Biomaterials Research (2007) 11(2) : 70-74

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Biomaterials

Research

C The Korean Society for Biomaterials

HA/PCL 복합지지체에서 HA 입자의 크기가 조골세포의 증식에 미치는 영향

Effects of HA Particle Sizes on Proliferation of Osteoblasts in

Novel 3-dimensional HA/PCL Scaffolds

허수진1,2·김승언

2·Wei Jie

1,3·현용택

2·김동화

1·윤희숙

2·신지원

1·황영미

1·신정욱

1*

S. J. Heo1,2, S. E. Kim2, W. Jie1,3, Y. T. Hyun2, D. H. Kim1, H. S. Yun2, J. W. Shin1,Y. M. Hwang1, and Jung-Woog Shin1*

1인제대학교 의생명공학대학 의용공학과 BK21 사업단, 2

한국기계연구원 미래기술연구부, 3(주) 태산 솔루젼스lTeam of BK21, Dept. of Biomedical Engineering, Inje University2Dept. of Future Technology, Korea Institute of Machinery and Materials3TaeSan Solutions Ltd.(Received April 7, 20007/Accepted May 11, 2007)

The aim of this study is to fabricate novel nano- (n), micro-(m) HA/PCL composite 3-D scaffolds with macropores andto compare the effects of two types of HA particles on the proliferation of osteoblasts in the 3-D scaffolds. A modifiedR.P. (rapid prototyping) process was employed to fabricate the 3-D composite scaffolds. Composite materials were pre-pared with nano- and micro- size of HA particles. The size of the synthesized nano-HA powders ranged from 10 to30nm, while that of micro-HA powders ranged from 25 to 35 µm. To examine the potential of the case of scaffolds,the surface morphology of the scaffolds and cell proliferation were evaluated with SEM observations and MTT assay.The effect of HA particle size (nano-, micro-) on the attachment and proliferation of MG-63 in HA/PCL compositescaffolds was studied. The cell attachment and proliferation of n-HA/PCL composite scaffold were slightly better thanthose of the m-HA/PCL composite scaffold. From this study, we suggest that the n-HA/PCL composite scaffold may bea promising candidate for bone tissue engineering in the future. However, further studies are needed for osteo-conductivity, differentiation of BMSC (bone marrow stromal cell) and bone tissue regeneration.

Key words: Hydroxyapatite, Polycaprolactone, 3-D scaffold, Bone tissue engineering, Rapid prototyping

서 론

조직의 치료 및 재생을 위한 조직 공학 지지체는 손상

된 골 조직이 충분히 재생되어 치료되는 시기를 맞추어

생체 내에서 분해되는 재료를 사용해야 한다.1,2) 이러한 골 조

직 재생용 지지체는 생체내 안전성뿐 아니라 크게 세 가지 조

건을 만족해야 한다. 첫째 골 세포의 부착, 증식, 분화의 활성

에 도움을 주는 재료로 제작 되어야 하고, 둘째 지지체 전체적

으로 골 세포의 증식과 골 조직 형성이 원활 할 수 있는 다

공성의 구조로 제작 되어야 하고, 마지막으로 이러한 기공들의

상호 연결성이 좋아야한다.3-10)

생분해성 고분자인 PCL (poly ε-caprolactone)은 다른 생분

해성 고분자보다 분해속도가 느려 손상된 뼈가 치유될 때까지

지지체로서의 역할을 충분히 할 수 있으며 값이 저렴하여 손

쉽게 구할 수 있다는 장점이 있다.11-15) 하지만 PCL은 소수성

의 물질이며 세포의 부착이나 증식이 원활하지 않는 물질로 알

려져 있다.16-18) 이에 HA (hydroxyapatite)와 같은 뼈의 성분

과 유사한 생체 활성 물질을 복합, 제조함으로 이러한 단점을

극복하고자하는 많은 연구가 진행되어 왔으며, 그 외에도 지지

체의 제작을 위한 재료로서 생분해성 고분자와 골 세포의 활

성을 위한 다양한 유기물을 복합하여 사용하고 있다.19-15) 또한

뼈를 재료적인 측면으로 보면, 주로 나노 크기의 아파타이트와

콜라겐으로 이루어져 있는 복합체이므로 최근 생체 모방적인

측면에서 나노 크기의 HA를 제조하여 지지체의 재료로 사용

하려는 연구들도 진행되고 있다.16-20)

