyon

potansiyeline sahiptir. Prokaspazların oligomerizasyonu otoaktivasyon için gereklidir.

Başlangıç kaspazları bir kez aktive olduğunda diğer prokaspazları aktive eder. Kaspaz

aktivasyonu için diğer bir mekanizmada non-kaspaz proteazlar ile direk proteolizdir.

Örnek olarak sitotoksik T hücre proteinazı, garanzim-B, prokaspaz-3 ve -7'nin etkin bir

aktivatörüdür. Garanzim-B ayrıca prokaspaz-8, -9 ve -10‟un aktivasyonunda da görev

alır. Başlatıcı kaspazlar apoptotik uyarıyla başlayan ölüm sinyallerini efektör kaspazlara

naklederler. Efektör kaspazlar ise ilgili proteinleri (örneğin, hücre iskeleti proteinleri

aktin veya fodrin, nükleer membran proteini lamin A, DNA tamirinde rol alan poli

ADP-riboz polimeraz) parçalayarak apoptotik hücre morfolojisinin meydana gelmesine

neden olur. İnaktif (zimojen) formdaki kaspazlar kırılarak aktifteşir ve dimerize olurlar.

Kaspaz aktivasyonu (dimerizasyonu), ya hücre yüzey ölüm reseptörlerinin aktivasyonu,

ya da kaspaz-9 bağlayıcı protein olan Apaf-1'in oligomerize olmak üzere indüklenmesi

ile gerçekleşir. Kaspaz ailesinin ve kaspaz inhibitörlerinin keşfi apoptotik hastalıklara

28

terapötik yaklaşımda bizleri cesaretlendirmektedir. Zira farklı kaspazlara spesifik farklı

sentetik inhibitörierin yanısıra kaspaz aktivasyonunu yada kaspaz aktivitesini önleyen

doğal kaspaz inhibitörleri de bulunmuştur.33,34

Memelilerde apoptozun farklı formlarındaki ana kontrol noktası mitokondridir.

Bu yüzden mitokondrinin aktivasyonu (Sitokromc'nin mitokondriden sitoplazmaya

salıverilmesi) apoptotik süreçte irreversbl noktayı gösterir. Mitokondrinin

aktivasyonuna yol açan en önemli faktör bcl-2 ailesidir. Hem pro-apoptotik hem de anti-

apoptotik üyeleri olan bu ailenin üyelerinin mitokondri üzerindeki etkileriyle, ya

sitokrom-c'nin sitoplazmaya salıverilmesi gerçekleşir (apoptozisin başlaması) veya

sitokromc'nin sitoplazmaya salıverilmesi baskılanır (apoptozisin inhibisyonu). Kaspaz

aktivasyonunun başlaması için mitokondrinin devreye girmesi gereklidir. Apaf-1 latent

sitozolik bir protein olup mitokondri tarafından salınan sitokrom-c ile bağlanarak

kompleks oluşturur. Bu da inaktif prekürsör haldeki kaspaz- 9'u aktive eder.32

(Şekil 2).

2.2.3. Mitokondri/Sitokrom-C Aracılı Apoptozis OluĢturulması

Mitokondri normal şartlar altında ATP oluşturmak üzere sitokrom-c ihtiva eder.

mitokondrial stres durumlarında serbest bırakılan sitokrom-c apoptotik hücre ölümünde

kaspaz-3 aktivasyonu için önemli rol teşkil eder. Bu yolda mitokondri tarafından kontrol

edilen apoptotik proteaz aktive edici faktör (Apaf-1) ve kaspaz-9 bulunmaktadır. Ko-

faktör nükleotid trifosfat (d-ATP ve ATP) ile aktive edilen sitokrom-c ve apaf-1

birleşerek prokaspaz-9‟u aktive eder. Aktive kaspaz-9 da kaspaz-3‟ü aktive ederek diğer

kaspaz kaskadının tetiklenmesini sağlar.33

(Şekil 3).

29

ġekil 3. Mitokondri/sitokrom-c aracılı apoptozisin tetiklenmesi

Sağlıklı bir hücre mitokondrisinin dış membranında Bcl-2 proteini yer alır. Bcl-

2, Apaf-1 proteininin bir molekülünü bağlar. Bcl-2 neden olduğu internal hasarla

mitokondride çatlaklar oluşturarak Apaf-1 ve Sitokrom-C salınımına yol açar. Bu iki

protein kaspaz-9 moleküllerine bağlanır.33

(Şekil 4,5).

ġekil 4. Apoptosom

30

Bu proteolitik aktivite kaskadı kan pıhtılaşması ve kompleman aktivasyonuna

benzer. Terminal uç kaspaz-3'dür. Bu proteolitik aktivite ile sitoplazmada yapısal

poteinlerin sindirimi, kromozomal DNA'nın degradasyonu ve hücrenin fagositozu

sağlanır.32-34

ġekil 5. Mitokondri/Sitokrom-C aracılı apoptozis oluşturulması

2.2.4. DıĢ Sinyallerle Apoptozisin Tetiklenmesi

Birbirini tamamlayan ölüm aktivatörlerinin (Fas-L ve TNF) hücre yüzeyindeki

Fas ve TNF reseptörlerine bağlanmasıyla sitoplazmaya kaspaz-8'i aktive eden sinyaller

yayılır (Şekil 6). Kaspaz-8 , kaspaz-9 gibi diğer kaspazları uyarır ve hücrenin

fagositozuna yol açar .

31

ġekil 6. Dış sinyallerle apoptozisin tetiklenmesi

2.2.5. Endoplazmik Retikulum Aracılı Apoptozis OluĢturulması

Son zamanlarda amiloid β nörotoksisitesine katkıda bulunan kaspaz-12‟ye

bağımlı endoplazmik retikulum aracılı apoptotik bir yol tarif edilmiştir. Bu yol

mitokondrial/sitokrom-c ve ölüm reseptör aracılı apoptozisten farklı bir yoldur. ER,

hücre içi kalsiyum dengesi ve membran proteinlerinin katlanmasını içeren bir çok

süreçte kritik öneme sahiptir. Kaspaz-12, ER membranında lokalize olan ve ER aracılı

apoptozis için esas teşkil eden bir kaspazdır. Kalsiyum seviyesinin ve kalpainin

endoplazmik retikulumu etkilemesi ile prokaspaz-12 aktiflenir. Ayrıca kaspaz-7 salınımı

ile de prokaspaz-12 salınımı arasında bir bağlantı bulunur. Aktiflenmiş kaspaz-12

sitoplazmaya yönelir. Kaspaz-9 ile karşılıklı olarak etkileşerek sitozolik kaspaz

kaskadını aktive eder. Son çalışmalar, invivo ve in vitro olarak kaspaz-12‟nin kaspaz-

9‟u aktive ettiğini göstermiştir.30-34

32

Tüm yönleriyle olmasa da, elimizde mevcut olan bilgiler kaspaz 1, 3 ve 8‟in

yapıları ve özelliklerini açıklamaktadır. Elimizde eksik olan şey, bu sistein proteaz

familyasının proenzimlerini harekete geçiren moleküler mekanizmanın iyi bir tanımıdır.