한편 다공성의 지지체를 제작하기 위하여 염침출법,21) 가스

발포법,22) 동결건조법23) 등 여러 가지 방법들이 제안 되어 왔

으나, 기공 구조의 다양한 설계나 제조의 재현성 측면에서 많

은 한계가 있으며 특히 생성된 기공들의 3차원적인 연결을 제

어하기 어려운 단점이 있다24-25). 이를 극복하고자 최근 몇몇

연구자들에 의해 쾌속조형 (rapid prototype) 기술을 이용하여

조직 공학용 지지체 제조 연구가 시도되고 있다.26-28)

따라서, 본 연구에서는 쾌속조형 기술 중 융착조형법 (Fused

deposition modeling)을 응용한 공정을 이용하여 뼈의 재료적*책임연락저자: sjw@bme.inje.ac.kr

골

HA/PCL 복합지지체에서 HA 입자의 크기가 조골세포의 증식에 미치는 영향 71

Vol. 11, No. 2

구성 요소를 모사한 HA/PCL 복합 지지체를 제조하였고, HA

분말의 입자 크기를 나노미터급과 마이크로미터급으로 다르게

하여, 그에 따른 지지체의 형태학적 분석과 조골 세포에 대한

증식 거동을 비교 분석하고자 하였다.

재료 및 방법

재료의 준비

지지체 제작에 사용된 PCL (Sigma Aldrich, Mw. 65,000,

USA)과 micro-HA (Sigma-Aldrich, USA)는 상용 소재를 구입하

여 사용하였으며, nano-HA는 calcium nitrate (Ca(N03)24H2O,

Junsei Chemical Co., Ltd., Japan)와 ammonium phosphate

((NH4)2HPO4, Junsei Chemical Co., Ltd., Japan)로 아래와

같은 반응을 이용하여 합성하였다.

10Ca(NO3)2 + 6(NH4)3PO4 + 8NH4OH →

Ca10(PO4)6(OH)2 + 20NH4NO3 + 6H2O

상세한 합성 과정은 다음과 같다. 우선 P와 Ca을 약 80oC

에서 증류수에 충분히 녹여 준비하고. Ca 용액을 P 용액에 천

천히 주입하면서 충분히 섞어 주어 nano-HA 합성을 하였다.

이때 ammonium hydroxide을 첨가하여 pH=11 이상의 조건

을 유지하고, 약 80oC 온도에서 두 시간 동안 가열한 후 24

시간 이상 상온에서 합성이 충분히 이루어 질 수 있도록 하였

다. 제작된 후 남아있는 불순물의 제거를 위하여 증류수로 3

회 이상의 세척 과정을 거친 후 알코올을 이용하여 남아 있는

수분을 충분히 제거하였다.

HA/PCL 복합 지지체 제작

PCL을 클로로폼(chloroform)에 넣어 상온에서 4시간 이상 교

반하여 균질한 고분자 용액을 제조한 후 준비된 micro-HA와

nano-HA 분말을 각각 40wt%씩 첨가하여 혼합물을 제조하였

다. 3차원 지지체 제조를 위하여 혼합물에 클로로폼

(chloroform)을 첨가하여 압출기에 주입하였고, 압력 펌프를 이

용하여 압출기 속의 혼합물을 비용매성 매개체 내에 압출하여

약 10 × 10 × 5 mm 크기의 HA/PCL 복합 지지체를 제작하였

다. Figure 1은 본 연구에서 사용한 3차원 지지체 제조 장치

의 개략도이다.

재료의 특성 분석

Transmission electron microscopy (TEM, JEOL, JEM-2100F,

Japan)를 이용하여 합성된 n-HA 입자의 크기와 형태를 관찰하

였고, 전계방출주사전자현미경 (FE-SEM, Hitachi Ltd, S-

4300SE, JAPAN)을 이용하여 사용된 micro-HA의 입자의 형태

와 크기를 관찰하였다. 사용된 nano-HA와 micro-HA의 상 조

성과 결정학적 분석을 위하여 X-ray diffraction (XRD,

RIGAKU, JAPAN) 분석을 실시하였다.

3차원 지지체의 평가

지지체의 구조 분석: HA/PCL 복합지지체의 기공도 분석을

위하여 mercury intrusion porosimetry (Auto-pore IV 9500,

Micro-meritics Instrument Corporation, USA)를 이용하였다

(n=3). 그리고 지지체의 표면과 단면의 구조를 분석하기 위하

여 전계방출주사전자현미경 (FE-SEM, Hitachi Ltd, S-4300SE,

JAPAN) 을 이용하여 관찰하였다.

지지체의 조골 세포 증식능 평가

제작된 각 지지체의 조골세포 증식능 평가를 위하여 MG-63

(American Type Culture Collection, No. CRL-1427, USA)을

104 cells/scaffold의 농도로 파종하였다. DMEM (Dulbecco's

Modified Eagle Medium, Gibco, USA)에 10%의 FBS (fetal

bovine serum)와 1% P/S (penicillin/streptomycin, Hyclone,

USA)을 첨가하여 기본 배양 배지로 사용하였다. 세포의 증식

평가는 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetra-

zolium bromide) assay (Cell Proliferation Kit I, Boehringer,

Mannheim, Germany)를 1일, 4일, 7일에 걸쳐서 실시하였으

며 다기능분석기 (ELISA, Synergy HT, Bio-Tek Instruments

Inc., USA)를 이용하여 595 nm 파장에서 분석하였다.

실험에서 얻어진 값은 평균 ±표준편차로 표시하였으며, 각

군 간의 다중비교(multiple comparison)를 위해 SPSS 10.0

(Ver. 10.0, Standard Software Package Inc., USA)을 이용하

여 Fisher's LSD 방법으로 처리하였고, 유의 수준은 p < 0.05

로 통계적 유의 수준 여부를 판단하였다.

결과 및 고찰

합성된 nano-HA는 10~30 nm의 크기로서 입자들이 응집되

어 있지 않고 개개의 입자 형상을 잘 유지하면서 분포하고 있

으며, micro-HA는 25~35 µm 크기로서 판상의 각진 형상으

로 보아 어떠한 결정성이 있음을 예상할 수 있다(Figure 2).

Figure 3은 nano-HA와 micro-HA 분말에 대한 XRD 분석

Figure 1. Schematic of 3-D robotic system of fabrication scaffold.

72 허수진·김승언·Wei Jie·현용택·김동화·윤희숙·신지원·황영미·신정욱

Biomaterials Research 2007

결과로서 nano-HA가 기존의 micro-HA와 주요 성분이 같은

저 결정성 HA라는 것을 알 수 있었다. Figure 4와 5는 n-

HA/PCL, m-HA/PCL 복합재로 제조한 3차원 지지체의 외관과

내부 기공 구조를 보여주는 사진으로서 지지체 전체적으로 기

공의 크기가 일정하고, 기공의 형태와 기공 간 내부 연결성이

좋은 것을 볼 수 있다. 기공 크기는 x-y 방향으로 약 500

µm, z 방향으로 약 300 µm로 제작됨을 알 수 있다. 3차원

지지체에 있어서 내부 연결성은 매우 중요한데, 이는 골 세포

및 골 조직이 지지체의 내부까지 충분히 침투하고 성장할 수

있는 공간을 제공할 수 있기 때문이다. 본 연구팀은 일반적인

염침출법에 의한 지지체와 3 차원 조형 지지체의 비교 연구를

통하여 3 차원 지지체의 내부 연결 기공 구조의 장점을 확인

한 바 있다29).