Bunun dışında öncü prokaspazların N terminal alanlarının adaptör moleküllerle nasıl

etkileşim içinde olduğu bilinmemektedir.

33

2.3. Allopürinol

Allopürinol hem primer hiperürisemiye bağlı gutta hemde hematolojik veya

neoplastik hastalıklara sekonder hiperürisemi durumlarında etkindir. Ürikozürik ajan

olarak üratın renal eksresyonunu artırarak üratın atılımını artırmasına karşın allopürinol

ürik asit sentezinin son basamağını inhibe eder. Gutlu hastaların çoğunda ürik asitin

aşırı yapımı hastalığı ağırlaştıran bir faktör olduğundan ve sekonder hiperüriseminin pek

çok tipinde karakteristik bir bulgu olduğundan allopürinolle tedaviye geleneksel

yaklaşım gösterir.35

2.3.1. Özellikleri

Allopürinol hipoksantin analoğudur. Fakat allopürinol ve primer metaboliti olan

oksipürinol (Alloksantin) ksantin oksidaz inhibitörleridir. Bu enzimin inhibisyonu

allpürinolün ana farmakolojik etkilerinden sorumludur. İnsanlarda ürik asit, hipoksantin

ve ksantinin oksidasyonu ile katalize edilen ksantin oksidaz enzimi ile primer olarak

oluşturulur. Allopürinol düşük konsantrasyonlarda enzimin bir substratı ve kompetetif

inhibitörü iken yüksek konsantrasyonlarda non-kompetetif inhibitörüdür. Ksantin

oksidaz etkisiyle yada aktivitesiyle oluşturulan allopürinolün metaboliti olan oksipürinol

enzimin non-kompetetif inhibitörüdür; bu bileşimin oluşumu dokularda uzun süre sebat

etmesi ile birlikte alopürinolün farmakolojik etkisinin çoğundan sorumludur. Ürik asit

biyosentezinin inhibisyonu ürik asidin plazma konsantrasyonunu ve idrarda atılımını

azaltırken daha çözünebilir oksipürin prekürsörlerinin plazma konsantrasyonu ve renal

atılımını artırır.35

Allopürinolün yokluğunda pürinlerin idrardaki içeriği hemen hemen her zaman

ürik aside göre daha azdır. Allopürinol tedavisi sırasında idrardaki pürinler; hipoksantin,

ksantin ve ürik aside ayrılır. Her birinin bağımsız çözünürlüğü olduğundan idrar

yolunda aşırı ürik asit birikimine ve benzer şekilde taş oluşumuna yol açmadan

plazmadaki ürik asit konsantrasyonunu azaltır. Allopürinol plazmada ürik asit

konsantrasyonunu düşürerek kendisinin çözünürlük limitini azaltır; tophusun

çözülmesini kolaylaştırır ve kronik gut artritinin gelişimini ve ilerlemesini önler. Ürik

asit taşlarının oluşumu tedaviyle hızlıca kaybolur ve nefropati gelişimini önler. Her ne

34

kadar allopürinol böbrek fonksiyonu şiddetli şekilde kötüleşmeden önce uygulanımı ile

gut nefropatisi geriye döndürülebilir gibi görünse de ilerlemiş renal hastalıkda düzelme

ile ilgili çok az veri vardır. Gut artritlerinin akut ataklarının insidansı tedavinin ilk

aylarında ürik asidin dokulardaki depolardan mobilizasyonunun sonucunda artış

gösterebilir. Kolşisinin birlikte uygulanımı böyle akut atakların oluşmasını önler. Ürik

asidin dokularda aşırı birikiminin azaltılması akut atakların insidansını düşürür. Ksantin

ve hipoıksantinin dokuda birikimi allopürinol tedavisi sırasında genellikle ortaya çıkmaz

çünkü oksipürinolün renal klirensi hızlıdır; plazma konsantrasyonları sadece çok az artış

gösterir fakat çözünürlüğünü aşmaz. Ksantin idrarda atılan total oksipürinin % 50‟sini

oluşturması ve göreceli olarak çözünür olmamasına rağmen allopürinol tedavisi

sırasında ksantin taş oluşumu sadece tedaviye bağlı çok yüksek ürik asit yapımı olan

hastalarda ortaya çıkar. Bu risk allopürinol tedavisi sırasında idrarın alkalizasyonu ve

günlük sıvı alımının artırılması ile azaltılabilir. Bazı hastalarda allopürinol‟e bağlı

oksipürin atılımındaki artış ürik asit atılımındaki azalmaya göre daha azdır. Bu çelişki

primer olarak oksipürinin tekrar kullanımı ve yeniden pürin sentezinin feed back

inhibisyonunun sonucudur.35

2.3.2. Famakokinetik Ve Metabolizma

Allopürinol relatif olarak oral alımdan sonra hızlı absorbe edilir. 60-90 dakikada

peak plazma konsantrasyonuna ulaşılır. Yaklaşık % 20‟si gaita ile 48-72 saatte atılır. 1-2

saatllik yarı ömür ile plazmadan uzaklaştırılır. Tek bir dozun % 10‟undan azı veya uzun

dönem tedavi sırasında alınan ilacın yaklaşık % 30‟u idrarla değişmeden atılılır.

Oksipürinol, glomerüler filtrasyonunu ve probeniside hassas tübüler rearbsorbsiyonunun

net balansı ile idrarla yavaş olarak atılır. Oksipürinolün plazma yarılanma ömrü normal

böbrek fonksiyonu olan hastalarda 18-30 saattir ve böbrek yetmezliği olan hastalarda

GFR‟deki azalma ile orantılı olarak uzar. Allopürinol ve onun aktif metaboliti olan

oksipürinol diğer dokulara göre konsantrasyonu 1-3 kat fazla olan beyin dışında total

doku sıvısına dağılır. Hiçbir komponenti plazma proteinlerine bağlanmaz. İki

komponentinin plazma konsantrasyonu terapotik veya toksik etkileri ile iyi korelasyon

göstermez.35

35

2.3.3. Ġlaç EtkileĢimleri

Probenisid oksipürinolün klirensini ve böylece allopürinolün doz ihtiyacı

artırırken allopürinol probenisidin yarı ömrünün uzatır ve ürikozürik etkisinin

güçlendirir. Allopürinol merkaptopürinin (ve onun derivesi azotiopürin)

metabolizmasını ve klirensini azaltır. Böylece merkaptopürin ve azotiopürin dozu

allopürinol ile birlikte uygulanacaksa azaltılmalıdır. Allopürinol diğer ilaçların; oral

antikoagülan ajanlar dahil hepatik inaktivasyonunu geciktirebilir. Her ne kadar etkisi

değişken, ve sadece bazı hastalarda klinik önemi olsa da tüm medikasyonları alan

hastalarda protrombin aktivitesi daha sık bakılmalıdır. Aynı anda allopürinol–ampisilin

tedavisi birlikte alan hastalarda ciltte döküntü olma ihtimali ilacı tek başına alanlara

göre artmıştır ve allopürinole ya da hiperürisemiye bağlanması düşünülebilir.