Figure 6에서 보는바와 같이 m-HA/PCL 지지체의 경우 큰

HA 입자의 불규칙한 쌓임에 의해 표면의 형상이 불규칙하였

고, 이에 따라 지지체의 표면과 단면에서 20~30 µm 크기의

미세 기공이 형성된 것으로 보인다. 반면 n-HA/PCL 지지체의

경우 전체적으로 표면 형상이 부드러웠고, nano-HA가 PCL과

의 복합체에서 뭉쳐져 있지 않고 각각의 입자의 형태를 유지

하면서 표면에 노출되어 있음을 알 수 있었다. Mercury

prosimetry로 기공도를 측정한 결과 n-HA/PCL 지지체의 평균

기공률은 72.297%, m-HA/PCL 지지체의 평균 기공률

73.525%였다. m-HA/PCL 지지체의 기공률이 약간 더 높은

이유는 자연적으로 형성된 20~30 µm 크기의 미세기공 때문

Figure 2. (a) TEM image of n-HA particles with 10-30 nm in widthand 90-100 nm in length (bar=100 nm), (b) SEM image of m-HA par-ticles with 25-35 um in width and 50-80 um in length.

Figure 3. XRD spectra of (a) nano-HA , (b) micro-HA. XRD pattern ofsynthesized n-HA powder can be seen that there is a good matchwith the conventional m-HA powder both in intensity and positionthe peaks.

Figure 4. Photographs of 3-D (a) n-HA/PCL, (b) m-HA/PCL scaffold.

Figure 5. SEM images of scaffolds (a) n-HA/PCL, (b) m-HA/PCL scaf-fold (bar=500µm).

HA/PCL 복합지지체에서 HA 입자의 크기가 조골세포의 증식에 미치는 영향 73

Vol. 11, No. 2

으로 사료된다.

3 차원 지지체에 MG-63 세포를 배양 평가한 결과 Figure

7에서 보듯이 골 세포의 초기 부착력에서는 n-HA/PCL 지지체

가 m-HA/PCL 지지체에 비해 더 효과적이었으며, 통계학적으

로 유의한 차이를 나타내었다 (p<0.05). 7 일간의 총 배양

기간 동안 m-HA/PCL 지지체에 비해 n-HA/PCL 지지체에서

전반적으로 MG-63 세포의 증식이 활발한 것을 알 수 있었

다. 이는 nano 크기의 HA 입자가 micro 크기의 HA 입자

보다 표면적이 월등히 크기 때문에 골 세포와의 초기 부착에

유리한 것으로 사료된다.

Webster30,31), Li32) 등에 의하면 nano 크기의 재료의 경우

micro 크기보다 단백질의 흡수나 조골 세포의 부착이 월등하

며, 또한 세포외기질과 더 큰 상호 작용을 하는 것으로 알려지

고 있다. 이처럼 nano-HA가 복합된 지지체는 생체 모사적인

측면에서도 뼈의 재료적 구성 요소와 부합되고, micro-HA가

복합된 지지체 보다 골 세포의 부착과 증식을 촉진시키므로 짧

은 시간에 새로운 골 조직을 형성시키는데 도움을 줄 것으로

기대되며 추가적으로 다양한 생물학적 평가가 필요할 것으로

사료된다.

결 론

HA/PCL 복합지지체에서 HA 입자의 크기가 조골 세포의 증

식에 미치는 영향에 대한 연구 결과를 요약하면 다음과 같다.

지지체의 형태가 제어되어 nano-HA를 이용한 3차원 지지체의

경우 골 세포의 부착과 증식이 우수하여 골 재생용 지지체로

의 응용 가능성이 높음을 알 수 있었다. 나아가 BMSC

(Bone marrow stromal cell) 등을 이용하여 지지체의 골 세

포로의 분화능력 평가와 동물실험을 통한 생체 내 적합성 평

가가 이루어져야 할 것으로 사료된다.

감사의 글

본 연구는 한국기계연구원 2007년도 기본 사업의 지원으로

이루어졌으며, 이에 감사드립니다.

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Figure 6. SEM images of pore, top and side view of n-HA/PCL scaf-fold (a) and m-HA/PCL scaffold (b). The pore size of top surface isabout 500 um and cross-section is about 300 um (bar=500 um).

Figure 7. MTT assay of MG-63 attached on n-HA/PCL and m-HA/PCL scaffolds (n=5, p<0.05). The cell attachment and proliferation ofn-HA/PCL composite scaffold were slightly better than those of the m-HA/PCL composite scaffold.

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Biomaterials Research 2007

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