Hipersensitivite reaksiyonları özellikle allopürinol ve tiazid diüretikleri birlikte kullanan

renal fonksiyonu bozulmuş hastalarda bildirilmiştir. Allopürinol ve teofilin birlikte

kullanımı teofilinin aktif bir metaboliti olan 1-metil ksantin birikimine yol açar bunlarda

teofilin düzeyi artabilir.35

2.3.4. Terapötik Kullanımlar

Allopürinol hem primer gut hiperürisemisi hemde polisitemia vera, myeloid

metaplazi ve diğer kan diskrazilerine bağlı sekonder hiperürisemide oral kullanım için

uygundur. Allopürinol profilaktik olarak hiperürisemiyi azaltmak için ve özellikle

antineoplastik veya radyoterapi başlanmış lösemi,lenfoma ve diğer malignensili

hastalarda ürat birikimine veya böbrek tşımı önlemek için kullanılır. Sıvı alımı ile

birlikte 2-3 gün günlük 600-800 mg doz tavsiye edilir. Malignenesilere bağlı sekonder

hiperürisemili çocıklarda yaşla orantılı olarak günlük doz 150-300 mg‟dır.35

Allopürinol merkaptopürinin ve onun derivesi olan azotiopürinin ksantin oksidaz

ile enzimatik inaktivasyonunu inhibe eder. Böylece Allopürinol oral mercaptopürin ile

birlikte kullanıldığında antineoplastik ajanın dozu normal dozu 1/3 veya ¼

azaltılmalıdır. Allopürinol özellikle siklofosfamid gibi ksantin oksidaz ile metabolize

edilmeyen sitotoksik ajanlarla birlikte kullanıldığında Kİ süpresyon riski artar. Çok

36

nadiren olsada tiazidlerle ve diğer ilaçlarla meydana gelebilen iatrojenik hiperürisemi

aynı anda Allopürinol verilmesi ile önlenebilir veya geriye döndürülebilir. Allopürinol

Lesch Nyhan sendromu olan hastalarda yüksek plazma konsantrasyonunu azaltırken

hiperürisemiye bağlı komplikasyonları da önler.35

2.3.4. Toksik Etkiler

Allopürinol çoğu hasta tarafından iyi tolere edilir. En sık görülen yan etkisi

hipersensitivite reaksiyonudur. Tedavi başlamasından aylar yada yıllar sonra bile

oluşabilir. Etkileri ilaç kesildikten birkaç gün sonra azalır. İlacın fazla kullanımı şiddetli

reaksiyonlara yol açar. Allopürinol tedavisinin ilk aylarında akut gut atakları daha sık

görülebilir ve kolşisinle birlikte profilaktik tedavi gerekebilir.

Allopürinole bağlı cilt reaksiyonları genellikle kaşıntılı, eritematöz veya

makülopapüler erüpsiyon şeklindedir. Fakat lezyon sıklıkla ürtikeryal veya purpuriktir.

Hastalarda nadiren toksik epidermal nekroz ve Steven Johnson sendromu gibi fatal

durumlar görülebilir. Steven Johnson sendromu gelişme riski öncelikle tedavinin ilk 2

ayına sınırlıdır. Ateş, halsizlik, kas ağrısı meydana gelebilir. Bu yan etkiler renal

fonksiyonu normal hastaların % 3‟ünde tespit edilse de böbrek yetmezliği olanlarda

daha sıktır. Cilt döküntüsünü şiddetli hipersensivite reaksiyonları izleyebildiğinden

böyle döküntü gelişmiş hastalarda allopürinol kesilmelidir.35

Geçici lökopeni veya lökositoz ve eozinofili nadir reaksiyonlardır, ancak tedavinin

kesilmesi gerekebilir. Hepatomegali ve plazma aminotransferaz aktivite artışı ve

progresif renal yetmezlik de gelişebilir.35

37

3. GEREÇ ve YÖNTEM

Perinatal hipoksik-iskemik beyin hasarının patogenezinin anlaşılması ve yeni

tedavi yaklaşımlarının belirlenmesi amacıyla yıllardan beri immatür rat modelleri

kullanılmaktadır.36-38

Bu amaçla 7 günlük ratların tercih edilmesinin nedeni bunların

beyinlerinin gelişim düzeyinin histolojik olarak 32-34 haftalık insan fetusları ile olan

benzerliğidir. Yedi günlük ratlarda serebral kortikal nöron tabakası gelişimini

tamamlamış, germinal matriks involüsyona uğramış ve beyaz cevher henüz miyelinize

olmaya başlamıştır. Postnatal 12-13 günlük ratların beyinleri ise fulterm

yenidoğanlarınkine benzemektedir. İmmatür ratlarda hipoksi-iskemi oluşturmak

amacıyla tek taraflı karotis arter ligasyonu ardından % 8 oksijen, % 92 nitrojen

karışımın inhalasyonu şeklinde uygulanan Levin‟in rat modeli kullanılmaktadır.37

Bu

modelde hipoksik-iskemik serebral hasar oluşması için gereken sistemik hipoksi

süresinin optimal 2-3 saat olduğu gösterilmiştir. Oluşan hasarın büyük bir kısmı arteria

karotis kommunisin bağlandığı ipsilateral serebral hemisferde; serebral korteks,

subkortikal ve periventriküler beyaz cevher, striatum (bazal ganglionlar) ve hipokampus

ile sınırlanır. Oluşan doku hasarı selektif nöronal nekrozdan infarkta kadar değişen

patolojik görünüm arz eder. İmmatür rat modellerinde hipoksinin laktik asidemiye ve

metabolik asidoza yol açtığı, metabolik asidozu kompanse etmek için oluşan

hiperventilasyonun hipokapniye neden olduğu ve sistemik kan basıncının ortalama %

25-30 oranında azaldığı gösterilmiştir.36

Bu çalışma, hipoksi-iskemi modeli oluşturulan 7 günlük Wistar-albino ratlar

üzerinde yapıldı. Çalışmaya alınan ratlar Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi

Deneyler Araştırma ve Uygulama Merkezinde üretime alınan 10 ayrı rat çiftinin

bulunduğu kafeslerden seçildi. Ratların bulunduğu ortamda 12 saat gündüz, 12 saat gece

ortamı sağlandı. 0da sıcaklığı sürekli olarak 21-23 0C ve nemi % 40-60 arasında tutuldu.

Üretime alınan erişkin ratlar Adana Tavaş yem fabrikasından temin edilen standart rat

yemi ile beslendi. Çalışma ile ilgili olarak Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi

Deneyler Araştırma ve Uygulama Merkezinde oluşturulan etik kurul tarafından etik

onay alındı.

Çalışmaya ağırlıkları ve cinsiyetleri arasında fark olmayan iki tedavi, bir kontrol

olmak üzere toplam dört grup rat alındı. İlk doğdukları günden itibaren annelerinin

38

yanında bulunan ve anne sütü ile beslenen rat yavruları 7 günlük olduklarında çalışmaya

alındı. Her bir ratın hangi gruba alınacağı randomize seçimle belirlendi. Grup 1, sadece

cerrahi işlem uygulanıp herhangibir tedavi verilmeyen sham (S) grubu (n=10). Grup 2,

% 09 NaCl verilen hipoksi-iskemi (H-İ) grubu (n=10). Grup 3, iskemi sonrası

30.dakikada ve 12 saat sonra 2 eşit doz şeklinde toplam 48 mg/kg dozda allopürinol

tedavisi verilen AL48 grubu (n=10). Grup 4, hipoksi-iskemi sonrası 30.dakikada, 12

saat sonra ve ardından tekrar 12 saat sonra 3 eşit doz şeklinde toplam 72 mg/kg dozda

allopürinol tedavisi verilen AL72 grubu (n=10) olarak belirlendi. Çalışmaya alınan rat

yavrularının işlem öncesi ağırlıkları ve cinsiyetleri kaydedildi. Eter anestezisi altında

boyun ortasından, trakeanın hemen solundan uygulanan 0,5 cm‟lik kesi ile sol arteria

karotis kommunis bulundu. 4/0 ipek sutur materyali ile arter iki tarafından bağlanılarak

ortası kesildi. Cilt aynı sutur materyali ile kapatıldıktan sonra 1-2 saat süreyle anestezi

etkisi geçene kadar annelerinin yanına verilen ratlar beşerli gruplar halinde %8 oksijen,

% 92 nitrojen içeren transparan fiberglastan yapılmış, çevre ısısı ışık kaynağı yardımıyla

33oC‟ye ayarlanan bir kafeste 2,5 saat bekletildi. Ortamdaki oksijen konsantrasyonu

oksijen monitörü (Ohmeda 5120 seri numarası: FABQ0104 USA) ile sürekli ölçülerek

% 8 oksijen içeren hipoksik ortam 2,5 saat süreyle korundu. Bu işlemin ardından yarım

saat oda havasında iyileşmeye bırakılan ratlar deney sonuna kadar kalmak üzere

annelerinin yanına verildi.

Allopürinol ve SF; intraperitoneal yoldan insülin enjektörleri ile uygulandı.

Allopürinol (Allopürinol flakon 5 gr Sıgma-Aldrich-USA) verilen Grup 3 tedavi

grubuna allopürinol toplam 48 mg/kg dozda hipoksi-iskemi işlemi bittikten yarım saat

sonra ve ardından 12 saat sonra olacak şekilde iki eşit doz ve Grup 4 tedavi grubuna

hipoksi-iskemi sonrası 30.dakikada, 12 saat sonra ve ardından tekrar 12 saat sonra üç

eşit doz toplam 72 mg/kg dozda allopürinol tedavisi verildi. Kontrol grubuna SF

hipoksi-iskemi işlemi bittikten yarım saat sonra başlanıp tek doz verildi. Uygulama

sonunda 7-10 günlükken deney ve kontrol grubunda yer alan reperfüzyona izin

verilmeden hafif eter anestezisi altında dekapite edildi.

Tüm ratlar annelerinden 4 saat ayrı tutularak eter anestezisi altında dekapite

edildiler. Beyin hızlıca çıkarılarak sağ serebral hemisfer, sol serebral hemisfer ayrıldı,

kuru buz içinde tutulan tüplere konuldu ve çalışma gününe kadar -20 oC‟de saklandı.

39

3.1. Kaspaz 3 ve Kaspaz 8 Ölçüm Yöntemleri

Kaspaz 3 ve Kaspaz 8 enzimleri çalışma kitlerinde açıklandığı şekilde yapıldı.

Kaspaz 3 ve Kaspaz 8 enzimleri ölçümü için sırası ile FLICE/Kaspaz-3 Colorimetric

Protease Assay Kit ve FLICE/Kaspaz-8 Colorimetric Protease Assay Kit (Oxford

Biomedical

Research, Oxford, MI) kullanıldı. Yöntemlerin prensibi kromofor p-

nitroanilitin (pNA), işaretlenmiş IETD (Ile-Glu-Thr-Asp)-pNA substratından kırılması

ile spektrofotometrik olarak ölçüm esasına dayanmaktadır. p-nitroanilid miktarı

spektrofotometrede 405 nm‟deki absorbans değeri ölçülerek tayin edildi.

3.2. Ġstatistiksel analiz

Değişkenlerin normal dağılıp dağılmadığı kontrol edildi ve değişkenler normal

dağılım gösterdiği için analizlerde parametrik testler kullanıldı. Veriler SPSS 11.5 paket

programına girilerek analizleri yapıldı ve grafikler STATISTICA 6.1‟de yapıldı.P<0,05

değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

40

4. BULGULAR

Yenidoğan ratların ortalama ağırlıkları 11.3 2.3 (8.2-16) gr olup gruplar

arasında cinsiyet ve ağırlık açısından istatistiksel farklılık yoktu (p>0.05).

Çalışma grubundaki ratlardan alınan sağ ve sol serebral hemisferlerde hem

kaspaz-3 hemde kaspaz-8 çalışıldı. Elde edilen değerlerin her grup içinde ve hemde

gruplar arasında fark olup olmadığı istatistiksel olarak değerlendirildi.

Grupların 405nm optik dansitede ölçülen sol ve sağ hemisfer kaspaz-3

aktiviteleri Şekil 7 ve Tablo 5‟ de verildi.

Grupların kendi içinde sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktiviteleri arasında

istatistiksel farklılık saptanmadı (p>0,05).

Shame grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktiviteleri, H-İ grubu,

AL48 grubu ve AL72 grubundaki ratların kaspaz-3 aktivitelerine göre belirgin düşük

bulundu (p= 0,0001, p= 0,0001, p= 0,0001).

H-İ grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktiviteleri ile AL48

grubundaki ratların kaspaz-3 aktiviteleri arasında fark yokken, AL72 grubundaki ratların

kaspaz-3 aktiviteleri H-İ grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3

aktivitelerinden belirgin düşük bulundu (p= 0,0001).

AL48 grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktiviteleri, AL72

grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktivitelerinden belirgin yüksek

bulundu (p= 0,0001).

41

Sol Beyin

Sağ BeyinS H-Ġ AL48 AL72

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

Kaspaz 3

Enzim

Aktiv

itele

ri

ġekil 7. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-3 aktiviteleri (405nm optik dansite)

Tablo 5. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-3 aktiviteleri (405nm optik dansite)

Çalışma

Grupları

n(sayı) Kapaz-3 sol serebral

hemisfer

Ort SS

Kapaz-3 sağ serebral

hemisfer

Ort SS

P

S 10 0,09 0,02* 0,08 0,02* p>0,05

H-İ 10 0,23 0,03*#€

0,24 0,03*#€

p>0,05

AL48 10 0,22 0,04*&€

0,21 0,04*&€

p>0,05

AL72 10 0,14 0,03*#&

0,13 0,04*#&

p>0,05

* S ve H-İ, S ve AL48, S ve AL72 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık

saptandı (p= 0,0001).

# H-İ ve AL72 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık saptandı (p= 0,0001).

& AL48 ile AL72 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık saptandı (p=

0,0001).

€ H-İ ve AL48 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık saptanmadı (p>0.05).

42

Grupların 405nm optik dansitede ölçülen sol ve sağ hemisfer kaspaz-8

aktiviteleri Şekil 8 ve Tablo 6‟ da verildi.

Grupların kendi içinde sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktiviteleri arasında

istatistiksel farklılık saptanmadı (p>0,05).

Sham grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktiviteleri, H-İ grubu,

AL48 grubu ve AL72 grubundaki ratların kaspaz-3 ve kaspaz-8 aktivitelerine göre

belirgin düşük bulundu (p= 0,0001, p= 0,0001, p= 0,0001).

H-İ grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktiviteleri ile AL48

grubundaki ratların kaspaz-8 aktiviteleri arasında fark yokken, AL72 grubundaki ratların

kaspaz-8 aktiviteleri H-İ grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-8

aktivitelerinden belirgin düşük bulundu (p= 0,0001).

AL48 grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktiviteleri, AL72

grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktivitelerinden belirgin yüksek

bulundu (p= 0,0001).

43

Sol Beyin

Sağ BeyinS H-Ġ AL48 AL72

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,22

0,24

0,26

0,28

Kaspaz 8

Enzim

Aktiv

itele

ri

ġekil 8. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-8 aktiviteleri (405nm optik dansite)

Tablo 6. Çalışma grubundaki ratların sol ve sağ serebral kaspaz-8 aktiviteleri (405nm optik dansite)

Çalışma

Grupları

N(sayı) Kaspaz-8 sol serebral

hemisfer

Ort SS

Kapaz-8 sağ serebral

hemisfer

Ort SS

p

S 10 0,09 0,02* 0,08 0,02* p>0,05

H-İ 10 0,23 0,03*#€

0,23 0,03*#€

p>0,05

AL48 10 0,23 0,02*&€

0,22 0,02*&€

p>0,05

AL72 10 0,14 0,04*#&

0,14 0,04*#&

p>0,05

* S ve H-İ, S ve AL48, S ve AL72 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık

saptandı (p= 0,0001).

# H-İ ve AL72 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık saptandı (p= 0,0001).

& AL48 ile AL72 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık saptandı (p=

0,0001).

€ H-İ ve AL48 grubu ratlarda sol ve sağ hemisfer kaspaz-8 aktivitesi arasında istatistiksel farklılık saptanmadı (p>0.05).

44

5. TARTIġMA

Perinatal bakımda süregelen ilerlemelere rağmen kalıcı nörolojik sekellerin en

sık nedeni olarak gösterilen hipoksik-iskemik beyin hasarı, obstetrisyen ve

neonatologları uğraştıran yenidoğanın önemli sorunlarından biridir.39

Hipoksik-iskemik beyin hasarı, hipoksi-iskemi anında başlayıp resusitasyon

ardından iyileşme döneminde devam eden bir süreçtir. Akut dönemde selektif nöronal

nekroz veya infarkt şeklinde gözlenen doku hasarı, nöron, glia ve endotel hücre

yapısının bozulması ile devam eder. İnfarkt alanına en yakın bölgede yer alan

nöronlarda nekroz ya da programlanmış hücre ölümü yani apoptozis gelişir.40

Nekroz

gelişmiş hücrelerde hasarın önüne geçilmesi söz konusu değildir. Ancak infarkt

etrafında devam eden hasar sürecinin önüne geçilmesi bu dönemde meydana gelen

biyokimyasal olayların iyi bilinmesi ile mümkün olabilir.

Son çalışmalarda H-İ‟de olay ile hücre ölümü arasında geçen latent dönemin çok

kritik olduğu görülmüş ve bu dönem „terapodik pencere‟ olarak adlandırılmıştır.

Hipoksi-iskemiye maruz kalan bir yenidoğan bebekte bu süre 6 ile 12 saat arasında

değişmektedir. Terapodik pencere döneminde oluşan hücre ölümüne neden olan

moleküler olaylar kaskadının sonlandırılması klinikte çok yararlıdır.41

Hipoksik-iskemik serebral hasar, hücresel düzeyde oksidatif metabolizmanın

anaerobik metabolizmaya kayması ile başlar. Glikozun anaerobik yoldan yıkımı

sonucunda hücrede NADH, FADH gibi redükte ajanlar ile laktik asit ve H iyonları

birikmeye başlar. Anaerobik glikoliz, hücrenin enerji gereksinimini karşılayamadığı için

ATP gibi yüksek enerjili fosfat rezervleri tüketilmeye başlar. Bunun sonucunda hücreler

arasında iyon geçişini sağlayan ATP‟e bağımlı pompa fonksiyonları bozulur. Hücre

içerisinde Na , Ca2, Cl

- ve su birikerek sitotoksik ödem meydana gelir. Hipoksi-

iskemi aynı zamanda glutamat gibi eksitotoksik aminoasitlerin akson terminallerinden

salınımını stimüle eder. Glutamat salınımı glutamat hücre reseptörlerini aktive ederek

Na ve Ca2 iyonlarının hücre içerisine girmesine neden olur. Membran fosfolipitlerinin

turnoverinin artması sonucu sitosol içerisinde serbest yağ asitleri birikir daha sonra

mitokondri içerisinde devam eden indirgenme reaksiyonlarının sonucunda oluşan

serbest oksijen radikalleri, membran fosfolipitlerinin peroksidasyonuna yol açar.

Reaksiyonun ürünü olarak açığa çıkan prostaglandin, ksantin, ürik asit ve Ca2 sitosol

45

içerisinde birikmeye başlar. Kalsiyumun intrasellüler depolardan (mitokondri ve

endoplazmik retikulum) serbest hale geçmesi ve plazma membranı boyunca geçişinin

artması sonucunda hücre sitoplazmasında yüksek seviyelere ulaşır. Nitrik oksit sentaz

enziminin hücre içerisinde artan kalsiyum iyonları ile aktive olması sonucunda

sentezlenen NO , sahip olduğu serbest radikal gaz özelliği nedeniyle diffüzyon yoluyla

diğer hücrelere de rahatlıkla geçerek hücresel toksisiteye neden olur.40

Özetle sellüler enerji yetmezliği, asidoz, glutamat ve NO nörotoksisitesi, serbest

radikal oluşumu, hücre içinde Ca2 birikimi ve lipit peroksidasyonu hücrenin yapısal

komponentlerinin bozulmasına ve nihayetinde hücre ölümüne yol açan biyokimyasal

kaskadlar dizisidir.40

Hipoksi-iskemi sonrası gelişen serebral hasarın patogenezinde NO önemli bir

yer tutmaktadır. Hasar sürecinin devam ettiği reperfüzyon-reoksijenasyon döneminde

küçük damar endotel hücrelerinde serbest radikallerin üretimine neden olan

siklooksijenaz ve ksantin oksidazın aktive olduğu iki önemli yol tetiklenir. Açığa çıkan

serbest radikaller lökosit, platelet ve endotel hücrelerindeki adezyon moleküllerini

aktive ederek lökositlerin adezyonu ve ekstravazasyonunu sağlar. Kan beyin bariyerinin

bozulmasıyla serbest radikaller parankim içine boşalarak hasarın yayılmasına neden

olur.42

Lökosit adherasyonu, mikroglial aktivasyon ve sitokin etkisi hipoksik-iskemik

beyin hasarında önemli görünmesine rağmen perinatal modellerde bu düzeyde

nöroproteksiyon ile ilgili çalışmalar azdır.43

Ksantin oksidazın, serbest radikaller için önemli bir kaynak olduğu

bilinmektedir. Allopürinol, ksantin oksidaz enzimlerinin önemli bir inhibitörü olup,

hipoksantinden ksantinin sentezini engeller ve serbest radikal süper oksidinin

oluşumundan korur.44-49

Güneş T ve arkadaşlarının asfiktik yenidoğan bebeklerde yaptıkları bir çalışmada

serum NO düzeyinin afiktiktik bebeklerde kontrol grubuna göre önemli ölçüde yüksek

olduğu ve beyin omurilik sıvısı NO düzeyinin ensefalopatinin derecesi ile korele

olduğunu bildirmişler. Ayrıca allopürinol ile tedavi ettikleri asfiktik yenidoğanların

serum NO düzeylerinin azaldığını ve daha iyi nörolojik sonuçların olduğunu

bulmuşlardır.50

46

Itoh ve arkadaşları50

hipertansiyonlu farelerde, iki yönlü ana karotis arter

kapatılmasından 4 saat sonra serebral iyileşmesinde alloprinol‟ün koruyucu etkisi

olduğunu göstermişlerdir. Palmer ve arkadaşları46,47

serebral hipoksi-iskemiden 15

dakika sonra allopürinol uygulanmış genç farelerin beyin hasarlarının azaldığını

bulmuştur.

Soloniuk ve arkadaşları, allopürinol ve deforaksaminin iskemi boyunca hücre

hasarını engellediğini belirtmiştir.52

Yüksek dozdaki allopürinol‟ün ön tedavide infrakt

hacmini azalttığı kanıtlanmıştır. Yapılan birkaç çalışma bu bulguyu desteklemiştir.46,53,54

Farelerdeki geçici fokal serebral iskemi üzerinde, allopürinolün morfolojik

etkisini araştıran bir çalışmada sadece infarkt hacmini ölçülmemiş, toplam

supratentoryal beyin hacmi ölçülmüş ve standard sağlamak için ve sonuçları

karşılaştırmak için toplam suprotentoryal hacminin toplam infarkt hacmine olan oranına

kadar hesaplanmıştır. Ksantin oksidazın ihhibisyonu, iskemideki nöral hasarlardan

sorumlu mekanizmalardan biri olan serbest radikallerdeki artıştan dolayı infark oranı ve

hacmindeki azalmayla sonuçlanmıştır. Allopürinol yüksek dozda kullanılmış (50 mg/kg)

ve herhangi bir yan etkisini görülmemiştir. Çalışma sonucunda, kontrol grubuyla

kıyaslandığında, allopürinolün iskemiden 2 saat önce verilmesiyle, oluşan infartk hacmi

ve oranında önemli istatistiksel azalmalar olduğu kanıtlanmıştır. İnfarkt hacim ve oranı,

allopürinolün iskemiden hemen önce uygulandığı zaman bile kontrol grubundan daha az

olmuştur, fakat bu önemli bulunmamıştır. Allopürinolün, reperfüzyondan hemen sonra

ya da daha sonra kullanılması etkili bulunmamıştır. Serebral iskemiden hemen sonra

uygulanan allopürinolün koruyucu ve iyileştirici etkileri hakkında birkaç çalışma

yapılmıştır. 45, 52, 54, 56, 57

Scholte ve arkadaşlarının57

yaptıkları diğer bir çalışmada deneysel hipoksi

uygulanan domuzlarda allopürinol ve desferroksamin uygulanan grup shame grubu ile

kıyaslandığında kaspaz-3 seviyeleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark

görülmemiştir. Çalışmada allopürinol ve oksipürinol düzeyleri 5-20 mg/L seviyeleri

arasında seyretmiş olup, bu düzeylerde ksantin oksidaz seviyesini inhibe ettiği

bilinmektedir. Yenidoğanlarda allopürinolün güvenli kullanılabilirliği halen tartışmalı

olup daha çok kombine tedaviler denenmiştir.

47

Bizim çalışmamızda AL48 Grubundaki yenidoğan ratlara 48 mg/kg, AL72

Grubundaki ratlara 72 mg/kg dozda tek başına allopürinol verilmiştir. Sağ ve sol beyin

kaspaz 3 ve kaspaz 8 seviyeleri hipoksi-iskemi grubu ile kıyaslandığında 72 mg/kg

dozda allopürinol verilen grupta belirgin düşük saptanmıştır. Ancak bizim

çalışmamızda yenidoğan ratlara hipoksi-iskemi oluşturulup reperfüzyondan sonra

allopürinol tedavisi vererek sağ ve sol beyinlerinden kaspaz 3 ve kaspaz 8 seviyelerinin

kıyaslanması sonucunda hipoksi-iskemi grubu ile AL48 grubu arasında anlamlı fark

saptanmazken, hipoksi-iskemi grubu ile 72 mg/kg allopürinol tedavisi alan AL72

Grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı farklı sonuç elde edilmiştir. Bu sonuçlara

gore AL72 grubunda kaspaz 3 ve kaspaz 8 seviyeleri belirgin düşük saptanmıştır.

Yaptığımız bu çalışmada allupurinolün 72 mg/kg dozunda kullanımı ile elde

edilen rat modelinde sağ ve sol beyin dokularında kaspaz 3 ve kaspaz 8 düzeylerinin H-İ

ve AL48 grubuna göre belirgin düşük olması allopürinolün hipoksik-iskemik

ensefalopatide iskemi boyunca koruyucu etkisi olduğu düşündürmektedir.

Sonuç olarak yaptığımız bu çalışma; hipoksik iskemik serebral hasarın

önlenmesinde allopürinol verilmesinin kaspaz-3 ve kaspaz-8 düzeylerine etki ederek

hipoksik-iskemide etkili olduğunu düşündürmektedir. Ancak allopürinolün hipoksik

iskemik ensefalopatideki rolünün daha iyi anlaşılabilmesi için daha ileri çalışmalara

ihtiyaç vardır.

48

6. SONUÇLAR

1-Grupların kendi içinde sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 ve kaspaz-8 aktiviteleri

arasında istatistiksel farklılık saptanmadı (p>0,05).

2-Sham grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 ve kaspaz-8

aktiviteleri, H-İ grubu, AL48 grubu ve AL72 grubundaki ratların kaspaz-3 aktivitelerine

göre belirgin düşük bulundu (p= 0,0001, p= 0,0001, p= 0,0001).

3-H-İ grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 ve kaspaz-8 aktiviteleri

ile AL48 grubundaki ratların kaspaz-3 aktiviteleri arasında fark yokken, AL72

grubundaki ratların kaspaz-3 aktiviteleri H-İ grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer

kaspaz-3 aktivitelerinden belirgin düşük bulundu (p= 0,0001).

4-AL48 grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktiviteleri, AL72

grubundaki ratların sol ve sağ hemisfer kaspaz-3 aktivitelerinden belirgin yüksek

bulundu (p= 0,0001).

49

7. KAYNAKLAR

1. Vannuccı RC. Hypoxia-Ischemia: Clinical Aspects. In: Fanaroff AA, Martin

RJ eds. Neonatal-Perinatal Medicine, Disease of the Fetus and Infant. 6th ed.

St Louis: Mosby, 1997 :812-951.

2. Hance AJ, Robin ED, Simon LM, Alexander S, Herzenberg LA, Theodore

J. Regulation of glycolytic enzymes activity during chronic hypoxia by changes

in rate-limiting enzyme content. Use of monoclonal antibodies to quantitate

changes in pyruvate kinase content. J Clin Invest 1980 ;66:1258-1264.

3. Ptashne KA, Morin ME, Hance A, Robin ED. Increased biosynthesis of

pyruvate kinase under hypoxic conditions in mammalian cells. Biochim Biophys

Acta 1985 ;844:19-23.

4. Robin ED, Murphy BJ, Theodore J. Coordinate regulation of glycolysis by

hypoxia in mammalian cells. J Cell Physiol 1984 ;118:287-290.

5. Mates JM, Sanchez-Jimenez FM. Role of reactive oxygen species in

apoptosis: implications for cancer therapy. Int J Biochem Cell Biol 2000

;32:157-170.

6. Nordberg J, Arner ES. Reactive oxygen species, antioxidants, and the

mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med 2001 ;31:1287-1312.

7. Taylor DL, Edwards AD, Mehmet H. Oxidative metabolism, apoptosis and

perinatal brain injury. Brain Pathol 1999 ;9:93-117.

8. Nakajima W, Ishida A, Lange MS, Gabrielson KL, Wilson MA, Martin LJ,

Blue ME, Johnston MV. Apoptosis has a prolonged role in the

neurodegeneration after hypoxic ischemia in the newborn rat. J Neurosci 2000

;20:7994-8004.

50

9. Volpe JJ. Hypoxic-Ischemic encephalopathy: Biochemical and Physiological

Aspects. In: Volpe JJ, ed. Neurology of the Newborn, 4th ed. Philadelphia: WB

Saunders Co, 2001 :217-394.

10. Pasternak JF. Hypoxic-ischemic brain damage in the term infant: Lessons

form laboratory. Ped Clin N Am 1993 ;40:1061-1072.

11. Satar M, Narlı N, Kırımi E, Atıcı A, Türkmen M, Yapıcıoğlu H. Hipoksik

İskemik Ensefalopatili 205 Olgunun Değerlendirilmesi. T Klin J Pediatr 2001

;10:36-41.

12. Evans DJ, Levene MI. Hypoxic-ischaemic injury. In: Rennie JM, Roberton

NRC, eds. Textbook of Neonatology, 3rd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone,

1999 :1235-1251.

13. Volpe JJ. Perinatal brain injury: From pathogenesis to neuroprotection. Ment

Retard Dev Disabil Res Rev 2001 ;7:56-64.

14. Myers RE. Two patterns of perinatal brain damage and their conditions of

occurence. Am J Obstet Gynecol 1972 ;112:246.

15. Myers RE, Beard R, Adamsons K. Brain swelling in the newborn rhesus

monkey following partial asphyxia, Neurology 1969 ;19:1012-1018.

16. Brann AW Jr, Myers RE. Central nervous system findings in the newborn

monkey following severe in utero partial asphyxia. Neurology 1975 ;25:327-

338.

17. Miall-Allen WM, De Vries LS, Whitelaw AGL. Mean arterial pressure and

neonatal cerebral lesions. Arch Dis Child 1987 ;62:1068-1072.

18. Puka-Sundvall M, Valin C, Gilland E, Hallin U, Wang X, Sandberg M,

Karlsson J, Blomgren K, Hagberg H. Impairment of mitochondrial

respiration after cerebral hypoxia-ischemia in immature rats: relationship to

activation of caspase-3 and neuronal injury. Brain Res Dev Brain Res 2000

;125:43-50.

51

19. Northington FJ, Ferriero DM, Flock DL, Flock DL, Martin LJ. Delayed

neurodegeneration in neonatal rat thalamus after hypoxia-ischemia in apoptosis.

J Neurosci 2001 ;21:1931-1938.

20. du Plessis A, Volpe JJ. Perinatal brain injury in the preterm and newborn. Curr

Opin Neurol 2002 ;15:151-157.

21. Liao SL, Chen CJ. Differential effects of cytokines and redox potential on

glutamate uptake in rat cortical glial cultures. Neurosci Lett 2001 ;299:113-116.

22. Vannucci RC. Interventions for perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy.

Pediatrics; 1997 ;100:1004-1014.

23. Vannucci RC, Towfight J, Heitjan TF, Brucklacher RM. Carbon dioxide

protects the perinatal brain from hypoxic ischemic damage: an experimental

study in the immature rat. Pediatrics 1995 ;95:868-874.

24. Thoresen M, Wyatt J. Keeping a cool head, post-hypoxic hypothermia- an old

idea re-visited. Acta Paediatr 1997 ;86:1029-1033.

25. Crumrine RC, Bergstrand K, Copper AT, Faison WL, Cooper BR.

Lamotrigine protects hippocampal CA1 neurons from ischemic damage after

cardiac arrest. Stroke 1997 ;28:2230-2236.

26. Vartanian MG, Cordon JJ, Kupina NC, Schielke GP, Posner A, Raser KJ,

Wang KK, Taylor CP. Phenytoin pretreatment prevents hypoxic-ischemic

brain damage in neonatal rats. Dev Brain Res 1996 ;95:169-175.

27. Hagberg H, Gilland E, Bona E, Hanson LA, Hahin-Zoric M, Blennow M,

Holst M, McRae A, Söder O. Enhanced expression of interleukin (IL-1) and

IL-6 messenger RNA and bioactive protein after hypoxia-ischemia in neonatal

rats. Pediatr Res 1996 ;40:603-609.

28. Thorner MO, Vance ML, Laws ARE. The anterior pituitary. In: Wilson JD,

Foster DW, Kronenberg HM, et al, eds. Williams Textbook of Endocrinology.

9th ed. Philedelphia: W.B. Saunders Company, 1998 :249-326.

52

29. Scheepens A, Williams CE, Breier BH, Guan J, Gluckman PD. A role for

the somatotropic axis in neural development, injury and disease. J Ped Endoc

Metabol 2000 ;13:1483-1491.

30. Chen J, Nagayama T, Jin K, Stetler RA, Zhu RL, Graham SH, Simon RP.

Induction of caspase-3-like protease may mediate delayed neuronal death in the

hippocampus after transient cerebral ischemia. Joumal of Neuroscience 1998

:4914-4928.

31. Grutter MG. Caspases: key players in programmed cell death. Curr Opin

Struct Biol. 2000 ;10:649-55.

32. Boatright KM, Salvesen GS. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin

Cell Biol. 2003 ;15:725-31.

33. Chou KC, Jones D, Heinrikson RL. Prediction of the tertiary structure and

substrate binding site of caspase-8. FEBS Lett 1997 ;419:49-54.

34. Chou KC, Tomasselli AG, Heinrikson RL. Prediction of the tertiary structure

of a caspase-9/inhibitor complex. FEBS Lett 2000 ;470:249-256.

35. Roberts II LJ and Marrow D. Analgesic and antipyretic and antiinflammatory

agents and drugs employed ın the treatment of gout. In: Hardmann JG, Limbird

LE, Gilman AG eds. Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis Of The

Therapeutics.10 th ed. Mc-Graw Hill, 2001 :687-754

36. Vannucci RC, Connor JR, Mauger DT, Palmer C, Smith MB, Towfighi J,

Vannucci SJ. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. Journal of

Neuroscience Research. 1999 ;55:158-163

37. Levine S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am. J. Pathol. 1960 ;36:1-

17

38. Rice JED, Vanucci RRC, Brierly JB. The influence of immaturity on

hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann. Neurol. 1981 ;9:131-141

53

39. Amato M, Donati F. Update on perinatal hypoxic insult:mechanism, diagnosis

and interventions. European Journal of Paediatric Neurology 2000 ;4:203-209

40. Vannucci RC, Perlman JM. Interventions for Perinatal Hypoxic-Ischemic

Encephalopathy. Pediatrics 1997 ;100:1004-1114

41. Gunn AJ, Gunn TR, Gunning MI, et al. Neuroprotection with prolonged heat

cooling started before postischemic seizures in fetal sheep. Pediatrics 1999 ;

102:1098-1106

42. du Plessis A, Johnston MV. Hypoxic-ischemic brain injury in the newborn:

Cellular mechanisms and potential strategies for neuroprotection. Clinics in

Perinatology 1997 ;24:627-654

43. Volpe JJ. Perinatal Brain Injury: From pathogenesis to neuroprotection. Mental

Retardation and Develepmental Reviews 2001 ;7:56-64

44. Iansek R, Pockhom D, Aspey BS, Harrison MJ. An assessment of the

possible protective effect of allopurinol in acute stroke. J Neurol Neurosurg

Psychiatry 1986 ;49:585- 7

45. Mink RB, Dutka AJ, Hollenbeck JM. Allopurinol pretreatment improves

evoked response recovery following global cerebral ischemia in dogs. Stroke

1991 ;22:660- 5

46. Palmer C, Vannucci RC, Towfighi J. Reduction of perinatal hypoxicischemic

brain damage with allopurinol. Pediatr Res 1990 ;27:332 – 6

47. Palmer C, Towfighi J, Roberts RL, Heitjan DF. Allopurinol administrated

after inducing hypoxia-ischemia reduces brain injury in 7–day-old rats. Pediatr

Res 1993 ;33:405- 11

48. Peeters-Scholte C, Braun K, Koster J, Kops N, Blomgren K, Buonocore G,

van Buul-Offers S, Hagberg H, Nicolay K, van Bel F, Groenendaal F.

Effects of allopurinol and deferoxamine on reperfusion injury of the brain in

newborn piglets after neonatal hypoxia-ischemia. Pediatr Res 2003 ;54:516 –

22

54

49. Van Bel F, Shadid M, Moison RM, Dorrepaal CA, Fontijn J, Monteiro L,

Van De Bor M, Berger HM. Effect of allopurinol on postasphyxial free radical

formation, cerebral hemodynamics, and electrical brain activity. Pediatrics.

1998 ;101:185-93.

50. Gunes T, Ozturk MA, Koklu E, Kose K, Gunes I. Effect of allopurinol

supplementation on nitric oxide levels in asphyxiated newborns. Pediatr

Neurol. 2007 ;36(1):17-24.

51. Itoh T, Kawakami M, Yamauchi Y, Shimizu S, Nakamura M. Effect of

allopurinol on ischemia and reperfusion-induced cerebral injury in

spontaneously hypertensive rats. Stroke 1986 ;17:1284- 7

52. Soloniuk DS, Perkins E, Wilson JR. Use of allopurinol and deferoxamine in

cellular protection during ischemia. Surg Neurol 1992 ;38:110 – 3

53. Dilek I, Baysefer A, Gezen F, Çıklatekerlioğlu O,Kayalı H, Sirin S. The

protective effect of allopurinol on neural tissue on regional cerebral ischemia:

an experimental study on rats. Turkish Neurosurgery 1995 ;5:39 – 44

54. Martz D, Royas G, Schielke GP, Betz AL. Allopurinol and dimethylthiourea

reduce infarction following middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke 1989

;20:488- 94.

55. Akdemir H, Asik Z, Pasaoglu H, Karaküçük I, Oktem IS, Koç RK. The

effect of allopurinol on focal cerebral ischaemia: an experimental study in

rabbits. Neurosurg Rev 2001 ;24:131- 5

56. Kulah B, Besler HT, Akdag M, Oruc T, Altinok G, Kulacoglu H, Ozmen

MM, Coskun F. The effects of verapamil vs. allopurinol on intestinal

ischemia/reperfusion injury in rats. An experimental study.

Hepatogastroenterology 2004 ;51:401-7

57. Peeters-Scholte C, Braun K, Koster J, Kops N, Blomgren K, Buonocore G,

van Buul-Offers S, Hagberg H, Nicolay K, van Bel F, Groenendaal F.

Effects of allopurinol and deferoxamine on reperfusion injury of the brain in

newborn piglets after neonatal hypoxia-ischemia. Pediatr Res. 2003 ;54:516-22

55

8. ÖZGEÇMĠġ

Adı Soyadı : Kenan Özcan

Doğum Tarihi ve Yeri : 27.06.1973/Tarsus

Medeni Durumu : Evli, 2 çocuk babası

Adres : Mahfesığmaz Mah 38 Sk. Özgülat Apt Apt No:2

Kat:1/2 ADANA

Telefon : 505-7704868

Fax : -

E.mail : kenanozcan73@gmail..com

Mezun Olduğu Tıp Fakültesi : Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi

Görev Yerleri : -

Dernek Üyelikleri : Ç.Ü.Neonatoloji Derneği,

Alınan Burslar : -

Yabancı Dil(ler) : İngilizce

Diğer Hususlar : -